KR20200030284A

KR20200030284A - 고구마 스트레스 조절 관련 유전자인 IbMT3 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200030284A
Application number: KR1020180108954A
Authority: KR
Inventors: 허경혜; 김영화; 이혜인
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2020-03-20

Abstract

본 발명은 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 IbMT3 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상기 유전자를 이용하여 환경 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 개발하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

고구마 스트레스 조절 관련 유전자인 IbMT3 유전자 및 이의 용도{IbMT3 gene related to stress regulation in sweet potato and the use thereof}

본 발명은 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 IbMT3 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물체는 토양에 고착생활을 하기 때문에 각종 환경 스트레스를 받았을 때, 다른 생물종처럼 안전한 곳으로 직접 이동할 수 없어 외부 스트레스에 대한 환경 적응능력이 다른 생물체보다 탁월할 것으로 간주된다. 실제로 식물은 다른 생물에 비해 많은 종류의 항산화물질을 생산한다. 식물체에서 산화적 스트레스원으로 온도, 건조, 오존, 중금속, 고농도의 염, 제초제와 같은 비 생물학적 스트레스와 병충해 등의 생물학적 스트레스가 있는데, 이러한 환경 스트레스들은 세포 내에 다양한 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 유발한다 (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 43, 83-116, 1992; 및 Plant Cell 3, 783-792, 1991). 식물체는 이와 같은 활성 산소종으로부터 자신을 보호하기 위하여 일련의 항산화 기구(antioxidative mechanism)를 구축하는 진화과정을 거치면서 현재까지 새로운 환경에 적응하여 왔다.

식물 현탁 배양세포는 산화 스트레스의 처리 없이 그 자체가 식물체보다 높은 산화 스트레스 상태에서 배양되고 있다고 간주되어 식물체와 함께 스트레스 연구에 아주 적합한 소재일 것으로 판단되고 있다. 뿐만 아니라 현탁 배양세포는 산화 스트레스 처리에 대한 세포반응 연구를 비롯한 세포 사멸 기작 연구, 단백질 기능분석, 세포 주기 분석 및 다양한 분야에서 사용되고 있다. 이전 연구에서, 산화 스트레스에 관여하는 유용 유전자를 발굴하기 위해 고구마 현탁 배양세포로부터 cDNA library를 제작하였다 (J Plant Biol 49, 364-370, 2006). 본 연구에서는 cDNA library로부터 확보된 EST 중, 배양세포에 많은 수로 존재하는 MT (metallothionein) 유전자를 선별하여 분석하였다.

MT는 시스테인(cysteine)이 많고 중금속과 친화력이 크며, 미생물, 곰팡이, 그리고 모든 식물과 동물에 존재하는 저분자량 단백질이다. 동물의 MT는 중금속의 해독과 Zn²⁺및 Cu²⁺와 같은 금속의 항상성 유지에 관여하는 등 세포 독성을 억제하는 과정에 연관되어 있는 것으로 보고되었다 (Biochem Pharmacol. 59, 95-104, 2000; 및 Toxicol Lett. 157, 69-78, 2005). 뿐만 아니라, 산화 스트레스에 대해 자유 라디칼을 제거하는 항산화제로 작용함으로써 세포의 방어에 직접적으로 관여하는 것으로 알려졌다. 동물에서 먼저 MT 단백질의 기능이 규명되었으며, 식물에서도 주로 금속의 독성과 산화 스트레스에 반응하는 것으로 보고되었다 (Biochem Pharmacol. 59, 95-104, 2000; Bull Kor Chem Soc. 22, 362-366, 2001; 및 Int J Mol Sci. 14, 6044-6066, 2013). 식물이 비생물학적 스트레스에 노출되었을 때, MT가 효율적으로 ROS를 제거할 뿐 아니라 (Free Radic Biol Med. 14, 325-337, 1993), 식물의 생장 과정과 연관되어 있는 것으로 알려졌다 (Plant Physiol. 155. 1750-1751, 2011; 및 Plant Physiol 146, 1637-1650, 2008).

한국등록특허 제10-1824698호

본 발명의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 환경 스트레스 내성을 조절하는 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 유전자; 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbMT3 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체; 및 환경 스트레스 내성이 조절된 식물체의 형질전환된 종자를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 환경 스트레스 내성을 조절하는 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 제공한다.

본 발명의 IbMT3 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.

본 발명은 IbMT3 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본 발명에서의 용어, "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 IbMT3 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 IbMT3 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(noncoding) 가닥일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 IbMT3 유전자는 고구마에서 유래된 것이나, 고구마 유래의 IbMT3 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 포함할 수 있다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 IbMT3 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 상기 용어, "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명의 IbMT3 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한, 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면, 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 가능할 수 있다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "환경 스트레스"는 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며, 생물학적 스트레스(biotic stress) 및 비생물학적 스트레스(abiotic stress)가 있다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있고, 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온, 제초제 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다. 바람직하게는 상기 환경 스트레스는 산화, 저온 또는 제초제 스트레스인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbMT3 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 재조합 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개 될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체을 제공한다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 환경 스트레스 내성이 조절된 식물체의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 IbMT3 유전자를 이용하여 환경 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 개발하는데 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 고구마 (Ipomoea batatas, GenBank accession number MG001450) 유래의 MT 유전자("IbMT3"로 명명함)의 염기서열 및 이로부터 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2A는 MT 유전자의 구조 및 유형 1 내지 4를 나타낸 것이다.
도 2B는 본 발명의 IbMT3 단백질과 유형 3에 속하는 다른 식물체(GmMT3: Glycine max, NP_001340546; AtMT3: Arabidopsis thaliana, O22433; OsMT3a: Oryza sativa, A2WLS0; 및 OsMT3b: Oryza sativa, A3B0Y1)의 MT 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 다중 정렬한 결과이다 (굵은 글씨의 C는 시스테인을 나타내며, 밑줄은 N-terminal 과 C-terminal에서의 시스테인 패턴을 보여주는 것이고, X는 시스테인을 제외한 아미노산을 나타낸다).
도 2C는 본 발명의 IbMT3 (White star)와 기존에 보고된 IbMT3 (Yulmi) 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 정렬한 결과이다.
도 3은 본 발명의 IbMT3와 다른 식물체의 MT 단백질 간의 계통학적 분석한 결과로서, scale bar는 1,000 nucleotides 당 100 inferred nucleotide substitutions 를 나타낸 것이다.
도 4A는 고구마 식물체의 잎(L)과 현탁 배양세포(S)에서의 IbMT3 유전자의 발현을 노던블럿을 통해 측정한 결과이다.
도 4B는 MV 처리 또는 저온 스트레스에 따른 IbMT3 유전자의 발현을 노던블럿을 통해 측정한 결과이다 (MV: MV 처리; 및 Cold: 저온 스트레스).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험재료 및 방법

1.1. 식물체와 세포 배양

고구마 현탁 배양세포주는 SP-47 (Ipomoea batatas (L) Lam cv. White Star)를 이용하였다. 세포(1 g, fresh weight)를 50 mL MS (Physiol Plant 15, 473-497, 1962) 기본 배지에 1 mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)과 30 g/L의 수크로즈(sucrose)가 포함된 배지에 14일 간격으로 계대배양하였고, 25℃에서 100 rpm으로 암상태에서 배양하였다. 고구마 식물체(Ipomoea batatas cv. Yulmi (Ym))는 온실(25-28℃)에서 16시간/8시간(명/암) 주기로 배양하였다.

1.2. 식물체의 스트레스 처리

과산화물을 유발시키는 제초제인 MV (methyl viologen, 0.125%의 triton X-100에서 50 μM로 사용)는 고구마 잎에 도포하여 6, 12 및 24시간 동안 처리하였다. 저온 처리를 하기 위해, 고구마 식물체를 24 및 48시간 동안 15℃에 노출시켰다. 스트레스 처리를 하지 않은 식물체 잎을 대조군으로 사용하였다. 상부에서 두 번째, 세 번째 잎을 취하여 액체질소에 바로 얼리고 실험 전까지 -70℃에 보관하였다.

1.3. RNA 분리

배양 15일째의 현탁 배양세포에서 RNA를 분리하였다. 고구마 배양세포에 액체 질소를 첨가하면서 미리 얼려둔 막자사발에서 파쇄한 후, Tri Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 다당류가 많은 고구마 잎에서 RNA를 분리하기 위해서, 조직에 액체질소를 첨가하면서 파쇄한 후, 10 mL Extraction Buffer (250 mM Tris-Cl, pH 9.0, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 27 mM naphthalene disulfonic acid, 0.25 M ρ-aminosalicylic acid, 0.5 volume (V) phenol)를 넣고 vortex하여 잘 섞이도록 한다. 0.5 V의 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 1분간 vortex하여 잘 섞어 주고 실온에 10분 동안 두었다. 12,000× g, 4℃에서 15분간 원심분리한 후, 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 여기에 동량의 페놀:클로로포름:이소아밀알코올 (25:24:1)를 넣고 1분간 vortex하였다. 12,000× g, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 새로운 튜브에 다시 옮겨 0.6 V의 이소프로판올을 첨가한 후 잘 섞어 -20℃에서 3시간 두었다. 원심분리하여 RNA 침전물을 얻은 후 상층을 버리고 침전물을 TE Buffer에 넣어 잘 녹였다. 얼음 속에 30분간 두었다가 원심분리하여 다당류를 제거하였다. 4 M LiCl를 동량으로 넣어 잘 섞은 후 4℃에서 하루동안 방치하였다. 30분간 원심분리한 후 침전물을 TE Buffer에 녹였다. 분리된 RNA의 농도, 총량 및 순도는 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.

1.4. IbMT3 cDNA 프로브의 바이오틴(biotin) 표지

IbMT3 cDNA를 주형으로 하고, biotin-14-dCTP (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 함유되어 있는 5X dNTPs 혼합물 (04 mM biotin-14-dCTP, 10 mM dCTP, 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP)를 이용하여 T3 및 T7 primer를 사용하여 PCR을 수행함으로써 IbMT3 유전자에 biotin이 표지되도록 하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃ 30초, 58℃ 20초, 72℃ 30초로 30 cycle을 수행한 다음, 72℃에서 7분간 더 연장시켰다. PCR이 끝난 후, primer와 dNTPs를 제거하기 위해 PCR Purification Kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)로 정제하여 -20℃에 보관하였다.

1.5. 노던블럿(Northern blot)

배양세포와 잎에서 분리한 총 RNA 10 μg을 12% 포름알데하이드 젤에 전기영동한 후, 0.5X TBE Buffer를 사용하여 semi-dry 방법(Trans-Blot® SD DNA/RNA Blotting kit, Bio-Rad, Hercules, California, USA)으로 나일론 막에 흡착시켰다. 흡착된 막은 65℃ 혼성화용액(1 mM EDTA, 7% SDS, 0.25 M sodium phosphate, pH 7.2)에서 1시간 동안 prehybridization시켰다. 100℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 biotin-표지된 프로브를 혼성화 용액에 넣어 65℃에서 24시간 반응시켰다. 혼성화 반응이 끝난 후, 2X SSC, 1% SDS로 상온에서 10분간 2회, 0.1X SSC, 1% SDS로 65℃에서 20분간 2회, 1X SSC로 상온에서 10분간 2회씩 세척하여 비특이적 결합을 제거하였다. 그 후 나일론 막은 biotin-표지된 DNA를 이용한 화학 발광 검출법인 Southern-Star system (Applied Biosystem, Waltham, MA, USA)을 이용하여 X-ray film에 감광시켰다.

1.6. 다중정렬 및 계통분석

아미노산 서열들은 Clustal W 프로그램을 이용하여 정렬하였다 (Bioinformatics 23, 2947-2948, 2007). 다중정렬(multiple alignment) 결과는 MEGA 6.0 프로그램 (Mol Biol Evol 30, 2725-2729, 2013)을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 계통수를 작성하였으며 bootstrap은 1,000번 수행하였다.

실시예 2. 고구마 현탁 배양세포의 cDNA library로부터 MT(metallothionein) cDNA 분리

대표적 뿌리작물 중의 하나인 고구마에서 스트레스 조절 유전자를 찾아내기 위해 고구마 현탁 배양세포의 cDNA library에서 1,411개 EST(expressed sequence tag)를 분석하였다 (Phytochemistry 65, 2471-2476, 2004). MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences; database for genome and protein sequences, Nucleic Acids Res. 30, 31-34, 2002)를 이용한 기능적인 분류와 공용 데이터베이스 중 스트레스 관련 EST와의 비교 분석을 통해 스트레스 관련 유전자들을 추정하였다. 그 중, EST library에 높은 빈도 수로 존재하는 MT(metallothionein) 유전자를 선별하여 염기서열을 결정(GenBank accession number MG001450) 하였고, "IbMT3"로 명명하였다. IbMT3 유전자의 코딩 영역은 총 201 bp(서열번호 1)이며, 66개의 아미노산(서열번호 2)으로 구성되어 있다. 염기서열 중 GC%비율이 42%로 높았고, 아미노산 서열에서 시스테인 잔기는 총 11개로 16.7%를 차지하였다 (도 1).

실시예 3. IbMT3 유전자의 아미노산 서열 비교 분석

일반적으로 MT는 시스테인이 많은 단백질이며, 두 개의 시스테인이 풍부한 도메인(C-rich domain)사이에 시스테인이 없는 영역(C-free spacer)으로 구성되어 있다. MT는 시스테인의 분포 정도와 C-free spacer의 특성에 따라 4가지 유형(유형 1~4)으로 구분되었다 (도 2A). 유형 1은 C-free spacer (약 40 개의 아미노산)의 양 말단에 CXC 모티프가 각 3개씩 존재하며, 유형 2는 유형 1의 N-말단 특징을 가짐과 동시에 CC 모티프가 한 개 더 존재한다. 유형 3은 4개의 시스테인을 가진 N-말단과 CXC 모티프가 3개 존재하는 C-말단을 가지며, 두 말단 사이에 30-40개의 아미노산으로 구성된 C-free spacer를 가지고 있다. 유형 4는 유형 1-3과는 구조적으로 큰 차이점을 보인다. 총 17개의 시스테인이 흩어져 분포하고 C-free spacer에는 15-40개의 아미노산으로 구성되어 있다 (Metallomics 5, 1146-1169, 2013). 본 연구에서 분리한 고구마 IbMT3는 4개의 시스테인이 N-말단에 존재하고 6개의 시스테인이 3개의 CXC 모티프로 C-말단에 배열되어 있는 유형 3 구조에 속한다.

Chen 등은 고구마 잎(Ipomoea batatas (L) Lam cv. Tainong 57)에서 2개의 MT cDNA (IbMT, IbMT2)를 분리하였다 (J Plant Physiol 160, 547-555, 2003). 상기 두 MT 유전자의 아미노산 서열을 IbMT3의 아미노산 서열과 비교한 결과, 각각 44%, 28%의 낮은 상동성을 나타내었다. IbMT2 (clone Y459)는 유형 2와 유사한 새로운 유형이었고, IbMT (clone G14)는 유형 4와 유사하였다. Kim 등은 고구마 잎(Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Ym)으로부터 각각 유형 1, 2, 3으로 분류되는 IbMT1, IbMT2, IbMT3 유전자를 클로닝하였다 (Mol Biol Rep. 41, 6957-6966, 2014). 본 논문의 고구마 White star 품종에서 분리한 IbMT3와 같은 유형에 속하는 IbMT3 (Ym)와는 28%의 상동성을 나타내었다. 이와 같이, 고구마 식물체도 애기장대처럼 게놈에 여러 유형의 MT 유전자가 존재하며, 각 IbMT isoform은 각기 다른 기능을 할 것으로 추측된다. 유형 3에 속하는 다른 식물체의 MT 아미노산 서열과 IbMT3을 비교하여 다중 정렬하였다. 도 2B에서 나타낸 바와 같이, GmMT3 (Glycine max), AtMT3 (Arabidopsis thaliana), OsMT3a 및 OsMT3b (Oryza sativa)는 유형 3에 해당되는 구조적 특징을 잘 보여주고 있다. 하지만, 아미노산 수준에서 상동성을 비교한 결과, IbMT3와는 각각 29%, 34%, 35% 및 32%의 낮은 상동성을 보여주었다. 즉, 같은 유형에 속한다고 해서 높은 상동성을 나타내는 것이 아님을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, MT 단백질은 아미노산 수준에서의 유사성 보다 구조적 특징이 기능과 더 깊은 관련이 있을 것으로 추정된다.

IbMT3와 다른 식물체의 MT 단백질 간의 계통학적 분석을 한 결과는 도 3에 제시된 계통수와 같다. MT 구조의 유형에 따라 계통이 나뉘어졌으며, IbMT3는 유형 3에 속하는 다른 식물체의 MT와 근연관계에 있음을 알 수 있다.

실시예 4. 현탁 배양세포 및 산화 스트레스하의 식물체에서 IbMT3 유전자 발현

mRNA가 분리된 대수증식기의 고구마 현탁 배양세포는 산화 스트레스를 많이 받는 상태로 보고되었다 (Phytochemistry 65, 2471-2476, 2004). 이에 본 발명자들은 현탁 배양세포 및 식물체 잎에서 IbMT3 유전자의 발현을 알아보기 위해, 노던블럿 분석을 수행하였다. 그 결과, 고구마 식물체보다 현탁 배양세포에서 IbMT3 유전자가 더 많이 발현되었다 (도 4A). 현탁 배양세포 EST library에 다른 유전자보다 높은 빈도수로 존재하는 IbMT3 유전자의 분석 결과와 노던블럿 결과는 일치하였다. 따라서, IbMT3 유전자는 산화 스트레스 조건에서 고발현됨으로써 스트레스에 대응하여 조절하는 유전자임을 확인하였다.

상기 결과를 바탕으로, 식물체에 MV (methyl viologen) 또는 저온 스트레스를 처리하여 IbMT3 유전자의 발현을 조사하였다. MV는 빛을 매개로 하여 광합성을 하는 식물 조직에 ROS를 축적함으로써 산화 스트레스를 초래하는 제초제이다. MV를 식물체 전체에 뿌려 6, 12 및 24시간 동안 처리하였다. 6시간 처리했을 때, 급격하게 많은 양이 발현되었으며, 시간이 지나면서 발현양이 점차 감소하였다 (도 4B, MV).

저온 스트레스를 받은 식물에서는 ROS가 증가하고, 이로 인해 세포막의 지질, 단백질 및 핵산에도 상해를 일으켜 결국에는 세포의 사멸을 초래하게 된다 (Front Plant Sci. 6, 69, 2015). 그러므로, 스트레스 조건 하에서 ROS를 방어하기 위해 다양한 항산화효소계를 조절하는 것이 필수적이다. 고구마는 저온에 민감하게 반응하여 생장이 억제되는 작물이므로, 본 발명자들은 고구마에서 저온 스트레스에 따른 MT 유전자의 발현도 조사하였다. 저온처리를 위해 고구마 식물체를 15℃에 24 및 48시간 동안 노출시킨 후, 고구마 잎 조직에서 IbMT3 유전자의 발현양상을 분석하였다. 그 결과, 저온에 노출되는 시간이 길어질수록 IbMT3 유전자의 발현양이 점차 증가하였다 (도 4B, Cold).

따라서, MV 처리 또는 저온 스트레스에 대해 항산화효소를 세포 내에 축적시킴으로써, 세포의 방어에 관여하는 것을 확인하였다. 본 발명에서는 산화 스트레스 조건에서 스트레스에 대응하여 조절하는 유전자로서 IbMT3 유전자가 고발현됨을 확인하였다.

<110> Inje University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> IbMT3 gene related to stress regulation in sweet potato and the use thereof <130> P20180056KR-00 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 1 cgcggcggcg gcgctctaga actagtggat cccccgggct gcaggaattc ggcacgaggg 60 ttgtgtttgt agggatcgga gtaagagatg tcttccggtt gcaagtgtgg ctccgactgc 120 aagtgcggca gtgactgcgc gtgtgaagag gtgaccacca ccgttaccat catcgagggg 180 gttgcaccag tgaagttggc cttagagggg tcttctgaga aggctacaga gggaggacat 240 gcctgcaagt gtggatcaaa ctgcacctgt gacccttgca actgttaggg ccaaaatagt 300 gcaaaataaa taatcacccc ttcagctatg tatggattga gcatgtctta ttagggtttg 360 tctaaatata tatacatata tgtgtatgta ctgatgataa ttaatggatg gggcttttgc 420 agtgatgatg atgagtgtaa taataagcag attgcagatg atgagttatg cagatctttg 480 ttgaagtgtc acttagattt gtgcgattca tttatgtttg gaatgtgtgg ttgcttgggt 540 gtttggactt tatccttaat gtatgttgaa agaggttgac tgtactgtat tgaactaaat 600 ggtatcatat taatgttgtg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaa 663 <210> 2 <211> 66 <212> PRT <213> Ipomoea batatas <400> 2 Met Ser Ser Gly Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys Gly Ser Asp 1 5 10 15 Cys Ala Cys Glu Glu Val Thr Thr Thr Val Thr Ile Ile Glu Gly Val 20 25 30 Ala Pro Val Lys Leu Ala Leu Glu Gly Ser Ser Glu Lys Ala Thr Glu 35 40 45 Gly Gly His Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asn Cys Thr Cys Asp Pro Cys 50 55 60 Asn Cys 65

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 환경 스트레스 내성을 조절하는 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질.
제 1 항의 단백질을 코딩하는 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 유전자.
제 2 항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 3 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 환경 스트레스는 산화 스트레스, 저온 스트레스 또는 제초제 스트레스인 것을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbMT3 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 IbMT3 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 IbMT3 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 환경 스트레스는 산화 스트레스, 저온 스트레스 또는 제초제 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 IbMT3 (Ipomoea batatas metallothionein 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제 13 항의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체.
제 14 항의 환경 스트레스 내성이 조절된 식물체의 형질전환된 종자.