KR101416071B1 - 인공간섭 펩티드를 이용한 표적 전사인자 비활성화 방법 및 이의 용도 - Google Patents

인공간섭 펩티드를 이용한 표적 전사인자 비활성화 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인공간섭 펩티드를 이용한 표적 전사인자 비활성화 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 이합체를 형성 (dimerization)하여 전사를 조절하는 전사인자 (transcription factor)의 절단형인 인공간섭 펩티드 (artificial small interfering peptide; a-siPEP)를 제작하였고, a-siPEP가 전사인자와 이형이합체 (heterodimer)를 형성하여 전사인자의 DNA 결합과 핵 안으로의 이동을 저해함으로써 해당 전사인자를 단백질 수준에서 비활성화시키는 것을 확인하였다. a-siPEP를 이용한 전사인자 활성 억제 방법은 유전자 넉아웃 방법을 대체하여 단백질 수준에서 전사인자의 활성화를 억제할 수 있고, 쌍자엽 및 단자엽 식물 모두에 적용가능한 정확성 및 효율이 높은 전사 조절 방법이다.

Description

인공간섭 펩티드를 이용한 표적 전사인자 비활성화 방법 및 이의 용도 {Method for targeted inactivation of transcription factor using artificial small interfering peptide and uses thereof}
본 발명은 인공간섭 펩티드를 이용한 표적 전사인자 비활성화 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물체 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하면서, 전사인자의 절단형 (truncated form)인 것을 특징으로 하는 인공간섭 펩티드 (a-siPEP; artificial small interfering peptide), 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터, 상기 재조합 식물 벡터로 형질전환되어 전사인자의 활성이 저해된 식물체, 상기 인공간섭 펩티드를 이용한 식물체의 전사인자 활성을 저해하는 방법, 상기 인공간섭 펩티드를 이용한 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 전사인자 활성 저해용 조성물에 관한 것이다.
표적 유전자 발현 조절은 작물 생명공학의 기본적인 관심사이며, 유전자의 발현을 조절하기 위한 다양한 분자적 방법이 개발되어 왔다. 그러나, 여전히 표적 유전자 불활성화는 대부분의 작물에서 실질적으로 어렵다. 표적 유전자 침묵을 위해 주로 이용되는 RNA 간섭 (RNAi)은 종종 잠재적 효과 (off-target effect) 및 불안정한 유전자 침묵이 일어난다. ZFN (zinc-finger nuclease) 및 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)과 같은 유전자 조작 뉴클레아제-기반 도구는 위치-특이적 게놈 변형을 유도하기 위해 발달해왔다. 이러한 접근은 정확한 유전자 변형을 수월하게 하지만, 많은 시간과 광범위한 선별을 위한 노동을 요구한다.
식물에서 이합체 전사인자의 활성이 비기능적 이형이합체 (heterodimer)를 경쟁적으로 형성하는 게놈-코딩 siPEP에 의해 효과적으로 억제된다는 것이 최근에 보고되었다 (Seo et al ., Trends Plant Sci . 16, 541-549, 2011). 67-105개의 잔기로 구성된 ZPR (LITTLE ZIPPER) 단백질들은 류신 지퍼 모티프를 포함하며, HD-ZIP III (class III homeodomain-leucine zipper) 전사인자와 상호작용 한다. 그러나 그들은 DNA 결합 및 전사 활성화에 필요한 단백질 도메인들이 부족하다. 그 결과, ZPR 단백질들은 DNA 결합 친화력 및 전사 조절 활성 감소에 의해 HD-ZIP III 전사인자 활성을 감소한다. 유사하게, MIF (MINI FNGER) 단백질들은 목적 전사인자의 핵 이입 및 DNA 결합을 저해함으로써 다중 호르몬 신호전달 및 꽃의 발달에 작용하는 ZHD (zinc finger-homeodomain) 전사인자를 방해한다 (Hong et al ., J. Biol . Chem. 286, 1659-1668, 2011).
특히, siPEP는 전사인자 유전자의 대안적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 생산된다. 애기장대 IDD14 (INDETERMINATE DOMAIN 14) 유전자는 대안적 스플라이싱에 의해 두 개의 스플라이싱된 이소폼 (spliced isoform)인 IDD14α 및 IDD14β를 생산한다. IDD14β 형태는 파괴된 DNA-결합 도메인을 갖지만, IDD14α 형태와 이형이합체를 형성하는 것이 가능하고 (Seo et al ., Nat . Commun. 2, 303, 2011b), 식물에서 siPEP의 범위 (repertoire)를 더 확대한다.
동물에서, 다양한 암들은 전사인자 유전자의 항시성 (constitutive) 발현에 의해서 초래된다. 합성 펩티드는 동물 조직에 주입되었을 때, 효과적으로 발암성 전사인자의 활성을 억제한다는 것을 보여주었다 (Polo et al ., Nat . Med . 10, 1329-1335, 2004). 게다가 STAT3 (signal transducers and activators of transcription 3), c-Myc, Max, c-Jun, 및 c-Fos와 같은 전사인자의 동적 이합체 (dynamic dimer) 형성은 구조적으로 이합체 형성에 필요한 단백질 도메인을 모방한 작은 단백질 유사 분자인 펩티도미메틱 (peptidomimetic)에 의해 불안정해진다. 작은 분자들은 식물의 게놈 siPEP에서 관찰되는 것과 유사하게 단백질-단백질 상호작용 또는 DNA 결합을 억제하여 전사인자 활성을 억제한다.
본 발명자는 식물의 게놈 siPEP에 대한 그들의 구조적 유사성 때문에 인공간섭 펩티드 (a-siPEP)를 고안하여 유전자 조작된 전사인자 단백질의 생물공학적 타당성을 연구하였다. 개화 유도 및 꽃의 기관형성에 각각 작용하는 MADS 박스 전사인자인 SOC1 및 AG (Komeda, Annu . Rev . Plant Biol . 55, 521-535, 2004)의 잠재적인 a-siPEP를 코딩하는 유전자 서열 및 생체주기 (circadian clock) 조절에 관여하는 MYB 전사인자인 LHY (Schaffer et al ., Cell , 93, 1219-1229, 1998)를 애기장대 및 숲개밀 (Brachypodium)에 형질전환하였고, 표현형적 비교와 생화학적 및 분자적 분석은 a-siPEP가 두 식물 종에서 전사인자와 비기능적 이합체를 형성하여 전사인자의 핵 내 이입 및 DNA 결합을 억제한다는 것을 보여주었다. 이는 a-siPEP 도구가 작물에서 특정한 전사인자를 비활성화시키기 위해 사용될 수 있다는 개념을 뒷받침한다.
한편, 한국공개특허 제2012-0017913호에는 '전사인자의 DNA 결합 도메인 및 단백질 운반 도메인을 포함하는 융합단백질을 가지는 전사인자 억제제 및 이의 제조방법'이 개시되어있고, 한국공개특허 제2007-0076918호에는 '전사인자 AtMYB44의 유전자 전이를 통한 광엽화, 개화지연 및 환경스트레스 저항성이 강화된 식물체'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 인공간섭 펩티드를 이용한 표적 전사인자 비활성화 방법 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 이합체를 형성 (dimerization)하여 전사를 조절하는 전사인자 (transcription factor)의 절단형인 인공간섭 펩티드 (artificial small interfering peptide; a-siPEP) 유전자를 과발현하는 식물체를 제조하였고, a-siPEP가 전사인자와 이형이합체 (heterodimer)를 형성하여 전사인자의 DNA 결합과 핵 안으로의 이동을 억제하여 해당 전사인자를 단백질 수준에서 비활성화시키는 것을 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물에서 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물체 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하면서, 전사인자의 절단형 (truncated form)인 것을 특징으로 하는 인공간섭 펩티드 (a-siPEP; artificial small interfering peptide)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 벡터로 형질전환되어 전사인자의 활성이 저해된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 전사인자 활성을 저해하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 전사인자 활성 저해용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 인공간섭 펩티드인 siPEP (a-siPEP) 유전자 과발현을 통한 전사인자 활성 억제 방법은 유전자 넉아웃 방법을 대체하여 단백질 수준에서 전사인자의 활성화를 억제할 수 있고, 쌍자엽 및 단자엽 식물 모두에 적용가능하며, 정확성과 효율이 높기 때문에, a-siPEP를 이용하여 형질이 개선된 작물을 개발함으로써 농업 및 식물 종자 산업의 발전에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 a-siPEP에 의한 SOC1의 표적 비활성화를 나타낸다. (a) SOC1 단백질의 도메인 구조. 숫자는 잔기의 위치를 나타낸다. 화살표 및 막대 표시는 각각 SOC1 및 S-K 전사체를 검출하기 위해 사용된 SOC1 및 S-K 프라이머의 위치를 나타낸다. aa: 아미노산. (b) 개화 표현형. 토양에서 5주 동안 키운 식물체를 촬영한 사진이다 (위쪽 패널). SOC1 과발현 soc1 -101D 및 SOC1 결핍 soc1 -2 돌연변이체는 비교를 위해 포함되었다. 약 20개 식물체의 로제트 (rosette) 잎의 수는 평균을 구하고, 통계 처리하였다 (아래쪽 패널). 다른 문자는 P<0.05에서 유의차를 나타낸다 (one-way ANOVA with Fisher's post hoc test). 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 2는 SOC1 및 SOC1의 다운스트림 (downstream) 유전자의 전사체 축적을 나타낸다. 1/2 MS 한천 배지 (1/2 x Murashige and Skoog-agar plate)에서 장일조건 (LD)으로 2주 동안 키운 식물체는 총 RNA 추출을 위해 사용되었다. AP1, CAL, FUL, LFY 및 SPL과 같은 SOC1의 다운스트림에서 작동하는 유전자 및 S-K 도메인을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 qRT-PCR로 측정되었다. 동일한 실험을 3번 반복하여 평균을 구했고, Student's t-test를 사용하여 통계 처리하였다 (*P<0.01). 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 3은 a-siPEP에 의한 SOC1의 경쟁적 억제를 나타낸다. (a) 효모 세포에서 절단형 (truncated) SOC1 단백질과 SOC1의 상호작용. Leu, Trp, His, 및 Ade가 없는 선택 배지 (-QD)에서 세포 성장은 양성 (positive) 상호작용을 나타낸다 (위쪽 패널). β-Gal 활성을 3번 측정하여 평균을 구했고, 통계 처리하였다 (아래쪽 패널). 다른 문자는 P<0.05에서 유의차를 나타낸다 (one-way ANOVA with Fisher's post hoc test). (b) 시험관 내 풀-다운 분석 (pull-down assay). 말토스 결합 단백질 (MBP)-코딩 서열은 SOC1 유전자의 5' 말단에 인프레임 (in-frame)으로 융합되었고, 재조합 MBP-SOC1 융합 단백질은 E. coli 세포에서 준비되었다. 35S-표지 SOC1 폴리펩티드는 시험관 내 번역으로 준비되었다. 위쪽 패널은 쿠마시-염색 젤의 일부를 나타낸다. 화살표는 재조합 MBP-SOC1 단백질을 나타낸다. (c) 효모-3-혼성체 (yeast three-hybrid) 분석. 절단형 SOC1 유전자는 메티오닌 (Met)-억제 프로모터 (pMET25)에 의해서 조절된다. AD: 활성화 도메인, BD: DNA 결합 도메인. 절단형 SOC1 유전자는 Leu, Trp, 및 His가 없는 선택배지 (-LWH)에서는 발현되지 않지만, Leu, Trp, His, 및 Met가 없는 선택배지 (-LWHM)에서는 발현되는 것을 나타낸다. Met가 있거나 없는 배지에서 β-Gal 활성을 3번 측정하여 평균을 구했고, 통계 처리하였다 (t-test, *P<0.01). (d) BiFC 분석. 부분적인 YFP 융합 구축물은 애기장대 원형질체에서 일시적으로 발현되었다. 스케일 바 = 10 ㎛. (e) 리포터 (reporter) 벡터 및 효과기 벡터는 애기장대 원형질체에서 일시적 발현 분석을 위해 사용되었다. (f) SOC1의 전사 활성에 대한 절단형 SOC1 단백질의 효과. GAL4 일시적 발현 분석은 이전에 기재된 방법으로 수행되었다 (Yang et al ., Plant Cell , 23, 2155-2168, 2011). ARF5M 및 ARF1M은 각각 전사 활성제 및 억제제 대조구이다. 동일한 실험을 3번 반복하여 평균을 구하고 통계 처리하였다. 다른 문자는 P<0.05에서 유의차를 나타낸다 (one-way ANOVA with Fisher's post hoc test).
도 4는 다양한 AG 유전자 구축물을 과발현하는 형질전환 식물체의 표현형을 나타낸다. (a) 사용된 애기장대 AG 단백질 구축물. 숫자는 잔기 위치를 나타낸다. AG 이합체 형성에 필수적인 Q-126은 AG-mK 구축물에서 H로 변이되었다. 화살표 및 막대 표시는 각각 AG 및 AG -K 전사체를 검출하기 위해 사용된 AG 및 AG-K 프라이머의 위치를 나타낸다. aa: 아미노산. (b) 다양한 AG 유전자 구축물을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물의 꽃 형태. 형질전환 애기장대 식물의 완전히 개화한 꽃을 촬영한 사진이다. AG-결핍 ag -3 돌연변이체는 비교를 위해 포함되었다. (c) AG 다운스트림 유전자의 mRNA 수준. DAD1 및 GIK 유전자의 mRNA 수준은 qRT-PCR로 측정되었다. 동일한 실험을 3번 반복하여 평균을 구했고, Student's t-test를 사용하여 통계 처리하였다 (*P<0.01). 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. (d) Col-0 및 AG-K-ox 형질전환 애기장대 식물체에서 AG 및 AG -K 유전자의 mRNA 수준. mRNA 수준은 (a)에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 qRT-PCR로 측정되었다. 동일한 실험을 3번 반복하여 평균을 구하고, 통계 처리하였다. 다른 문자는 P<0.05에서 유의차를 나타낸다 (one-way ANOVA with Fisher's post hoc test). 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. y-축은 배수 변화의 더 나은 비교를 위해 로그 스케일 (logarithmic scale)로 표시하였다.
도 5는 숲개밀 (Brachypodium) 개화에서 a-siPEP에 의한 BdSOC1의 표적 비활성화를 나타낸다. (a) 사용된 숲개밀 SOC1 구축물. 숫자는 잔기의 위치를 나타낸다. 화살표 및 막대 표시는 각각 BdSOC1 및 BdS -K 전사체를 검출하기 위해 사용된 BdSOC1 및 BdS-K 프라이머의 위치를 나타낸다. aa: 아미노산. (b 및 c) BdSOC1 유전자를 과발현하는 숲개밀 식물체의 표현형 및 개화. 토양에서 8주 동안 키운 식물체를 촬영한 사진이다 (b). 흰색 화살표는 출수 (heading)를 나타낸다. 개화 시간은 출수가 일어날 때까지의 일 수를 계산하여 측정하였다 (c). 20개 식물체의 평균을 구하고, 통계 처리하였다. 다른 문자는 P<0.05에서 유의차를 나타낸다 (one-way ANOVA with Fisher's post hoc test). (d) BdSOC1 및 BdSOC1 다운스트림 유전자의 발현. BdAP1, BdCAL, BdFUL, BdLFY 및 BdSPL8과 같은 BdSOC1의 다운스트림에 작용하는 유전자 및 BdS-K 도메인 코딩 유전자 (BdS -K)의 mRNA 수준은 qRT-PCR로 측정되었다. 동일한 실험을 3번 반복하여 평균을 구했고, Student's t-test를 사용하여 통계 처리하였다 (*P<0.01). 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 6은 a-siPEP에 의한 핵 내에 위치하는 BdSOC1의 감소를 나타낸다. (a) 시험관 내 풀-다운 (pull-down) 분석. BdSOC1 단백질은 E. coli 세포에서 재조합 BdSOC1-MBP 융합 단백질로 준비되었다. 35S-표지 BdSOC1 폴리펩티드는 시험관 내 번역으로 준비되었다. 아래쪽 패널은 쿠마시-염색 젤의 일부를 나타낸다. (b) BiFC 분석. 부분적인 YFP 융합 구축물은 숲개밀 원형질체에서 일시적으로 발현되었다. 스케일 바 = 10 ㎛.
도 7은 생체 주기 (circadian clock) 조절에서 LHY 활성의 a-siPEP 매개 억제를 나타낸다. (a) LHY 단백질의 도메인 구조. 숫자는 잔기 위치를 나타낸다. DD: 이합체 형성 도메인, aa: 아미노산. (b) LHY - DD - ox 형질전환 식물체에서 TOC1 유전자 발현 주기 기록. 1/2 MS 한천 배지에서 중일 (neutral day) 조건 (12시간 광, 12시간 암)으로 10일 동안 키운 식물체를 지속적 광 조건으로 옮겼다. 두 독립적인 LHY-DD-ox 형질전환 라인이 분석에 사용되었다. 전체 식물은 72시간까지 차이트게버 (zeitgeber) 시간 (ZT) 지점에 수확되었고, 유전자 전사체 수준은 qRT-PCR로 측정되었다. 동일한 실험을 3번 반복하여 평균을 구하고, 통계 처리하였다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 8은 a-siPEP의 작용 기작 모델을 나타낸다. a-siPEP는 표적 전사인자 (TF)와 비기능적 이형이합체 (heterodimer)를 형성하여 핵(N)으로부터 격리 (sequestration) 및/또는 DNA 결합 억제를 초래한다. P: 프로모터, C: 세포질.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물체 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하면서, 전사인자의 절단형 (truncated form)인 것을 특징으로 하는 인공간섭 펩티드 (a-siPEP; artificial small interfering peptide)를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 전사인자는 이합체를 형성 (dimerization)하여 전사를 조절할 수 있으며, 바람직하게는 동형이합체 (homodimer) 또는 이형이합체 (heterodimer)를 형성하여 전사를 조절할 수 있으며, 가장 바람직하게는 동형이합체를 형성하여 전사를 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 인공간섭 펩티드는 전사인자와 비기능적 (nonfunctional) 이합체를 형성하여 전사인자의 활성을 조절할 수 있으며, 바람직하게는 전사인자의 활성을 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 인공간섭 펩티드는 도 8에 도시된 것과 같이 전사인자와 비기능적 이합체를 형성함으로써 전사인자의 DNA 결합 또는 핵 내로의 이동을 저해하여 전사인자의 활성을 조절할 수 있으며, 바람직하게는 전사인자의 활성을 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인공간섭 펩티드에 의한 전사인자 활성 저해를 구체적으로 설명하면, 본 발명의 인공간섭 펩티드는 이합체를 형성하여 전사를 조절하는 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하는 식물 전사인자의 일부 (truncated form)로 구성된다. 상기 인공간섭 펩티드는 식물체에서 생성된 정상적인 전사인자와 결합하여 비기능적 이합체를 형성하며, 이 과정에서 정상 전사인자 간의 결합을 경쟁적으로 억제 (competitive inhibition)할 수 있다. 또한, 상기 비기능적 이합체는 DNA 결합 또는 핵 내로의 이동이 저해된다. 따라서 정상적인 전사인자 이합체의 형성 억제 및 비기능적 이합체 형성에 의해 전사인자의 활성을 저해하고, 그로 인해 해당 전사인자가 조절하는 전사가 저해될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 전사인자는 DNA 결합 도메인, 이합체 형성 도메인 (단백질-단백질 상호작용 매개 도메인), 전사인자의 동형이합체 형성 기여 (contribution) 도메인 및 전사조절 도메인을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 DNA 결합 도메인 및 이합체 형성 도메인 (단백질-단백질 상호작용 매개 도메인)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 인공간섭 펩티드는 이합체 형성 도메인만을 포함하여 전사인자의 활성을 저해하는 전사인자의 절단형일 수 있고, 이합체 형성 도메인과 DNA 결합 도메인을 포함하나 전사조절 도메인을 포함하지 않아 전사인자의 활성을 저해하는 전사인자의 절단형일 수도 있고, 이합체 형성 도메인과 전사조절 도메인을 포함하나 DNA 결합 도메인을 포함하지 않아 전사인자의 활성을 저해하는 전사인자의 절단형일 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 전사인자는 MADS 박스 전사인자 또는 MYB 전사인자일 수 있으나, 이합체 형성 도메인을 포함하며 이합체를 형성하여 전사를 조절하는 전사인자라면 제한되지 않는다. 상기 MADS 박스 전사인자는 SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSOR OF CONSTANS 1), BdSOC1 (Brachypodium distachyon SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSOR OF CONSTANS 1) 또는 AG (AGAMOUS)일 수 있으며, MYB 전사인자는 LHY (LATE ELONGATED HYPOCOTYL)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 전사인자 SOC1, BdSOC1, AG 또는 LHY는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, 상기 SOC1 전사인자에 대한 인공간섭 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 SOC1 전사인자의 1-170 아미노산, 30-170 또는 82-170 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 BdSOC1 전사인자에 대한 인공간섭 펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BdSOC1 전사인자의 49-188 아미노산 또는 99-188 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 AG 전사인자에 대한 인공간섭 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 AG 전사인자의 18-192 아미노산, 77-192 아미노산, 103-192 아미노산 또는 103-252 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 LHY 전사인자에 대한 인공간섭 펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 LHY 전사인자의 100-359 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 SOC1 전사인자는 애기장대의 개화 조절에 관여하며, 본 발명에 따른 SOC1 전사인자의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.
본 발명의 BdSOC1 전사인자는 숲개밀 (Brachypodium distachyon)의 개화 (출수; heading) 조절에 관여하며, 본 발명에 따른 BdSOC1 전사인자의 범위는 숲개밀로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명의 AG 전사인자는 애기장대의 꽃 구조 형성에 관여하며, 본 발명에 따른 AG 전사인자의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명의 LHY 전사인자는 애기장대의 생체 시계 (circadian clock) 조절에 관여하며, 본 발명에 따른 LHY 전사인자의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 전사인자 SOC1, BdSOC1, AG 또는 LHY는 각각 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 애기장대 SOC1 전사인자 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 5의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 5의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 숲개밀 BdSOC1 전사인자 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 애기장대 AG 전사인자 유전자는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 애기장대 LHY 전사인자 유전자는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 제공하며, 상기 인공간섭 펩티드 코딩 유전자의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 인공간섭 펩티드 코딩 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 발현 벡터인 상기 재조합 식물 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.
인공간섭 펩티드 코딩 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA 영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 벡터로 형질전환되어 전사인자의 활성이 저해된 식물체를 제공한다.
본 발명에서 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계는 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol . Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미 주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol . Gen . Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein T.M. et al ., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 (EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 전사인자 활성을 저해하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 식물체는 쌍자엽 또는 단자엽 식물일 수 있다. 바람직하게는 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 숲개밀, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대 또는 숲개밀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 인공간섭 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 전사인자 활성 저해용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 전사인자 활성을 저해하여, 해당 전사인자가 조절하는 전사를 억제할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료와 성장 조건
사용된 모든 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 라인은 컬럼비아 (Col-0)를 기본적으로 사용했다. 애기장대 식물들은 형광 FLR40D/A 튜브 (오스람, http://www.osram.de)에서 제공되는 백색 조명 (120 μmol photons m-2sec-1)의 장일 조건 (LD: 16시간 광/8시간 암)하에서 55% 상대 습도와 23℃로 조절되는 배양실에서 자랐다. 애기장대의 기능결핍 soc1 -2 과 유전자 과발현 soc1 -101D 돌연변이는 이전에 설명되었다 (Moon et al., Plant J. 35:613-623, 2003). T-DNA가 삽입된 ag -3 넉아웃 (knockout) 돌연변이체 (SALK_014999)는 애기장대 생물자원 센터 (ABRC; http://abrc.osu.edu)에서 얻었고, cca1 -2 돌연변이체는 이전에 설명되었다 (Seo et al ., Plant Cell . 24(6):2427-2442, 2012).
커뮤니티 표준 이배체 근교계 (community standard diploid inbred line)인 숲개밀 (Brachypodium distachyon) Bd21-3이 본 발명에 사용되었다. 숲개밀은 형광 FLR40D/A 튜브 (오스람)에서 제공되는 백색 조명 (150 μmol photons m-2sec-1)의 LD 조건 (20시간 광/4시간 암)으로 상대습도 60%의 성장 챔버에서 성장했다. 성장 온도는 낮 동안 24℃와 밤에는 18℃를 유지했다.
2. a- siPEP ( artificial small interfering peptide ) 구조의 생성
우리는 이전에 예측된 애기장대 AG (At4g18960)와 SOC1 (At2g45660) 전사인자의 단백질 도메인 구조를 참조하였다 (Kaufmann et al ., Gene , 347, 183-198, 2005). MADS, K (keratin-like), I (intervening), C (C-terminal) 및 도메인 복합체와 같은 특정 단백질 도메인들을 코딩하는 유전자 서열들은 유전자 특이적 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR로 획득하였다. 또한 우리는 애기장대 LHY 전사인자 (At1g01060)의 단백질 도메인 구조를 설명하는 이전 연구 (Lu et al ., Plant Physiol. 150, 834-843, 2009)를 참고하였고, 이합체 형성 (dimerization) 도메인을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 디자인하였다. PCR 결과물은 전체 염기서열을 확인하기 위해 양방향으로 서열분석되었다. 인공적인 시작 및 정지 코돈을 5' 말단과 3' 말단 프라이머에 각각 포함시켰다. 사용된 RT-PCR 프라이머들은 표 1에 제시하였다.
프라이머 용도 염기서열 서열번호
eIF4a-F qRT-PCR 5'-TGACCACACAGTCTCTGCAA 서열번호 9
eIF4a-R qRT-PCR 5'-ACCAGGGAGACTTGTTGGAC 서열번호 10
SOC1-F qRT-PCR 5'-GGATCTCATGAAAGCGAAGTTT 서열번호 11
SOC1-R qRT-PCR 5'-TCACTTTCTTGAAGAACAAGGTA 서열번호 12
SOC1-K-F qRT-PCR 5'-AAGAAAATATGCAGCATTTGAAATA 서열번호 13
SOC1-K-R qRT-PCR 5'-CCTATGCCTTCTCCCAAGAGT 서열번호 14
AP1-F qRT-PCR 5'-TGATGCTGAAGTTGCTCTTGTT 서열번호 15
AP1-R qRT-PCR 5'-CGACCAGTTTGTATTGACGTCG 서열번호 16
CAL-F qRT-PCR 5'-GGGAAGGGGTAGGGTTGAAT 서열번호 17
CAL-R qRT-PCR 5'-ACAATAAGGGAAACCTCGGC 서열번호 18
FUL-F qRT-PCR 5'-ATGATGGAACTCCGTTGTCG 서열번호 19
FUL-R qRT-PCR 5'-TTCATGAGAAATCATTACCAAGATATG 서열번호 20
LFY-F qRT-PCR 5'-TTACTGGGACGCAGGTCAAG 서열번호 21
LFY-R qRT-PCR 5'-CCCAAACCACTACCTCCGTT 서열번호 22
SPL3-F qRT-PCR 5'-ACAATGCAGCAGGTTTCACG 서열번호 23
SPL3-R qRT-PCR 5'-CTTTTCCGCCTTCTCTCGTT 서열번호 24
SPL5-F qRT-PCR 5'-GATCAGATAAACCCTCCCGC 서열번호 25
SPL5-R qRT-PCR 5'-ACCATGACCAACTTTTCTTGACA 서열번호 26
SPL8-F qRT-PCR 5'-CGCCGTAAATGTCACCAATC 서열번호 27
SPL8-R qRT-PCR 5'-GAAGACGCTGTCGTTTGGAA 서열번호 28
AG-F qRT-PCR 5'-TCAACCGTTTGATTCACGG 서열번호 29
AG-R qRT-PCR 5'-TTACACTAACTGGAGAGCGGTTT 서열번호 30
AG-K-F qRT-PCR 5'-CTCAGGAACTTGGAAGGCAG 서열번호 31
AG-K-R qRT-PCR 5'-ATCAACTTCTCTTTTCTGCATGTAGT 서열번호 32
DAD1-F qRT-PCR 5'-TTCGTGCCACGTCAGGTATT 서열번호 33
DAD1-R qRT-PCR 5'-TCTTTGTCCTGGCAAACTGC 서열번호 34
GIK-F qRT-PCR 5'-GTAATGGTCATGGCAGCGTC 서열번호 35
GIK-R qRT-PCR 5'-ACATATTCCCTCCACCTCCG 서열번호 36
TOC1-F qRT-PCR 5'-TCTTCGCAGAATCCCTGTGAT 서열번호 37
TOC1-R qRT-PCR 5'-GCTGCACCTAGCTTCAAGCA 서열번호 38
S-M-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGGTGAGGGGCAAAACT 서열번호 39
S-M-R Subcloning 5'-AGAAAGCTGGGTTTCAGGAGCTGGCGAATTCATA 서열번호 40
S-MIK-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGGTGAGGGGCAAAACT 서열번호 41
S-IK-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGAAGAAAGCCTTTGAGCTCTCA 서열번호 42
S-K-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGGTTTCTGAAGAAAATATGCAGC 서열번호 43
S-K-R Subcloning 5'-AGAAAGCTGGGTTTCACCACTTTTCAGAGAGCTTCTC 서열번호 44
AG-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGACGGCGTACCAATCGG 서열번호 45
AG-R Subcloning 5'-AGAAAGCTGGGTTTTACACTAACTGGAGAGCGGT 서열번호 46
AG-M-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGGGGAGAGGAAAGATCGAAATCAAACGG 서열번호 47
AG-M-R Subcloning 5'-AGAAAGCTGGGTTTTAGTTGTTAGAGTACTCATAGAGACGACCACG 서열번호 48
AG-I-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGAGTGTAAAAGGGACTATTGAGAGGT 서열번호 49
AG-I-R Subcloning 5'-AGAAAGCTGGGTTTTAGTCCGATATTGCCTTCTTGTACCTCTC 서열번호 50
AG-K-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGAATTCTAACACCGGATCGGTGGCAGAA 서열번호 51
AG-K-R Subcloning 5'-AGAAAGCTGGGTTTTAATCAACTTCTCTTTTCTGCATGTAGTCGATTTC 서열번호 52
AG-C-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGTTGCATAACGATAACCAGATTCTTC 서열번호 53
LHY-DD-F Subcloning 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGAATACTCCTTATCCTCGAAAGCCTG 서열번호 54
LHY-DD-R Subcloning 5'-AGAAAGCTGGGTTTTAAGCCCACCAAGCAGTTGC 서열번호 55
SOC1-F Y2H 5'-GGAATTCCATATGATGGTGAGGGGCAAAAC 서열번호 56
SOC1-R Y2H 5'-CGGGATCCTCACTTTCTTGAAGAACAAGGTA 서열번호 57
S-MIK-F Y2H 5'-GGAATTCCATATGATGGTGAGGGGCAAAAC　 서열번호 58
S-IK-F Y2H 5'-GGAATTCCATATGAAGAAAGCCTTTGAGCTCTC 서열번호 59
S-K-F Y2H 5'-GGGAATTCGTTTCTGAAGAAAATATGCAGC 서열번호 60
S-K-R Y2H 5'-CGGGATCCCCACTTTTCAGAGAGCTTCTC 서열번호 61
S-MIK-F Y3H 5'-TCAGCGGCCGCGATGGTGAGGGGCAAAAC　 서열번호 62
S-IK-F Y3H 5'-TCAGCGGCCGCGATGAAGAAAGCCTTTGAGCTC 서열번호 63
S-K-F Y3H 5'-TCAGCGGCCGCGATGGTTTCTGAAGAAAATATGCA 서열번호 64
S-K-R Y3H 5'-GAAGATCTTCACCACTTTTCAGAGAGCTTC 서열번호 65
SOC1-nEYFP-F BiFC 5'-CCGCTCGAGGGATGGTGAGGGGCAAAACTCA　 서열번호 66
SOC1-nEYFP-R BiFC 5'-CGGGATCCTCACTTTCTTGAAGAACAAGGTAACC 서열번호 67
SOC1-cEYFP-R BiFC 5'-GCGGATCCCCCTTTCTTGAAGAACAAGGTAACCC 서열번호 68
S-MIK-cEYFP-F BiFC 5'-CCGCTCGAGCATGGTGAGGGGCAAAACTCA　 서열번호 69
S-IK-cEYFP-F BiFC 5'-CCGCTCGAGCATGAAGAAAGCCTTTGAGCTCTCA 서열번호 70
S-K-cEYFP-F BiFC 5'-CCGCTCGAGCATGGTTTCTGAAGAAAATATGCAG 　 서열번호 71
S-K-cEYFP-R BiFC 5'-GCGGATCCCCCACTTTTCAGAGAGCTTCTCGTTT 서열번호 72
SOC1-F TAA 5'-TCCCCCGGGGATGGTGAGGGGCAAAACTC　 서열번호 73
SOC1-R TAA 5'-TCCCCCGGGTCACTTTCTTGAAGAACAAGGTAAC 서열번호 74
예상되는 숲개밀 BdSOC1 (Bradi1g77020) 유전자는 애기장대 SOC1 유전자를 미끼 (bait)로 이용한 숲개밀 게놈 데이터베이스 (http://www.brachypodium.org/)의 BLAST 검색 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 의해 규명되었다. BdSOC1 단백질의 구조 도메인 조직 (organization) 또한 애기장대 SOC1 단백질과 비교 분석하였다. 절단형 (truncated) BdSOC1 유전자 구축물은 애기장대 SOC1 유전자에서 정의된 염기서열에 따라 제작되었다. 사용된 RT-PCR 프라이머들은 표 2에 제시하였다.
프라이머 용도 염기서열 서열번호
BdUBC18-F qRT-PCR 5'-GGAGGCACCTCAGGTCATTT 서열번호 75
BdUBC18-R qRT-PCR 5'-ATAGCGGTCATTGTCTTGCG 서열번호 76
BdSOC1-F qRT-PCR 5'-TACGCTGGTGACCTCTGCTC 서열번호 77
BdSOC1-R qRT-PCR 5'-GGTTCTCCTCCTCCTCCTCC 서열번호 78
BdS-K-F qRT-PCR 5'-AAGAGCCTTCGTAGCATCAGG 서열번호 79
BdS-K-R qRT-PCR 5'-CGCAACGTCATCTCCTTCTG 서열번호 80
BdAP1-F qRT-PCR 5'-CAAGATAAACCGGCAGGTGA 서열번호 81
BdAP1-R qRT-PCR 5'-CCCTTGGTGGAGAAGACGAT 서열번호 82
BdCAL-F qRT-PCR 5'-TTCGCCACCGACTCATGTAT 서열번호 83
BdCAL-R qRT-PCR 5'-CGTGACACCAGTTTCCCTGA 서열번호 84
BdFUL-F qRT-PCR 5'-GCAGGAGGAGAACAAGGCTC 서열번호 85
BdFUL-R qRT-PCR 5'-CTGTTCCCACTGCACTTGCT 서열번호 86
BdLFY-F qRT-PCR 5'-GAAGTGTTGTCGAACGAGCG 서열번호 87
BdLFY-R qRT-PCR 5'-CCATTCCTCTGCTTCTTCCC 서열번호 88
BdSPL8-F qRT-PCR 5'-TACGACAGCTTCGACTTCGC 서열번호 89
BdSPL8-R qRT-PCR 5'-GGGTGGTGGAGTAGGTTGCT 서열번호 90
BdSOC1-F Subcloning 5'-GCTCTAGAATGCAGGCAGGCCGGCTCGATCGG 서열번호 91
BdSOC1-R Subcloning 5'-GCGGATCCGAGAGCGATTTCTGCCGGGCAGTC 서열번호 92
BdS-MK1-F Subcloning 5'-GCTCTAGAATGGTGCGGGGGAAGACGCAGCTG 서열번호 93
BdS-MK2-F Subcloning 5'-GCTCTAGAATGAAGGCGCACGAGCTCTCCGTCCTCTG 서열번호 94
BdSOC1-K-F Subcloning 5'-GCTCTAGAATGACGGCACAGCAAGACATAG 서열번호 95
BdSOC1-K-R Subcloning 5'-GCGGATCCGCACCTTGCCCCTTAGATCTTCGTTCTC 서열번호 96
BdSOC1-F in vitro translation 5'-CGCGCGATCGCATGCAGGCAGGCCGGCTCGATCGG 서열번호 97
BdSOC1-R in vitro translation 5'-TCGTTTAAACTCAAGAGCGATTTCTGCCGGGCAGTC 서열번호 98
BdS-MK1-F in vitro translation 5'-CGCGCGATCGCATGGTGCGGGGGAAGACGCAGCTGAAG 서열번호 99
BdS-MK2-F in vitro translation 5'-CGCGCGATCGCATGAAGGCGCACGAGCTCTCCGTCC 서열번호 100
BdS-K-F in vitro translation 5'-CGCGCGATCGCATGACGGCACAGCAAGACATAG 서열번호 101
BdS-K-R in vitro translation 5'-TCGTTTAAACTCACACCTTGCCCCTTAGATCTTCGTTC 서열번호 102
BdSOC1-F MBP/GFP fusion 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGCAGGCAGGCCGGCTCGATCGGAGAGG 서열번호 103
BdSOC1-R MBP/GFP fusion 5'-AGAAAGCTGGGTTTCAAGAGCGATTTCTGCCGGGCAGTCCGATGAACAGCTC 서열번호 104
BdS-M-F GFP fusion 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGGTGCGGGGGAAGACGCAGCTGAAGCGG 서열번호 105
BdS-M-R GFP fusion 5'-AGAAAGCTGGGTTTCAGCTGGCGAACTCGTAGAGGCGGCCGCTGGGGG 서열번호 106
BdS-MK1-F GFP fusion 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGGTGCGGGGGAAGACGCAGCTGAAGCGG 서열번호 107
BdS-MK2-F GFP fusion 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGAAGGCGCACGAGCTCTCCGTCCTCTGCG 서열번호 108
BdS-K-F GFP fusion 5'-AAAAAGCAGGCTCTATGACGGCACAGCAAGACATAGAGAAGATAA 서열번호 109
BdS-K-R GFP fusion 5'-AGAAAGCTGGGTTTTACACCTTGCCCCTTAGATCTTCGTTCTCCTTG 서열번호 110
BdS-K-F GST fusion 5'-CGGGATCCATGACGGCACAGCAAGACATAG 서열번호 111
BdS-K-R GST fusion 5'-GGAATTCCTTACACCTTGCCCCTTAGATCTTCG 서열번호 112
BdSOC1-F BiFC 5'-TCGAATTCTATGCAGGCAGGCCGGCTCGATCGG 서열번호 113
BdSOC1-R BiFC 5'-GGTGGATCCTCAAGAGCGATTTCTGCCGGGCAGTC 서열번호 114
BdS-MK1-F BiFC 5'-GCTCAAGCTTCGATGGTGCGGGGGAAGACGCAGCTGAAG 서열번호 115
BdS-MK2-F BiFC 5'-GCTCAAGCTTCGATGAAGGCGCACGAGCTCTCCGTCCTCTG 서열번호 116
BdS-K-F BiFC 5'-GCTCAAGCTTCGATGACGGCACAGCAAGACATAGAGAAGATA 서열번호 117
BdS-K-R BiFC 5'-CGCGGTACCTTACACCTTGCCCCTTAGATCTTCGTTCTCCTTG 서열번호 118
3. 식물 형질전환
SOC1, AG 및 LHY 유전자가 과발현되는 형질전환 애기장대 식물을 생산하기 위해, 유전자 염기서열들을 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터의 조절을 받는 바이너리 벡터 pB2GW7 (Invitrogen, http://www.invitrogen.com/)에 서브클로닝하였다. 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 애기장대 형질전환은 수정된 플로랄 딥 (floral dip) 방법 (Clough and Bent, Plant J. 16, 735-743, 1998)에 따라 실시되었다. T1 씨앗들을 토양에 뿌렸고, 5.78%의 바스타 (Basta)를 포함한 최종 용액 (AgrEvo)의 1:1000 희석액 (물에 희석)을 일주일에 두 번 정도 분무하였다. 단일 T-DNA가 삽입된 동형접합 형질전환 식물은 두 번의 추가 세대에 대한 제초제 선발 및 분리 비율 분석을 통해 획득하였다.
숲개밀 cDNA 풀에서 증폭된 BdSOC1 유전자 서열들은 CaMV 35S 프로모터 조절하의 pJJ461 벡터에 서브클로닝하였다. pJJ461 벡터는 전종성 박사님 (경희대학교, 서울, 한국)이 제공해주셨다. 숲개밀 형질전환은 이배체 근교계인 Bd21-3 (Vogel and Hill, Plant Cell Rep . 27, 471-478, 2008)의 미성숙한 배아에서 파생된 작은 배발생 캘러스를 사용하여 아그로박테리움 매개 방법으로 수행되었다. T3 형질전환 숲개밀 식물이 모든 분석 실험에 사용되었다.
4. mRNA 수준 분석
mRNA 수준은 정량적 실시간 RT-PCR (qRT-PCR)을 이용해 측정하였다. 총 RNA 준비, 역전사 및 정량적 중합 효소 연쇄 반응은 mRNA 수준의 정확하고 재현 가능한 측정을 위해 제안된 방법에 따라 실시하였다. 적절한 식물 재료로부터 총 RNA 샘플의 추출 및 RT-PCR 조건이 이전에 설명되었다 (Udvardi et al ., Plant Cell , 20, 1736-1737, 2008). 총 RNA 샘플은 사용하기 전에 게놈 DNA의 오염을 제거하기 위해 RNase가 없는 DNase를 광범위하게 전처리하였다.
qRT-PCR 반응은 25 ㎕의 반응 볼륨에 SYBR Green I master Mix를 사용하는 Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 시스템 (http://www.appliedbiosystems.com/)을 사용하여 96-웰 플레이트에서 수행되었다. PCR 프라이머들은 시스템 내에 설치된 프라이머 익스프레스 (Primer Express) 소프트웨어를 사용하여 고안되었다. 사용된 2단계 열 사이클링 프로필은 94℃에서 15초 및 68℃에서 1분이다. eIF4A (EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4A1) 유전자 (At3g13920)는 사용된 cDNA 양의 변화를 표준화하기 위한 내부 대조구 유전자로 반응에 포함되었다. 모든 qRT-PCR 반응은 동일 조건에서 성장한 식물의 3개의 독립적인 복제 샘플에서 추출된 총 RNA 샘플을 사용하여 3회 수행되었다. 비교 ΔΔCT 방법은 샘플의 각 증폭 산물의 상대적인 양을 평가하는데 사용되었다. 임계값 사이클 (CT)는 기본 매개 변수 (default parameter)가 설정되어 있는 시스템에 의해 각 반응에 대해 자동적으로 결정되었다. qRT-PCR 반응의 특이성은 시스템에 설치되어 있는 표준 방법을 사용하여 증폭된 산물의 용해 곡선 (melt curve) 분석에 의해 결정되었다.
5. 개화시기 측정
애기장대 식물은 LD (16시간 광/8시간 암) 및 23℃ 온도 조건의 토양에서 키웠다. 개화시기는 꽃대가 올라오기 시작했을 때 로제트 (rosette) 잎의 수를 계산하여 측정했다. 15 내지 20개 식물체를 계산하였고, 각 측정값에 대한 평균을 구했다.
숲개밀 식물은 Sunshine Professional Growing Mix 1 (SUN GRO Horticulture)에 심어서 길렀고, 이후에 LD (20시간 광/4시간 암) 조건으로 조절되는 성장 챔버에서 키웠다. 개화시기는 출수가 일어날 때까지의 일 수를 계산하여 측정하였다. 20개 식물체를 계산하였고, 각 측정값에 대한 평균을 구했다.
6. 세포 내 위치 ( Subcellular localization ) 분석 실험
형광 현미경에 의한 검출을 위해, 애기장대 SOC1 유전자 염기서열의 3' 말단에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 염기서열을 융합시켰고, 그 유전자 융합체를 pB7FWG2 벡터 (Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 발현 벡터 구축물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 매개 칼슘 트랜스펙션 방법 (Yoo et al ., Nat . Protoc . 2, 1565-1572, 2007)으로 애기장대 원형질체 (protoplast) 내로 형질전환시켰다. SOC1 단백질의 세포 내 분포는 DIC (differential interference contrast) 현미경 및 형광 현미경으로 시각화되었다. GFP 융합 단백질은 488nm 및 568nm에서 발광되었고, 녹색 형광 신호는 HQ600/50 방출 필터 (Croma)로 필터링되었다. 엽록소의 자가형광 (autofluorescence)은 568nm에서 발광되었고, E600LP 필터 (니콘, http://www.nikon.com/)로 방출되었다. 병합된 신호는 Zeiss LSM 이미지 브라우저 (Carl Zeiss, http://www.zeiss.com/)를 사용하여 얻었다.
숲개밀 BdSOC1 유전자도 유사하게 GFP 코딩 염기서열과 융합시켰고, 융합 구축물은 pB7FWG2 벡터 (Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 숲개밀 원형질체는 애기장대 원형질체 준비를 위한 절차에 따라, 2주 동안 키운 숲개밀 실생의 세 번째 잎에서 분리되었다. BdSOC1 융합 구축물은 숲개밀 원형질체에서 일시적으로 발현되었고, 탐지된 녹색 형광 신호는 상기에 기재된 애기장대 원형질체 분석 방법으로 분석되었다.
7. 전사 활성 분석 실험
애기장대 원형질체에서 일시적인 발현 분석을 위해, 여러 가지 리포터 (reporter) 플라스미드 및 효과기 (effector) 플라스미드를 제작하였다. 리포터 플라스미드는 GAL4 업스트림 활성화 염기서열 (UAS)의 4개 카피 및 β-글루쿠로니다아제 (GUS) 유전자 (uidA)를 포함하고 있다. p35S:SOC1 효과기 플라스미드를 제작하기 위해, SOC1 유전자 염기서열을 GAL4 DNA-결합 도메인과 융합시켰고, CaMV 35S 프로모터를 포함하는 발현 벡터에 삽입하였다. 리포터 및 효과기 플라스미드는 PEG-매개 형질전환 방법 (Yoo et al ., Nat . Protoc . 2, 1565-1572, 2007)으로 애기장대 원형질체에 공동-형질전환 (co-transformation)시켰다. GUS 활성은 이전에 기술된 형광분석 방법 (Yang et al ., Plant Cell , 23, 2155-2168, 2011)으로 측정하였다. CaMV 35S 프로모터-루시퍼라아제 (luciferase; LUC) 구축물도 내부 대조구로 공동-형질전환시켰고, 루시퍼라아제 분석은 루시퍼라아제 분석 시스템 키트 (Promega, http://www.promega.com/)를 사용하여 수행하였다.
8. 시험관 내 풀-다운 ( pull - down ) 분석 실험
재조합 말토스 결합 단백질 (MBP) 및 MBP-SOC1 및 MBP-BdSOC1 단백질은 E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL 균주 (Stratagene, http://www.stratagene.com/)에서 생산되었고, 하기에 기재된 방법으로 부분적으로 정제되었다. 전배양 세포 배양액의 1/10 볼륨 (5 ml)을 신선한 LB 배지 500 ml에 옮겨, OD600 값이 0.3-0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 단백질 생산은 최종 농도 0.5 mM의 IPTG (isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 37℃에서 5시간 동안 교반 배양하는 것에 의해 유도되었다. 세포를 수확하였고, 버퍼 A [25 mM HEPES, pH 7.5, 20% 글리세린, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 0.2 mM EDTA 단백질 억제제 칵테일 (시그마-알드리치, http://www.sigmaaldrich.com/) 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)]에 다시 현탁하였다. 세포는 세포파쇄기 (French press)를 사용하여 용해하였다 (8500 p.s.i., 1회). 세포 용해물은 30초 동안 초음파 처리하여 분해하였고 (2 회), 20분 동안 20000 g로 원심분리하였다. 상층액은 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 절단형 SOC1 단백질도 생체 외에서 번역하여 준비하였다. SOC1 및 BdSOC1 cDNA는 pGADT7 벡터에 서브클로닝하였다. 그리고 SOC1 폴리펩티드는 TNT®-coupled reticulocyte lysate 시스템 (Promega)을 사용하여 35S-Met으로 표지하였다.
MBP 또는 MBP 융합 단백질은 아밀로오스 레진 (amylose resin)(시그마-알드리치)과 혼합하여 상온 (23-25℃)에서 15분 동안 섞어주었다. 비드 (beads)는 1x PBS 버퍼로 3번 반복하여 세척한 후, 신선한 버퍼 A로 한번 세척하였다. 35S-표지 폴리펩티드 5 ㎕를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 비드를 신선한 버퍼 A로 5번 세척하였다. 비드에 결합된 단백질은 5분 동안 가열한 후 1x 로딩 버퍼로 추출 (elution)하여 SDS-PAGE 및 방사능 사진 촬영을 수행하였다.
9. 효모-2- 혼성체 분석 실험
효모 2-혼성체 (yeast two-hybrid) 분석 실험은 BD Matchmaker 시스템 (Clontech, http://www.clontech.com/)을 사용하여 수행하였다. pGADT7 벡터는 GAL4 AD (활성화 도메인) 융합을 위해 사용하였고, pGBKT7 벡터는 GAL4 BD (DNA 결합 도메인) 융합을 위해 사용하였다. GAL1 프로모터의 조절하에 있는 리포터 유전자인 lacZ와 HIS가 염색체에 결합되어 있는 효모 균주 AH109 (leu-, trp-, ade- 및 his-)를 형질전환에 사용하였다. SOC1 유전자의 PCR 산물은 EcoRI과 BamHI으로 자르고 pGBKT7 및 pGADT7 벡터에 서브클로닝하였다. AH109 세포의 형질전환은 제조사의 지시에 따라 실시했다. 획득한 콜로니 (colony)들은 His, Ade, Leu 및 Trp이 없는 배지에 키웠다. 세포 성장 분석 실험의 결과를 확인하기 위해, β-갈락토시다아제 (β-Gal) 분석 실험 역시 시스템 절차에 따라 실시했다.
pBridge 벡터 (Clontech)는 효모 3-혼성체 (yeast three-hybrid) 스크리닝을 위해 사용하였다. SOC1 cDNA는 RT-PCR로 증폭하였고, PCR 산물은 EcoRI과 BamHI로 잘라 pBridge 벡터에 서브클로닝하여 BD-SOC1 구축물을 제작하였다. SOC1 cDNA는 발현이 메티오닌-억제성 (methionone-repressible) pMET25 프로모터에 의해 조절되게 하기 위해, NotI과 BglII으로 자른 pBridge 벡터에 서브클로닝하였다. 발현 구축물들은 효모 AH109 세포 내로 공동-형질전환시켰다. 콜로니들은 기본적으로 Leu, Trp 및 His는 없고, 메티오닌이 있거나 없는 배지에서 키웠다.
10. BiFC 분석 실험
BiFC (Bimolecular fluorescence complementation) 분석 실험은 이전에 기재된 방법으로 수행되었다 (Hong et al ., J. Biol . Chem . 286, 1659-1668, 2011). 전장 SOC1 유전자는 pSATN-cEYFP-C1 벡터 (E3082) 내 EYFP의 C-말단 절반을 코딩하는 유전자 서열의 5' 끝 부분에 융합시켰다. 절단형 SOC1 유전자 서열은 pSATN-nEYFP-C1 벡터 (E3081) 내 EYFP의 N-말단 절반을 코딩하는 유전자 서열의 5' 끝 부분에 융합시켰다. 이 발현 구축물들을 애기장대 원형질체에 공동-형질전환시켰다. 이 융합 구축물의 발현은 Zeiss LSM510 공초점 현미경 (Carl Zeiss MicroImaging)을 사용한 형광 현미경 검사로 관찰되었다. BdSOC1 유전자 구축물도 애기장대 SOC1 유전자 구축물과 비슷한 방법으로 준비되었고, 숲개밀 원형질체에서 일시적으로 발현시켰다.
11. EMSA ( electrophoretic mobility shift assay )
SOC1 유전자는 MBP-코딩 서열을 갖는 pMAL-c2X E. coli 발현 벡터 (NEB, http://www.neb.com/)에 서브클로닝하였다. E. coli에서 만들어진 MBP 융합 단백질은 제조사의 지시에 따라 pMAL® Protein Fusion and Purification System (#E8000S)을 사용하여 정제되었다. γ-32P [dATP]는 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 DNA 절편 끝에 표지되었다. 표지된 프로브들은 경쟁자 DNA (competitor DNA) 절편이 있거나 없는 25℃의 결합 버퍼 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT 및 5% 글리세린)에서 30분 동안 약 1 ㎍의 정제된 MBP 융합 단백질과 함께 반응시켰다. 반응 혼합물은 6% native PAGE 겔에서 분석했고, 겔은 Whatman 3MM 종이 위에서 건조시킨 후 X선 필름에 노출시켰다.
실시예 1. 애기장대에서 a- siPEP 과발현에 의한 SOC1 유전자 결핍 표현형의 유도
애기장대 게놈에서는 적어도 80개의 잠재적인 siPEP들이 코딩되는 것으로 추정된다 (Seo et al ., Trends Plant Sci . 16, 541-549, 2011). 지금까지 확인된 게놈 siPEP의 구조 분석은 그것들이 일반적으로 이합체 형성 (dimerization) 도메인을 보유 하지만 DNA 결합 및 전사 조절에 필요한 다른 단백질 도메인들이 부족한 것을 규명하였다.
애기장대 SOC1 전사인자는 4개의 구분된 도메인을 가지고 있다. MADS 도메인은 DNA 결합에 관여하고, K (keratin-like) 도메인은 단백질-단백질 상호 작용 (이합체 형성)을 매개한다 (도 1a). I (intervening) 도메인은 SOC1-SOC1 동형이합체 형성에 기여하고, C-말단 영역은 전사 조절에서 다양한 기능을 수행한다 (Kaufmann et al ., Gene , 347, 183-198, 2005). 알려진 siPEP에 의해 정의된 구조 기준을 기초로, 본 발명자는 SOC1 전사인자의 잠재적인 a-siPEP 시리즈를 고안하였다 (도 1a).
SOC1의 a-siPEP 코딩 유전자 서열을 애기장대에 형질전환시켰고, 형질전환 식물체의 표현형을 SOC1 유전자 기능 결핍 및 기능 활성화 돌연변이 표현형과 비교하였다 (각각, soc1 -2 및 soc1 -101D). 눈에 띄게, S- MIK - ox, S- IK - ox 및 S-K- ox와 같은 절단형 SOC1 형태가 과발현되는 형질전환 식물체는 soc1 -2 돌연변이처럼 개화지연 표현형을 보였고 (도 1b), K 도메인을 포함하는 절단형 SOC1 형태의 이소성 발현 (ectopic expression)은 SOC1의 활성을 효율적으로 억제한다는 것을 보여준다. MADS 도메인이 과발현되는 S-M- ox 형질전환 식물체도 약간 지연된 개화가 나타났다. 이는 비록 MADS 도메인이 이형이합체를 형성하지 않지만, DNA 결합을 위해 SOC1과 경쟁을 하기 때문에 나타나는 표현형이 확실하다.
본 발명자는 AP1 (APETALA1), CAL (CAULIFLOWER), FUL (FRUITFULL), LFY (LEAFY) 및 SPL (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN - LIKE)과 같은 SOC1 다운스트림 유전자의 발현을 분석하였다. 검사된 모든 유전자들은 soc1 -101D 돌연변이체에서 발현이 증가했다 (도 2). 대조적으로, AP1, SPL3 및 SPL5의 발현은 soc1 -2 돌연변이체에서 관찰된 것처럼 S-K- ox 형질전환 식물체에서 억제되었다. 한편, 내재성 (endogenous) SOC1 유전자의 공동-억제 (co-suppression)가 S-K- ox 식물체에서 관찰되지 않아서, S-K-ox 표현형은 S-K 유전자의 과발현에 의해 발생하는 것으로 나타났다 (도 2).
실시예 2. SOC1 a- siPEP 에 의한 SOC1 의 핵내 이입 및 DNA 결합 억제
MADS 전사인자들의 동형- 및 이형이합체 형성은 대상 유전자 프로모터에 대한 그들 전사인자의 결합을 위해 중요한 것으로 알려져있다 (Kaufmann et al ., Gene, 347, 183-198, 2005). 따라서 본 발명자들은 절단형 SOC1 형태가 비기능적 이합체를 형성하여 SOC1의 활성을 방해할 것이라는 가설을 세웠고, 효모-2-혼성체-혼성체-2-hybrid) 분석으로 SOC1이 동형이합체를 형성한다는 것을 밝혀냈다 (도 3a). 또한, SOC1은 S-MIK, S-IK 및 S-K와 같은 절단형 SOC1 형태들과도 상호작용하였다. E. coli 세포에서 만들어진 재조합 말토스 결합 단백질 SOC1 (MBP-SOC1) 및 시험관 내 번역을 통해 제조된 절단형 SOC1 폴리펩티드를 이용한 시험관 내 풀-다운 (pull-down) 분석 실험에서 SOC1-SOC1 동형이합체 및 SOC1과 절단형 SOC1의 이형이합체 형성을 확인하였다 (도 3b).
다음으로 본 발명자는 절단형 SOC1이 SOC1-SOC1 동형이합체의 형성을 감소시키는지 확인하였다. 이 실험에서는, 절단형 SOC1 단백질이 효모세포에서 메티오닌 (Met)-억제성 프로모터의 조절하에서 발현되었다. SOC1 유전자는 GAL4의 활성화 도메인 (AD) 또는 DNA 결합 도메인 (BD)을 코딩하는 유전자 서열에 융합되었고, AD-SOC1 및 BD-SOC1 융합물은 MET25 구축물과 공동 발현되었다. AD-SOC1은 Met 결핍 하에서 효율적으로 BD-SOC1과 상호작용하였다. 그러나, Met 존재 하에서, 효모 세포의 성장 및 β-갈락토시다아제 활성 분석은 SOC1-SOC1 동형이합체의 형성이 S-K 형태와 같은 절단형 SOC1에 의해 저해된다는 것을 보여주었다 (도 3c).
핵 위치화 신호 (Immink et al ., Proc . Natl Acad . Sci . USA 99:2416-2421, 2002)를 포함하는 S-M을 제외한 절단형 SOC1이 주로 세포질에 위치한다는 것을 발견했다. BiFC (Bimolecular fluorescence complementation) 분석은 SOC1과 절단형 SOC1의 이형이합체가 주로 세포질에서 입상 형태 (granular pattern)로 검출되고, 부분적으로 핵 내에서 검출된다는 것을 밝혔고 (도 3d), 이는 절단형 SOC1이 적어도 부분적으로 핵에서 SOC1을 격리시킨다는 것을 나타낸다. 이형이합체의 점 모양 분포는 단백질 분해 및/또는 분비 경로와 연관되기 때문일 것이다. EMSA는 S-K 형태 또한 SOC1의 DNA 결합을 감소시킨다는 것을 보여주었고, 핵 내에서 SOC1 활성이 더 저해된다는 생각을 뒷받침해준다. 게다가, 애기장대 원형질체에서의 일시적 발현 분석은 SOC1의 전사인자 활성이 S-K 형태에 의해 저해된다는 것을 보여준다 (도 3e, f). 이러한 관찰은 절단형 SOC1이 핵으로부터 SOC1을 격리시키고, DNA에 결합하는 것을 방지함으로써 SOC1 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
실시예 3. 애기장대 AG 전사인자에 대한 a- siPEP 매개 불활성화
한 가지 의문은 a-siPEP 매개 불활성화가 다른 전사인자에도 적용되는가 이다. 이것을 증명하기 위해, 본 발명자는 꽃 구조를 형성하는데 중요한 역할을 하는 전사인자인 AG의 절단형 시리즈를 제작하였고 (도 4a), Col-0 식물에서 절단형 AG가 과발현된 것을 선발했다. 전반적으로 절단형 AG가 과발현되는 애기장대 식물체들의 표현형은 Col-0 식물체의 표현형과 구별되지 않았다 (도 6). 흥미롭게도, K 도메인을 포함하는 절단형 AG가 과발현된 형질전환 식물체에서는 ag -3 넉아웃 (knockout) 돌연변이체에서 관찰되는 것과 같은 망가진 꽃 구조가 나타났다 (도 4b). 게다가, AG-K의 과발현은 비정상적인 꽃 구조를 야기하는 반면, K 도메인에 점 돌연변이 (point mutation)를 가진 AG-mK 및 AG와 상호작용할 수 없는 형태는 꽃 발달에서 눈에 보이는 효과는 없었다. 이러한 관찰은 AG에 대한 AG-K의 부정적 효과가 K 도메인에 의해 매개되는 단백질-단백질 상호작용을 통해 발생한다는 것을 뒷받침해준다.
꽃 발달에 대한 AG-K 형태의 효과를 더 확인하기 위해, 본 발명자는 DAD1 (DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE 1) 및 GIK (GIANT KILLER)를 포함하는 AG 유전자의 다운스트림에서 작동하는 유전자의 발현을 AG -K- ox 형질전환 식물체에서 분석하였다. DAD1 및 GIK 유전자는 ag 넉아웃 돌연변이체에서 관찰된 것처럼 (Ng et al ., PLoS Biol . 7, e1000251, 2009), AG -K- ox 형질전환 식물체에서 억제되었다 (도 4c). AG 및 AG -K 유전자의 발현 연구는 내재성 AG 유전자의 공동-억제가 아니라는 것을 보여주며 (도 4d), AG -K- ox 형질전환 식물체의 망가진 꽃 구조가 SOC1 특이적 a-siPEP의 역할과 유사하게 AG-K 형태의 과발현 때문이라는 것을 나타낸다.
실시예 4. 숲개밀 ( Brachypodium )에 a- siPEP 도구의 적용
본 발명자는 다음으로 바이오 연료 잔디 연구를 위한 모델 시스템으로 널리 이용되는 단자엽 모델 식물 숲개밀 (Brachypodium)에서 a-siPEP 도구의 실행 가능성 (feasibility)을 검사하였다. 추정되는 숲개밀 SOC1 단백질 (BdSOC1)은 아미노산 서열 분석 및 단백질 도메인 예측에 의해 규명되었다 (도 5a). 몇 가지 절단형 BdSOC1을 코딩하는 유전자들이 숲개밀 식물에 형질전환되었다. 절단형 BdSOC1이 과발현되는 형질전환 숲개밀 식물은 절단형 SOC1이 과발현되는 형질전환 애기장대 식물에서 관찰된 것처럼 지연된 출수 (heading)가 나타났다 (도 5b, c). 지연된 개화는 K 도메인이 과발현된 BdS -K- ox 형질전환 식물체에서 가장 눈에 띄게 나타났다. 지연된 개화와 일치하는, AP1, CAL 및 FUL과 같은 BdSOC1의 다운스트림 유전자의 발현은 BdSOC1 - ox 식물체에서 상승했지만, BdS -K- ox 식물체에서는 억제되었다 (도 5d).
E. coil 세포에서 생산된 재조합 MBP-BdSOC1 단백질 및 시험관 내 번역에 의해 제조된 절단형 BdSOC1 폴리펩티드를 이용한 시험관 내 풀-다운 분석은 BdSOC1이 BdS-MIK, BdS-IK 및 BdS-K와 같은 절단형 및 BdSOC1 자체와 상호작용한다는 것을 보여주었다 (도 6a). 절단형은 대부분 세포질에 위치하였고, 애기장대 SOC1의 a-siPEP에서 관찰된 것처럼 이형이합체는 주로 세포질에서 검출되었고, 부분적으로 핵 내에서 검출되었다 (도 6b). 본 발명자는 a-siPEP가 대상 DNA에 대한 BdSOC1 단백질의 결합을 방지할 수 있다고 예상하였다. 이러한 결과들은 애기장대 개화에서의 절단형 SOC1의 역할과 유사한 방식으로, 절단형 BdSOC1이 BdSOC1을 비활성화시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 5. 생체 시계 조절에서 a- siPEP 에 의한 LHY 전사인자의 비활성화
많은 전사인자들은 게놈 siPEPs에 의한 표적이 될 수 있다. 본 발명자는 a-siPEP가 애기장대 및 숲개밀에서 MADS 박스 전사인자인 SOC1 및 AG를 비활성화시킨다는 것을 밝혔다.
a-siPEP 도구가 다른 전사인자에도 적용되는지 알아보기 위해, 본 발명자는 생체 시계 (circadian clock) 조절에 관여하는 MYB 전사인자인 LHY의 a-siPEP를 고안하였다. LHY 전사인자는 260개의 잔기로 구성된 추정 이합체 형성 도메인 (putative dimerization domain, DD)을 가지고 있으며 (도 7a), 이는 생체리듬 진동 (oscillation) 유지에서 CCA1 (CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1)과 상호작용에 중요하다 (Lu et al ., Plant Physiol . 150, 834-843, 2009). LHY-DD 도메인을 코딩하는 유전자 서열을 Col-0 식물체에 형질전환하여, LHY - DD - ox 형질전환 식물체를 얻었다.
lhy 기능 상실 돌연변이체는 표현형적으로 야생형 식물체와 구분되지 않지만, 변형된 생체리듬을 나타낸다 (Mizoguchi et al ., Dev . Cell , 2, 629-641, 2002). 특히, 생체 진동의 주기가 LHY 결핍 돌연변이체에서 관찰된 것처럼, LHY - DD - ox 형질전환 식물체에서도 단축되는 것을 확인하였다 (도 7b).
LHY-LHY 및 CCA1-CCA1 동형이합체 및 LHY-CCA1 이형이합체의 동적 형성 (dynamic formation)은 생체 시계 기능에서 중요한 역할을 수행하고, 생체 리듬은 cca1 lhy 이중 돌연변이체에서 심각하게 변경된다 (Lu et al ., Plant Physiol . 150, 834-843, 2009). 본 발명자는 TOC1 유전자 발현의 리듬성이 LHY - DD - ox 형질전환 식물체에서 관찰된 것처럼 CCA1 결핍 cca1 -2 돌연변이체에서 약간 변경되는 것을 발견했는데, 이는 LHY-DD가 LHY-LHY 및 CCA1-LHY 상호작용은 억제하지만, CCA1-CCA1 상호작용에는 영향을 미치지 않기 때문일 것이다. 이러한 관찰은 a-siPEP 도구가 MYB 전사인자인 LHY에도 적합하다는 것을 나타내며, 더욱 다양한 전사인자들을 대상으로 a-siPEP 도구의 광범위한 유용성을 뒷받침한다.
본 발명은 게놈 siPEP를 구조적으로 모방한 a-siPEP가 표적 전사인자의 핵 위치화 및 DNA 결합을 감소시킴으로써 애기장대 및 숲개밀에서 다양한 전사인자를 효과적으로 불활성화시킬 수 있다는 것을 증명하였다 (도 8). 또한, 본 발명의 데이터는 a-siPEP 도구가 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에 쉽게 적용가능하다는 것을 강하게 뒷받침한다.
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Claims (20)

  1. 서열번호 1 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 식물체 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하면서, 상기 전사인자의 절단형 (truncated form)인 것을 특징으로 하는 인공간섭 펩티드 (a-siPEP; artificial small interfering peptide)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터로 형질전환되어 전사인자의 활성이 저해된 식물체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인공간섭 펩티드는 전사인자와 비기능적 (nonfunctional) 이합체를 형성하여 전사인자의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 전사인자의 활성이 저해된 식물체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인공간섭 펩티드는 전사인자의 DNA 결합 또는 핵 내로의 이동을 저해하여 전사인자의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 전사인자의 활성이 저해된 식물체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 전사인자는 DNA 결합 도메인 및 이합체 형성 도메인(단백질-단백질 상호작용 매개 도메인)을 포함하는 것을 특징으로 하는 전사인자의 활성이 저해된 식물체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전사인자는 DNA 결합 도메인, 이합체 형성 도메인(단백질-단백질 상호작용 매개 도메인), 전사인자의 동형이합체 형성 기여 (contribution) 도메인 및 전사조절 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 전사인자의 활성이 저해된 식물체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인공간섭 펩티드는 이합체 형성 도메인만을 포함하여 전사인자의 활성을 저해하는 전사인자의 절단형, 이합체 형성 도메인과 DNA 결합 도메인을 포함하나 전사조절 도메인을 포함하지 않아 전사인자의 활성을 저해하는 전사인자의 절단형 또는 이합체 형성 도메인과 전사조절 도메인을 포함하나 DNA 결합 도메인을 포함하지 않아 전사인자의 활성을 저해하는 전사인자의 절단형인 것을 특징으로 하는 전사인자의 활성이 저해된 식물체.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 전사인자는 SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSOR OF CONSTANS 1), BdSOC1 (Brachypodium distachyon SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSOR OF CONSTANS 1), AG (AGAMOUS) 또는 LHY (LATE ELONGATED HYPOCOTYL)이며, 각각 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 전사인자의 활성이 저해된 식물체.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 서열번호 1 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 식물체 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하면서, 상기 전사인자의 절단형 (truncated form)인 것을 특징으로 하는 인공간섭 펩티드 (a-siPEP; artificial small interfering peptide)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 전사인자 활성을 저해하는 방법.
  15. 서열번호 1 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 식물체 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하면서, 상기 전사인자의 절단형 (truncated form)인 것을 특징으로 하는 인공간섭 펩티드 (a-siPEP; artificial small interfering peptide)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 인공간섭 펩티드 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  16. 제15항의 방법에 의해 제조된 전사인자의 활성이 저해된 형질전환 식물체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  18. 제16항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대 또는 숲개밀 (Brachypodium distachyon)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  19. 제16항에 따른 식물체의 종자.
  20. 서열번호 1 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 식물체 전사인자의 이합체 형성 도메인 (dimerization domain)을 필수적으로 포함하면서, 상기 전사인자의 절단형 (truncated form)인 것을 특징으로 하는 인공간섭 펩티드 (a-siPEP; artificial small interfering peptide)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터를 함유하는 식물체의 전사인자 활성 저해용 조성물.
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