KR101756180B1 - AtHPY2 유전자를 이용한 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 촉진하는 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AtHPY2 유전자를 이용한 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 촉진하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 본 발명을 통해 곡류, 두류, 작물 등의 유용작물의 개화시기를 조절할 유전자로 AtHPY2 유전자를 활용함으로써 특정 환경에서의 재배지역 확대와 생산량 증대로 미래의 식량안보 문제의 대안으로 이용될 수 있을 것이다. 또한, 개화시기를 촉진시켜 원예작물의 꽃과 종자를 단기간 내에 생산함으로써 생산량을 증대시킬 수 있고 개화시기를 지연시켜 영양생장을 계속 유지시킴으로써 잎이나 줄기 등의 유용한 부분의 생산량을 증대시킬 수 있다. 또한, 식물을 이용해 대체에너지를 개발하는 분야의 사업에 대체에너지로 사용되는 식물의 수확량을 개화시기의 조절로 증가시켜 대체 에너지 생산에 큰 이점을 가져올 것으로 예상된다.

Description

AtHPY2 유전자를 이용한 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 촉진하는 방법 및 그에 따른 식물체{Method for promoting sumoylation of FLC protein using AtHPY2 gene in plant and the plant thereof}

본 발명은 AtHPY2 유전자를 이용한 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 촉진하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 AtHPY2 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 FLC(Flowering Locus C) 단백질의 수모화(sumoylation)를 촉진하는 방법, 상기 방법에 의해 FLC 단백질의 수모화(sumoylation)가 촉진된 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체, 상기 식물체의 종자 및 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 FLC 단백질의 수모화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

번역 후 변형(Post-translational modification)은 단백질의 기능 및 안정성 조절을 위한 하나의 중요한 기작이다. 현재까지, 200 종류 이상의 단백질 변형이 보고되었다(Castro et al., 2012 Cell. Mol . Life Sci . 　69, 3269-8323). 이러한 단백질 변형 중 하나인 수모화(sumoylation)는 SUMO(small ubiquitin-related modifier)의 첨가를 위해 리신을 타겟으로 한다(Wilkinson and Henley, 2010 Biochemical J. 428, 133-145). SUMO는 약 11 kDa의 분자량을 갖는 작은 펩티드이다. 효모 및 동물 시스템에서, SUMO는 스트레스 및 방어 반응, 질소 대사, 호르몬 신호전달, 후성 유전자(epigenetic gene) 발현, 생장 및 개화와 같은 다양한 세포의 과정을 조절한다(Hotson et al., 2003 Mol . Microbiol . 50, 377-389).

표적 단백질에 대한 SUMO의 결합은 리가아제와 독립적으로 발생할 수 있지만, SUMO에 의한 표적 단백질의 변형은 일반적으로 E3 SUMO 리가아제에 의해 촉매된다(Wilkinson and Henley, 2010 Biochemical J. 428, 133-145). 현재까지 규명된 4가지 유형의 E3 SUMO 리가아제는 RanBP2(RanGAP1-binding protein 2), Pc2(polycomb group 2), NES2/MMS21(non-SMC element/methyl methanesulfonate sensitive 1) 및 SIZ/PIAS(SAP and MIZ/protein inhibitor of activated STAT)이다(Verger et al., 2003 EMBO Rep. 4, 137-142). PIAS/SIZ-유형 E3 SUMO 리가아제는 5개의 도메인을 갖는다: SAP, PINIT, SP-RING finger, SXS, 및 PHD(Miura et al., 2007 Curr. Opin. Plant Biol . 10, 495-502). 현재까지, 2가지 PIAS-유형 SUMO E3 리가아제, SIZ1 및 HPY2(High Ploidy 2)(Ishida et al., 2009 Plant Cell 21, 2284-2297)가 애기장대에서 보고되었다.

AtSIZ1는 양분 흡수, 호르몬 신호전달, 생장, 개화 및 스트레스 반응에 관련된다(Catala et al., 2007 Plant Cell 19, 2952-2966). AtSIZ1은 질산환원효소(nitrate reductase) NIA1 및 NIA2, ICE1(CBF 발현의 유도인자 1), R2R3-유형 전사인자 MYB30, FLC(FLOWERING LOCUS C), SLY1(SLEEPY1) 및 CMT3(chromomethylase 3)를 포함하여 다양한 표적 단백질을 갖는다(Conti et al., 2014 Dev . Cell 28, 102-110).

AtHPY2는 AtSIZ1보다 훨씬 더 작은 크기로 249개의 아미노산 및 단일 도메인(SP-RING 징크 핑거 도메인)으로 구성된다. HPY2의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없지만, 연구들은 HPY2가 세포주기 진행, 분열조직 발달 및 옥신 신호전달 조절에 관련된다고 제안한다(Ishida et al., 2009 Plant Cell 21, 2284-2297). AtSIZ1 및 HPY2는 다른 발현 양상을 보이며, 이들의 돌연변이체는 서로 다른 왜성(dwarf) 표현형을 나타낸다. 또한, 이들의 상호(reciprocal) 발현은 단일-돌연변이체 표현형을 보완하지 않는다(Ishida et al., 2012 MMS21/HPY2 and SIZ1, two Arabidopsis SUMO E3 ligases, have distinct functions in development. PLoS One 7, e46897). HPY2에 의한 특정한 표적 단백질의 수모화에 대한 연구는 현재까지 보고되지 않았다.

MADS-박스 전사 인자인 FLC는 개화시기의 조절에 참여한다(Samach et al., 2000 Science 288, 1613-1616). FLC의 발현은 자율 경로(autonomous pathway) 요소 및 춘화처리(vernalization)에 의해 음성적으로 조절되고(Sheldon et al., 1999 Plant Cell 11, 445-458), FLC 전사는 후성적 메틸화에 의해 조절된다(Swiezewski et al., 2009 Nature 462, 799-802). SINAT5의 E3 유비퀴틴 리가아제 활성에 의한 유비퀴틴화는 FLC 안정성을 조절하는 것으로 여겨진다(Park et al., 2007 Plant Sci . 173, 269-275). 연관된 E3 SUMO 리가아제는 여전히 규명되지 않았지만, FLC의 기능 및 안정성은 수모화에 의해서도 조절된다(Son et al., 2014 J. Exp . Bot. 65, 339-351). 이러한 결과들은 번역 후 기작이 FLC에 의한 꽃 전환(floral transition)의 조절에 관련된다는 것을 제시한다. 그러나, FLC의 전사 조절은 상대적으로 잘 규명되어 있지만, FLC의 근본적인 번역 후 변형 기작은 여전히 불명확하다.

본 발명에서는 FLC에 대한 E3 SUMO 리가아제로서 이의 수모화를 촉매하기 위해 FLC와 직접적으로 상호작용하는 HPY2 기능을 첫번째 증거로 제공한다. 수모화는 FLC를 안정화시키고, HPY2의 손실은 조기 개화를 초래한다. 이러한 결과는 HPY2가 FLC 수모화를 통해 FLC-매개 개화 억제를 양성적으로 조절한다는 것을 나타낸다.

한편, 한국공개특허 제2014-0143259호에서는 'AtSIZ1 유전자를 이용한 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 억제하는 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2004-0075252호에서는 '식물의 개화시기 조절 유전자 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 'AtHPY2 유전자를 이용한 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 촉진하는 방법 및 그에 따른 식물체'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 AtHPY2이 FLC 단백질과 상호작용하는 점을 확인하였는데, 특히 AtHPY2이 식물체의 FLC 단백질의 154번째 라이신 잔기(K154)를 수모화하여 FLC 단백질을 안정화시켜 식물체의 개화를 지연시키는 것을 확인하였고, 또한 hpy2 돌연변이체는 조기 개화를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 AtHPY2 유전자를 식물체의 개화조절인자로 이용할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 AtHPY2 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 FLC(Flowering Locus C) 단백질의 수모화(sumoylation)를 촉진하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 AtHPY2 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 FLC 단백질의 수모화(sumoylation)가 촉진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 FLC 단백질의 수모화가 촉진된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 FLC 단백질의 수모화가 촉진된 식물체의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 FLC 단백질의 수모화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, AtHPY2 단백질이 FLC와 직접적으로 상호작용함으로써, AtHPY2 단백질에 의한 FLC 단백질의 수모화가 FLC 단백질을 활성화 및 안정화하여 식물체의 개화시기를 조절한다는 것을 확인하였다. 따라서, 곡류, 두류, 작물 등의 유용작물의 개화시기를 조절할 유전자로 활용함으로써 특정 환경에서의 재배지역 확대와 생산량 증대로 미래의 식량안보 문제의 대안으로 이용될 수 있을 것이다. 또한, 개화시기를 촉진시켜 원예작물의 꽃과 종자를 단기간 내에 생산함으로써 생산량을 증대시킬 수 있고 개화시기를 지연시켜 영양생장을 계속 유지시킴으로써 잎이나 줄기 등의 유용한 부분의 생산량을 증대시킬 수 있다. 또한, 식물을 이용해 대체에너지를 개발하는 분야의 사업에 대체에너지로 사용되는 식물의 수확량을 개화시기의 조절로 증가시켜 대체 에너지 생산에 큰 이점을 가져올 것으로 예상된다.

도 1은 HPY2와 FLC의 상호작용을 나타낸다. (A) His₆-FLC 및 GST-HPY2는 대장균에서 과발현되었고, Ni^{2 +}-NTA 또는 글루타티온(glutathione) 친화성 컬럼으로 정제되었다. (B) His₆-FLC 단백질은 GST-HPY2 단백질로 풀 다운(pull-down)되었고, 11% SDS-PAGE 상에서 분리된 후 항-His 항체를 사용하여 웨스턴 블럿으로 분석되었다. (C) 생체 내 HPY2 및 FLC의 상호작용. 야생형(WT) 식물은 다양한 조합의 35S-Myc ₆ -FLC 또는 35S- HPY2 - FLAG ₃ 구축물로 침윤되었다. 총 단백질은 각 샘플들로부터 추출되었고, 항-FLAG 항체를 이용하여 면역침전되었다. 면역침전 후, Myc₆-FLC는 항-Myc 항체를 사용한 웨스턴 블럿으로 검출되었다. Myc₆-FLC 및 HPY2-FLAG₃ 발현은 또한 항-Myc 항체 및 항-FLAG 항체를 각각 사용한 웨스턴 블럿으로 조사되었다.
도 2는 FLC가 HPY2에 의해 시험관 내에서 수모화된다는 것을 나타낸다. 애기장대 His₆-AtSAE1b, His₆-AtSAE2, His₆-AtSCE1, GST-HPY2, His₆-AtSUMO1 및 GST-FLC-Myc는 대장균에서 과발현되었고, Ni²⁺-NTA 또는 글루타티온 친화성 컬럼으로 적절하게 정제되었다. GST-FLC-Myc의 수모화는 E1(His₆-AtSAE1b 및 His₆-AtSAE2), E2(His₆-AtSCE1), E3(GST-HPY2) 및 His₆-AtSUMO1의 존재 또는 부재 하에 분석되었다. FLC 수모화는 항-Myc 항체를 사용하여 웨스턴 블럿으로 검출되었다. FLC 상의 수모화 위치를 확인하기 위해, GST-FLCm1-Myc(K54R), GST-FLCm2-Myc(K135R) 및 GST-FLCm3-Myc(K154R)가 대장균에서 과발현되었고, 글루타티온 친화성 컬럼을 사용하여 정제되었다. 반응 혼합물은 GST-FLC-Myc 대신에 돌연변이체 단백질을 포함하지 않거나(-), 포함하는(+) E1(His₆-AtSAE1b 및 His₆-AtSAE2), E2(His₆-AtSCE1), E3(GST-HPY2) 및 His₆-AtSUMO1을 함유하였다. FLC 수모화는 항-Myc 항체를 사용한 웨스턴 블럿으로 검출되었다.
도 3은 FLC가 생체 내에서 HPY2에 의해 안정화된다는 것을 나타낸다. 35S-FLC-FLAG ₃ 및 XVE - HA ₃ - HPY2 (A) 또는 35S- mFLC ( K154R )- FLAG ₃ 및 XVE - HA ₃ - HPY2 (B)를 포함하는 이중 형질전환 식물체는 HPY2 발현을 유도하기 위해 β-에스트라디올이 포함된 액체 배지에서 배양되었다. 15시간 동안 배양한 후, HA₃-HPY2, FLC-FLAG₃ 및 mFLC-FLAG₃ 수준이 항-HA 항체 또는 항-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블럿으로 평가되었다. 튜불린은 로딩 대조구로 사용되었다. 레인 아래의 숫자는 상대적인 강도를 나타낸다. 단백질 수준은 유도물질이 없는 FLC 또는 mFLC 수준을 1.00 값으로 표준화되었다(양쪽 패널에서 "-"으로 표시). FLC - FLAG ₃ 및 mFLC - FLAG ₃ 의 RNA 농도는 FLAG 프라이머 및 유전자 특이적 프라이머를 사용한 실시간 qRT-PCR에 의해 측정되었다. 튜불린 RNA는 로딩 대조구로 사용되었다. (C)(B)의 튜불린, FLC -FLAG ₃ 및 mFLC - FLAG ₃ 전사체 수준의 도표화. 막대는 표준 오차를 나타낸다(n=3).
도 4는 hpy2-2 돌연변이체의 개화시기를 나타낸다. 조기 개화는 장일 및 단일 조건하에서 자란 hpy2-2 돌연변이체에서 관찰되었다(A). 개화시기는 화서가 나타났을 때 존재하는 로제타 잎의 수를 계수하여 조사되었다(B). 야생형 및 hpy2-2 식물에서 로제타 잎의 수는 유의한 차이가 있었다(P < 0.0001, t-test, n = 20). 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 5는 hpy2-2 돌연변이체에서 개화-관련 유전자의 전사체 수준을 나타낸다. 총 RNA는 장일 또는 단일 조건 하의 토양에서 자란 야생형 및 hpy2-2 돌연변이체 식물의 잎에서 분리되었다. 전사체 수준은 유전자 특이적 프라이머를 이용한 실시간 qRT-PCR로 조사되었다. 실험 결과는 평균±SD로 표현되었다(n=3). 약어: FLC: FLOWERING LOCUS C; SOC1: SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1; FT: FLOWERING LOCUS T; TSF: TWIN SISTER OF FT.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 AtHPY2 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 FLC(Flowering Locus C) 단백질의 수모화(sumoylation)를 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 AtHPY2 단백질 또는 FLC 단백질의 범위는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명에 따른 수모화(sumolyation)는 SUMO(small ubiquitin-like modifier)의 C-말단의 카르복실기와 기질의 라이신 잔기의 ε-아미노기 간에 이소펩티드 결합이 형성되는 것으로, SUMO의 결합을 통해 번역 이후 수모화(sumoylation)를 통해 세포 내 단백질의 기능을 변화시키는 반응이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, AtHPY2 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열일 수 있으며, FLC 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 FLC 단백질의 수모화는 FLC 단백질의 안정성 및 활성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다시 말하면, AtHPY2 단백질은 FLC 단백질과 서로 결합할 수 있으며, AtHPY2 유전자가 과발현된 식물체 내의 FLC 단백질 농도를 증가시키며, AtHPY2 단백질은 FLC 단백질과 결합하여 FLC 단백질의 안정성 및 활성을 증가시키며, AtHPY2 단백질은 FLC 단백질의 수모화를 촉진한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 FLC 단백질의 수모화는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 FLC 단백질의 154번째 아미노산 잔기에서 발생할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 AtHPY2 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 AtHPY2 유전자를 과발현시키는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 FLC 단백질의 수모화가 촉진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, AtHPY2 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열일 수 있으며, FLC 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 FLC 단백질의 수모화는 FLC 단백질의 안정성 및 활성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다시 말하면, AtHPY2 단백질은 FLC 단백질과 서로 결합할 수 있으며, AtHPY2 유전자가 과발현된 식물체 내의 FLC 농도를 증가시키며, AtHPY2 단백질은 FLC 단백질과 결합하여 FLC 단백질의 안정성 및 활성을 증가시키며, AtHPY2 단백질은 FLC 단백질의 수모화를 촉진한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 FLC 단백질의 수모화는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 FLC 단백질의 154번째 아미노산 잔기에서 발생할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 FLC 단백질의 수모화가 촉진된 형질전환 식물체 및 상기 식물체의 종자를 제공한다.

또한 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물이 될 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 FLC 단백질의 수모화 촉진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 촉진할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료 및 생장 조건

콜롬비아-백그라운드 생태형 애기장대(Columbia-background ecotype Arabidopsis thaliana, 야생형) 및 T-DNA 삽입 hpy2 -2 돌연변이체가 본 발명에 사용되었다. 종자를 멸균하기 위해, 야생형 및 hpy2 -2 돌연변이체 종자는 10분 동안 5% 차아염소산 나트륨 및 0.1% 트리톤 X-100이 처리되었다. 배지에서의 발아 및 생장을 위해, 종자는 증류수로 철저하게 세척된 후 4℃에서 암조건으로 보관되었다. 4일 후, 종자는 2% 수크로스가 포함된 MS(Murashige and Skoog) 아가 배지에 치상되었다. 토양 재배 식물을 준비하기 위해, 야생형 및 hpy2 -2 돌연변이체 종자가 질석 토양에 직접 파종되었다. 실생을 포함한 식물은 16시간 광/8시간 암주기(장일) 또는 8시간 광/16시간 암주기(단일) 조건으로 22℃의 생장상에서 재배되었다.

재조합 플라스미드의 구축

His₆-FLC 및 GST-HPY2를 제작하기 위해, 전장 FLC 및 HPY2 cDNA가 PCR로 증폭되었고, pET28a(Novagen) 및 pGEX4T-1(Amersham Biosciences) 벡터로 각각 클로닝되었다. GST-FLC-Myc를 준비하기 위해, 전장 FLC cDNA는 Myc 태그 추가를 위한 프라이머를 사용하여 증폭되었고, pGEX4T-1에 클로닝되었다. FLC 돌연변이체 단백질 GST-FLCm1(K5R)-Myc, GST-FLCm2(K135R)-Myc 및 GST-FLCm3(K154R)-Myc는 선행연구에 기술된 방법으로 준비되었다(Son et al., 2014 J. Exp . Bot. 65, 339-351). 숫자들은 라이신(K) 잔기의 위치를 나타내며, R은 라이신의 아르기닌 잔기로의 대체를 나타낸다. His₆-AtSUMO1의 제작을 위해, 애기장대 전장 SUMO1 cDNA가 PCR로 증폭되었고, pET28a에 클로닝되었다. 프라이머 서열은 하기 표 1에 기술되었다.

재조합 단백질의 정제

모든 재조합 단백질은 대장균 균주 BL21에서 발현되었고, 선행연구에 기술된 방법으로 정제되었다(Colby et al., 2006 Plant Physiol . 142, 318-332). 간단하게는, His₆-AtSUMO1, His₆-FLC, SUMO-활성화 효소 E1(His₆-AtSAE1b 및 His₆-AtSAE2) 및 SUMO-접합 효소 E2(His₆-AtSCE1)는 Ni^{2 +}-NTA(nitrilotriacetate) 레진(Qiagen)으로 정제되었다. GST, GST-FLC-Myc, GST-FLCm1(K5R)-Myc, GST-FLCm2(K135R)-Myc, GST-FLCm3(K154R)-Myc 및 GST-HPY2는 글루타티온(glutathione) 레진(Pharmacia)으로 정제되었다.

시험관 내(In vitro) 및 생체 내(in vivo) 상호작용 분석

GST-HPY2 및 His₆-FLC 사이의 상호작용을 평가하기 위한 시험관 내 풀-다운 분석(pull-down assay)이 각 2 ㎍의 GST-HPY2 베이트(bait) 및 His₆-FLC 프레이(prey)를 사용하여 선행연구에 기술된 방법으로 수행되었다. His₆-FLC는 항-His 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 웨스턴 블럿으로 검출되었다.

식물 발현 플라스미드는 생체 내 HPY2 및 FLC 사이의 직접 상호작용을 조사하기 위해 구축되었다. FLC 발현을 위해, 해당 전장 cDNA는 헥사머릭 Myc(Myc₆)를 추가하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 증폭되었고, pBA002 벡터로 클로닝되었다. HPY2 발현을 위해, 해당 전장 cDNA는 정방향 프라이머 및 FLAG₃ 태그를 추가하기 위한 역방향 프라이머를 사용한 PCR로 증폭되었고, pBA002 벡터로 클로닝되었다. 헥사머릭 Myc-태깅 또는 트라이머릭(trimeric) FLAG-태깅 프라이머는 DNA 합성기(Bioneer)로 합성되었다. 야생형 애기장대 식물은 35S-Myc ₆ -FLC 또는 35S-HPY2-FLAG ₃ 구축물로 형질전환된 다른 조합의 아그로박테리움으로 침윤되었다. 총 단백질은 침윤 2일 후에 각 샘플들로부터 추출되었고, Myc₆-FLC 및 HPY2-FLAG₃는 각각 항-Myc 및 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블럿으로 검출되었다. 최종적으로, 총단백질은 각 샘플들로부터 추출되었고, 50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF 및 단백질 분해효소 억제제 칵테일(Promega)을 포함하는 버퍼에서 항-FLAG 항체(1 ㎍/mL, Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 면역침전되었다. FLC는 항-Myc 항체(0.5 mg/mL, Sigma-Aldrich)를 이용한 웨스턴 블럿 분석에 의해 면역침전된 샘플들에서 검출되었다.

수모화(Sumoylation) 분석

시험관 내 수모화는 50 ng의 His₆-AtSAE1b, 50 ng의 His₆-AtSAE2, 50 ng의 His₆-AtSCE1, 8 ㎍의 His₆-AtSUMO1 및 100 ng의 GST-FLC-Myc가 포함되고, 200 ng의 GST-HPY2가 포함되거나, 포함되지 않은 30 ㎕의 반응버퍼 [200 mM Hepes(pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP]에서 수행되었다. 30℃에서 3시간 동안 배양한 후, 반응 혼합물은 11% SDS-PAGE 겔 상에서 분리되었다. 수모화된 GST-FLC-Myc는 항-Myc 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용한 웨스턴 블럿 분석으로 검출되었다. 수모화 반응은 또한 야생형 FLC(GST-FLC-Myc) 및 돌연변이체 FLC(GST-FLCm1(K5R)-Myc, GST-FLCm2(K135)-Myc 또는 GST-FLCm3(K154R)-Myc)를 이용하여 SUMO에 의해 변형된 라이신 잔기를 확인하기 위해 상기 기술된 방법으로 수행되었다.

단일 및 이중 형질전환 식물체의 제작

FLC- 또는 mFLC(K154R)-과발현 식물체는 선행연구에 기술된 꽃 침지법(floral dipping)(Son et al., 2014 J. Exp . Bot. 65, 339-351)으로 제작되었다. HPY2 및 FLC 또는 mHPY2 및 mFLC를 과발현하는 이중 형질전환 애기장대 식물체는 XVE - HA ₃ - HPY2 및 35S-FLC-FLAG ₃ 또는 XVE-HA ₃ -HPY2 및 35S-mFLC-FLAG ₃ 의 도입에 의해 제작되었다. 재조합 플라스미드 XVE-HA ₃ -HPY2는 트라이머릭 HA(HA₃)로 태깅된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 HPY2 cDNA의 증폭 및 pET8 벡터로 상기 결과물 단편의 삽입에 의해 생성되었다.

생체 내 FLC 안정성에 대한 HPY2 효과의 조사

2개의 독립적인 형질전환 35S-FLC-FLAG ₃ 및 XVE HA ₃ -HPY2 라인 및 2개의 독립적인 형질전환 35S-mFLC-FLAG ₃ 및 XVE HA ₃ -HPY2 라인이 실험에 사용되었다. XVE HA ₃ -HPY2 및 35S-FLC-FLAG ₃ 또는 XVE HA ₃ -HPY2 및 35S-mFLC-FLAG ₃ 를 갖는 2주령의 이중 형질전환 식물체는 10 μM의 β-에스트라디올로 처리되었다. 15시간 후, 샘플들은 액체질소에서 분쇄되었고, 분쇄물은 11% SDS-PAGE 상에서 분리되었다. FLC-FLAG₃ 및 mFLC-FLAG₃ 수준은 항-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블럿으로 조사되었다. HA₃-HPY2 유도는 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석으로 분석되었다.

hpy2-2 돌연변이체의 개화시기 조사

개화시기는 장일 및 단일 조건 하에서 조사되었다. WT 및 hpy2-2 돌연변이체 식물이 재배되었고, 화서(inflorescence)가 나타났을 때 로제타 잎을 계수하였다. 각 유형(WT 또는 hpy2 -2 돌연변이체)의 20개의 식물체들이 실험에 사용되었다.

정량 실시간 RT - PCR 분석

WT 및 hpy2-2 돌연변이체는 상기 기술된 것처럼 장일 및 단일 조건 하에서 재배되었다. 총 RNA는 WT 및 hpy2-2 돌연변이체의 잎에서 추출되었고, 정량 실시간 RT-PCR이 선행연구에 기술된 방법으로 FLC, SOC1( SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1), FT(FLOWERING LOCUS T) 및 TSF(TWIN SISTER OF FT)의 수준을 평가하기 위해 사용되었다(Park et al., 2011 Arabidopsis nitrate reductase activity is stimulated by the E3 SUMO ligase AtSIZ1. Nat. Commun . 2, 400 doi: 10.1038/natcomms1408). 튜불린 증폭은 내부 대조구로 사용되었다. 모든 반응은 3회 반복 수행되었다. 프라이머 서열은 추가 표 1에 기재되었다.

실시예 1. FLC는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo )에서 HPY2 와 상호작용한다

본 발명에서는 FLC 수모화를 촉진하는 것이 E3 SUMO 리가아제에 의한 것인지 확인하기 위해, SP-RING(SIZ/PIAS-RING) 도메인을 보유하는 애기장대 E3 SUMO 리가아제인 HPY2가 후보 단백질로 선발하였다. 시험관 내 풀-다운 분석은 HPY2와 FLC의 상호작용을 조사하기 위해 사용되었다. 재조합 단백질 GST-HPY2 및 His₆-FLC는 대장균에서 과발현되었고, 글루타티온 또는 Ni^{2 +}-NTA 레진으로 정제되었다(도 1). 상기 결과는 GST-HPY2가 His₆-FLC를 풀 다운(pull down)시키는 것이 가능했다는 것을 보여주었다(도 1B). HPY2 및 FLC 사이의 상호작용은 또한 면역침전법(immunoprecipitation, IP)으로 조사되었다. 2개의 구축물 35S-Myc ₆ -FLC 및 35S-HPY2-FLAG ₃ 은 WT 식물체의 잎으로 공동 침윤되었다. 항-FLAG 항체로 면역침전 후, Myc₆-FLC는 항-Myc 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석으로 조사되었다. Myc₆-FLC가 명확하게 검출되었고(도 1C), 이는 시험관 내 풀-다운 실험 결과와도 일치하며, HPY2 및 FLC 사이의 강한 상호작용을 나타낸다.

실시예 2. FLC 수모화는 HPY2 에 의해 촉진된다

HPY2 및 FLC 사이의 강한 상호작용(도 1B 및 1C)은 FLC가 HPY2의 E3 SUMO 리가아제 활성을 통한 SUMO에 의해 변형될 수 있다는 것을 제시하였다. 따라서, 본 발명자는 HPY2가 FLC를 위한 E3 SUMO 리가아제 활성을 갖는지를 다음으로 테스트하였다. 시험관 내 수모화 반응은 His₆-AtSAE1b, His₆-AtSAE2, His₆-AtSCE1, His₆-AtSUMO1, GST-HPY2 및 GST-FLC-Myc를 사용하여 수행되었다. 수모화된 GST-FLC-Myc의 양은 E1- 및 E2-의존적으로 HPY2에 의해 증가되었다(도 2A).

본 발명자의 선행연구는 FLC가 3개의 수모화 가능 위치를 갖는다는 것을 제시하였다(Son et al., 2014 J. Exp . Bot. 65, 339-351). 돌연변이 K154R, K5R/K135R, K5R/K154R 또는 K135R/K154R을 갖는 단일- 또는 이중-돌연변이체 유도체가 제작되었고, 이들의 수모화는 시험관 내 수모화 분석으로 조사되었다(Son et al., 2014 J. Exp . Bot. 65, 339-351). 실험 결과는 K154를 FLC에 대한 SUMO 결합의 주요 위치로 나타냈다. 최근 연구에서, HPY2-매개 수모화는 돌연변이체 FLC 단백질 GST-FLCm1(K5R)-Myc, GST-FLCm2(K135)-Myc 및 GST-FLCm3(K154R)-Myc에서 조사되었다. 선행연구와 일치하게, GST-FLCm3(K154R)-Myc는 HPY2의 존재에도 불구하고 수모화되지 않았으며, 이는 위치 154의 라이신 잔기가 실제 수모화 위치라는 것을 확실히 보여준다(도 2B).

실시예 3. HPY2 는 FLC를 안정시킨다

HPY2 및 FLC 사이의 강한 상호작용 및 HPY2 활성의 결과로서 FLC 수모화의 증가를 바탕으로, 본 발명자는 FLC 안정성이 HPY2에 의해 조절될 수 있다는 것을 유추하였다. 따라서 본 발명자는 이중 형질전환 식물체 XVE-HA ₃ -HPY2 및 35S-FLC-FLAG ₃ , 또는 XVE-HA ₃ -HPY2 및 35S-mFLC-FLAG ₃ 를 이용하여 FLC 수준에 대한 HPY2의 영향을 측정하였다. mFLC에서, 154번 위치(수모화 위치)의 라이신은 아르기닌으로 돌연변이되었다(K154R). HPY2 유도는 2가지 독립적인 형질전환 식물체에서 FLC 수준을 2.3배 및 3.6배까지 증가시켰다(도 3A 및 3C). 그러나, mFLC 수준의 증가는 2가지 독립적인 형질전환 식물체에서 HPY2의 유도 후에도 관찰되지 않았다(도 3B 및 3C). 실시간 qRT-PCR을 사용하여 측정된 FLC 및 mFLC 전사체 수준은 HPY2 발현 유도 후에도 유사했다(도 3A 및 3B). 이러한 데이터는 FLC 단백질이 HPY2의 E3 SUMO 리가아제 활성에 의해 안정화된다는 것을 나타낸다.

실시예 4. hpy2 돌연변이체는 조기 개화를 보인다

FLC는 HPY2-매개 수모화에 의해 안정화되는데, 이는 FLC 기능이 hpy2 돌연변이체 백그라운드에서 저하될 수 있으며, 개화에 영향받을 수 있다는 것을 제시한다. 2가지의 독립적인 T-DNA 삽입 돌연변이체 라인 hpy2-1 및 hpy2-2는 선행연구에서 규명되었다(Ishida et al., 2009 Plant Cell 21, 2284-2297). hpy2 -2 돌연변이체는 상대적으로 약한 표현형을 나타내지만, hpy2 -1 돌연변이체는 심각한 생장 결함 표현형을 나타내며, 생장은 추대(bolting) 이전에 빈번하게 종료된다. 따라서 hpy2-2 돌연변이체는 개화 시기를 조사하기 위해 선발되었다. 로제타 잎은 WT 및 hpy2-2 식물체에서 추대 직후에 계수되었다. 야생형과 비교하여, hpy2-2 돌연변이체의 개화는 장일 및 단일 조건 모두에서 촉진되었다(도 4A 및 4B). hpy2 -2에서의 개화 촉진은 단일 조건 하에서 유의하게 나타났지만, 장일 조건 하에서보다 덜 현저하게 나타났다(도 4A 및 4B).

실시예 5. 개화-관련 유전자의 발현은 HPY2 의 영향을 받는다

HPY2는 FLC를 위한 E3 SUMO 리가아제로 규명되었는데, 이는 hpy2-2 돌연변이체에서 관찰된 조기 개화 표현형이 부분적으로 낮은 FLC 수준 및 감소된 FLC 활성에 의해 초래될 수 있다는 것을 제시한다. 그러나, hpy2-2 돌연변이체의 조기 개화는 변경된 유전자 발현의 결과로서 발생하는 것도 가능했다. 이를 조사하기 위해, 실시간 qRT-PCR이 장일 또는 단일 조건에서 자란 WT 및 hpy2-2 돌연변이체의 FLC 및 개화-관련 유전자들인 SOC1, FT, 및 TSF의 전사체 수준을 측정하기 위해 사용되었다(도 5A 및 5B). SOC1, FT 및 TSF는 장일 조건 하에서, WT 식물체에서의 발현에 비해 hpy2 -2 돌연변이체에서 약하게 상향조절되었다(도 5A). SOC1, FT 및 TSF 발현의 더 현저한 차이는 단일 조건 하에서, 야생형에 비해 약 2배 더 높은 전사체 수준이 관찰된 hpy2 -2 식물체에서 명백하게 나타났다(도 5B).

<110> SNU R＆DB FOUNDATION <120> Method for promoting sumoylation of FLC protein using AtHPY2 gene in plant and the plant thereof <130> PN16167 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 750 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggcgtcgg cgtcctcgtc tgacggagtt gccggaagga ttcagaacgc ttctttggtt 60 cttgtctccg ataacagttc cacgcttgct gatatccgca aagctgtggc aatgatgaag 120 aacattgcag ttcaattgga gaaagaaaat caaacggaca aggttaagga ccttgaaaat 180 tctgtggctg agttattgga tttgcatagt gattgtaatc accgttcgac agcaattcaa 240 tccgttgcaa atcggtacca acccgtggaa caattaacgg actttaaaaa gttgcttgat 300 gatgaattca caaagctcaa ggctacacct tcctcagtgc cacaaaatga tcatttgatg 360 cgccagttca gggaagcagt ttggaatgtt catcatgcag gtgaaccaat gcctggtgac 420 gatgatgagg acattgttat gaccagtact cagtgccctc ttctaaacat gacatgtccc 480 ttgagcggga agcctgtcac tgaattagca gatccagttc gcagtatgga ttgcaggcac 540 gtctatgaaa aatctgtaat cctgcattac atagtcaaca atccaaatgc gaattgtcct 600 gtagcagggt gccgaggtaa actgcagaat agcaaagtga tttgtgatgc aatgttgaag 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Glu Met Ser Pro Ala Gly Gln Ile Ser Asp Asn Leu Pro Val Thr Leu 180 185 190 Pro Leu Leu Asn 195 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cggtctcatc gagaaagctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccacaagctt gctatccaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aattcgccag ctccaatatg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atctgttgca gctcctcgat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctggaacaac ctttggcaat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agccactctc cctctgacaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caaccctcac caacgagaat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 accgtttgtc ttccgagttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgaaaacgct gacgagtgta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ccttgggaat gggataaggt 20 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tctacctcga gatgggaaga aaaaaactag aaatc 35 <210> 16 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tctacgagct ctcacttgtc atcgtcatcc ttgtagtcct tgtcatcgtc atccttgtag 60 tccttgtcat cgtcatcctt gtagtccata t 91 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctcgagatgg cgtcggcgtc ctcgtc 26 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 actagtagct aatcttcatc cacatctt 28 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atgcagaatt catgggaaga aaaaaactag aaa 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atgcactcga gattaagtag tgggagagtc acc 33 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gaattcctaa tcttcatcca catctt 26 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gtcgacacta atcttcatcc acatctt 27 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tggatccgta tgggaagaaa aaaactagaa a 31 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 actagtgatt aagtagtggg agagtcacc 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tggatccgtc taatcttcat ccacatctt 29 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 actagtgcta atcttcatcc acatctt 27 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tctacgaatt catgggaaga aaaaaacta 29 <210> 28 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tctacctcga gttattcatt caagtcctct tcagaaatga gcttttgctc catattaagt 60 agtgggagag t 71

Claims (8)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 AtHPY2 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 FLC(Flowering Locus C) 단백질의 수모화(sumoylation)를 촉진하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 FLC 단백질의 수모화는 FLC 단백질의 안정성 및 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 FLC 단백질의 수모화를 촉진하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 FLC 단백질의 수모화는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 FLC 단백질의 154번째 아미노산 잔기에서 발생하는 것을 특징으로 하는 FLC 단백질의 수모화를 촉진하는 방법.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 AtHPY2 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 FLC(Flowering Locus C) 단백질의 수모화가 촉진된 형질전환 식물체의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 FLC 단백질의 수모화는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 FLC 단백질의 154번째 아미노산 잔기에서 발생하는 것을 특징으로 하는 FLC 단백질의 수모화가 촉진된 형질전환 식물체의 제조방법.
6. 제4항 또는 제5항의 제조방법에 의해 제조된 FLC 단백질의 수모화가 촉진된 형질전환 식물체.
7. 제6항의 식물체의 형질전환된 종자.
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 AtHPY2(Arabidopsis thaliana HIGH PLOIDY2) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 FLC 단백질의 수모화 촉진용 조성물.

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