KR101957736B1 - 식물의 고온 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래 OsOPT10 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래 OsOPT10(Oryza sativa Oligopeptide transporter 10) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법, 상기 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 고온 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 고온 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 포함하는 식물체의 고온 스트레스 내성 조절용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 고온 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래 OsOPT10 유전자 및 이의 용도{OsOPT10 gene from rice for enhancing high temperature stress tolerance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 고온 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래 OsOPT10 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물은 생장하면서 다양한 환경 스트레스에 노출되며 작물의 생장, 발달, 수확량 등에 영향을 미친다. 그 중, 온도는 모든 식물의 생존에 영향을 미칠 수 있는 가장 중요한 요소 중의 하나로서 작물의 생육과 발달에 주요한 원동력으로 작용한다. 지구온난화로 인해 온도 상승에 따른 고온 스트레스는 전세계 많은 지역에서 농업적으로 문제가 되고 있다. 식물체에 미치는 고온에 의한 직접적인 영향으로는 단백질의 변성, 집적, 세포 막 지질의 유동성 증가 등을 포함한다. 간접적인 손상으로는 엽록체와 미토콘드리아의 효소가 불활성화되고, 단백질 합성이 저해되며 합성된 단백질이 분해되고 세포막 손상을 일으킨다.

벼(Oryza sativa)는 여러 작물 중 전세계적으로 주요한 식량 작물로써 수년간 모델 식물로 많은 연구가 이루어지긴 했으나 고온의 영향에 대한 연구는 아직 미흡한 단계로 고온으로 인한 벼의 생산 피해가 크게 나타나고 있다. 온도가 높은 환경조건뿐만 아니라 다양한 비생물학적(abiotic) 스트레스 환경에서 생존 및 적응하기 위해서 식물은 생리적 및 유전적인 변화를 통해서 다양하게 반응한다. 불량한 환경에 대해서 내성을 가진 식물들은 세포 내에 수분을 유지시키기 위해 수분스트레스에 의한 팽압과 세포내의 농도, 삼투 스트레스의 완화 등 세포질 내에 다양한 유기물을 축적하며 불량환경에 따른 유전자 발현을 조절하게 된다. 프롤린(proline)은 염분 및/또는 건조 스트레스와 같은 다양한 환경 스트레스에 피해를 입는 많은 식물에 있어서 오스모프로텍터(osmoprotector)로서 삼투압 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 비생물학적 스트레스에 대한 방어 기작으로 프롤린 외에도 주요 물질로서 당알코올(sugar alcohol) 및 글리신베타인(glycinebetaine) 등이 보고된 바 있다.

펩타이드는 일반 세균에 있어서 주요 질소원의 공급원으로서 생육에 필수적인 중요한 영양성분이다. 펩타이드의 세포 내 전달은 펩타이드의 길이에 따라 각각 다른 전달체를 이용하여 세포 내로 전달되는데 현재까지 디-, 트리-, 올리고펩타이드 투과효소 시스템(di-, tri-, oligopeptide permease system)을 통하는 것으로 보고되고 있다. 펩타이드 수송(Peptide transport)은 세포가 펩타이드 또는 펩타이드 유도체를 에너지-의존적인 방식(energy-dependent manner)으로 막(membranes)을 가로질러 운반하는 것으로 보고된 바 있다. 펩타이드 수송체(Peptide transporters)는 3 가지 그룹으로 분류되는데, 첫 번째 그룹은 ATP 결합 카세트 전달체(ATP-binding cassette transporters, ABC family)이고, 두 번째 그룹은 펩타이드 수송체(peptide transporters, PTR family)이며, 세 번째 그룹은 올리고펩타이드 수송체(oligopeptide transporters, OPT family)이다. 최근 애기장대의 AtOPT6가 도입된 형질전환체에서 세포분화, 증식 및 세포 사멸을 비롯한 수많은 세포과정에 중요한 역할을 하는 항산화 물질로 알려진 글루타티온(Glutathione, GSH)의 활성이 높아진 것이 보고된 바 있다(Cagnac O. et al., (2004) Plant Physiology 135:1378-1387).

이에 본 발명에서는 벼 유래 올리고펩타이드 전달체 관련 유전자(OsOPT10)가 도입된 형질전환 벼에서 고온 스트레스 저항성 계통을 선발하고, 이들과 관련된 다양한 유전자 발현양상에 대한 분자적 특성에 대해 확인하였다.

한편, 한국등록특허 제1325960호에는 '식물의 고온 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsHCI1 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0107280호에는 '식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCYP21-4 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 고온 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래 OsOPT10 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래 올리고펩타이드 전달체 10 유전자(OsOPT10)로 형질전환된 벼 식물체가 고온 스트레스 조건에서, 대조구(모품종)에 비해 고온 스트레스에 대한 저항성이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10(Oryza sativa Oligopeptide transporter 10) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 고온에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고온 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 고온 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명은 고온 스트레스 내성을 부여하는 벼 유래 올리고펩타이드 수송체(Oligopeptide transporters) 10 유전자에 관한 것이다. 식물은 갑작스런 온도 상승으로 인해 심각한 피해를 입을 수 있는데, 이러한 피해를 줄이는 방법으로 본 발명의 유전자를 이용하여 형질전환 식물체를 제조하면 제조된 형질전환 식물체는 고온 지역이나 갑작스런 온도 상승이 일어날 수 있는 지역에서 보다 안정적으로 식물을 재배할 수 있게 된다. 따라서, 적도 지방 근처나 열대 지방 작물의 재배에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 OsOPT10 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환한 벼 식물체에서 OsOPT10 유전자의 존재 및 발현을 RT-PCR로 확인한 결과(A, B) 및 삽입 수 분석 결과(C)를 보여준다.
도 2는 대조구(모품종)와 OsOPT10 형질전환체의 고온 스트레스에 대한 반응을 확인한 결과로, A는 대조구와 OsOPT10 형질전환체 벼의 유묘를 42℃의 온도 조건에서 2주간 방치하며 촬영한 사진이고, B는 고온 처리에 의한 전해질 누출 정도를 측정한 결과이며, C는 고온 처리에 의한 가용성 당 함량의 변화를 측정한 결과이다.
도 3은 고온 스트레스 처리 후 대조구와 OsOPT10 형질전환체에서 OsOPT10 유전자의 발현 양상을 정량적 실시간 PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 고온 스트레스 처리 후 대조구와 OsOPT10 형질전환체에서 프롤린 함량을 확인한 결과(A)와, 프롤린 생합성 과정에 관여하는 P5CS 유전자의 발현을 정량적 실시간 PCR로 확인한 결과(B)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10(Oryza sativa Oligopeptide transporter 10) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

용어 '고온 스트레스'란 식물의 생장과 발달에 비가역적인 영향을 일으키는데 충분한 정도의 일정 시간과 기준 이상의 온도 상승에 노출되었을 때 식물이 받는 스트레스를 의미한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 과발현시킴으로써 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 고온은 40℃ 이상, 바람직하게는 40~50℃, 더욱 바람직하게는 42℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 OsOPT10 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 고온 스트레스에 대한 내성 증가 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 OsOPT10 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 OsOPT10 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 OsOPT10 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 특징이 있으며, OsOPT10 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

상기 "유전자 과발현"이란 모품종 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 고온에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 과발현시킴으로써 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 고온 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자는 고온 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자이다.

본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물이 될 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 고온 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은, 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 고온 스트레스 내성을 조절할 수 있는 것이다. 상기 고온 스트레스 내성의 조절은 바람직하게는, 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료

벼 유래 OPT10(Oligopeptide transporter 10) 유전자를 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 방법으로 도입하여 형질전환 벼를 육성하였으며, 그 형질전환 벼를 이용하여 T1, T2 및 T3 계통을 육성하였고, 고온 스트레스에 대한 내성 형질전환체의 선발 및 분자적 특성을 조사하는데 사용하였다. OsOPT10 유전자가 도입된 형질전환 벼의 분석에는 모품종인 동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin)를 대조구(모품종)로 이용하였다.

형질전환체 확인 및 분자학적 특성

재분화 식물체를 대상으로 벼 게놈 상에 OsOPT10 유전자의 도입을 확인하기 위해서, 재분화된 잎으로부터 게놈 DNA를 분리하여 35S 프로모터 부위와 도입유전자 OsOPT10 유전자 특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머는 35S-Fw: 5'-TTCGCAAGACCCTTCCTCTA-3'(서열번호 3)와 OsOPT10-Rv: 5'- TCAGGAAGAACTGCAGCCT-3'(서열번호 4)이고, 증폭반응은 95℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation) 시킨 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 신장(extension) 과정을 30회 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 10 분간 신장 과정을 실시한 후 분석하였다. 도입 유전자의 단일 카피 여부를 확인하기 위하여 Taq-Man probe를 이용하여 실시간 PCR(real-time PCR) 분석을 수행하였다. 추출한 주형 DNA 30ng에 2ⅹ brilliantⅡ QPCR master mix(Roche, 스위스) 10㎕, 20ⅹ Tublin(reporter VIC, Quancher TAMRA) 1㎕, 20ⅹ Nos(reporter FAM, Quancher none) 1㎕를 PCR 튜브에 넣었으며(n=3), 양성 대조군은 검증된 호모(homo) 계통 형질전환체의 DNA를, 음성 대조군은 동진벼의 DNA를 사용하였다. PCR 반응액은 StepOne^TM real-time PCR system(Life technologies, 미국) 기기를 이용하여 증폭반응을 수행하였으며, 반응 조건은 95℃에서 10분간 전변성시킨 후, 95℃에서 15초간 변성, 60℃에서 1분간 어닐링으로 40회로 수행하였다.

정량적 실시간 PCR 분석

정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR) 실험을 위해, SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo, 일본)와 Light Cycler Bio-Rad CFX96^TM real-time PCR detection system) 기기를 사용하였다. OsOPT10 유전자 증폭을 위해서, 정방향 프라이머(5'-TCAAGGAGCATGTGCTCATCA-3'; 서열번호 5)와 역방향 프라이머(5'-TCAGGAAGAACTGCAGCCT-3'; 서열번호 6)를 이용하여 qRT-PCR 수행하였다.

qRT-PCR 반응조건은 95℃에서 3분간 전변성시킨 후, 95℃에서 10초간 변성, 55℃에서 20초간 어닐링, 72℃에서 30초간 신장하고, 스캐닝(scanning)하는 과정을 50회 반복하였으며, PCR 산물의 용융곡선(melting curve) 분석은 65~95℃에서 0.5℃씩 5초간 시행하였다.

형질전환 벼의 고온 스트레스 저항성 검정

형질전환 벼 및 대조구인 모품종 동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin) 종자를 2ppm의 포스피노트리신(phosphinotricin)을 함유한 1/2 MS 배지와 1/2 MS 고체 배지에 각각 치상하여 28℃의 명조건 생장상에서 10일간 생육시켰다. 생존한 형질전환체와 대조구 품종을 토양으로 이식한 후, 28~30℃의 온실(16시간 명/8시간 암 주기)에서 3엽기까지 생육시킨 후, 한 포트(10.5ⅹ10.5ⅹ11 cm) 당 20 개체씩 3반복이 되도록 이식하였다. 42℃ 고온 스트레스를 유도하기 위해, 식물 생장상(습도: 50%, 온도: 42℃, 16시간 명/8시간 암 주기)에서 14일간 고온에서 생육시켰다.

생리활성 분석

전해질 누출(electrolyte leakage) 측정

식물체의 잎 0.1g을 5mm 간격으로 잘라서 10㎖의 증류수와 함께 50㎖ 튜브에 담았다. 32℃로 설정된 중탕기에서 2시간 처리 후 Multi-range EC meter(Hanna instru ments, 루마니아)로 전해질 수치를 측정하였는데, 이 때의 측정값을 EC₁으로 하였다. 이후 고압증기멸균기(autoclave)로 20분간 고온·고압 처리하고 다시 상온이 되었을 때, 한번 더 EC meter로 수치를 측정하여 EC₂ 값을 얻었다. 구해진 EC₁과 EC₂로 EL 값을 구하고, 고온 스트레스 처리 전과 처리 11일 후의 측정치인 EL₁과 EL₂ 값을 측정 비교하였다.

가용성 당 함량(soluble sugar content) 분석

모품종 동진벼와 OsOPT10 형질전환체를 가지고 가용성 당 함량을 분석하였다. 유묘기 단계에서 고온 스트레스를 처리하고 2일차에 분석하였으며, 총 당 함량은 페놀 황산법을 이용하여 3반복으로 측정하였다. 시약은 9%(v/v) 페놀을 사용하였다. 실험 방법은 시험관에 표본으로부터 잘라낸 잎 0.1g과 멸균수 8㎖를 혼합한 후, 항온수조에서 100℃ 30분간 2번 가열하였다. 추출물(약 500㎕)을 새로운 마이크로 튜브에 옮겨준 후, 멸균수 1.5㎖, 9% 페놀 1㎖, 황산 5㎖를 넣고 실온에 30분간 두고 485nm에서 흡광도를 분광광도계(Optizen Series, Model 2120UV)로 측정하였다.

프롤린 함량 분석

모품종 동진벼와 OsOPT10 형질전환체를 실험 재료로 하여, 유묘기 단계에서 고온 스트레스 2일차로 실험을 진행하였다. 표본 0.1g의 잎을 채취하여 액체질소로 마쇄한 후, 추출용액 MCW(MeOH: Chloroform: Water = 12:5:1) 완충액 1㎖을 넣어주고 10,000rpm 속도로 4℃ 10분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 2개의 튜브에 1.5㎖ 씩 추출하여 10,000rpm 속도로 4℃, 5분 동안 한번 더 원심분리 하였다. 상등액 1㎖(4배 희석: 상등액 0.25㎖ + MCW 완충액 0.75㎖)에 아세트산 3㎖, 닌하이드린 시약(ninhydrin(g): acetic acid(㎖): 6 M phosphoric acid(㎖) = 1.25: 30: 25) 1㎖을 첨가하였다. 그리고 100℃에서 45분간 중탕시킨 후, 얼음에서 20분간 식힌 후 톨루엔 1㎖을 첨가하여 볼텍싱(vortexing)을 30분간 한 다음 520nm에서 OD 값을 측정하였다. 표준 용액은 L-프롤린을 사용하였고 프롤린 함량 분석은 MCW 버퍼(1㎖) × 1/샘플(0.1g) × OD 값(㎍/㎖) × 희석 4배를 하여 값을 얻어냈다.

실시예 1. OsOPT10 유전자 도입 형질전환 벼 육성

벼 유래 OPT10(Oligopeptide transporter 10) 유전자는 전신발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되도록 Ti-플라스미드 벡터에 구축하여 형질전환 실험을 수행하였다. 형질전환체의 분자적 특성 및 발현분석은 Jung 등(Journal of Plant Biotechnology 2010, 37(4):483-493)에 의해 보고된 바와 같다. 그 후 형질전환 벼 16개체를 얻어 유전자 도입여부를 PCR로 검정하여 그 개체의 후대를 육성하였으며, T1 세대에서 35S 프라이머와 OsOPT10 유전자 프라이머를 이용하여 도입여부를 확인하였다. 16개의 후대를 분석한 결과 7개의 후대에서 유전자가 안정적으로 도입되어 발현되고 있음을 확인하였다(도 1A). 상기 7개체에서 OsOPT10 유전자의 발현 수준을 정량적으로 확인한 결과, OsOPT10-4 및 OsOPT10-8 형질전환체에서 유전자의 발현량이 가장 높았고, 그 다음으로 OsOPT10-2, 7, 5, 1, 16순 이었으며, 대조 품종인 동진벼에서는 OsOPT10 유전자의 발현이 확인되지 않았다(도 1B). 벼 게놈내에 OsOPT10 유전자의 단일 카피 도입여부를 확인하기 위하여 수행한 복제수 어세이(copy number assay) 분석에서는, OsOPT10-16 형질전환체는 단일 카피, OsOPT10-1 형질전환체는 두 카피의 OsOPT10 유전자가 도입된 것을 확인할 수 있었으며, OsOPT10-2, 4, 5, 7, 8 형질전환체에서는 다수의 카피로 OsOPT10 유전자가 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 1C).

실시예 2. 고온스트레스 내성 검정 및 생리활성 분석

OsOPT10의 과발현이 벼에서 고온 스트레스 내성과 관련 있는지를 조사하기 위해, 모품종 동진벼를 포함하여 OsOPT10-1, 5, 7, 16 계통을 고온(42℃) 스트레스에 노출시켰다. 처리 후 6일차까지 고온의 의한 피해증상이 큰 변화는 없었으나 7일차부터 식물체들이 고온에 의한 피해 증상으로, 시들음과 같은 조직의 손상과 잎 말림 현상 및 엽록소 감소 같은 위조 증상을 보였다. 처리 11일 후에, 형질전환체 OsOPT10-1, 5, 7, 16 계통은 대조구(WT)에 비해 피해 고온 스트레스에 대해 피해증상이 약한 것으로 확인되었다(도 2A).

또한, 스트레스에 의한 세포막 피해 정도를 알아보기 위해 대표적인 표시자로 알려진 전해질 누출(electrolyte leakage) 분석을 하여 세포막 피해 정도를 비교하고자 하였다. 비스트레스 조건에서는 대조구(WT) 및 OsOPT10-1, 7, 16 계통의 전해질 누출(EL) 정도에 차이는 보이지 않았으나, 고온 처리 11일 후 대조구의 EL 값은 형질전환 벼 OsOPT10-1, 7, 16 계통에 비해 높게 나타났다. 대조구와 비교시, 형질전환 벼 OsOPT10-1, 7, 16 계통은 전해질 누출(EL)이 40% 정도 낮게 나타났다(도 2B).

대부분의 식물에서 건조 또는 염 스트레스에 대한 반응으로 수크로스와 같은 가용성 당의 축적이 보고되고 있다. 또한, 저온 순화식물에서 수용성 당류의 축적이 일어나며, 삼투조절제(osmoregulator), 신호분자로서 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 당류는 탈수기간에 지질분자에서 수소결합을 유지하는데 물 분자를 대체하여 식물세포막을 보호하고, 활성산소종을 제거하는 역할을 함으로써 막의 안정성을 증가시키는 데 기여하는 것으로 알려져 있다. 고온 처리에 의한 가용성 당 함량의 변화는 OsOPT10-16 형질전환체를 제외하고 OsOPT10-1과 OsOPT10-7 계통이 대조구보다 당 함량이 높게 나타났다(도 2C). 모품종 동진벼에 비해 OsOPT10 형질전환벼 계통의 EL 값이 낮게 나타난 것과 가용성 당 함량이 비슷하거나 높게 나타난 것으로 보아 OsOPT10 형질전환체가 고온 스트레스에서 저항성 반응을 나타내는 것으로 보인다.

실시예 3. 고온 스트레스 처리 후 OsOPT10 발현 양상

올리고펩타이드 전달체 관련 유전자(OsOPT10)가 도입된 형질전환 벼에서 고온 처리 후 이 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여, 대조구와 OsOPT10 형질전환 벼 계통을 이용하여 정량적 실시간 PCR을 분석하여 비교한 결과는 도 3과 같다. 대조구는 고온 처리 시간별 OsOPT10 유전자의 발현차이를 보이지 않았으나, OsOPT10 형질전환 벼 3계통, OsOPT10-1, 7, 16은 고온 6시간 처리후에 높게 발현량을 보였고, 이 후 고온 24시간 처리 조건에서는 점차 발현량이 감소하는 현상을 보였지만, 대조구에 비해 OsOPT10 형질전환 벼가 여전히 높은 발현 양상을 나타냈다.

실시예 4. 프롤린 함량 분석 및 P5CS 유전자 발현 양상

프롤린은 환경 스트레스를 받는 식물에서 이온불균형, 이온독성 및 생리적 수분 스트레스로부터 보호 작용이 있는 것으로 삼투보호(osmoprotective)의 특성이 보고되고 있다. 고온 처리 후 프롤린 함량의 변화를 살펴보기 위해, 대조구와 OsOPT10 형질전환 벼를 3 엽기 단계에서 42℃ 고온 스트레스를 2일 처리하여 프롤린 함량을 3반복으로 측정하였고, 그 결과는 도 4A와 같다. 대조구의 프롤린 함량이 1.23 mg/g 생체중인 반면에, 형질전환체인 OsOPT10-1, 7, 16 계통은 각각 2.64, 3.26, 4.96 mg/g 생체중으로 대조구에 비해 약 2~4배 정도 높은 함량을 보였다.

일반적으로 식물에서 프롤린 전구체로서는 글루타메이트와 오르니틴(ornithine)이 보고되고 있고, 식물에서 글루타메이트로부터의 합성 과정에는 두 개의 효소 즉, P5CS(△1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)와 P5CR(△1-pyrroline-5-carboxylate reductase)이 관여하는데, 염분과 건조와 같은 환경 스트레스 하에서 프롤린 생합성의 촉진은 P5CS와 P5CR의 mRNA 발현의 증가와 관련되어 있다. 또한, 프롤린이 과발현되었을 때, 잎의 삼투 포텐셜이 증가하여 수분 스트레스 시 삼투조절이 용이해진다는 보고가 있다. 삼투압 조절과 관련된 유전자 중 프롤린 합성에 관여하는 P5CS 유전자를 이용하여 대조구와 형질전환 벼 3 계통간 전사체 발현 양상을 알아보기 위하여, 고온 처리 후(42℃; 0h, 6h, 24h, 48h) 대조구와 OsOPT10-1, 7, 16 계통간 발현양을 비교하였다(도 4B). 그 결과, 대조구는 고온처리에 의해 P5CS 유전자의 발현차이를 보이지 않았으나, 형질전환 벼인 OsOPT10 계통은 모두 무처리 조건과 비교했을 때, 최소 4배에서 최대 20배 이상 발현 차이를 나타내었다. 즉, 형질전환체에서는 고온 처리 시간에 따라 점차 프롤린 함량이 증가하는 현상을 보였다. 상기와 같은 결과를 통해 지금까지 명확한 기능이 알려지지 않았던 OsOPT10 유전자는 고온 스트레스 환경 조건에서 고온 저항성 향상 기작에 대해서도 역할을 하고 있는 것으로 판단되었다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> OsOPT10 gene from rice for enhancing high temperature stress tolerance of plant and uses thereof <130> PN17402 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2259 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggagcaac cacggcttga gctcagcagc ctggaaggtc accggagtag cgaaaatcca 60 gagagcagag atgagaaaac cgaagaggag gtagacgact gcccgatcga ggaggtgcgg 120 ctgacggtgc cgatcaccga cgacccggca ttgccggcgc tgacgttcag gacatggctg 180 ctggggctca tctcctgcgc gatgctggcc ttctccaacc agttcttcgg ctaccggcag 240 aatccgctct acatctcgtc gctgtccgtg cagatcgtcg tcttgccgct gggcaagctg 300 atggctgctt gcctccccaa gaaggtgttc agggtgaagg gcacggcatg gtcgttctcg 360 ctcaacccgg ggccgttcaa cctcaaggag catgtgctca tcaccatctt cgccaacacc 420 ggatccaact ccgtctacgc cgtcggcatt atcaccattg ttaaggcctt ctaccgccgg 480 gagattcatc ctcttgctgc catgctgctc acccagacaa cccagctgat gggatatggt 540 tgggctggcc tcttcagaaa gtttcttgtg gactcacctt acatgtggtg gccttcaaac 600 ttggtacagg tttcactctt cagagctctg catgagaagg agaagaggcc aaagggaggg 660 acgacgaggc tgcagttctt cctgaccgtg ctcatcacca gcttcgccta ctacattgtg 720 ccgaactacc tgttcccgac catctccacc atctcggtgg tgtgcctggt gtggaagaag 780 tcggtgacgg cgcagcagat cggctccggc gtgtacggcc tgggcgtcgg ctcgttcggc 840 ctggactggg cgacggtggc cggcttcctc ggcacgccgc tgtcgacgcc ggcgttcgcc 900 atcgtcaaca tcatggccgg cttcttcctc atcgtctacg tgatcgtgcc ggcggcgtac 960 tgggccgacg cgtacggcgc caagcggttc ccgatcatct cctcccacgt gttctccgcc 1020 aacggcagcc ggtacgacgt caaccaggtg ctcgacacgg cgacgttcga gttcagccag 1080 gccgggtacg acgccgcggg caagatcaac ctgagcatct tcttcgcctt cacctacggc 1140 ctcagcttcg ccacgctcgc cgcgacgctg tcgcacgtcg cgctcttcca cggcgggtcg 1200 atatggcggc agaccaaggc ggcggtgagc gggcagggcg gcgacgtgca caccaggctg 1260 atgaagcgca actacgccgc ggtgccgcag tggtggttcc aggtgatgct cgtcgccgtg 1320 ctcggcctct ccgtgttcac ctgcgagggc ttcggccagc agctgcagct cccgtactgg 1380 ggcgtcctcc tcgccgccgg cctcgccttc ttcttcaccc tccccatcgg catcatcacc 1440 gccaccacca atcagcaacc tgggctgaac gtgatcaccg agctgatcat cggatacctg 1500 tacccgggga ggccgctcgc caacgtcgcc ttcaagacgt acggctacat cagcatgtcc 1560 caggcgatca tgttcttgca ggatttcaag ctgggccact acatgaagat cccaccacgc 1620 tccatgttca tcgtccagct cgtcgggacg gtgctggcgt cgtcggtgta cttcgggacg 1680 tcgtggtggc tgctggagag cgtgagcaac atctgcgacc cggcgaagct gccggagggg 1740 agcccgtgga cgtgccccgg cgacgacgtc ttcttcaacg cctccatcat ctggggggtg 1800 gtcggcccgc tgcggatgtt cggccgcctc ggcctgtacg ccaagatgaa ctacttcttc 1860 ctcgccggcg cgctggcgcc ggtgccggtg tgggcgctgt cgcgggcgtt cccgggcagg 1920 gcgtggatcg ggctcgtcaa catgccggtg ctcctcggcg ccacggggat gatgccgccg 1980 gcgaggtcgg tgaactacct catgtggggc gccgtggggc tcgccttcaa ctacgtcgtg 2040 taccgccggt acaaggggtg gtgggcgcgg cacaactacg tgctgtccgc cgggctggac 2100 gccggcgtgg ccttcatggg gatcctctcg tacgccgtgc tgcagtcgag gggcatcaat 2160 ggcgtcaact ggtgggggct gcaggtggac gaccactgcg ccctggctcg ttgccccacg 2220 gcgcccgggg tcagcgcccc cggctgcccg gtgcagtga 2259 <210> 2 <211> 752 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Gln Pro Arg Leu Glu Leu Ser Ser Leu Glu Gly His Arg Ser 1 5 10 15 Ser Glu Asn Pro Glu Ser Arg Asp Glu Lys Thr Glu Glu Glu Val Asp 20 25 30 Asp Cys Pro Ile Glu Glu Val Arg Leu Thr Val Pro Ile Thr Asp Asp 35 40 45 Pro Ala Leu Pro Ala Leu Thr Phe Arg Thr Trp Leu Leu Gly Leu Ile 50 55 60 Ser Cys Ala Met Leu Ala Phe Ser Asn Gln Phe Phe Gly Tyr Arg Gln 65 70 75 80 Asn Pro Leu Tyr Ile Ser Ser Leu Ser Val Gln Ile Val Val Leu Pro 85 90 95 Leu Gly Lys Leu Met Ala Ala Cys Leu Pro Lys Lys Val Phe Arg Val 100 105 110 Lys Gly Thr Ala Trp Ser Phe Ser Leu Asn Pro Gly Pro Phe Asn Leu 115 120 125 Lys Glu His Val Leu Ile Thr Ile Phe Ala Asn Thr Gly Ser Asn Ser 130 135 140 Val Tyr Ala Val Gly Ile Ile Thr Ile Val Lys Ala Phe Tyr Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ile His Pro Leu Ala Ala Met Leu Leu Thr Gln Thr Thr Gln Leu 165 170 175 Met Gly Tyr Gly Trp Ala Gly Leu Phe Arg Lys Phe Leu Val Asp Ser 180 185 190 Pro Tyr Met Trp Trp Pro Ser Asn Leu Val Gln Val Ser Leu Phe Arg 195 200 205 Ala Leu His Glu Lys Glu Lys Arg Pro Lys Gly Gly Thr Thr Arg Leu 210 215 220 Gln Phe Phe Leu Thr Val Leu Ile Thr Ser Phe Ala Tyr Tyr Ile Val 225 230 235 240 Pro Asn Tyr Leu Phe Pro Thr Ile Ser Thr Ile Ser Val Val Cys Leu 245 250 255 Val Trp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Gln Ile Gly Ser Gly Val Tyr 260 265 270 Gly Leu Gly Val Gly Ser Phe Gly Leu Asp Trp Ala Thr Val Ala Gly 275 280 285 Phe Leu Gly Thr Pro Leu Ser Thr Pro Ala Phe Ala Ile Val Asn Ile 290 295 300 Met Ala Gly Phe Phe Leu Ile Val Tyr Val Ile Val Pro Ala Ala Tyr 305 310 315 320 Trp Ala Asp Ala Tyr Gly Ala Lys Arg Phe Pro Ile Ile Ser Ser His 325 330 335 Val Phe Ser Ala Asn Gly Ser Arg Tyr Asp Val Asn Gln Val Leu Asp 340 345 350 Thr Ala Thr Phe Glu Phe Ser Gln Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Gly Lys 355 360 365 Ile Asn Leu Ser Ile Phe Phe Ala Phe Thr Tyr Gly Leu Ser Phe Ala 370 375 380 Thr Leu Ala Ala Thr Leu Ser His Val Ala Leu Phe His Gly Gly Ser 385 390 395 400 Ile Trp Arg Gln Thr Lys Ala Ala Val Ser Gly Gln Gly Gly Asp Val 405 410 415 His Thr Arg Leu Met Lys Arg Asn Tyr Ala Ala Val Pro Gln Trp Trp 420 425 430 Phe Gln Val Met Leu Val Ala Val Leu Gly Leu Ser Val Phe Thr Cys 435 440 445 Glu Gly Phe Gly Gln Gln Leu Gln Leu Pro Tyr Trp Gly Val Leu Leu 450 455 460 Ala Ala Gly Leu Ala Phe Phe Phe Thr Leu Pro Ile Gly Ile Ile Thr 465 470 475 480 Ala Thr Thr Asn Gln Gln Pro Gly Leu Asn Val Ile Thr Glu Leu Ile 485 490 495 Ile Gly Tyr Leu Tyr Pro Gly Arg Pro Leu Ala Asn Val Ala Phe Lys 500 505 510 Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Met Ser Gln Ala Ile Met Phe Leu Gln Asp 515 520 525 Phe Lys Leu Gly His Tyr Met Lys Ile Pro Pro Arg Ser Met Phe Ile 530 535 540 Val Gln Leu Val Gly Thr Val Leu Ala Ser Ser Val Tyr Phe Gly Thr 545 550 555 560 Ser Trp Trp Leu Leu Glu Ser Val Ser Asn Ile Cys Asp Pro Ala Lys 565 570 575 Leu Pro Glu Gly Ser Pro Trp Thr Cys Pro Gly Asp Asp Val Phe Phe 580 585 590 Asn Ala Ser Ile Ile Trp Gly Val Val Gly Pro Leu Arg Met Phe Gly 595 600 605 Arg Leu Gly Leu Tyr Ala Lys Met Asn Tyr Phe Phe Leu Ala Gly Ala 610 615 620 Leu Ala Pro Val Pro Val Trp Ala Leu Ser Arg Ala Phe Pro Gly Arg 625 630 635 640 Ala Trp Ile Gly Leu Val Asn Met Pro Val Leu Leu Gly Ala Thr Gly 645 650 655 Met Met Pro Pro Ala Arg Ser Val Asn Tyr Leu Met Trp Gly Ala Val 660 665 670 Gly Leu Ala Phe Asn Tyr Val Val Tyr Arg Arg Tyr Lys Gly Trp Trp 675 680 685 Ala Arg His Asn Tyr Val Leu Ser Ala Gly Leu Asp Ala Gly Val Ala 690 695 700 Phe Met Gly Ile Leu Ser Tyr Ala Val Leu Gln Ser Arg Gly Ile Asn 705 710 715 720 Gly Val Asn Trp Trp Gly Leu Gln Val Asp Asp His Cys Ala Leu Ala 725 730 735 Arg Cys Pro Thr Ala Pro Gly Val Ser Ala Pro Gly Cys Pro Val Gln 740 745 750 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttcgcaagac ccttcctcta 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcaggaagaa ctgcagcct 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcaaggagca tgtgctcatc a 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcaggaagaa ctgcagcct 19

Claims (8)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10(Oryza sativa Oligopeptide transporter 10) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 형질전환된 식물세포에서 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
2. 삭제
3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10(Oryza sativa Oligopeptide transporter 10) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 형질전환된 식물세포에서 OsOPT10 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 고온에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
4. 삭제
5. 제3항의 방법에 의해 제조된 고온 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.
6. 삭제
7. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsOPT10(Oryza sativa Oligopeptide transporter 10) 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 고온 스트레스 내성 증가용 조성물.

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