KR20140050218A - 배추 유래의 ＢｒＲＺＦＰ１ 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

배추 유래의 ＢｒＲＺＦＰ１ 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 Download PDF

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조용구
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Abstract

본 발명은 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BrRZFP1 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, BrRZFP1 유전자를 이용하여 환경 스트레스에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체를 개발할 수 있게 하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

배추 유래의 ＢｒＲＺＦＰ１ 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased resistance to various environmental stresses using BrRZFP1 gene and the plant thereof}
본 발명은 배추 유래의 BrRZFP1 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BrRZFP1 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 상기 BrRZFP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 BrRZFP1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.
전사 인자(transcription factor)는 환경 자극에 대한 식물 세포 및 생리학적 반응의 필수적인 조절자로 알려져 있다. 전사 인자는 CBF(C-repeat binding factors), DREB(dehydration responsive element binding factors), NAM(no apical meristem), CUC(cup-shaped cotyledon), NAC 전사 인자, bZIPs 및 일부 징크 핑거(zinc finger) 단백질과 같은 환경 스트레스에 대해 중요한 조절자인 여러 패밀리들을 특이적으로 포함한다. 징크 핑거 단백질(zinc finger protein, ZFP)은 가장 많이 연구된 전사 인자 패밀리들 중 하나이고, 전사 활성화, 세포 사멸(apoptosis) 조절, 단백질 폴딩(folding) 및 조립(assembly)을 포함한 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 한다. ZFP의 징크-결합 모티프는 구조적으로 뿐만 아니라 기능면에서도 매우 광범위하게 다양한데, 이것은 단백질-단백질 간의 상호작용 및 막 결합에 대한 DNA 또는 RNA 결합을 포함할 수 있다. ZFP의 한 그룹(group)은 아연의 두 원자에 결합하는 40 내지 60개의 AA 잔기로 이루어진 RING-핑거 모티프를 포함하는데, 추가로 다음과 같은 2개의 일반적인 클래스(class)로 구분될 수 있다; RING-H2(C3H2C3) 및 RING-HC(C3HC4) ZFP. 상기 ZFP의 최초 동정 이래, RING 핑거 단백질을 코딩하는 많은 유전자들이 동물, 식물 및 바이러스를 포함하는 다양한 생물체에서 분리되었으며, 다양한 범위의 생물학적 기능을 보유하고 있는 것으로 나타났다(Ma K. et al., 2009 Gene 444, 33-45). C3HC4-유형 RING 핑거 단백질은 애기장대(Arabidopsis)에서 게놈 규모로 연구된 바 있고, 배추(Brassica rapa)의 몇 가지 BAC 클론 말단의 염기서열은 애기장대 게놈 서열과 유사한 것으로 발견되었으나, 아직 상기 종들에서는 이들 유전자가 검증된 바 없다.
식물은 고염, 고온, 저온 뿐만 아니라 건조와 같은 다양한 비생물적 스트레스에 대해 생존하도록 반응하는 능력을 가지고 있다. 작물의 성장 및 생산성을 제한하는 것으로 알려진 상기 불리한 환경 스트레스 또한 ZFP를 포함하는 다양한 유전자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다(Islam et al., 2009 Plant and Cell Physiology 50, 1171-1175). 다양한 식물 유래의 RING 징크 핑거 단백질에 대한 선행 연구에서, 상기 단백질이 건조 및 다른 비생물적 스트레스를 포함하는 수많은 환경 스트레스의 프로세스 뿐만 아니라 질병 내성에도 연관된 것으로 나타났다. 또한, ZFP는 광 인지 및 퍼옥시좀 형성을 포함하는 스트레스 프로세스와 연계되어 있는 형성, 발생 또는 신호전달 프로세스 및 종자 및 뿌리가 발생하는 동안 작용하는 것으로 알려져 있다(Prestele et al., 2010 Proceedings of the National Academy of Science 107, 14915-14920).
본 발명에서는, 배추 유래의 C3HC4-유형 RING 징크 핑거 단백질인 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1)의 특징을 분석하였다. 배추의 일반적인 환경 스트레스를 시험하는 최초의 작업은 상기 프로세스에 잠재적으로 관여하는 30가지 전사 인자들의 그룹을 식별해 내는 결과를 가져왔다. 이종상동성(orthologus) 유전자에 의한 환경 스트레스에 대한 광범위한 발현 패턴 및 연계성으로 인해, BrRZFP1을 추가 연구용으로 선별하였다. 이를 위해, 상기 저온 내성 배추 종 유래의 첫 번째 RING 징크 핑거인 BrRZFP1을 클로닝하였고, BrRZFP1 전사체가 다양하고 상이한 스트레스 처리에 반응하여 신속하게 유도된다는 것을 발견하였다. 추가적으로, 담배 식물에서 BrRZFP1의 과발현은 염, 저온 및 건조 스트레스에 대한 식물의 증진된 내성을 제공할 수 있다. 상기 결과들은 식물 스트레스 반응을 매개하는 BrRZFP1의 역할을 나타낸다.
한편, 한국공개특허 제2006-0132442호에는 '신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 이를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0052156호에는 '배추 유래의 BrCIPK3 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 배추 유래의 BrRZFP1 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 염, 저온 또는 건조 등의 환경 스트레스 조건에서 배추 유래 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질 코딩 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, BrRZFP1 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체가 염, 저온 또는 건조의 환경 스트레스 내성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BrRZFP1 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 배추 유래 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질 코딩 유전자는 염, 저온 또는 건조 등의 환경 스트레스 조건 하에 강하게 발현이 유도되고, BrRZFP1 유전자를 과발현시킨 형질전환 담배 식물체가 염, 저온 또는 건조 스트레스 내성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 BrRZFP1 유전자를 이용하여 환경 스트레스에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체를 개발할 수 있게 하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 BrRZFP1 과발현 계통의 발현 수준을 나타낸다. (A) 담배 식물체에 형질전환시킨 유전자(HPT, BrRZFP1)의 PCR 증폭 결과를 나타낸다. 증폭 산물은 1% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였다. 레인 M; 1-kb DNA 마커, 레인 P; BrRZFP1을 포함한 pBigs 플라스미드의 PCR 산물, 레인 WT; 야생형 대조구 식물, 레인 1 내지 4; 독립적인 형질전환 계통의 DNA 주형으로부터 생성된 PCR 산물. (B) 형질전환 담배 식물에서 BrRZFP1 유전자 발현에 대한 서던 블랏(Southern Blot) 분석을 나타낸다. 4가지 형질전환 계통 및 대조구의 게놈 DNA를 EcoRI으로 절단시키고, 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리한 후에 BrRZFP1 절편 프로브를 이용하여 혼성화시켰다. WT; 야생형(wild type) 대조구 식물, 레인 1 내지 4; 형질전환 계통 식물을 나타낸다. (C) RT-PCR에 의한 형질전환 담배 계통에서 BrRZFP1 유전자 발현 분석을 나타낸다. 로딩 대조구로 액틴 유전자에 대한 특이적 프라이머를 사용하였다.
도 2는 BrRZFP1이 과발현된 담배 식물의 증대된 환경 스트레스 내성을 나타낸다. BrRZFP1을 과발현하는 담배 모종(형질전환 계통 1 내지 4) 및 WT 식물을 다양한 스트레스 조건 하에 시험하였다. ½ MS 배지 상에서 성장시킨 14일령 담배 모종을 염 스트레스 처리를 위해 250mM NaCl이 함유된 배지로 옮기고, 건조 스트레스 처리를 위해 0.3M 또는 0.4M 만니톨을 포함하는 신규한 배지로 옮겨 배양하였다. 또한, 저온 스트레스 처리를 위해 담배 모종을 4℃에서 배양하였다. 다양한 스트레스 처리 14일 후, 식물들을 촬영하고(좌측), 상대적인 생체량, 순 및 뿌리 길이에 대해 분석하였다. 평균 측정값 ± 표준 편차를 1개의 대표적인 실험으로부터 5개의 식물에 대해 나타내었다(우측).
도 3은 BrRZFP1이 과발현된 담배 식물의 증대된 염 스트레스 내성을 나타낸다. BrRZFP1을 과발현하는 담배 모종(형질전환 계통 1 내지 4)을 염 스트레스 영향에 대해 시험하였다. (A) 담배 모종에 4일간 250mM NaCl 염-스트레스를 처리하고, 8일간 회복시킨 후에 백화되지 않은(녹색) 21일령 담배 모종(WT 및 형질전환 계통)의 갯수를 계수하였다. (B) 회복 기간 종료시 (A)의 대표적인 모종을 나타낸다. (C) 및 (D) 250mM NaCl 용액에서 4일간 배양한 WT 및 과발현 형질전환 계통(2 및 4)의 잎 디스크 표현형 및 클로로필 함량을 나타낸다. 증류수를 대조구로 사용하였다.
도 4는 BrRZFP1이 과발현된 식물의 증대된 저온 스트레스 내성을 나타낸다. BrRZFP1을 과발현하는 담배 모종(형질전환 계통 1 내지 4)을 저온 스트레스 영향에 대해 시험하였다. (A) 스트레스를 처리하지 않은 대조구(WT) 및 15일간 저온(4℃) 스트레스를 처리하고 15일간 회복시킨 21일령 담배 모종(형질전환 계통)의 생체량을 측정하고 비교하였다. (B) 회복 기간 종료시 (A)의 대표적인 모종을 나타낸다.
도 5는 BrRZFP1이 과발현된 식물의 증대된 건조 스트레스 내성을 나타낸다. BrRZFP1을 과발현하는 담배 모종(형질전환 계통 1 내지 4)을 건조 스트레스 영향에 대해 시험하였다. 0.3M(A) 및 0.4M(B) 만니톨을 처리한 종자(WT 및 형질전환 계통)의 발아율을 발아 개시 후 4 내지 8일 동안 측정한 결과를 나타낸다. (C) 0.3M 또는 0.4M 만니톨 상에서 발아시킨 8일령 담배 모종의 상대적인 생체량 백분율 증가를 스트레스를 처리하지 않은 모종의 생체량과 비교하여 나타내었다. (D) 0.3M(상단) 및 0.4M(하단) 만니톨 상에서 발아 후 8일째에 촬영한 WT 및 형질전환 계통의 대표적인 모종을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BrRZFP1 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress) 및 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염, 건조, 강한 빛, 고온, 저온, 또는 산화 스트레스일 수 있고, 바람직하게는 염, 저온 또는 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 저온은 10℃ 이하, 바람직하게는 2~8℃, 더욱 바람직하게는 4℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 BrRZFP1 단백질의 범위는 배추(Brassica rapa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 의미한다.
또한, 본 발명은 BrRZFP1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 BrRZFP1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자 상동체는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 BrRZFP1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
BrRZFP1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 BrRZFP1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염, 건조, 강한 빛, 고온, 저온, 또는 산화 스트레스일 수 있고, 바람직하게는 염, 저온 또는 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 저온은 10℃ 이하, 바람직하게는 2~8℃, 더욱 바람직하게는 4℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 담배, 애기장대, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 상기 쌍자엽 식물체는 바람직하게는 담배(Nicotiana tabacum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BrRZFP1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성을 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1) 전사체 분석을 위한 식물 재료 및 스트레스 처리
배추(Brassica rapa var. "Sosongchae")를 배양실 내 MS 아가 배지 상에서 명:암(16:8 시간)의 광주기로 하여 25℃에서 무균으로 성장시켰다. 성장 9일 후의 배추 모종을 250mM NaCl 또는 100μM 앱시스산(ABA)을 포함하며 수크로스가 없는 신선한 1/2 강도의 액체 MS 배지(MSH 배지)로 옮기고, 24시간 동안 배양하여 염 및 호르몬 처리를 하였다. 저온 스트레스의 유도는 모종을 8℃로 옮기고 24시간 성장시켜 처리하였다. 화학물 조절제를 이용한 막 유동 처리는 25℃에서 3시간 동안 5, 10 및 15mM 벤질 알콜에 노출시킨 모종의 잘라낸 잎에서 실시하였고, 처리 후 8℃에서 24시간 동안 후속 성장을 수행하였다. 모종의 잘라낸 잎을 2%, 4% 및 6% DMSO의 존재 하에 25℃에서 6시간 동안 유지시키고, 대조구 잎은 25℃의 증류수에서 유지시켰다.
2) BrRZFP1 전장 cDNA 분리
BrRZFP1 절편은 프로브 서열로서 특이적인 징크 핑거 단백질 모티프를 이용하여, BLAST 프로그램에 의해 GenBank의 dbEST 부문에서 동정하였다. 전장 cDNA를 SMART RACE-PCR 키트(Clontech, Palo Alto, CA, 미국)를 이용하여 RACE(Rapid Amplication of cDNA Ends) 기법으로 분리하였다.
3) BrRZFP1 형질전환 담배 식물 생성
전장 BrRZFP1을 프라이머 BrRZFP1F1(5'-ATGCCTTCTTCTGGAGATCCC-3'; 서열번호 3) 및 BrRZFP1R1(5'-TTAAACAAATGGCATAGTTTTAC-3'; 서열번호 4)을 사용하여 BrRZFP1을 포함하는 pGEM-T easy 벡터로 증폭하고, 서열분석으로 확인하였다. 그 후, 과발현을 위해 변형된 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터를 가진 과발현용 pBigs 식물 바이너리 벡터 시스템의 SfiI 부위로 삽입하였다. BrRZFP1의 완전한 코딩 서열을 포함하는 pBigs 식물 바이너리 벡터를 선행 문헌(Horsch et al., 1985 Science 227, 1229-1231)의 과정에 따라 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개 형질전환을 통해 담배 모종에 도입하였다.
4) 형질전환 담배 식물의 PCR 및 서던 블랏 분석
4주된 담배 모종을 PCR 증폭 및 서던 블랏(Southern blot) 분석을 이용하여형질전환 계통을 선별하였다. DNA는 CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide) 방법(Rogers & Bendich, 1994 Plant Molecular Biology Manual 2nd edition, 1-8)을 이용하여 담배 모종의 잎으로부터 추출하였다. PCR 증폭을 위한 프라이머 세트 및 서던 블랏 분석을 위한 프로브는 각각 BrRZFP1F2 및 BrRZFP1R2를 사용하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분 동안의 최초 변성; 94℃에서 1분 변성, 58℃에서 1분 어닐링 및 72℃에서 2분 중합의 30회 반응; 이어서 72℃에서의 추가적인 10분 중합으로 수행하였다. DNA 분주물(40㎕)을 밤새 37℃에서, BrRZFP1 cDNA에서는 예측되지 않는 부위인 EcoRI으로 절단시켰다. 선행 문헌(Yang et al., 2008 Journal of Bioscience 33, 103-112)의 과정에 따른 서던 블랏 분석과 유사하게 이동 및 혼성화를 수행하였다.
5) 비생물적 스트레스 내성에 대한 형질전환 식물 분석
4개의 동형접합성 T2 세대 형질전환 담배(Nicotiana tabacum cv. Samson) 식물 계통을 2 내지 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험에서 5 내지 10개의 시료를 이용하는 모든 후속 비생물적 스트레스 검정에 이용하였다. 대조구(wild type, WT) 및 형질전환 계통 종자들을 명:암(16:8 시간) 광주기 하의 배양실에서 24℃로 1/2 강도의 MS 배지 상에서 발아 및 성장시켰다.
대조구 및 형질전환 담배에 염, 저온 및 건조 스트레스 처리를 위해, 모종들을 14일 동안 상기와 같이 발아 및 성장시킨 후, 250mM NaCl, 4℃ 저온, 0.3M 및 0.4M 만니톨(mannitol)을 포함하는 1/2 강도의 MS 배지로 옮겼다. 상기 조건 하에서 모종을 배양하고, 14일 후에 식물을 촬영하고, 생체량(fresh weight), 어린줄기(shoot) 및 뿌리 길이를 측정하였다. 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)의 Student's t-test를 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 유의성은 0.05 미만의 P-value로 결정하였다. 상기 분석에서 0.015~0.02(생체량), 0.015~0.02(어린줄기 길이) 및 0.02~0.025(뿌리 길이)인 유의한 P-value가 WT 및 형질전환 계통(TG1 및 TG2) 사이에서 발견되었다.
형질전환체의 스트레스 내성을 분석하기 위해, WT 및 형질전환 식물의 모종을 1/2 강도의 MS 배지 상에서 다양한 시간 동안 상기 기재된 바와 같이 배양실에서 발아 및 성장시켰다. 250mM NaCl이 함유된 MSH 용액으로 4일간 적신 멸균 배양지로 WT 및 형질전환 모종(21일령) 옮긴 후에, 백화현상(chlorosis)을 초래하는 염 스트레스의 영향을 시험하였다. 처리 후, 모종을 Milli-Q 멸균수로 가볍게 세척하고, 배양실의 MSH 용액에서 8일간 성장 및 회복하도록 한 후, 녹색 모종의 갯수를 결정하였다. 형질전환 및 WT 식물(21일령)의 4개의 잎 디스크를 250mM NaCl이 함유된 MSH 용액 및 염이 없는 대조구 MSH 용액에 4일간 띄워서 잎의 상태 및 클로로필 함량을 검사하였다. 잎 디스크의 클로로필 함량(mg/g 생체량)을 측정하고, 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 저온 스트레스 처리 및 회복의 영향을 분석하기 위하여, 형질전환 및 WT 식물(21일령)을 콜드 챔버(4℃)로 옮겨 15일간 방치한 후, 식물들을 다시 배양실 조건으로 옮기고, 15일간 성장 및 회복하도록 하였다. 이어서, 개별 식물 생체량(mg)을 측정하고, 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 또한, 형질전환 및 WT 식물의 발아 모종에 대한 건조 스트레스를 시험하기 위해, 식물들을 0.3M 및 0.4M 만니톨 상에서 발아시키고, 대표 식물의 관찰(발아율, 생체량)을 선행 문헌(Mukhopadhyay et al. 2004 Proceedings of the National Academy of Science 101, 6309-6314)에 따라 8일 동안 기록하였다.
실시예 1. BrRZFP1 의 클로닝 및 서열분석
BrRZFP1의 부분 cDNA는 프로브 서열로서 징크 핑거 단백질 모티프를 이용하여 GenBank의 dbEST 부문의 데이터베이스 검색으로 동정하였다. BrRZFP1의 전장 cDNA는 RACE-PCR을 이용하여 분리하였고, 그 결과, 길이가 1,338bp이고, 126bp의 5'-UTR(untranslation region), 346개의 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 1,041bp의 완전한 ORF 및 171bp의 3'-UTR로 이루어진 유전자인 것을 확인하였다.
실시예 2. 모델식물 담배에서 35S 프로모터에 의한 BrRZFP1 유전자의 발현 유도
BrRZFP1의 생리학적 기능을 분석하기 위해, pBigs 벡터 내에서 BrRZFP1의 전장 cDNA 서열을 CaMV 35S 프로모터에 융합하여 BrRZFP1을 과발현하는 몇 가지 형질전환 담배 식물 계통을 제작하였다. 4개의 양성 형질전환 식물 계통(계통 1 내지 4 또는 TG1 내지 TG4로 표기)을 게놈 PCR, 서던 블랏 및 RT-PCR로 확인하였고, 상기 형질전환체가 WT 담배에서는 발견되지 않는 단일하고 높게 발현되는 BrRZFP1 카피를 포함하고 있음을 확인하였다(도 1).
실시예 3. 담배 형질전환체에서 BrRZFP1 발현 증가에 의한 염 스트레스 내성 분석
표준 성장 조건 하에서는 형질전환 및 비 형질전환 식물 사이에서 뚜렷히 큰 형태적 결함이 발견되지 않았다. 또한, 형질전환체의 일부 계통에서는 전체적인 생체량(FW)에서 다소 증가한 것이 관찰되긴 하였지만, 비 스트레스 조건 하에서는 WT와 유사한 성장 패턴을 나타내었다(도 2).
각 형질전환 계통을 염 스트레스에 대한 반응에 대해 WT와 비교하여 시험하였다. 생체량, 어린줄기 및 뿌리 길이를 시험하기 위한 처리는 염(250mM NaCl), 저온(4℃) 또는 건조(0.3M 및 0.4M 만니톨) 스트레스의 존재 하에 14일 동안 모종에 스트레스를 처리함으로써 수행하였다(도 2). 염 스트레스 처리 후, 모든 모종(WT, TG1 및 TG2)은 측정된 각각의 생리학적 카테고리에서 뚜렷한 감소를 나타내었다. 그러나, 형질전환 BrRZFP1 과발현 계통은 생체량, 어린줄기 및 뿌리 길이에서 WT 수준보다 거의 2배의 현저한 증가를 보여 WT 보다 염 스트레스에 대해 더 큰 내성을 나타내었다. 염 스트레스에 이은 회복 기간 후에도 식물을 시험하였다. 구체적으로, 250mM NaCl에서 4일간 모종에 염 스트레스를 처리하고, 이어서 8일간 비 스트레스 조건으로 되돌린 후, 백화현상이 없는 식물(녹색 모종)의 갯수를 계수하였다(도 3). 상기 기간 종료 후, 약 40%의 WT 모종이 녹색으로 남아있는 반면, 몇 가지 BrRZFP1 과발현 계통들은 녹색 모종 갯수의 현저한 증가를 나타냈는데, 일부는 60%를 초과하는 비-백화현상 수준을 나타내었다(도 3A). 도 3B는 상기 BrRZFP1 과발현 계통의 대표적인 생존 식물 예를 나타낸다. BrRZFP1 과발현 계통에 대한 염 스트레스의 유효성을 더 시험하기 위해, WT 및 형질전환 식물의 잎 디스크를 250mM NaCl 용액의 존재 또는 부재 하에 4일간 띄워 두었다. 형질전환 잎 디스크는 염 처리 후 WT보다 더 낮은 백화현상을 나타내었다(도 3C). 상기 잎의 클로로필 함량 측정 결과는 스트레스 하에서는 과발현 계통이 WT에 비해 3 내지 4배 더 높은 클로로필 함량을 지닌 반면, 비 스트레스 조건 하에서는 차이가 없다는 것을 나타내었다(도 3D). Student's t-test에 의한 P-value는 각각 0.015 및 0.02를 나타내었다.
실시예 4. 담배 형질전환체에서 BrRZFP1 발현 증가에 의한 저온 스트레스 내성 분석
저온 스트레스 동안 BrRZFP1의 역할 결정을 위해 과발현 계통을 시험하였다(도 2 및 4). 모종들을 4℃에서 15일 동안 성장시킨 후, 성장 파라미터(생체량, 어린줄기 및 뿌리 길이)에 대해 시험하였다. BrRZFP1을 과발현하는 모종인 TG1 및 TG2는 WT에 비해 상당히 더 성장하였고, 생체량은 5배, 어린줄기 및 뿌리는 WT보다 각각 2 또는 3배 더 성장하였다(도 2). 저온 스트레스(4℃)를 15일간 처리한 후, 표준 성장 조건에서 15일간 회복기간을 준 형질전환 계통의 추가 시험 결과, 더 낮은 정도이긴 하지만 회복 전 나타낸 WT에 비해 유사한 생체량 증가를 나타내었다(도 4). 몇 가지 형질전환 계통의 생체량은 저온 스트레스 처리 식물에서 WT 수준의 50% 내지 100%의 증가를 보였다(도 4A). Student's t-test에 의하여 P-value < 0.02를 나타내었다. 게다가, 형질전환 모종들은 저온 스트레스 처리 및 회복 후 그들의 3번째 및 4번째 잎이 나오고 성장하여, 첫 번째 2개의 잎만 나오고 완전히 성장하지 않은 WT 모종에 비해 더 크고 더 건장한 것으로 나타났다(도 4B). 이들을 종합하면, WT 식물이 비록 주어진 시간 내에 회복한다고 하더라도, WT 식물 성장은 저온에 의해 더욱 극적으로 영향받는다는 것을 나타낸다.
실시예 5. 담배 형질전환체에서 BrRZFP1 발현 증가에 의한 건조 스트레스 내성 분석
건조 스트레스 내성에서 BrRZFP1의 역할을 시험하기 위해, 스트레스를 주는 수준의 만니톨 존재 하에 WT 및 형질전환 계통을 성장시켜 분석하였다. 모종들을 성장시키고, 건조 스트레스 조건(0.3M 및 0.4M 만니톨)으로 옮기고, 15일 후 성장 파라미터를 관찰 및 측정하였다. 형질전환 계통 1 및 2(TG1 및 TG2)는 0.3M 및 0.4M 만니톨 수준에서 모두 생체량, 어린줄기 및 뿌리 길이에서 현저한 증가를 보였으며, 총 생체량에서 최대 증가를 나타냈다(도 2). 건조 스트레스 또한 동일한 스트레스를 주는 만니톨 수준에서 동시에 발아율을 결정함으로써 발달 초기에 시험하였다(도 5). 발아는 4일까지는 10% 미만의 수준으로 WT 식물에서 극적으로 영향받은 반면, 형질전환 BrRZFP1 계통은 시험한 저농도(0.3M) 및 고농도(0.4M)의 만니톨 모두에서 동일한 시기에 거의 3배 더 높은 발아 수준을 나타내었다(도 5A 및 5B). 거의 모든 BrRZFP1 형질전환 계통에서 WT에 비해 2배 이상 더 높은 수준으로 유사하게 증가된 발아 수준이 발견되어, 건조 스트레스 내성에서 상기 BrRZFP1 유전자에 대한 강력한 역할을 확인하였다. 추가로, 발아 후 8일째에 만니톨에 의해 유사하게 스트레스를 받은 형질전환 계통의 생체량 또한 몇몇의 경우 WT 식물의 생체량보다 2배 수준으로 증가하였다(도 5C 및 5D). Student's t-test에 의한 P-value는 각각 0.01 및 0.015를 나타내었다.
상기 결과는 BrRZFP1가 몇 가지 환경 스트레스 관련 프로세스에서 강력한 역할을 하고, BrRZFP1의 과발현은 염, 저온 또는 건조 스트레스에 대한 내성을 형질전환 식물에 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center <120> Method for producing transgenic plant with increased resistance to various environmental stresses using BrRZFP1 gene and the plant thereof <130> PN12286 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1041 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 atgccttctt ctggagatcc ctcgacaaca atcagacacc aacccatgaa cctcccacca 60 tttcccacct ccgacgagcc tctaatcccc aaacctaacc gcatctgtaa atccgccatg 120 tctaccttct tcctcttacc ttcatcgtcc aacgaaccca acaacagaag aaaggggaag 180 aaacagacga cgtcgtcctt tcgcagcctc ggctgcacct cctccgcctc tcagcaagtt 240 tccgtccccg ccgtgatccg ctcctccgcg aattgggacg cgagtgatgc caaaagcaag 300 aagacgaaga gcaagactaa gaagaacaag ggttgtagtg gctacagtgg cggtggctcg 360 gttaagatct tgagcgaggc tgaacgaagc ggttgcggtc cggttcctga tgtttggtgc 420 ggacccggtg tcgggttttc caccgatgcg gtggtctccg gcaccgtcga agcggagcct 480 ccgagaagga atattccggc gagacgcaaa atcgatggag agggctcttc tgttcctccc 540 cggcgatctc ataatcaaga aaccagtctt tactttgact ctgatttgac atcgagggat 600 gaacagacgc agacgctttt ctctgataga taccatcgtc atctacgaca accttaccct 660 aatggactcg acgagatgat gatgttacag aatggttttg taatgggagg aatgttaaac 720 tctcacgatc acttccgtga cttgagattc aacgtcgatg gcatgtctta cgagcaactt 780 ttggagcttg gtgatagaat tgggtatgtg gacactggac ttaatgaaaa acagatcaaa 840 acctgtctct ggagagtcaa accatctcac aaagctacac cacttgaaga tagaaagtgc 900 agcatttgtc aagaagagta tgagggtaaa gacgaggtag ggaagttacg atgtgggcac 960 aggtaccata tctactgtgc gaaacaatgg ctgttaagga agaactcttg tcccgtctgt 1020 aaaactatgc catttgttta a 1041 <210> 2 <211> 346 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Pro Ser Ser Gly Asp Pro Ser Thr Thr Ile Arg His Gln Pro Met 1 5 10 15 Asn Leu Pro Pro Phe Pro Thr Ser Asp Glu Pro Leu Ile Pro Lys Pro 20 25 30 Asn Arg Ile Cys Lys Ser Ala Met Ser Thr Phe Phe Leu Leu Pro Ser 35 40 45 Ser Ser Asn Glu Pro Asn Asn Arg Arg Lys Gly Lys Lys Gln Thr Thr 50 55 60 Ser Ser Phe Arg Ser Leu Gly Cys Thr Ser Ser Ala Ser Gln Gln Val 65 70 75 80 Ser Val Pro Ala Val Ile Arg Ser Ser Ala Asn Trp Asp Ala Ser Asp 85 90 95 Ala Lys Ser Lys Lys Thr Lys Ser Lys Thr Lys Lys Asn Lys Gly Cys 100 105 110 Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Ile Leu Ser Glu Ala Glu 115 120 125 Arg Ser Gly Cys Gly Pro Val Pro Asp Val Trp Cys Gly Pro Gly Val 130 135 140 Gly Phe Ser Thr Asp Ala Val Val Ser Gly Thr Val Glu Ala Glu Pro 145 150 155 160 Pro Arg Arg Asn Ile Pro Ala Arg Arg Lys Ile Asp Gly Glu Gly Ser 165 170 175 Ser Val Pro Pro Arg Arg Ser His Asn Gln Glu Thr Ser Leu Tyr Phe 180 185 190 Asp Ser Asp Leu Thr Ser Arg Asp Glu Gln Thr Gln Thr Leu Phe Ser 195 200 205 Asp Arg Tyr His Arg His Leu Arg Gln Pro Tyr Pro Asn Gly Leu Asp 210 215 220 Glu Met Met Met Leu Gln Asn Gly Phe Val Met Gly Gly Met Leu Asn 225 230 235 240 Ser His Asp His Phe Arg Asp Leu Arg Phe Asn Val Asp Gly Met Ser 245 250 255 Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Leu Gly Asp Arg Ile Gly Tyr Val Asp Thr 260 265 270 Gly Leu Asn Glu Lys Gln Ile Lys Thr Cys Leu Trp Arg Val Lys Pro 275 280 285 Ser His Lys Ala Thr Pro Leu Glu Asp Arg Lys Cys Ser Ile Cys Gln 290 295 300 Glu Glu Tyr Glu Gly Lys Asp Glu Val Gly Lys Leu Arg Cys Gly His 305 310 315 320 Arg Tyr His Ile Tyr Cys Ala Lys Gln Trp Leu Leu Arg Lys Asn Ser 325 330 335 Cys Pro Val Cys Lys Thr Met Pro Phe Val 340 345 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgccttctt ctggagatcc c 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttaaacaaat ggcatagttt tac 23

Claims (9)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BrRZFP1 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염, 저온 또는 건조 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염, 저온 또는 건조 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 담배 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  8. 제5항에 따른 식물체의 종자.
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 배추 유래의 BrRZFP1(Brassica rapa RING zinc finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물.
KR1020120116213A 2012-10-18 2012-10-18 배추 유래의 ＢｒＲＺＦＰ１ 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 KR20140050218A (ko)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20150142136A (ko) 2014-06-10 2015-12-22 전남과학대학교 산학협력단 오이 유래의 CsGolS1 유전자를 이용한 고온 또는 염에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 용도
KR101724933B1 (ko) * 2015-10-23 2017-04-10 경희대학교 산학협력단 내건성 조절 단백질 BrDST71(Brassica rapa Drought Stress Tolerance 71), 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 내건성 증진용 재조합 벡터

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