KR101231591B1 - 애기장대 유래의 ｕｃｌ1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키는 방법, 상기 UCL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 CLF (curly leaf) 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 CLF 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 UCL1 유전자를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키기 위한 조성물 및 상기 UCL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

애기장대 유래의 ＵＣＬ1 유전자 및 이의 용도{UCL1 gene from Arabidopsis thaliana and uses thereof}

본 발명은 애기장대 유래의 UCL1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키는 방법, 상기 UCL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 CLF (curly leaf) 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 CLF 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 UCL1 유전자를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키기 위한 조성물 및 상기 UCL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

PcG (Polycomb group) 단백질은 후생유전학적으로 유전자 발현을 침묵시키며, 진핵 세포 증식, 줄기 세포 아이덴티티(identity), 암, 게놈 각인(imprinting) 및 X 염색체 불활성화를 조절하는데 중요한 역할을 한다 (Kerppola, 2009, Trends in Cell Biol 19, 692-704.). 3가지 다른 PcG 복합체, PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), PRC2 및 Pcl (Polycomb-like)-PRC2 는 동물에 존재하며 타겟 유전자를 억제하기 위해 순차적인 방식으로 함께 작용한다 (Muller and Verrijzer, 2009, Curr Opin Genet Dev 19, 150-158).

오직 PRC2 복합체만이 고등 식물에서 고도로 보존되어 있다 (Hennig and Derkacheva, 2009, Trends in Genetics 25, 414-423). 초파리(Drosophila) PRC2 복합체는 Esc (Extra Sex Combs), p55, Su(z)12 (Suppressor of Zeste 12) 및 E(z) (Enhancer of Zeste)로 구성되어 있다 (Schwartz and Pirrotta, 2008, Curr Opinion Cell Biology 20, 266-273). WD-40 단백질인 Esc 및 p55, C2H2 징크-핑거(zinc-finger) DNA-결합 단백질인 Su(z)12, H3K27을 메틸화시키는 SET-도메인 단백질인 E(z)는 타겟 유전자를 침묵시킨다. 애기장대(Arabidopsis)에는, Esc 동족체(homolog)인 FIE (FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM), p55 동족체인 MSI1 내지 MSI5 (ARABIDOPSIS MULTICOPY SUPRESSPR OF IRA1 TO 5), 징크-핑거-포함 Su(Z) 동족체인 EMF2 (EMBRYONIC FLOWER 2), VRN2 (VERNALIZATION2) 및 FIS2 (FERTILIZATION INDEPENDENT SEED2), 그리고 SET-도메인 E(z) 동족체인 CLF, SWN (SWINGER) 및 MEA (MEDEA)이 있다 (Hennig and Derkacheva, 2009, Trends in Genetics 25, 414-423).

3가지 다른 PRC2 복합체가 있으며, 이는 각각의 징크-핑거-포함 Su(Z) 동족체인 EMF2, VRN2 및 FIS2로 명명되었다. FIE, MSI1, CLF/SWN 및 EMF2로 구성된 EMF2 PcG 복합체는 조기 개화를 막고 식물의 생장을 조절한다 (Hennig and Derkacheva, 2009, Trends in Genetics 25, 414-423). 식물의 발달 상태 동안, CLF와의 EMF2 PcG 복합체는 중요한 꽃 촉진 유전자인 FT (FLOWERING LOCUS T), 그리고 꽃기관 아이덴티티 유전자인 AG (AGAMOUS) 및 AGL19 (AGAMOUS - LIKE 19)의 발현을 억제한다 (Schonrock et al., 2006, Genes & Developmnet 20, 1667-1678). CLF SET-도메인 PcG 유전자에 돌연변이를 가지는 식물은 하편생장(동그랗게 말린) 잎, 꽃기관의 호메오틱 (homeotic) 형질전환, 및 조기 개화를 포함하는 다면발현성(pleiotropic) 효과를 야기한다 (Goodrich et al., 1997, Nature 386, 44-51). FIS2 복합체는 적절한 종자 발달에 필요한 FIE, MSI1, MEA 및 FIS2로 구성되어 있다. MEA SET-도메인 PcG 유전자에서의 돌연변이는 종자 퇴화(abortion), 비-생존 배의 형성, 배유 세포의 과-증식, 수정이 없을 때에 자발적 배유 발달을 야기하고, 배유에서 유전자 각인을 방해한다 (Huh et al., 2008, Cell 132, 735-744).

유비퀴틴-26S 프로테아좀 시스템은 진핵세포에 보존되어 있다 (Hershko and Ciechanover, 1998b, Annu Rev Biochem 67, 425-479). 3가지 유비퀴틴-리가제 복합체 (E1, E2 및 E3)는 상기 26S 프로테아좀 복합체에서 분해되는 타겟 단백질로 유비퀴틴을 순차적으로 이동시킨다. 상기 시스템은 동물에서 세포주기의 진행, 신호 전달, 유전자 전사, PCD (programmed cell death) 및 발달, 그리고 식물에서 호르몬 합성 및 신호전달, 식물-병원체 상호작용, 자가-불화합성(self-incompatibility), 생체리듬(circadian rhythm), 형태발생 및 후생유전을 조절하는 특이적 조절 단백질뿐만 아니라 생합성 오류에 의해 생성되거나 또는 넌-네이티브(non-native) 형태로 폴딩(folding)된 비정상적 단백질을 분해한다 (Hershko and Ciechanover, 1998a, Annu Rev Biochem 67, 425-479). 식물에서 가장 흔한 E3 리가제인 SCF는 CUL1 (CULLIN1) 골격 단백질, 촉매 RING 도메인 단백질, RBX1 (RING-BOX1), 어댑터(adaptor) 단백질, 동물에서의 SKP1 (S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEIN1), 애기장대에서의 ASK1/2 (ARABIDOPSIS SKP1 HOMOLOGUE1/2) 및 F-box 단백질로 구성된 다중 서브유닛으로 이루어져 있으며, 이는 상기 E2-유비퀴틴 리가제 복합체로부터 타겟 단백질로의 유비퀴틴의 이동에 기질 특이성을 부여한다.

PcG 단백질 복합체에 의한 유전자의 후생유전 표지는 유전자 침묵의 기억을 세포에게 제공한다 (Kerppola, 2009, Trends in Cell Biol 19, 692-704). 그러나, PcG 복합체 조성의 변화 및 염색질과의 연관성은 유기체가 발달 전이를 겪고 환경에 반응을 할 때 유익할 수 있으며 (Bracken et al., 2006, Genes Dev 20, 1123-1136), PcG 단백질의 번역후 변형의 역할에 대한 증가하는 증거가 있다 (Niessen et al., 2009, Epigenetics chromatin 2, 10). 상기 식물 PcG 유전자 즉, CLF의 활성을 조절하는 메커니즘을 밝히기 위해, 본 발명자들은 clf 기능 상실 돌연변이를 표현형모사하는 우성 돌연변이체인 ucl1 -D을 분리하였다. 상기 돌연변이의 분석은 CLF 활성이 번역 후 수준에서 유비퀴틴-26S 프로테아좀 경로를 통한 분해를 위해 CLF에 결합하여 타겟팅하는 F-box 단백질인 UCL1에 의해 조절된다는 것을 나타낸다.

한국등록특허 제10-0693496호에는 종자 발달과 관련된 벼 유래 OsFIE 유전자가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 활성화-표지된 애기장대 집단에서 clf 기능 상실 돌연변이를 표현형모사하는(phenocopy) 돌연변이체를 확인하였고, 상기 돌연변이체에서 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자의 발현이 증가한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 UCL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 CLF (curly leaf) 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 CLF 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 UCL1 유전자를 포함하는 식물의 CLF 단백질의 활성을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 UCL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 애기장대 유래 UCL1 유전자는 clf 기능 상실 돌연변이를 표현형모사하는 돌연변이체에서 그 발현이 증가하였다. 따라서 UCL1 유전자를 이용하면 종자와 화분의 발달, 화서의 높이 감소, 꽃 기관의 호메오틱(homeotic) 변화 또는 조기 개화 등 식물체의 표현형이 조절된 형질전환 식물체를 개발하는데 유용할 것으로 사료된다.

도 1은 clf 돌연변이를 표현형모사하는 F-Box 유전자 바로 옆에 활성화 T-DNA의 삽입을 나타낸다. (A) 야생형, (B) 이형접합성 및 (C) 동형접합성 ucl1 -D 돌연변이체 식물은 위쪽에 나타내었고, 상기 식물에 해당하는 잎의 횡단면은 아래쪽에 나타내었다. (D) ucl1 -D 식물에서 T-DNA 삽입 부위와 인접한 게놈 영역. LB: T-DNA 좌측경계(left border), bar: 바스타-저항성(Basta-resistance) 유전자, 4 Enhancer: CaMV 35S 인핸서 테트라드(tetrad), RB: T-DNA 우측경계(right border). (E) 야생형 및 동형접합성 ucl1 -D 돌연변이체에서 T-DNA와 인접한 유전자의 RNA 수준의 실시간 qRT-PCR 분석. 수치는 야생형 식물에서 At1g65740의 발현을 1.0로 했을 때 상대적인 값으로 계산되었고, 평균±표준편차(3회 측정)로 나타내었다. (F) CaMV::UCL1 식물. (G) 4X Enh :: UCL1 식물. 식물은 25일 된 것들이 사용되었다. 눈금자는 1 cm를 나타낸다.
도 2는 도 1과 관련하여, At1g65740 (UCL1)의 과발현이 컬링(curling)된 잎 표현형을 야기한다는 것을 나타낸다. (A) 제노타이핑 프라이머 세트 JCW132/JCW133 (표 1)은 야생형에서 971bp 절편을 증폭하고, JCW132 및 LB1(JCW11)은 동형접합성 ucl1-D 돌연변이체에서 613bp 절편을 증폭한다. 이형접합성 ucl1 -D 돌연변이체에서, 상기 두 절편은 동시에 증폭되었다. (B) 평평한 잎을 가지는 30일 된 야생형 식물. (C) 컬링된 잎을 가지는 30일 된 CaMV :: UCL1 형질전환 식물. (D) 평평한 로제트 잎을 가지는 25일 된 야생형 식물. (E) 25일 된 CaMV :: UCL1의 컬링된 로제트 잎. (F) 30일 된 ucl1 -1 돌연변이체 식물. (G) 평평한 잎을 가지는 30일 된 CaMV :: At1g65760 형질전환 식물. (H) 평평한 잎을 가지는 30일 된 CaMV :: At1g65770 형질전환 식물. (I) 컬링된 잎을 가지는 25일 된 CaMV::UCL1 식물. (J) 평평한 잎을 가지는 doubly 반접합성(hemizygous) CaMV::UCL1; CaMV :: UCL1 - RNAi 식물. F1 CaMV :: UCL1 식물의 돌연변이체 표현형은 CaMV :: UCL1 - RNAi 식물을 교배함으로써 회복되었다. 상기 (B) 내지 (J)의 모든 식물은 장일 조건(16시간 광, 8시간 암)에서 생장되었다. 눈금자: 1 ㎜ (D 내지 E), 1 ㎝ (B 내지 C 및 F 내지 J).
도 3은 CLF-타겟 유전자를 활성화시키는 UCL1의 이소성(ectopic) 발현을 나타낸다. (A) 야생형 및 3가지 독립적 CaMV :: UCL1 라인(#9-1, #17-1 및 #44-3)에서 RNA 수준의 실시간 qRT-PCR 분석. (B) 야생형, ucl -D 및 CaMV - UCL1 식물에서 RNA 수준의 실시간 qRT-PCR 분석. 수치(A 및 B)는 TUB 레퍼런스(reference) 유전자의 발현에 대한 상대적인 값으로 계산되었고, 평균±표준편차(2회 측정)로 나타내었다. (C) 볼팅(bolting) 전 CaMV :: UCL1에서 AG -I:: GUS 활성. (D) CaMV :: UCL1 로제트 잎에서 AG-I::GUS 활성. (E) 볼팅(bolting) 후 CaMV :: UCL1 화서에서 AG -I:: GUS 활성. Fs: 꽃 줄기, Pe: 꽃잎. (F) 볼팅(bolting) 전 야생형 식물에서 AG -I:: GUS 활성. (G) 야생형 로제트 잎에서 AG -I:: GUS 활성. (H) 볼팅(bolting) 후 야생형 화서에서 AG -I::GUS 활성. Fs: 꽃 줄기, Pe: 꽃잎.
도 4는 도 3과 관련하여, CaMV :: UCL1 형질전환 식물이 clf 기능 상실 돌연변이와 유사한 꽃 호메오틱 변화 및 조기 개화를 나타낸다는 것을 보여준다. (A) 45일 된 야생형 및 CaMV :: UCL1 동형접합성 식물. (B) 야생형 꽃. (C)컬링된 꽃받침 및 꽃잎을 가지는 CaMV :: UCL1 꽃. (D) 꽃봉오리의 미성숙 개화를 가지는 CaMV::UCL1 화서. (E) 감소된 꽃잎을 가지는 CaMV :: UCL1 꽃. (F) 수술-유사 꽃잎을 가지는 CaMV :: UCL1 꽃. (G) 암술머리-유사 꽃받침을 가지는 CaMV :: UCL1 꽃. (H) 심피-유사 꽃받침을 가지는 CaMV :: UCL1 꽃. (I) 감소된 꽃잎, 수술-유사 꽃잎 및 심피-유사 꽃받침을 가지는 CaMV :: UCL1 꽃. 눈금자: 1 ㎜. (J) 65일 된 야생형 및 CaMV :: UCL1 식물은 12시간 광 및 12시간 암조건하에 생장되었다. (K) 컬링된 잎 및 조기 개화 표현형을 가지는 25일 된 CaMV :: UCL1 식물은 장일 조건(16시간 광 및 8시간 암)하에 생장되었다. (L) 억제된 조기 개화를 나타내는 35일 된 CaMV :: UCL1 ; ft-1/ft-1 식물은 장일 조건에서 생장되었다. 눈금자: 1 ㎝.
도 5는 CLF-타겟 유전자의 히스톤 메틸화 패턴을 변화시키는 UCL1 이소성 발현을 나타낸다. (A) ChIP 분석에 사용된 영역을 나타내는 AG, FT 및 FLC 유전자의 게놈 구조 모식도. 엑손은 사각형으로 나타내었고, 회색 막대기는 증폭된 영역을 나타낸다. (B) 항체 침강 전(Input), 항체 침강 없이(No Ab), 또는 H3K4me2 및 H3K27me3에 대해 특이적인 항체를 이용한 침강 후, DNA의 반정량 PCR 증폭. ACTIN2/7 ( ACT ), PHOSPHOFRUCTOKINASE ( PFK ), 및 TA3 역트랜스포존(retrotransposon) 유래 영역의 대조군 증폭을 나타내었다. (C) 야생형에 비해 ucl1-D 및 CaMV :: UCL1 유묘에서 AG , FLC 및 FT 염색질에서의 H3K27me3의 수준. H3K27me3 항체를 이용한 침강 후 DNA 농도는 실시간 qPCR에 의해 정량되었고 내부 레퍼런스(TUB2)로 표준화되었다. (D) 야생형에 비해 ucl1 -D 및 CaMV :: UCL1 유묘에서 AG , FLC 및 FT 염색질에서의 H3K4me2의 수준. H3K4me2 항체를 이용한 침강 후 DNA 농도는 실시간 qPCR에 의해 정량되었고 내부 레퍼런스(TUB2)로 표준화되었다. 수치(C-D)는 야생형을 1.0로 했을 때 상대적인 값으로 각 DNA에 대해 계산되었고, 평균±표준편차(3회 측정)로 나타내었다.
도 6은 CLF에 결합하는 UCL1을 나타낸다. (A) CLF 및 UCL1의 모식도. 효모 이중 하이브리드 분석에 사용된 부분 구축물에 아미노산의 번호를 나타내었다. (B) 효모 이중 하이브리드 분석법에서 UCL1 및 CLF 사이의 상호작용 시험. SD-LW: 류신 및 트립토판이 없는 합성 최소 SD 배지, SD-LWAH: 류신, 트립토판, 아데닌 및 히스티딘이 없는 합성 최소 SD 배지, lacZ: β-갈락토시다제(β-galactosidase) 효소 활성. (C) CaMV :: UCL1 : GFP 형질전환 식물의 생장이 덜된 유묘의 뿌리 끝에서 GFP 필터 세트를 이용한 공초점 레이저 주사 현미경에 의한 UCL1-GFP 융합 단백질의 세포하 위치 확인. (D) DIC, PI 및 GFP 필터 세트를 이용한 합병된 이미지. 삽입된 이미지는 GFP 및 PI 필터 세트를 이용한 클로즈업 뷰를 나타낸다. (E) 애기장대 세포에서 UCL1 및 CLF의 단백질-단백질 상호작용의 BiFC 분석. CFP와 융합한 공지된 전사 인자인 FES는 공-형질전환 후 핵 마커로서 사용되었다. 눈금자: 20 ㎛(C), 10 ㎛(E).
도 7은 SCF 복합체에 존재하는 UCL1을 나타낸다. (A) ASK1 및 ASK2와 UCL1의 상호작용에 대한 효모 이중 하이브리드 분석. UCL1Δ: 1 내지 43번 아미노산의 결손을 가지며 대부분의 N-말단 F-box 모티프를 포함하지 않음, -LW: 류신 및 트립토판이 없는 합성 최소 SD 배지, -LWU: 류신, 트립토판 및 우라실이 없는 합성 최소 SD 배지. (B) UCL1, CUL1 및 ASK1의 공-면역침강. GFP, UCL1 - HA , CUL1 - HA 및 ASK -GFP를 발현하는 구축물로 형질전환된 원형질체 유래 단백질은 항-GFP 항체를 이용하여 침강 되었거나(Output) 또는 침강되지 않았고(Input), SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동된 다음, 블로팅되어 항-헤마글루티닌(Anti-HA) 또는 항-GFP 항체로 반응시켰다. (C) 30일 된 F1 유묘는 도면에 나타낸 돌연변이체 라인과 CaMV::UCL1을 교배하여 획득하였다.
도 8은 도 7과 관련하여, 쿨린(Cullin)의 RUB E1인 AXR이 ucl1 -D 식물에서의 컬링된 잎 표현형에 대해 필수적이라는 것을 나타낸다. 25일된 F1 유묘는 도면에 나타낸 돌연변이체 라인과 ucl -D을 교배하여 획득되었다.
도 9는 CLF 단백질 수준을 감소시키는 이소성 UCL1 발현을 나타낸다. (A) 35S::GFP:CLF 15일 된 유묘 또는 도면에 나타낸 라인과 35S:: GFP : CLF을 교배하여 제조된 F1 유묘 유래 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동된 다음, 블로팅되어 항-GFP 항체(GFP:CLF)와 반응시켰다. 로딩 대조군인 리불로스-비스포스페이트 카르복실라제(ribulose-bisphosphate carboxylase, RbcS) 단백질은 폰슈(Ponceau)로 염색되었다. (B 내지 D) 뿌리 분화대(differentiation zone)의 DIC 이미지. 뿌리의 유전자형을 나타내었다. (E 내지 G) 뿌리 분화대의 GFP 활성. E 내지 G의 유전자형은 B 내지 D와 동일하다. (H 내지 J) 뿌리 신장대의 DIC 이미지. H 내지 J의 유전자형은 B 내지 D와 동일하다. (K 내지 M) 교배된 F₁ 라인의 뿌리 신장대의 GFP 활성. K 내지 M의 유전자형은 B 내지 D와 동일하다. 눈금자: 20 μm.
도 10은 mea -유사 표현형을 야기하는 배유에서의 CLF의 이소성 발현을 나타낸다. (A 내지 D) 수정 후 성숙 UCL1 :: UCL1 : GUS 배주(ovule) 우측(A), 그리고 자가수분 후 4 (B), 18 (C) 및 36 (D) 시간된 종자에서 GUS 활성. Em: 배아, En: 배유 핵, Pen: 초기 배유 핵, Zy: 접합체. (E) 도면에 나타낸 DAP (days after self-pollination)에서 야생형 및 MEA :: CLF 형질전환 식물의 CLF RNA 수준의 실시간 qRT-PCR 분석. 수치는 2 DAP 야생형에서 CLF 발현을 1.0로 했을 때 상대적인 값으로 계산되었고 평균±표준편차(2회 측정)로 나타내었다. (F) 퇴화된 종자(화살표)와 같은 비정상적 종자 및 작고 하얀 미수정 배주를 포함하는 MEA :: CLF 형질전환 식물. AS: 퇴화된 종자, Ov: 배주. (G) 야생형의 개방 장각과(silique). (H) 야생형 종자. Em: 배아, En: 배유. (I) MEA :: CLF 종자. Em: 배아, En: 배유. (J) 꽃밥 제거 후 4일째의 미수정된 야생형 배주. Cc: 중앙 세포 핵, Ec: 난세포 핵. (K) 꽃밥 제거 후 4일째의 미수정된 MEA :: CLF 배주. 화살표는 증식하는 배유 세포의 핵을 나타낸다. 눈금자는 50 ㎛ (A 내지 D 및 H 내지 K) 및 500 ㎛ (F 내지 G) 이다.
도 11은 도 10과 관련하여, 발달 동안에 UCL1의 발현과 MEA :: CLF 형질전환 식물에서 AGL62 및 MEA의 발현을 나타낸다. (A) 야생형 식물에서 UCL1 RNA 수준의 실시간 qRT-PCR 분석. 수치는 장각과(silique)에서 UCL1의 발현을 1.0로 했을 때 상대적인 값으로 계산되었고, 평균±표준편차(3회 측정)로 나타내었다. (B) UCL1::GUS 꽃 클러스터에서의 GUS 활성. (C) UCL1 :: GUS 꽃에서의 GUS 활성. (D 내지 F) 수분 후 2시간(D), 4시간(E) 및 16시간(F)째인 UCL1 :: GUS 발달 종자에서의 GUS 활성. (G) UCL1 :: UCL1 : GUS 꽃밥 및 화분 알갱이의 발달. Vn: 식물 세포핵(vegetative cell nucleus). 눈금자는 1 ㎜ (B 내지 C), 20 ㎛ (D 내지 F), 및 10 ㎛ (G)이다. (H 내지 I) 야생형 및 MEA :: CLF 발달 종자에서 AGL62 (H) 및 MEA (I) RNA 수준의 실시간 qRT-PCR 분석. (H) 수치는 야생형의 7 DAP에서 AGL62의 발현을 1.0로 했을 때 상대적인 값으로 계산되었고 평균±표준편차(2회 측정)로 나타내었다. (I) 수치는 야생형의 2 DAP에서 MEA의 발현을 1.0로 했을 때 상대적인 값으로 계산되었고 평균±표준편차(2회 측정)로 나타내었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 UCL1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 CLF 단백질의 활성 감소는 잎의 컬링(curling), 종자와 화분의 발달, 화서의 높이 감소, 꽃 기관의 호메오틱 변화, 조기 개화 또는 꽃받침과 꽃잎의 수 감소 등을 야기할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 UCL1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

UCL1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 CLF (curly leaf) 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 UCL1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 CLF 단백질의 활성이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 식물체는 잎의 컬링(curling), 종자와 화분의 발달, 화서의 높이 감소, 꽃 기관의 호메오틱 변화, 조기 개화 또는 꽃받침과 꽃잎의 수 감소 등을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는, 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 UCL1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 식물의 CLF 단백질의 활성을 감소시키기 위한 조성물은 유효 성분으로서 애기장대 유래의 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 CLF 단백질의 활성을 감소시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 UCL1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 UCL1 유전자를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자의 발현을 증가시키면 CLF 단백질의 활성을 감소시킬 수 있으며, 반대로 UCL1 유전자의 발현을 감소시키면 CLF 단백질의 활성을 증가시킬 수 있으므로, UCL1 유전자의 발현의 조절에 따라 CLF 단백질의 활성을 조절할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 절차

식물 재료, 생장 조건, 조직화학적 GUS 염색 및 현미경 검사

애기장대 식물은 Ws 생태형 (Schubert et al., 2006, Embo Journal 25, 4638-4649)인 clf -50 (무효대립유전자)의 35S:: GFP : CLF 및 Nossen (No-0) 생태형 (Sieburth and Meyerowitz, 1997, Plant Cell 9, 355-365)인 pAG -I:: GUS을 제외하고는 Col-0 생태형이었다. ucl1 -D 돌연변이체는 이전에 기재된 바와 같이 활성화-표지 (activation-tagging) 돌연변이체 라이브러리로부터 분리되었다 (Ahn et al., 2007, Plant and Cell Physiology 48, 169-178). 식물 생장, GUS 염색, 조직 고정 및 현미경 검사를 위한 방법은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다 (Yadegari et al., 2000, Plant Cell 12, 2367-2381). GFP 및 YFP 형광을 검출하기 위해, 본 발명자들은 여기(excitation)을 위한 488 nm 레이저 라인(laser line) 및 방출(emission)을 위한 BP 500-530 nm 필터를 사용하였다. 요오드화 프로피디움 (propidium iodide) (PI, 10 ㎍/mL, 분자 프로브)를 검출하기 위해, 본 발명자들은 여기를 위한 543 nm 레이저 라인 및 방출을 위한 LP 560 nm 필터를 사용하였다. CFP 형광을 검출하기 위해, 본 발명자들은 여기를 위한 458 nm 레이저 라인 및 방출을 위한 480-520 nm 필터를 사용하였다.

재조합 플라스미드 구축

CaMV::UCL1, 4X Enh::UCL1, CaMV::UCL1:GFP, CaMV::UCL1-RNAi, UCL1::GUS (β-glucuronidase), UCL1::UCL1:GUS 및 MEA::CLF 구축물을 제조하기 위한 방법은 하기와 같다. UCL1 cDNA 클론은 주형인 야생형 Col-0 cDNA와 JCW494/JCW495, JCW269/JCW271 및 JCW77/JCW78 (표 1) 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR에 의해 획득되었고, 상기 획득된 클론은 제한 효소 및 Gateway? technology를 이용하여 pBI III-L, pMN20, pGWB5 및 pH7GW1WG2(II) 벡터로부터 유래된 CaMV 35S 프로모터에 융합되었다. 상기 제조된 구축물은 CaMV::UCL1, 4X Enh::UCL1, CaMV::UCL1:GFP, 및 CaMV::UCL1-RNAi로 각각 명명되었다. UCL1::GUS 및 UCL1::UCL1:GUS 구축물을 제조하기 위해, UCL1 업스트림 영역(-4,089 내지 -1, 번역 개시부위 기준)을 포함하는 DNA는 야생형 게놈 DNA 주형과 JCW402/JCW386 및 JCW402/JCW387 (표 1) 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭되어, pBI101 벡터의 SalI 및 BamHI 제한효소 자리로 서브클로닝되었다. MEA::CLF 구축물을 제조하기 위해, MEA 업스트림 영역(-3,888 내지 -1, 번역 개시부위 기준)을 포함하는 DNA는 JCW478/JCW479 (표 1) 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭되었고, CLF(AT2G23380) 전장 코딩 영역은 야생형 게놈 DNA 주형과 JCW463/JCW464 (표 1) 프라이머 세트를 이용하여 증폭되어, pBI101 벡터의 SalI 및 BamHI 제한효소 자리로 삽입되었다.

본 발명에 사용된 프라이머 서열.

라벨	올리고 이름	서열
JCW11	LB3	TTGACCATCATACTCATTGCTG (서열번호 2)
JCW22	IK054	ATGTGATATCTAGATCCGAAAC (서열번호 3)
JCW77	At1g65740 attB1	AAAAAGCAGGCTTCAACATGGTAGATTGGTCTACCTTACC (서열번호 4)
JCW78	1g65740attB2w/ostop	AGAAAGCTGGGTCAAGAAAGCTAGGAAAAAACATTTC (서열번호 5)
JCW79	At1g65760 attB1	AAAAAGCAGGCTTCAACATGGTTGATTGCGATTGGTCTAA (서열번호 6)
JCW80	1g65760attB2 w/ostop	AGAAAGCTGGGTCGACAAAGCTAGGATAAAACATTTC (서열번호 7)
JCW132	108964-F	CTGTCTCCGAGATTCAAGAATCT (서열번호 8)
JCW133	108964-R	AATAAATATAGTTCAGCTACATCC (서열번호 9)
JCW170	At1g65770 attB1	AAAAAGCAGGCTTCAACATGGCTGATTGGTCTACCTTACC (서열번호 10)
JCW171	At1g65770 attB2	AGAAAGCTGGGTCGAGAAAGCTAGGAACAAACATTTG (서열번호 11)
JCW269	Sal-65740Pro F	ACGCGTCGACCCATCCCTCACTTGGTTTCCCA (서열번호 12)
JCW271	Sal-65740G wi R-2	ACGCGTCGACTATGAGATCTCTTACTTGCTTGAG (서열번호 13)
JCW336	65740 GenoL	GAATCGGTAGGGATGGAACA (서열번호 14)
JCW337	65740 genoR	TTTTTGGTTTGTCACAGTTTGT (서열번호 15)
JCW386	Bam 40PRO 4K R	CGCGGATCCCATTTTGCTACTTTGATTGTTTGT (서열번호 16)
JCW387	Bam 40PNC 4K R	CGCGGATCCAAGAAAGCTAGGAAAAAACATTTC (서열번호 17)
JCW402	Sal 40PRO 4K F-1	ACGCGTCGACAAGCAGACCGCACTGAGAAT (서열번호 18)
JCW463	gCLF4kF_Bam	CGGGATCCATGGCGTCAGAAGCTTCGCCTT (서열번호 19)
JCW464	gCLF4kRw_Bam	CGGGATCCCTAAGCAAGCTTCTTGGGTCTAC (서열번호 20)
JCW478	pMEA4kR_Sal	GTCGACCATTAACCACTCGCCTCTTCTTT (서열번호 21)
JCW479	pMEA4kF_Sal	GTCGACAATCTAGTGGCAGCCATCGTAAA (서열번호 22)
JCW486	ChIP-AG-D-F	ATTCGACACGCAATTTCCA (서열번호 23)
JCW487	ChIP-AG-D-R	ATCTTGCGCTCAATTCCAAC (서열번호 24)
JCW488	ChIP-AG-E-F	GTTGGAATTGAGCGCAAGAT (서열번호 25)
JCW489	ChIP-AG-E-R	TGAACATTGGGTATTGACCA (서열번호 26)
JCW490	ChIP-FT-I-F	CCAGATGTTCCAAGTCCTAGCAACC (서열번호 27)
JCW491	ChIP-FT-I-R	GGTGTGGGCTTTTTTGGGAGAC (서열번호 28)
JCW492	ChIP-FLC-I-F	GTCATTCACGATTTGTTTGATACGATCTG (서열번호 29)
JCW493	ChIP-FLC-I-R	GATCTCCCGTAAGTGCATTGCA (서열번호 30)
JCW494	Bam_1g65740_F	CGGGATCCATGGTAGATTGGTCTACCTTACCGG (서열번호 31)
JCW495	Xho_1g65740_R	CCCTCAGTCAAAGAAAGCTAGGAAAAAACATTTCG (서열번호 32)
JCW503	40 F Sal	GTCGACATGGTATGGTCTACCTTACC (서열번호 33)
JCW504	40 R stop Bam	GGATCCTCAAAGAAAGCTAGGAAAAAACATTTC (서열번호 34)
JCW507	CLF F Sal	GTCGACATGGCGTCAGAAGCTTCGCCTT (서열번호 35)
JCW508	CLF R stop Bam	GGACTTCAGCAAGCTTCTTGGGTCTACCA (서열번호 36)
JCW81	q-TUB2-L	ATCGATTCCGTTCTCGATGT (서열번호 37)
JCW82	q-TUB2-R	ATCCAGTTCCTCCTCCCAAC (서열번호 38)
JCW85	q-AG-L	TTCCCAAGAAAAATAAAACTTTCC (서열번호 39)
JCW86	q-AG-R	TCTCCTCCTAGCTCCGATTG (서열번호 40)
JCW95	q-FLC-L	GAAGAGAACCAGGTTTTGGCTA (서열번호 41)
JCW96	q-FLC-R	TTTGTCCAGCAGGTGACATC (서열번호 42)
JCW118	q-65740-L	CTCTCACGTGCAGCCTTCTT (서열번호 43)
JCW119	q-65740-R	TGATTATCCAGCCCTTACTCG (서열번호 44)
JCW120	q-65760-L	GCTGTTGGGGAGACTTGAGAT (서열번호 45)
JCW121	q-65760-R	GGCGCTCCACAATATAAAGC (서열번호 46)
JCW122	q-65770-L	GCAAGAAAAACCCTTTCAGGA (서열번호 47)
JCW123	q-65770-R	GAGAGGTTTGTTTGGGTTAGGA (서열번호 48)
JCW388	q-AP3-LP	AAGAATCTCATACATGAGCTGGAA (서열번호 49)
JCW389	q-AP3-RP	TTGGTATCCAAGAACTGAGTCGT (서열번호 50)
JCW390	q-AGL17-LP	CACTGACAAGCTCTATGACTTTGC (서열번호 51)
JCW391	q-AGL17-RP	CCTCCATCTTAGCCGTATTGA (서열번호 52)
JCW396	q-KNAT2-LP	CAGCGTCTGCTACAGCTCTTT (서열번호 53)
JCW397	q-KNAT-RP	TCATCCGCTGCTATGTCATC (서열번호 54)
JCW398	q-SEP3-LP	GAAAGCTGTACGAGTTTTGCAG (서열번호 55)
JCW399	q-SEP3-RP	TTGAAGGCACATTGGGTTCT (서열번호 56)
JCW413	q-AP2-L	TCCCAATTCAAACCACCAAT (서열번호 57)
JCW414	q-AP2-R	CGCCGGAAACAGTGAGAA (서열번호 58)
JCW415	q-SEUSS-L	CGAACAGGACCAATCGAGA (서열번호 59)
JCW416	q-SEUSS-R	GCTGCTGCCTAAGCTGGT (서열번호 60)
JCW417	q-LEUNIG-L	TCTCTCAAGAACCCTAGATTCTTTTT (서열번호 61)
JCW418	q-LEUNIG-R	CAGAACCCTAATTCGATCTTCAG (서열번호 62)
JCW480	q-65740_1 F	TTGTGATGGCTACCGATACTTG (서열번호 63)
JCW481	q-658740_1 R	CGACTTTCTGGTGATACTACTTCC (서열번호 64)
JCW484	q-FT-F	GGTGGAGAAGACCTCAGGAA (서열번호 65)
JCW485	q-FT-R	GGTTGCTAGGACTTGGAACATC (서열번호 66)
JCW517	q-MEA-F	ACATGGGTCTTCACCAAAAGTAG (서열번호 67)
JCW518	q-MEA-R	TTCTAGTGCCTCACCATTCAAA (서열번호 68)
JCW519	q-CLF-F	GTTCGATATCAATGGAAATATGGTT (서열번호 69)
JCW520	q-CLF-R	CTTTGCCTCTCCTACGTAGAAATC (서열번호 70)
JCW576	UCL1 2- F Bam	GGCGGATCCGTGTAGATTGGTCTACCTTACC (서열번호 71)
JCW577	UCL1 44- F Bam	GGCGGATCCGTAAGAATCCTTTCCATAGGCG (서열번호 72)
JCW578	UCL1 R Pst	CAACTGCAGTCAAAGAAAGCTAGGAAAAAAC (서열번호 73)
JCW579	ASK1 GADT7 F Eco	GAATTCTCTGCGAAGAAGATTGTGTTGAA (서열번호 74)
JCW580	ASK1 GADT7 R Pst	CTGCAGCTCATTCAAAAGCCCATTGGTTCT (서열번호 75)
JCW581	ASK2 GADT7 F Eco	GAATTCTCGACGGTGAGAAAAATCACTCT (서열번호 76)
JCW582	ASK2 GADT7 R Pst	CTGCAGCTCATTCAAACGCCCACTGATTCT (서열번호 77)
JCW583	CUL1 GADT7 F Eco	GAATTCGAGCGCAAGACTATTGACTTGG (서열번호 78)
JCW584	CUL1 GADT7 R Pst	CTGCAGCCTAAGCCAAGTACCTAAACATGT (서열번호 79)
JCW585	UCL1 HA_F_Stu	AGGCCTACCATGGTAGATTGGTCTACCTTACC (서열번호 80)
JCW586	UCL1 HA_R w/o_Bam	GGATCCAAGAAAGCTAGGAAAAAACATTTC (서열번호 81)
JCW587	ASK1 GFP_F_Xba	TCTAGAGACCATGGGGATGTCTGCGAAGAAGATTGTGTT (서열번호 82)
JCW588	ASK1 GFP_Rw/oBam	GGATCCTTCAAAAGCCCATTGGTTCTCTC (서열번호 83)
JCW589	CUL1 HA_F_Stu	AGGCCTACCATGGAGCGCAAGACTATTGACTT (서열번호 84)
JCW590	CUL1 HA _Rw/o_Bam	GGATCCAGCCAAGTACCTAAACATGTTAG (서열번호 85)

마이크로어레이 분석

총 RNA는 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 사용하여 분리되었다. 프로브 합성, 검출, 및 스캐닝은 아피메트릭스 (Affymetrix, Inc)의 프로토콜에 따라 수행되었다. 절편화된 cRNA는 애기장대 게놈 ATH1 어레이로 45℃에서 16시간 동안 혼성화되었고, 스트렙트아비딘-피코에리트린 (streptavidin-phycoerythrin) 복합체를 이용하여 염색되었다. 염색 후, 강도는 GCOS Affymetrix 소프트웨어를 사용하여 유전자칩 스캐너 3000으로 결정되었다. 발현에서 현저한 변화를 나타내는 유전자는 t 검정 (one-way ANOVA Welch t test, P = 0.05)을 적용하여 선택되었다. 2배로 변화한 컷오프 (cutoff) 수치는 유전자의 발현을 구별하기 위해 이용되었다.

정량적 실시간 RT - PCR

총 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출되었다. RNase free DNase kit (Qiagen)를 이용한 DNase-I 처리 후, 각 샘플의 총 RNA 2 ㎍은 올리고 dT 프라이머 (18mer) 및 RevertAid^TM first strand cDNA synthesis kit (Fermentas)를 사용하여 cDNA로 전환되었다. RNA 수준은 실시간 RT-qPCR (Bio-Rad, iQ5)에 의해 정량되었고, 데이타는 iCycle iQ system software (Bio-Rad)로 분석되었다. 실시간 PCR을 위한 프라이머 서열은 애기장대에 대한 유니버셜 프로브 라이브러리 (https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/acenter.jsp)에 따라 고안되었고, 표 1에 나타내었다. 주형은 3배수로 실시되었고, iQ™ five Optical System Software (Bio-Rad)는 형광이 백그라운드 이상으로 현저하게 증가한 시점인 주기 역치(Ct)를 결정하기 위해 사용되었다. β2 튜불린으로 표준화된 유전자 특이적 전사체는 ΔΔCt 방법(관심 유전자의 주기 역치 - β2 튜불린의 주기 역치)으로 정량되었다. 실시간 SYBR-그린 해리 곡선은 각 프라이머 결합에 대한 한가지 종의 앰플리콘(amplicon)을 나타내었다.

염색질 면역 침강법 ( ChIP )

ChIP는 하기와 같이 이전에 기재된 방법을 수정하여 수행되었다 (Saleh et al., 2008, Nature Protocols 3, 1018-1025). DNA-단백질 교차-연결 염색질은 MS 배지를 포함하는 페트리디쉬에서 생장한 유묘 4 ㎍으로부터 분리되었다. 100 ㎍의 각 염색질 샘플은 핵 용균 완충액(50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 0.1% 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 1% Triton X-100, 1 X protease inhibitor cocktail)으로 10배 희석되었고, 항체(anti di-methyl H3K4 또는 anti tri-methyl H3K27; Upstate) 5 ㎕를 이용하여 4℃에서 5시간 동안 인큐베이션시킨 후, protein A-agarose/Salmon sperm DNA (Upstate) 75 ㎕를 이용하여 2시간 동안 일정한 회전속도로 인큐베이션하였다. PCR 반응에 사용된 유전자 특이적 프라이머 세트는 ucl1 -D 및 35S:: UCL1 돌연변이체 백그라운드에서 AG (Schubert et al., 2006, Embo Journal 25, 4638-4649), FT, 및 FLC 뉴클레오좀 (Jiang et al., 2008, PLoS One 3)의 히스톤 메틸화 프로파일을 검출하기 위해, AG -D는 JCW486/JCW487, AG -E는 JCW488/JCW489, FT -I JCW490/JCW491, 그리고 FLC -I는 JCW492/JCW493이었다(표 1). 면역침강된 DNA는 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finzyme)를 이용한 PCR 및 iQ SYBR green Supermix를 이용한 정량적 실시간 PCR (Bio-Rad,iQ5)에 의해 분석되었다.

이분자 형광 상보성 ( BiFC ) 분석법

전장 UCL1 및 CLF는 유전자-특이 프라이머 세트인 JCW503/JCW504 및 JCW507/JCW508 (표 1)을 이용하여 증폭되었고, CaMV - nEYFP - CLF 및 CaMV - cEYFP - UCL1 의 구축물을 제조하기 위해 식물 발현 벡터인 pSAT4 - nEYFP - C1 (E3801) 및 pSAT4 - cEYFP - C1 -B (E3802)로 클로닝 되었다. 상기 구축물은 이전에 기재된 바와 같이 PEG 트랜스펙션에 의해 애기장대 원형질체내로 쌍으로 도입되었다 (Yoo et al., 2007, Nature Protocols 2, 1565-1572). 16 내지 24시간의 일시적인 발현 후, 단백질/단백질 상호작용은 공초점 현미경에 의해 결정되었다. CFP 리포터와 융합된 FES 전사인자는 공-트랜스펙션 후, 핵 마커로서 사용되었다.

효모 이중- 하이브리드 ( Two - Hybrid ) 분석법

UCL1 1^st (2-261), UCL1 2^nd (201-371), CLF 1^st (2-300), CLF 2^nd (241-700) 및 CLF 3^rd (601-902)을 암호화하는 UCL1 및 CLF cDNA 절편은 특이적 프라이머 세트인 JCW375/JCW376, JCW377/JCW378, JCW379/JCW380, JCW381/JCW382 및 JCW383/JCW384을 각각 이용한 PCR 증폭에 의해 획득되었다. UCL1 , UCL1 Δ, ASK1 , ASK2 및 CUL1 cDNA는 프라이머 세트인 JCW576 내지 JCW584 (표 1)를 사용한 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 서열은 Matchmaker^TM Two-Hybrid system (Clontech Laboratories)에서 pGBKT7 베이트(bait) 벡터 그리고, pGADT7 또는 pGAD424 프레이(prey) 벡터내로 서브클로닝되었다. 분석 조건은 제조자에 의해 기재된 바와 같다.

공- 면역침강법

UCL1 , ASK1 및 CUL1 cDNA는 쌍을 이룬 프라이머 세트인 JCW585 내지 JCW590 (표 1)을 각각 이용한 RT-PCR 증폭에 의해 생성되었고, HA 또는 GFP 표지 식물 발현 벡터인 CsVMV999 :: HA3 및 CsV - GFP - 999내로 각각 삽입되었다. UCL1 - HA , CUL1 - HA , ASK1 - GFP 및 GFP (음성 대조군)는 이전에 기재된 바와 같이 PEG 트랜스펙션에 의해 애기장대 원형질체내로 도입되었다 (Yoo et al., 2007, Nature Protocols 2, 1565-1572). 생장 챔버에서 밤새 인큐베이션 후 세포는 수확되었고, 500 ㎕의 1×IP 완충액 (50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 1% Triton X-100 및 protease inhibition cocktail (Roche))에서 초음파처리되었다. 원심분리 후, 50 ㎕의 상등액은 입력을 위해 제거되었고, 450 ㎕ 상등액은 2 ㎕의 polyclonal rabbit anti-GFP antibody (Invitrogen)를 포함하는 총 부피 900 ㎕에서 3시간 동안 인큐베이션되었고 그 후, protein A Sepharose beads (GE Healthcare)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 상기 펠렛 분획은 Triton X-100을 포함하지 않는 IP 완충액으로 6번 세척되었다. 상기 단백질 추출물 및 면역침강된 샘플은 10% SDS-PAGE 겔에서 분리되어 PVDF 막으로 이동되었고, 단클론 마우스 항-GFP (Clontech) 및 단클론 래트 항-HA (Roche) 항체를 이용하여 검출되었다.

실시예 1: 열성 PcG 돌연변이를 표현형모사하는 우성 돌연변이의 분리

CLF (CURLY LEAF) SET-도메인 PcG 단백질 유전자에서 열성, 기능 상실 돌연변이는 잎의 컬링 (curling)을 야기한다 (Goodrich et al., 1997, Nature 386, 44-51). 활성화-표지는 강력한 CaMV 인핸서 (enhancer)와 함께 삽입된 DNA 인자(T-DNA)와 인접한 유전자의 증가 및/또는 이소성 발현에 기인하는 우성, 기능 획득 돌연변이를 생성한다 (Weigel et al., 2000, Plant Physiol 122, 1003-1013). 상기 방법을 사용하여, 본 발명자들은 clf 돌연변이를 표현형모사하는 ucl1 -D (upward curly leaf1 - dominant) 돌연변이를 제조하여 확인하였다. 동형접합성 ucl1 -D 식물은 심하게 컬링된 잎을 나타내었고, 이형접합성 식물은 중간 정도로 컬링된 잎을 나타내었는데, 이는 상기 돌연변이가 반-우성이라는 것을 제안한다 (도 1A 내지 1C 및 도 2A). 자가-수분된 이형접합성 식물은 심한 컬링 잎, 중간 정도의 컬링 잎 및 정상 잎을 가지는 F1 식물의 분리비가 1:2:1로 나타내는데 (68:128:71, χ2 = 0.52, P > 0.77), 이는 단 하나의, 반-우성 유전자좌가 상기 돌연변이체 표현형을 부여한다는 것을 제안한다.

실시예 2: F- box 단백질 유전자인 At1g65740 의 과발현을 야기하는 ucl1 -D 돌연변이

플라스미드 회수법 (Weigel et al., 2000, Plant Physiol 122, 1003-1013)은 T-DNA가 At1g65740 및 At1g65750 사이의 인터제닉 (intergenic) 영역에 삽입되었다는 것을 나타내었다 (도 1D). 실시간 qRT-PCR은 At1g65740, 그리고 2개의 다운스트림 유전자 At1g65760 및 At1g65770의 발현이 상기 ucl1 -D 동형접합성 식물에서 증가한 것을 나타내었다 (도 1E). 상기 ucl1 -D의 컬링된 잎 표현형을 야기하는 유전자를 결정하기 위해, 각 유전자는 CaMV 35S 프로모터를 사용하여 형질전환 식물에서 각각 과발현되었다. 본 발명자들은 At1g65740의 과발현이 상기 ucl1 -D 돌연변이체를 효과적으로 표현형모사하는 반면(도 1F 및 1G, 도 2C 및 2I), At1g65760 및 At1g65770의 과발현은 거의 효과가 없다는 것을 발견하였다(도 2G 및 2H). 상기 결과는 F-box 단백질을 암호화하는 At1g65740의 과발현이 컬링된 잎 표현형을 야기한다는 것을 나타낸다. 상기 결과 이후로, 본 발명자들은 At1g65740 유전자를 UCL1 (UPWARD CURLY LEAF1)으로 명명하였다.

실시예 3: 다면발현성(Pleiotropic ) 기능 상실 clf 돌연변이를 표현형모사하는 UCL1 과발현

본 발명자들은 애기장대 생활사를 통해 clf 및 CaMV :: UCL1 표현형을 비교하였다. 동형접합성 clf 돌연변이체 식물은 컬링된 잎, AG의 이소성 발현에 기인하는 꽃 호메오틱 변화, 화서(inflorescence)의 높이 감소 (Goodrich et al., 1997, Nature 386, 44-51), 및 FT의 탈억제(derepression)에 기인하는 감소된 일장(day-length) 조건하에 조기 개화 (Jiang et al., 2008, PLoS One 3)를 나타내었다. 마찬가지로, 동형접합성 CaMV :: UCL1 식물은 컬링된 잎-유사 기관, 꽃받침 및 꽃잎(도 4B 및 4C)뿐만 아니라 컬링된 로제트 잎(도 2D 및 2E)을 나타내었다. CaMV :: UCL1 식물은 조기 개화하였고(도 4J), 종자는 거의 생산하지 않았으며, 수술-유사(stamen-like) 특징을 가지는 꽃잎(도 4F 및 4I) 및 스티그마성 파필라(stigmatic papilla)를 가지는 배주-포함(ovule-bearing) 꽃받침(도 4G 내지 4I)과 같은 꽃 기관의 호메오틱 변화를 나타내었다. clf 돌연변이체와 같이, UCL1을 과발현하는 식물의 줄기 절간(stem internode)은 야생형보다 짧았고, 이는 화서의 높이를 감소시켰다(도 4A). 또한, 본 발명자들은 꽃봉오리의 조기 개화(도 4D) 및 꽃받침과 꽃잎의 수 감소(도 4D 내지 4I)를 포함하는 추가적인 발달 이상을 관찰하였다. 따라서, clf 및 CaMV :: UCL1은 유사한 표현형을 나타낸다. clf 식물은 이소성으로 발현된 꽃 프로모터 FT가 이소성으로 발현된 꽃 억제인자(repressor)인 FLC (FLOWERING LOCUS C)에 대해 상위성(epistatic)이기 때문에 조기 개화한다 (Searle et al., 2006, Genes Dev 20, 898-912). 본 발명자들은 CaMV :: UCL1 ; ft -1/ ft -1 식물을 제조하였고, CaMV :: UCL1 식물에서 조기 개화 표현형이 ft -1 돌연변이에 의해 억제되었다는 것을 발견하였다(도 4K 및 4L). 상기 결과는 clf 식물에서와 같은 CaMV::UCL1 식물에서의 조기 개화가 FT를 필요로 한다는 것을 나타낸다.

실시예 4: UCL1 과발현에 의한 CLF - 타겟 유전자의 발현 활성화

다른 PRC2 구성요소인 EMF2 및 FIE를 포함하는 CLF 단백질은 AG , STM (SHOOT MERISTEMLESS), FLC 및 FT 을 포함하는 다운스트림 타겟 유전자를 억제한다 (Katz et al., 2004, Plant Journal 37, 707-719). UCL1 과발현이 CLF-타겟 유전자에 영향을 주는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 발아 후 10일 된 CaMV :: UCL1 및 야생형 유묘에서 RNA 발현 프로파일을 비교하였다. 현저한 발현 변화를 나타내는 유전자 리스트는 아피메트릭스(Affymetrix) 마이크로어레이에 대한 RNA 혼성화의 분석에 의해 만들어졌다 (표 2). UCL1 및 AG 발현은 2개의 독립적 CaMV::UCL1 형질전환 라인에서 각각 약 400 및 500배 증가하였다. 개화 시간 조절자(regulator)인 FT 및 FLC뿐만 아니라 AGL 유전자가 상향조절되었다. 본 발명자들은 선택된 CLF-타겟 유전자의 이소성 발현을 실시간 qRT-PCR 실험에 의해 확인하였다 (도 3A). 다른 알려진 CLF-타겟 유전자인 AP3 (APETALATA3), AGL17, FT, KNAT2 (KNOTTED - LIKE FROM ARABIDOPSIS THALIANA 2), MEA 및 SEP3 (SEPALLATA3)는 ucl1-D 및 CaMV :: UCL1 식물의 로제트 잎에서 과발현되었다. 대조적으로, 비 CLF-타겟 유전자인 SEU (SEUSS), LEU (LEUNIG), AP2 (APETALATA2) 및 CLF의 발현은 UCL1 과발현에 의해 현저하게 변화되지 않았다 (도 3B). 상기 결과는 CLF-타겟 유전자가 UCL1를 과발현하는 식물에서 특이적으로 상향조절된다는 것을 제안한다.

도 3과 관련된, 발아 후 10일째 CaMV :: UCL1 유묘의 마이크로어레이 데이타.

이름	기호	배수 변화 ox #44-3	배수 변화 ox #17-1
F-box family protein	AT1G65740	449.93	391.04
AGAMOUS	AG	481.93	552.83
AGAMOUS-LIKE 1 / SHATTERPROOF 1	AGL1 / SHP1	19.35	23.26
AGAMOUS-LIKE 2 / SEPALLATA 1	SEP1 / AGL2	6.01	-
AGAMOUS-LIKE 4 / SEPALLATA 2	SEP2 / AGL4	6.07	4.79
AGAMOUS-LIKE 5	AGL5/SHP2	12.96	15.04
AGAMOUS-LIKE 8 / FRUITFULL	AGL8/FUL	3.82	3.51
AGAMOUS-LIKE 9 / SEPALLATA 3	SEP3 / AGL9	32.73	27.27
AGAMOUS-LIKE 17	AGL17	4.90	3.54
AGAMOUS-LIKE 19	AGL19	7.34	7.98
AGAMOUS-LIKE 24	AGL24	2.18	2.16
AGAMOUS-LIKE 31 / MADS AFFECTING FLOWERING2	AGL31 / MAF2	0.28	-
AGAMOUS-LIKE 42	AGL42	3.74	3.31
APETALA3	AP3	2.20	-
FLOWERING LOCUS C	FLC / AGL25 / FLF	13.48	14.21
FLOWERING LOCUS T	FT	4.47	7.63
KNOTTED-LIKE 1 / BREVIPEDICELLUS	KNAT1 / BP	-	2.38
KNOTTED-LIKE 2	KNAT2	-	2.36
SHOOT MERISTEMLESS / BUMBERSHOOT	STM / BUM	-	2.15
MADS AFFECTING FLOWERING 4	MAF4	2.69	2.24
MADS AFFECTING FLOWERING 5	MAF5	3.89	3.75
EARLY FLOWERING 4	ELF4	2.59	2.13
EMBRYONIC FLOWER 1	EMF1	4.80	5.16
FLOWERING PROMOTING FACTOR 1	FPF1	2.97	2.03

본 발명자들은 GUS 리포터 유전자에 융합된 AG 첫번째 및 두번째 인트론을 포함하는 AG 프로모터로 구성된 pAG -I:: GUS 유전자를 CaMV :: UCL1 유전학적 백그라운드내로 도입하였다. 상기 AG 1^st 인트론은 AG 전사의 조절에 중요하다 (Sieburth and Meyerowitz, 1997, Plant Cell 9, 355-365). pAG -I:: GUS; CaMV :: UCL1 식물에서, 본 발명자들은 대조군 pAG -I:: GUS 식물에 비해 어린 로제트 잎, 꽃줄기 및 꽃잎에서 이소성 GUS 발현을 검출하였다 (도 3C 내지 3H). 상기 결과는 기능 상실 clf 돌연변이와 유사한 UCL1 과발현이 AG 전사를 상향조절한다는 것을 나타낸다 (Chanvivattana et al., 2004, Development 131, 5263-5276).

실시예 5: CLF - 타겟 유전자에서 H3K27 및 H3K4 메틸화 프로파일을 변화시키는 UCL1 과발현

H3K27me3 침묵 마크는 clf 돌연변이체 식물의 CLF-타겟 유전자에서 감소되었다(Schubert et al., 2006, Embo Journal 25, 4638-4649). 따라서, 본 발명자들은 CaMV::UCL1 형질전환 식물의 CLF-타겟 유전자(AG, FLC 및 FT)에서 H3K27 메틸화 프로파일을 조사하였다. 본 발명자들은 CLF에 의해 메틸화되는, AG 인트론 D 및 E 영역의 H3K27 부위에 초점을 맞추었다(도 5A) (Schubert et al., 2006, Embo Journal 25, 4638-4649). 발아 후 14일 된 야생형, ucl -D 및 CaMV :: UCL1 유묘를 이용한 염색질 면역침강(ChIP) 실험에 이어서 실시간 qPCR 또는 반-정량 PCR이 수행되었고, 이는 H3K27me3 수준이 UCL1 과발현 식물의 AG-D 및 AG-E 영역에서 야생형에 비해 현저하게 감소되었다는 것을 나타내었다(도 5B 및 5C). 또한, 감소된 H3K27me3 수준은 FLC 및 FT 유전자좌의 특이적 부위에서 검출되었다(도 5A 및 5C). 따라서, clf 돌연변이 및 UCL1 과발현은 CLF-타겟 유전자에서 H3K27me3을 감소시킨다. clf 돌연변이는 H3K4 이중메틸화 (H3K4me2)를 증가시키는데, 이는 CLF-타겟 유전자에서 전사의 활성화와 연관이 있다(Schubert et al., 2006, Embo Journal 25, 4638-4649). 본 발명자들은 UCL1을 과발현하는 유묘의 AG 및 FT 에서 H3K4me2의 증가를 검출하였다(도 5B 및 5D). 상기 결과는 clf 돌연변이체 및 UCL1 과발현 식물이 CLF-타겟 유전자의 히스톤 메틸화에서 유사한 변화를 나타낸다는 것을 보여준다.

실시예 6: CLF 과 결합하는 UCL1

E3 유비퀴틴-리가제 복합체의 서브유닛으로서 기능을 하는 F-box 단백질은 특이적 타겟 단백질과 결합하고, 프로테아좀에서 타겟 단백질의 분해를 야기하는 유비퀴틴의 이동을 매개한다 (Santner and Estelle, 2010, Plant J 61, 1029-1040). 본 발명자들은 UCL1 F-box 단백질이 CLF과 결합하는지를 결정하기 위해 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용하였다. 본 발명자들은 효모 GAL4 활성화 도메인에 융합된 CLF 부분, 및 효모 GAL4 DNA 결합 도메인에 융합된 UCL1 부분을 포함하는 구축물을 제조하였다(도 6A). CLF 아미노산 1번 내지 300번은 UCL1 아미노산 201번 내지 371번과 상호작용하고, 리포터 GAL4 및 lacZ 유전자 발현을 활성화시켰다(도 6B). 따라서, CLF 및 UCL1 단백질내의 도메인은 효모에서 상호작용한다.

CLF과 유사하게 UCL1이 핵 단백질인지를 결정하기 위해 (Baumbusch et al., 2001, Nucleic Acids Research 29, 4319-4333), 본 발명자들은 CaMV 프로모터의 조절하에 GFP (GREEN FLUORESCENT PROTEIN) 리포터에 융합된 UCL1 코딩 영역을 발현하는 형질전환 식물을 제조하였다. 형질전환 CaMV :: UCL1 : GFP 식물은 뿌리 세포의 핵에서 GFP 활성을 나타내었다 (도 6C 및 6D).

UCL1이 핵에서 CLF와 공-위치하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 CLF (CaMV::nEYFP:CLF)에 융합된 YFP 리포터의 N-말단 부분 및 UCL1 (CaMV::cEYFP:UCL1)에 융합된 YFP의 C-말단 부분을 발현시키기 위한 CaMV 프로모터를 이용하여 이분자 형광 상보성 (BiFC) 분석 실험을 수행하였다 (Kerppola, 2006, Nature Protocols 1, 1278-1286). 공-형질전환 및 16 내지 24시간의 일시적인 발현 후, 단백질-단백질 상호작용이 공초점 현미경 검사에 의해 결정되었다 (도 6E). 본 발명자들은 CaMV :: nEYFP : CLF 및 CaMV :: cEYFP : UCL1이 애기장대 원형질체내로 공-형질전환되었을 때, 핵에서 강한 복원된 YFP 신호를 검출하였다. 대조적으로, YFP 신호가 UCL1이 결핍된 음성 대조군 실험에서는 검출되지 않았다. 양성 대조군처럼, 본 발명자들은 또한 CFP와 융합된 전사 인자, FES (FRIGIDA - ESSENTIAL 1)를 공-형질전환시켰는데, 이는 모든 핵에서 강한 CFP 신호를 야기하였다. 상기 결과는 UCL1이 핵에서 CLF와 공-위치한다는 것을 나타낸다.

실시예 7: SCF 복합체에서 단백질과 결합하는 UCL1

UCL1 아미노산 서열은 UCL1이 F-box 단백질이라는 것을 추정한다. UCL1의 기능을 시험하기 위해, 본 발명자들은 상기 UCL1이 타겟 유전자의 분해를 위해 SCF E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 다른 폴리펩티드와 결합할 수 있는지를 결정하였다 (Dharmasiri and Estelle, 2002, Plant Mol Biol 49, 401-409). 효모 이중-하이브리드 분석은 UCL1이 비록 더 약한 결합 활성을 가진다 할지라도, 애기장대 SKP1 동족체인 ASK1 및 ASK2와 상호작용한다는 것을 나타내었다. 대부분의 F-box 모티프(motif)가 제거되었을 때, 상기 UCL1은 ASK1과 상호작용하지 않았는데, 이는 UCL1의 F-box 모티프가 ASK1-결합 활성에 필수적이라는 것을 나타낸다. UCL1은 CUL1과 직접적으로 상호작용하지 않았는데, 이는 아마도 SCF 복합체를 형성하기 위해 CUL1 골격 단백질에 결합하는 UCL1 F-box 단백질을 매개하는 데 ASK1을 필요로 한다는 것을 나타낸다(도 7A).

상기 UCL1이 생체내에서 SCF 복합체의 일부분인지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 헤마글루티닌(hemagglutinin)으로 UCL1 및 CUL1을 표지하였고 (UCL1-HA 및 CUL1-HA), GFP로 ASK1을 표지하였다 (ASK1-GFP). 본 발명자들은 애기장대 원형질체내로 ASK1-GFP, UCL1-HA 및 CUL1-HA를 발현하는 구축물을 도입하였다. 항-GFP 항체는 SCF 복합체를 면역침강시키기 위해 사용되었고, 항-HA 항체는 풀-다운된(pulled-down) 복합체에서 UCL1 및 CUL1의 존재를 검출하기 위해 사용되었다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, UCL1-HA 및 CUL1-HA는 ASK1이 공-발현되면 단백질 복합체를 형성한다. 음성 대조군과 같이, 본 발명자들은 원형질체에서 GFP를 발현시켰고, SCF 복합체의 구성요소 중 풀다운된 것은 없었다(도 7B). 상기 결과는 UCL1이 SCF 복합체의 구성요소라는 것을 나타낸다.

실시예 8: 쿨린 ( Cullin )의 RUB E1 인 AXR1 을 필요로 하는 UCL1 과발현 표현형

쿨린-기반의 E3 유비퀴틴 리가제 복합체는 상기 복합체의 쿨린 서브유닛에 작은 유비퀴틴-유사 단백질인 RUB (RLATED TO UBIQUITIN)의 부착 또는 제거에 의해 조절된다 (Hotton and Callis, 2008, Annu Rev Plant Biol 59, 467-489). AXR1/ECR1 (AUXIN RESISTANT1/E1 C-TERMINAL RELATED1) 헤테로다이머(heterodimer)는 애기장대에서 RUB E1 효소로서 역할을 하고, 쿨린의 RUB 컨주게이션을 위해 요구된다 (del Pozo et al., 2002, Plant Cell 14, 421-433). RUB에 의해 변형된 쿨린-기반의 SCF 복합체에서 상기 UCL1 F-box가 타겟 기질과 결합하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 CaMV :: UCL1 식물 및 ucl1 -D 식물을 열성 axr1 돌연변이체 라인과 교배시켰다. 흥미롭게도, 컬링된 잎 및 조기 개화 표현형은 CaMV :: UCL1 (도 7C) 또는 ucl1 -D (도 8)에 대해 반접합성(hemizygous)이고, axr1에 대해 이형접합성인 F1 식물에서 억제되었는데, 이는 상기 UCL1 과발현 표현형이 용량-의존적인 방식으로 기능적 AXR1을 필요로 한다는 것을 나타낸다. 종합해보면, 상기 결과는 UCL1 F-box가 RUB를 포함하는 SCF 복합체를 형성한다는 것을 나타낸다.

상기 AXR1 단백질은 옥신(auxin) 호르몬 신호 전달 경로와 관련이 있다. 옥신이 UCL1 과발현 표현형의 억제에서 역할을 하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 CaMV :: UCL1 식물 또는 ucl1 -D 식물을 옥신 호르몬의 합성, 수송 및 신호전달에 필요한 유전자 (yucca , aux1 -7, pin1 -1 및 tir1)의 돌연변이와 교배하였다 (Tromas and Perrot-Rechenmann, 2010, CR Biologies 333, 297-306). 상기 돌연변이체는 UCL1 과발현 표현형을 억제하지 않았는데(도 7C 및 도 8), 이는 옥신 호르몬의 합성 및 수송이 UCL1의 기능과 관련이 없다는 것을 나타낸다.

실시예 9: CLF 단백질 수준을 감소시키는 UCL1 과발현

F-box 단백질은 후에 프로테아좀에서 분해되는 타겟 단백질과 결합한다 (Santner and Estelle, 2010, Plant J 61, 1029-1040). UCL1의 과발현이 CLF 단백질의 수준을 감소시키는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 GFP 항체로 검출될 수 있는 GFP:CLF 융합 단백질을 발현하는 35S:: GFP : CLF 라인을 사용하였다 (Schubert et al., 2006, Embo Journal 25, 4638-4649). 단백질 블롯 실험에서, 본 발명자들은 대조군 동형접합성 35S:: GFP : CLF 유묘와 35S:: GFP : CLF를 야생형 식물에 교배하여 만들어진 F1 유묘에서 강한 신호를 검출하였다. 대조적으로, GFP:CLF 융합 단백질의 수준은 35S:: GFP : CLF을 CaMV :: UCL1 식물에 교배하여 만들어진 F1 유묘에서 현저하게 감소되었다(도 9A). 본 발명자들은 뿌리 조직에서 생체내 GFP 활성을 측정함으로써 GFP:CLF 단백질 수준을 또한 측정하였다. 대조군 동형접합성 35S::GFP:CLF 식물은 뿌리끝(도 9B 및 9E) 및 뿌리 신장대(elongation zone) (도 9H 및 9K)에서 강한 GFP 활성을 나타내었다. GFP 활성의 작은 감소는 35S:: GFP : CLF을 야생형에 교배하여 만들어진 F1 식물 유래의 뿌리끝(도 9C 및 9F) 및 뿌리 신장대(도 9I 및 9L)에서 검출되었다. 대조적으로, 본 발명자들은 35S:: GFP : CLF을 CaMV::UCL1에 교배하여 만들어진 F1 식물 유래의 뿌리끝(도 9D 및 9G) 및 뿌리 신장대(도 9J 및 9M)에서 GFP 활성의 현저한 감소를 검출하였다. 상기 결과는 UCL1 과발현이 식물내(in planta) GFP:CLF 단백질의 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 10: 배유 및 화분 발달 동안에 발현되는 UCL1

qRT-PCR 실험은 꽃, 특히 발달중인 종자를 포함하는 장각과(silique), 그리고 웅성 생식기인 수술에서 현저한 UCL1 발현을 나타내었다. UCL1 RNA의 매우 낮은 수준은 식물 조직, 잎 및 뿌리에서 검출되었다(도 11A).

본 발명자들은 GUS 활성이 세포질에 있는 것으로 추정되는 곳에서는 UCL1 프로모터에 GUS 리포터를 융합(UCL1 :: GUS)함으로써 UCL1 프로모터 활성을 측정하였고, GUS 활성이 핵에 타겟팅되는 곳에서는 번역 융합 유전자 (UCL1 :: UCL : GUS)를 제조함으로써 UCL1 프로모터 활성을 측정하였다. 세포질의 GUS 활성은 종자, 특히 초기 배유(도 11D 내지 11F)에서 검출되었다. 핵 GUS 활성은 초기 배유 핵에서 수정 후 바로, 그리고 증식한 배유 핵에서 검출되었다(도 10A 내지 10D). 본 발명자들은 접합체(zygote), 배(embryo), 또는 자성 배우체(gametophyte) (데이타 미제시)에서 GUS 활성을 검출하지 못했다(도 10A 내지 10D). 세포질의 GUS 활성은 어린 수술에서 검출되었고(도 11B 및 11C) 핵 GUS 활성은 화분 알갱이의 식물 핵에서 관찰되었지만(도 11G), 정자(sperm) 또는 생식 세포 핵에서는 관찰되지 않았다(데이타 미제시).

실시예 11: 종자 발달에서 UCL1 의 기능

야생형 식물 발달에서 UCL1의 기능을 이해하기 위해, 본 발명자들은 상기 UCL1 유전자에 T-DNA를 삽입하여 야기된 ucl1 기능 상실 돌연변이의 표현형을 조사하였다. 발달 이상은 동형접합성 ucl1 -1 종자에서 검출되지 않았다(도 2F). 또한 본 발명자들은 UCL1에 상보적인 RNAi를 이소성으로 발현하는 형질전환 식물 (CaMV::UCL1-RNAi)에서 임의의 돌연변이체 표현형을 검출하지 못했다(데이타 미제시). 본 발명자들은 CaMV :: UCL1 식물을 CaMV :: UCL1 - RNAi 식물과 교배하였고, 컬링된 잎 및 조기 개화 표현형이 F1 식물에서 억제되었다는 것을 발견하였는데(도 2I 및 2J), 이는 CaMV : UCL1 - RNAi 구축물이 CaMV :: UCL1 형질전환유전자의 발현을 감소시켰다는 것을 나타낸다.

UCL1 기능에 대한 정보를 얻기 위해, 본 발명자들은 UCL1이 발현되는 식물의 영역인 배유에서 UCL1의 타겟인 CLF의 과발현 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 배유-특이적 MEA 프로모터의 대조군하에 CLF를 발현하는 형질전환 식물 (MEA :: CLF)을 제조하였다. 실시간 qRT-PCR은 야생형에 비해 형질전환 MEA :: CLF 식물의 종자에서 높은 수준의 CLF 발현을 나타내었다(도 10E). 흥미롭게도, 본 발명자들은 야생형 종자에서 검출되지 않은, 퇴화된 종자, 과도한 배유 세포 증식, 미수정 중심 세포의 증식 및 종자-유사 구조 형성을 포함하는 기능 상실 mea 돌연변이와 연관된 표현형을 검출하였다(도 10F 내지 10K) (Kiyosue et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96, 4186-4191). 또한 본 발명자들은 mea 돌연변이 및 대조군 배유의 세포화 (cellularization)와 관련이 있는 전사 인자인 AGL62의 이소성 발현을 검출하였다(도 11H). 대조군 실험은 MEA :: CLF 형질전환유전자가 종자에서 MEA 유전자 발현에 영향을 주지 않았다는 것을 나타내었다(도 11I). 상기 결과는 배유에서 CLF의 이소성 발현이 종자 발달에 유해하며, 밀접한 관련이 있는 MEA PcG 단백질의 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> UCL1 gene from Arabidopsis thaliana and uses thereof <130> PN10187 <160> 85 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1116 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggtagatt ggtctacctt accggaggag ctcctccatt ttatcgccgc ccgatcgttc 60 tccctagttg aatacaagcg tttcagcagc atctgtgtat catggcactc ctctgtctcc 120 ggcgtgaaga agaatccttt ccataggcgc cctctcattg acttcaaccc catcgcccca 180 agtgagaccc ttctagagga ccatgtcttc agctgcaacc ccggcgcgtt cctctcacgt 240 gcagccttct tccgagtcac tctctcctcc tctccgagta agggctggat aatcaaatcc 300 gacatggaca ccaactccgg gagattccat ctcctcaacc ctctctcacg ttttccattg 360 cgtatttctt ccgagagcct tgatcttttg gatttcactg tctccgagat tcaagaatct 420 tatgcggttc ttaaggacgc caagggaaga ctaccgaatc caggatacca aagaagtgct 480 cttgtcaaag tgaaggaagg agatgatcat catcatggaa ttctcggaat cggtagggat 540 ggaacaatca actactggaa tggaaatgtc ttgaacggat tcaaacaaat gggtcatcac 600 ttctccgaca ttatagttca caaaggagta acttacgtct tggattcaaa aggcatcgtt 660 tggtgcatta attccgatct tgaaatgtca 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21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-65760-L primer <400> 45 gctgttgggg agacttgaga t 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-65760-R primer <400> 46 ggcgctccac aatataaagc 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-65770-L primer <400> 47 gcaagaaaaa ccctttcagg a 21 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-65770-R primer <400> 48 gagaggtttg tttgggttag ga 22 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-AP3-LP primer <400> 49 aagaatctca tacatgagct ggaa 24 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-AP3-RP primer <400> 50 ttggtatcca agaactgagt cgt 23 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-AGL17-LP primer <400> 51 cactgacaag ctctatgact ttgc 24 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-AGL17-RP primer <400> 52 cctccatctt agccgtattg a 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-KNAT2-LP primer <400> 53 cagcgtctgc tacagctctt t 21 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-KNAT-RP primer <400> 54 tcatccgctg ctatgtcatc 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-SEP3-LP primer <400> 55 gaaagctgta cgagttttgc ag 22 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-SEP3-RP primer <400> 56 ttgaaggcac attgggttct 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-AP2-L primer <400> 57 tcccaattca aaccaccaat 20 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-AP2-R primer <400> 58 cgccggaaac agtgagaa 18 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-SEUSS-L primer <400> 59 cgaacaggac caatcgaga 19 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-SEUSS-R primer <400> 60 gctgctgcct aagctggt 18 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-LEUNIG-L primer <400> 61 tctctcaaga accctagatt cttttt 26 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-LEUNIG-R primer <400> 62 cagaacccta attcgatctt cag 23 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-65740_1 F primer <400> 63 ttgtgatggc taccgatact tg 22 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-658740_1 R primer <400> 64 cgactttctg gtgatactac ttcc 24 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-FT-F primer <400> 65 ggtggagaag acctcaggaa 20 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-FT-R primer <400> 66 ggttgctagg acttggaaca tc 22 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-MEA-F primer <400> 67 acatgggtct tcaccaaaag tag 23 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-MEA-R primer <400> 68 ttctagtgcc tcaccattca aa 22 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-CLF-F primer <400> 69 gttcgatatc aatggaaata tggtt 25 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> q-CLF-R primer <400> 70 ctttgcctct cctacgtaga aatc 24 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCL1 2- F Bam primer <400> 71 ggcggatccg tgtagattgg tctaccttac c 31 <210> 72 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCL1 44- F Bam primer <400> 72 ggcggatccg taagaatcct ttccataggc g 31 <210> 73 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCL1 R Pst primer <400> 73 caactgcagt caaagaaagc taggaaaaaa c 31 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK1 GADT7 F Eco primer <400> 74 gaattctctg cgaagaagat tgtgttgaa 29 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK1 GADT7 R Pst primer <400> 75 ctgcagctca ttcaaaagcc cattggttct 30 <210> 76 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK2 GADT7 F Eco primer <400> 76 gaattctcga cggtgagaaa aatcactct 29 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK2 GADT7 R Pst primer <400> 77 ctgcagctca ttcaaacgcc cactgattct 30 <210> 78 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CUL1 GADT7 F Eco primer <400> 78 gaattcgagc gcaagactat tgacttgg 28 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CUL1 GADT7 R Pst primer <400> 79 ctgcagccta agccaagtac ctaaacatgt 30 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCL1 HA_F_Stu primer <400> 80 aggcctacca tggtagattg gtctacctta cc 32 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCL1 HA_R w/o_Bam primer <400> 81 ggatccaaga aagctaggaa aaaacatttc 30 <210> 82 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK1 GFP_F_Xba primer <400> 82 tctagagacc atggggatgt ctgcgaagaa gattgtgtt 39 <210> 83 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASK1 GFP_Rw/oBam primer <400> 83 ggatccttca aaagcccatt ggttctctc 29 <210> 84 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CUL1 HA_F_Stu primer <400> 84 aggcctacca tggagcgcaa gactattgac tt 32 <210> 85 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CUL1 HA _Rw/o_Bam primer <400> 85 ggatccagcc aagtacctaa acatgttag 29

Claims (12)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 UCL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 CLF 단백질의 활성 감소는 잎의 컬링(curling), 종자와 화분의 발달, 화서의 높이 감소, 꽃 기관의 호메오틱 변화, 조기 개화 또는 꽃받침과 꽃잎의 수 감소를 야기하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 애기장대 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 애기장대 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 CLF (curly leaf) 단백질의 활성이 감소된 형질전환 애기장대 식물체의 제조 방법.
5. 삭제
6. 제4항의 방법에 의해 제조된 CLF 단백질의 활성이 감소된 형질전환 애기장대 식물체.
7. 제6항에 있어서, 상기 애기장대 식물체는 잎의 컬링(curling), 종자와 화분의 발달, 화서의 높이 감소, 꽃 기관의 호메오틱 변화, 조기 개화 또는 꽃받침과 꽃잎의 수 감소를 특징으로 하는 형질전환 애기장대 식물체.
8. 삭제
9. 제6항에 따른 애기장대 식물체의 종자.
10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 UCL1 (upward curly leaf1) 유전자를 포함하는 재조합 과발현 벡터를 함유하는, 식물의 CLF (curly leaf) 단백질의 활성을 감소시키기 위한 조성물.
    
11. 삭제
12. 삭제

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