KR20110085729A - 당의 액포 내 수송에 관여하는 벼 유래의 ＯｓＴＭＴ1 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 생장 및 발달 동안에 당을 액포 내로 수송하는 역할을 하는 벼 유래의 OsTMT1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 액포 내로 당 수송을 증가시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액포 내에 당이 증가된 식물체 및 상기 유전자를 포함하는 식물체의 액포 내로 당 수송을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 벼 유래 OsTMT1은 벼의 생장 및 발달 동안에 액포 내 당의 수송에 관여하는 유전자로서, 벼로부터 처음으로 분리 및 동정에 성공하였다.

Description

당의 액포 내 수송에 관여하는 벼 유래의 ＯｓＴＭＴ1 유전자{OsTMT1 gene involved in vacuolar sugar transport from rice}

본 발명은 식물의 생장 및 발달 동안에 당을 액포 내로 수송하는 역할을 하는 벼 유전자 OsTMT1에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물의 생장 및 발달 동안에 당을 액포 내로 수송하는 역할을 하는 벼 유래의 OsTMT1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 액포 내로 당 수송을 증가시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액포 내에 당이 증가된 식물체 및 상기 유전자를 포함하는 식물체의 액포 내로 당 수송을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

고등식물에서, 당(sugar)은 공급기관으로 알려진 성숙한 잎의 엽육세포(mesophyll cell)에서 생산된다. 뿌리 및 종자와 같은 헤테로트로픽 세포(Heterotrophic cells)는 수용부 기관(sink organ)이며, 그들의 영양은 당의 공급에 의존한다. 따라서, 당의 적절한 생산, 저장 그리고 수송은 식물의 생장과 발달을 유지하는데 필수적이다.

식물에는 다양한 당 수송 시스템이 존재한다. 당은 막(membrane)들을 가로지르는 당 트랜스포터에 의한 세포외 이동(apoplastic) 경로 또는 플라스모데스마타(plasmodesmata)를 통과하는 세포내 이동(symplastic) 경로를 통해 주위세포로 수송된다. 체관부 체세포(phloem sieve cell)에서 당은 식물 종에 따라, 당 트랜스포터에 의한 세포외 이동 경로 및/또는 세포내 이동 경로로 로딩되고, 또한 공급지에서 수용부 기관으로 장거리에 걸쳐서 수송된다(Williams et al, 2000, Trends in Plant Science 5, 283-290; Lim et al, 2006, Physiologia Plantarum 126, 572-584). 이러한 단거리 및 장거리 수송 외에, 당 분자들은 영양분의 요구에 따라 세포내의 다른 세포하 소기관(subcellular organelles)들로 분포된다. 예를 들어, 일과성 전분(transitory starch)은 엽록체(chloroplasts)내에서 말토스(maltose)로 분해되며, 그 후 말토스는 말토스 트랜스포터(maltose transporter)를 통하여 밤에 세포질로 수송된다(Weise et al, 2006, Plant Physiology 141, 879-886).

많은 식물들에서 디사카라이드 수크로스(disaccharide sucrose)는 체관부 체세포에서 장거리 수송을 위한 당의 주된 형태인 반면, 주요 모노사카라이드 당(monosaccharide sugar) 형태들은 글루코스(glucose) 및 프룩토스(fructose)이다. 당 트랜스포터들은 많은 유전자 패밀리를 구성한다. 예를 들면, 애기장대(Arabidopsis)에서 7개의 다른 서브패밀리(subfamilies)에 속하는 53개의 추정(putative) 모노사카라이드 트랜스포터 유전자들과 10개 이상의 디사카라이드 트랜스포터들이 동정되었다(Buttner, 2007, FEBS Letters 581, 2318-2324; Lalonde et al, 2004, Annual Review of Plant Biology 55, 341-372). 게다가, 벼는 20개 이상의 모노사카라이드 트랜스포터 유전자와 5개의 디사카라이드 트랜스포터를 가지고 있다(Lim et al, 2006, Physiologia Plantarum 126, 572-584).

성숙한 식물세포에서, 액포(vacuoles)는 세포 부피의 가장 많은 부분을 차지하며 일종의 반투과성 액포막(semi-permeable vacuolar membrane)인 토노플라스트(tonoplast)에 의해 세포질로부터 분리된다. 액포는 세포에서 장기간 및 일시적인 저장 공간으로서 주된 역할을 한다. 즉, 과도하게 생산된 여분의 대사 산물들이 액포 내로 수송되며, 또한 대사적 요구에 따라 방출된다(Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490). 이 과정에서, 특이적인 토노플라스트 당 트랜스포터가 이러한 영양분들의 액포수송을 위해 요구된다. 반면에, 많은 원형질막에 위치한 당 트랜스포터가 다양한 식물에서 잘 규명되어 있으며(Lalonde et al, 2004, Annual Review of Plant Biology 55, 341-372; Lim et al, 2006, Physiologia Plantarum 126, 572-584), 토노플라스트 당 트랜스포터의 존재는 단지 애기장대와 보리의 토노플라스트 프로테옴(proteome)에서 최근에 동정되었다(Carter et al, 2004, Plant Cell 16, 3285-3303; Endler et al, 2006, Plant Physiology 141, 196-207). 게다가, 지금까지 단지 두가지 타입의 액포성 당 트랜스포터, 즉 애기장대(Arabidopsis thaliana) 토노플라스트 모노사카라이드 트랜스포터(AtTMT)와 액포성 글루코스 트랜스포터(AtVGT)가 기능적으로 세밀하게 알려져있다(Aluri et al, 2007, PNAS of USA 104, 2537-2542).

AtTMT와 AtVGT의 토노플라스트 위치(localization)는 원형질체(protoplast)를 이용한 GFP 융합 구축물(fusion constructs)의 일시적 발현 분석(transient expression analysis)에 의해 이전에 조사되었고, AtVGT1의 능동적 글루코스 수송 능력은 분리된 효모 액포에서 증명되었다. 게다가, AtVGT1의 유전자 발현과 돌연변이 분석은 종자 발아와 개화에서 역할을 제안하였다(Aluri et al, 2007, PNAS of USA 104, 2537-2542). 대조적으로, 매우 긴 친수성 중앙 루프(hydrophilic central loop)를 갖고 있는 AtTMT1과 AtTMT2는 가뭄, 염분 그리고 저온과 같은 스트레스 처리에 대한 반응에서 과발현된다고 알려졌다. AtTMT1의 당 수송 활동은 저온-처리된 tmt1 돌연변이체로부터 분리된 액포를 사용하여 증명하였다. 이러한 데이터는 애기장대에서 스트레스 반응동안 AtVGT1과는 구별되는 AtTMT에 대한 주된 역할을 집합적으로 제안한다(Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490). 또한 특히, AtTMT와는 달리 글루코스 트랜스포터로 작용하는 남세균 Synechocystis sp. PCC6803의 TMT 동족체(homolog)인 SsGTR은 남세균의 원형질막에 존재한다. SsGTR은 세균 세포 내로 proton-coupled 당 수송을 촉매한다(Schmetterer, 1990, Plant Molecular Biology 14, 697-706). 다른 식물들에서, TMT의 역할은 알려져 있지 않고 이 유전자들의 규명은 중요한 현안으로 남아 있다.

벼의 생장과 발달 동안 TMT 단백질의 가능성 있는 역할을 설명하기 위해, 본 발명은 벼로부터 두 가지의 TMT인 OsTMT1과 OsTMT2를 분리하고 규명하였다. OsTMT-GFP 융합 단백질의 세포하(subcellular) 위치를 애기장대에서 조사되었다. 세밀한 발현 패턴은 OsTMT 프로모터- GUS 융합체를 발현하는 형질전환된 벼에서 RT-PCR, 조직화학분석법, 그리고 추가적인 인 시투 혼성화(in situ hybridization)에 의해 분석되었다. 토노플라스트를 지나는 당 수송 능력은 OsTMT1을 발현하는 형질전환된 애기장대 TMT-결핍 돌연변이 라인(tmt1 -2-3)에서 분리된 액포로 실험하였고, 당 수준의 보충 실험 또한 형질전환된 애기장대 라인에서 실시되었다. 마지막으로, 본 발명에서 획득된 데이터를 근거로 하여, 동화물 수송 동안에 당의 회수과정에서 OsTMT의 관련성이 조사되었다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼(Oryza sativa) 유래의 TMT 유전자인 OsTMT1이 식물의 생장 및 발달 동안에 당을 액포 내로 수송하는 역할을 한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물의 생장 및 발달 동안에 당을 액포 내로 수송하는 역할을 하는 벼 유래의 OsTMT1 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 액포 내로 당 수송을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 액포 내에 당이 증가된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물체의 액포 내로 당 수송을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 벼 유래 OsTMT1은 벼의 생장 및 발달 동안에 액포 내 당의 수송에 관여하는 유전자로서, 벼로부터 처음으로 분리 및 동정에 성공하였다. 따라서 식물의 생장, 발달 및 환경 스트레스 등에 관여하는 새로운 유전자의 탐색 및 계통 연구에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 근연접합법(Neighbor-joining method)을 사용하여 구축된 TMT 유전자의 계통수를 나타낸다. 기준자(scale bar)는 100개의 아미노산 위치당 변화가 10개인 거리(distance)에 해당한다. 가지(branch)의 수는 백분율로 부트스트랩 밸류(bootstrap value)를 나타낸다. 등록번호(Accession No.)는 재료 및 방법에 기술되어 있다.
도 2는 OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 게놈 구조를 나타낸다. 엑손(exon)은 검은색 직사각형으로 나타내었고, 인트론(intron)은 선으로 나타내었다. 직사각형의 수는 엑손의 수를 나타낸다.
도 3은 벼 토노플라스트 모노사카라이드 트랜스포터(OsTMTs)인 OsTMT1, OsTMT2, OsTMT3 그리고 OsTMT4에 대한 연역된 아미노산 서열의 비교를 나타낸다. 이 단백질들은 밑줄친 서열(1~12)에 의해 보여진 바와 같이 12개의 추정 트랜스멤브레인(putative transmembrane) 영역을 가진다. 동일하고 보존된 잔기들은 별표, 점 그리고 콜론으로 표시하였다.
도 4는 형질전환 벼 캘러스와 OsTMT1 - GFP을 발현하는 형질전환 애기장대로 부터 분리된 엽육 원형질체에서 OsTMT1-GFP 융합 단백질의 세포하 위치를 나타낸다. (a, b) 형질전환 벼 캘러스에서 OsTMT1-GFP 융합 단백질의 위치. FM4-64로 염색된 원형질막은 OsTMT1-GFP와 겹치지 않는다. (c) 애기장대 원형질체에서 OsTMT1-GFP 융합 단백질의 위치. 엽록소 자가형광과 FM4-64는 각각 엽록체와 원형질막의 마커로서 사용되었다. GFP 시그널은 녹색으로 나타나고, FM4-64로 염색된 원형질막은 적색으로 나타난다.
도 5은 형질전환 벼 캘러스와 OsTMT2 - GFP을 발현하는 형질전환 애기장대에서 OsTMT2-GFP 융합 단백질의 세포하 위치를 나타낸다. (a) 형질전환 벼 캘러스에서 OsTMT2-GFP 융합 단백질의 위치. (b) OsTMT2-GFP를 발현하는 형질전환 애기장대의 잎에서 OsTMT2-GFP 융합 단백질. 엽록소 자가형광은 엽록체 마커로서 사용되었다.
도 6은 OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 발현 분석을 나타낸다. (a) 잎, 뿌리, 꽃 그리고 1~12 DAF 자실(caryopses)의 미성숙 종자 혼합물을 포함하는 벼 조직에서 OsTMT1과 OsTMT2의 발현 패턴. (b) 배유(endosperm)와 종자 껍질에서 OsTMT1과 OsTMT2의 발현 패턴. (c) 벼 종자 발달 동안에 OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 발현 수준의 변화. 벼 종자는 15 DAF까지 시간대별로 채집되었다. Act1은 PCR 대조군이다. (d) 벼 잎에서 OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 발현에 따른 당의 영향. 잘려진 잎들은 수크로스, 글루코스, 프룩토스 또는 만니톨을 함유하는 MS 배지로 처리되었고, 12시간과 24시간 후에 채집되었다. OsUBQ5는 PCR 대조군이다.
MS: MS 배지, MS+S: MS 배지 + 175mM 수크로스, MS+G: MS 배지 + 175mM 글루코스, MS+F: MS 배지 + 175mM 프룩토스, MS+M: MS 배지 + 175mM 만니톨
도 7은 연속적인 150 μmol/m²s의 광 조건하에 2주 된 벼 유묘에서 저온(a), 가뭄(b) 그리고 염분(c) 처리에 대한 OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 발현을 나타낸다. (a) 저온 스트레스를 위해, 유묘는 최대 6시간 동안 4℃에서 키워졌다. (b, c) 가뭄과 높은 염분 스트레스 자극을 위해, 유묘는 각각 공기 중에서 건조시키고, 250mM NaCl에서 최대 6시간 동안 28℃에서 키워졌다. 이 실험은 Jang 등 (2003, Plant Physiology 131, 516-524)이 기술한 절차에 따라 실시되었다.
도 8은 pOsTMT1 - GUS 또는 pOsTMT2 - GUS 구축물을 가지는 형질전환 벼의 잎, 뿌리 그리고 꽃에서 GUS 발현의 조직화학적 위치를 나타낸다. (a, b) pOsTMT1 -GUS(a) 또는 pOsTMT2 - GUS(b) 라인들의 잎의 횡단면. (c, d) pOsTMT1 - GUS(c) 또는 pOsTMT2-GUS(d) 라인들의 뿌리의 횡단면. (e, f) pOsTMT1 - GUS 의 소수상화(spikelet). (g, h) pOsTMT2 - GUS의 소수상화.
BS: 유관속초 세포(bundle sheath cells), CC: 반세포(companion cells), MC: 엽육세포, X: 후생목부(metaxylem), SE: 사요소(sieve element), VP: 관유조직(vascular parenchyma)
도 9는 pOsTMT1 - GUS 또는 pOsTMT2 - GUS 구축물을 가지는 형질전환 벼의 미성숙 종자에서 GUS 발현의 조직화학적 위치와 인 시투 혼성화(in situ hybridization) 분석을 나타낸다. (a, b) pOsTMT1 - GUS(a) 또는 pOsTMT2 - GUS(b)의 7~8 DAF 미성숙 종자에서 GUS 발현. (c, d) pOsTMT1 - GUS(c) 또는 pOsTMT2 - GUS(d)의 5 DAF 미성숙 종자의 종단면. (e, f) pOsTMT1 - GUS(e) 또는 pOsTMT2 - GUS(f)의 5 DAF 미성숙 종자의 횡단면(어두운 부분의 이미지). (g, h) pOsTMT1 - GUS(g) 또는 pOsTMT2-GUS(h)의 12~15 DAF 미성숙 종자의 종단면. 화살표는 등쪽(dorsal side)에서 GUS 발현을 나타낸다. (i) 3 DAF 종자의 횡단면의 인 시투 혼성화에 의한 OsTMT2 전사체의 검출. (j) 센스 프로브로 혼성화된 유사한 절편(section)은 양성 라벨링을 보여주지 않았다. (k) 5 DAF 종자의 종단면의 인 시투 혼성화에 의한 OsTMT2 전사체의 검출. (l) 센스 프로브로 혼성화된 유사한 절편은 양성 라벨링을 보여주지 않았다.
C: 크로스 세포층(cross cell layers), E: 표피(epidermis), Em: 배아(embryo), En: 배유, I: 외피(integument), M: 중과피(mesocarp), N: nucellar 표피, NP: nucellar projecion, T: 튜브 세포층(tube cell layers), V: 주 관다발(main vascular bundle)
도 10은 OsTMT1을 과발현하는 애기장대 tmt1 -2-3 트리플(triple) 돌연변이 식물들에서 분리된 액포 내로 글루코스 수송의 회복(complementation)과 이들 식물체들의 당 함량을 나타낸다. (a) OsTMT1, OsTMT1 - OX1 그리고 OsTMT1 - OX2를 발현하는 형질전환 tmt1 -2-3 라인들에서 OsTMT1의 발현. UBQ는 PCR 대조군이다. (b) 애기장대 야생형, tmt1 -2-3 돌연변이, OsTMT1-OX1 그리고 OsTMT1-OX2 라인들로부터 분리된 액포 내로 ¹⁴C-글루코스 흡수의 시간대별 분석. 열린 정사각형으로 된 회색 점선, 열린 마름모로 된 검은색 점선, 닫힌 삼각형으로 된 회색 직선 및 닫힌 원형으로 된 검은색 직선은 각각 tmt1 -2-3 트리플 돌연변이, 야생형, OsTMT1-OX1 그리고 OsTMT1-OX2를 나타낸다. (c) OsTMT1을 발현하는 형질전환 애기장대 tmt1-2-3 라인들에서 당 함량의 회복. 진회색 막대기는 야생형, 흰색 막대기는 tmt1 -2-3 트리플 돌연변이, 검은색 막대기는 OsTMT1-OX1, 연회색 막대기는 OsTMT1-OX2를 나타낸다. 각 데이타의 막대기 끝 부분은 3번의 실험으로부터의 평균±표준편차를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 생장 및 발달 동안에 당을 액포 내로 수송하는 역할을 하는 벼 유래의 OsTMT1 (Oryza sativa tonoplast monosaccharide transporter 1) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 OsTMT1 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 액포 내로 당을 수송하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 OsTMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsTMT1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 OsTMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터일 수 있으며, 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 더욱 바람직하게는 벼 또는 애기장대이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 애기장대 또는 벼이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 OsTMT1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 액포 내로 당 수송을 증가시키는 방법을 제공한다. OsTMT1 유전자는 토노플라스트(tonoplast)에 존재하면서, 액포 내로 당 수송을 수행하므로, 상기 유전자를 과발현시키면 액포 내로의 당 수송이 증가될 수 있는 것이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 액포 내에 당이 증가된 식물체를 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 OsTMT1 유전자를 포함하는, 식물체의 액포 내로 당 수송을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 OsTMT1 유전자를 유효성분으로 포함하는데, 상기 유전자는 토노플라스트(tonoplast)에 존재하면서, 액포 내로 당 수송을 수행하므로, 상기 유전자를 과발현시키면 액포 내로의 당 수송을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료

14시간-광/10시간-암 주기의 낮에는 30℃, 밤에는 20℃인 온실에서 키운 야생형 벼(Oryza sativa L. cv. 동진)를 본 발명에 사용하였다. 미성숙 종자들은 서로 다른 발달 단계에서 채집되었고 꽃들은 출수(heading) 직전에 채집되었다. 성숙 식물의 플래그 잎(flag leaves)이 채집되었고, 반면에 뿌리는 4개 잎의 유묘(four-leaf seedling) 단계에서 채집되었다. 애기장대 야생형(ecotype Columbia)과 tmt1 -2-3 돌연변이 식물(Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490)이 형질전환에 사용되었다. 모든 애기장대 식물들은 다르게 지정되지 않는다면, 14시간-광/10시간-암의 광주기하 22℃ 토양에서 키웠다.

OsTMT 전장 cDNA 클론의 클론닝

OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 전장(full-length) cDNA는 번역 개시 코돈과 3' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 유전자 특이적인 프라이머; OsTMT1: 5'-AAATCTCCCCTAAAAGCTTCC-3'(서열번호 3)과 5'-GAACTAGTACTCGGCTATGCTAA-3'(서열번호 4), OsTMT2: 5'-AAGAGGTGGAAGAAGAGGGAT-3'(서열번호 5)과 5'-TATTATGAACCCCAACATAGTAGC-3'(서열번호 6)를 이용하여 PCR에 의해 분리되었다. 모든 합성된 cDNA들은 pGEM-T easy 벡터 (Promega, Madison, WI) 내로 서브클로닝되었고, 그 후 시퀀싱되었다. OsTMT1과 OsTMT2의 cDNA 서열은 NCBI 데이터베이스에 각각 등록되었다(등록번호: GU066765 와 GU066766).

서열 정렬( sequence alignment )과 계통수( phylogenetic tree )의 제작

OsTMT 유전자의 연역된 아미노산 서열은 CLUSTAL W 프로그램(Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Research 22, 4673-4680)을 이용하여 다른 종에서 이전에 보고된 유전자와 서열 정렬되었다. 계통수는 근연접합법을 통해 MEGA 소프트웨어 버전 4.0(Tamura et al, 2007, Molecular Biology and Evolution 24, 1596-1599)을 이용하여 제작되었다. 부트스트랩(bootstrap) 분석은 1,000개의 replicate를 가지고 수행되었고 부트스트랩 밸류는 백분율로 나타내었다. 계통수의 제작에 사용된 서열의 등록번호는 애기장대 유래의 AtTMT1 (At1g20840; Z50752), AtTMT2 (At4g35300; AJ532570), AtTMT3 (At3g51490; AJ532571); 보리 유래의 HvSTP1 (AJ534445), HvSTP2 (AJ534446); 사탕수수 유래의 PST type 2a (AY165599); 포도 유래의 VvHT6 (AY861386) 이다.

OsTMT - GFP 융합 단백질의 세포하 위치

벼와 애기장대에서 OsTMT1과 OsTMT2의 세포하 위치를 조사하기 위해서, 종결코돈과 3'UTR을 제외한 각각의 전장 cDNA 단편이 증폭되었고 그 다음에 JJ461 바이너리 벡터(Cho et al, 2009, Plant Physiology 149, 745-759)의 CaMV35S 프로모터와 sGFP 사이 영역에 클로닝하였다. OsTMT-GFP 융합 벡터의 제조에 사용된 프라이머는 OsTMT1: 5'-GCTCTAGACTTGGTGGTAAGATTCGCCG-3'(서열번호 7)와 5'-CCCTCGAGAGTCCTCCTTGGCCTGCTTTGC-3'(서열번호 8), OsTMT2: 5'-GCTCTAGAGGGGTGAAGATGTCGGGTGCT-3'(서열번호 9)와 5'-CCCTCGAGAGGCCTTTGTAGCCTGCATTTG-3'(서열번호 10)이다. OsTMT - GFP 융합 구축물(constructs)을 발현하는 형질전환된 캘러스와 식물들, 그리고 형질전환된 애기장대로부터 분리된 원형질체는 공초점 현미경(LSM 510 META, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 조사되었다. 엽록소 자가형광(Chlorophyll autofluorescence)은 엽록체 마커로서 사용되었다. 형질전환 벼 캘러스에서, 원형질막은 친유성(lipophilic) 스티릴 염료인 FM4-64 (Molecular Probes, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색되었다.

프로모터 클로닝과 GUS 융합 벡터의 제조

주형(template)으로서 벼 게놈 DNA를 사용하여, 그 길이가 각각 2445 bp와 2481 bp인 OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 5'업스트림 영역이 PCR에 의해 증폭되었다. proof-reading DNA 폴리머라제 pfu (SolGent, Daejeon, Korea)가 PCR 에러를 감소시키기 위해 사용되었고, 증폭에 사용된 프라이머는 OsTMT1: 5'-CCCTCGAGAAACCTAAACTTGAAATGTGCTA-3'(서열번호 11)과 5'-CGCCTAGGCGAATCTTACCACTGCACAAGAA-3'(서열번호 12), OsTMT2: 5'-GCGTCGACATCGTGATTCTTTCTTTCAAAC-3'(서열번호 13)과 5'-GCTCTAGACTTCACCCCTCTCCGATCCC-3'(서열번호 14)이다. 증폭된 산물들은 pGEM T-easy 벡터 내로 클로닝 되었고, 그 후 시퀀싱되었다. 클로닝된 인서트(inserts)는 XhoI/AvrII 또는 SalI/XbaI 로 절단되었고, 그 다음에 바이너리 벡터 pC1300intC (Ouwerkerk et al, 2001, Planta 213, 370-378)로부터 유래한 프로모터 없는 β-glucuronidase (GUS) 리포터(reporter) 유전자를 함유하는 JJ376 벡터의 SalI 와 XbaI 부위에 서브클로닝되었다. 결과적으로, OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 프로모터 영역은 nopaline synthase (nos) 유전자의 터미네이터에 연결된 GUS 유전자에 융합되었다. OsTMT1 프로모터-GUS 와 OsTMT2 프로모터-GUS 융합체를 포함하는 이러한 구축물은 pOsTMT1 - GUS 와 pOsTMT2 - GUS 로 각각 명명되었다.

벼의 형질전환

CaMV35S - OsTMT - GFP 또는 pOsTMT - GUS 융합 구축물을 발현하는 형질전환 벼를 제조하기 위해, 이 각각의 벡터들을 가지는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주는 25mg/L 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 AB 배지에서 3일동안 28℃에서 배양되었고, 형질전환 캘러스는 이전에 기술된 아그로박테리움-매개 공배양 방법을 통해 획득되었다(Jeon et al, 2000, The Plant Journal 22, 561-570). 형질전환된 벼는 50mg/L 하이그로마이신(hygromycin)과 250mg/L 세포탁심(cefotaxime)을 함유하는 선택배지에서 형질전환된 캘러스로부터 재분화되었다.

애기장대의 형질전환

CaMV35S - OsTMT - GFP , CaMV35S - OsTMT1 또는 CaMV35S - OsTMT2 구축물 중 하나를 가지는 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefaciens) GV3101 균주는 25mg/L 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 정체기(stationary phase)까지 28℃에서 250rpm으로 흔들면서 배양되었다. CaMV35S - OsTMT - GFP에 대해, 야생형 애기장대(ecotype Columbia)가 이전에 기술된 floral dip 방법에 의해 형질전환되었다(Clough & Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735-743). CaMV35S - OsTMT1 과 CaMV35S-OsTMT2 구축물에 대해, 애기장대 tmt1 -2-3 돌연변이 라인이 형질전환에 사용되었다. 모든 형질전환 식물들은 25mg/L 하이그로마이신을 함유하는 Gamborg B5 배지에서 선별되었고, 14시간-광/10시간-암의 광주기하 22℃ 토양에서 키웠다. 애기장대에서 OsTMTs의 세포하 위치를 조사하기 위해, 이전에 기술한 Sheen의 방법과 같이, 원형질체는 잘 확장된 3-4주차 형질전환 식물의 잎들로부터 분리되었다(Sheen, 2001, Plant Physiology 127, 1466-1475).

조직화학적 GUS 분석

형질전환 식물들로부터 다양한 기관들이 채집되었고, 0.2M 소듐 포스페이트(pH 7.0), 10mM EDTA, 20% 메탄올, 2% DMSO, 0.1% 5-bromo-4-chloro-3-indol β-glucopyranoside (X-Gluc)를 함유하는 GUS 반응 용액에서 이전에 기술한 바와 같이 염색되었다(Jeon et al, 1999, Plant Molecular Biology 39, 35-44). 샘플들은 염색이 충분히 될 때까지 37℃에서 1시간 내지 밤새 인큐베이션하였고, 그 다음에 염록소를 제거하기 위해 70% 에탄올로 이동되었다. 염색 후, 그 샘플들은 50% 에탄올, 5% 아세트산 그리고 3.7% 포름알데히드를 함유하는 FAA 용액에서 고정되었다. 꽃들은 해부현미경(dissecting microscope, SZX12; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰되었고, ImagePro Express (Olympus, Tokyo, Japan)로 사진을 찍었다. 종단면과 횡단면의 관찰을 위해, 염색된 샘플들은 paraplast plus (Sigma, St Louis, MO)에 포매(embedding)되었고, 마이크로톰(microtome, Microm HM360, Woldorf, Germany)을 사용하여 10㎛ 절편을 준비하였다. 그 절편들은 그 다음에 슬라이드로 마운팅(mounting)되었고 복식현미경(compound microscope)에서 관찰되었다.

당 처리

당 처리를 위해, 4개 잎 단계의 유묘들을 그들의 내인성(endogenous) 당들을 제거하기 위해 암(dark) 조건하에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음에 잎들을 이전에 기술한 방법(Cho et al, 2006, Planta 224, 598-611; Dian et al, 2003, Planta 218, 261-268)과 같이 1cm 조각으로 자르고 175mM 수크로스, 글루코스, 프룩토스 또는 만니톨(mannitol)을 함유하는 액체 MS 배지에서 28℃ 암조건하에 처리하였다. 그 샘플들은 처리 12시간 또는 24시간 후에 채집되었다.

RT - PCR 분석

RT-PCR 분석을 위해, 트리졸 시약(Trizol reagent)을 사용하여 채집된 샘플로부터 총 RNA를 얻었고 First-Strand cDNA 합성 키트(Roche, Mannheim, Germany)와 oligo-dT 프라이머를 이용하여 역전사반응을 실시했다. First-Strand cDNA는 하우스키핑 유전자인 Act1 (McElroy et al, 1990, Plant Cell 2, 163-171), OsUBQ5 (Jain et al, 2006, BBRC 345, 645-651), 그리고 당-유도성(inducible) 유전자 OsGBSSII(Dian et al, 2003, Planta 218, 261-268)에 대한 유전자 특이적인 프라이머 및 대조군 프라이머와 함께 PCR 반응에 사용되었다. 유전자 특이적인 프라이머는 OsTMT1: 5'-GAAGTCATCACCGAGTTCTTC-3'(서열번호 15)과 5'-TACAGGGAGAAGAATTCCAAA-3'(서열번호 16), OsTMT2: 5'-GTCTTTGGTATATACGCAGTTGTT-3'(서열번호 17)과 5'-AGTGGACATGAATAACATGAAAAT-3'(서열번호 18), OsGBSSII: 5'-TAGGTGTCACTGAATGGCTAGAAC-3'(서열번호 19)과 5'-TGGCCCACATCTCTAAGTAACATC-3'(서열번호 20), Act1: 5'-GGAACTGGTATGGTCAAGGC-3'(서열번호 21)과 5'-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3'(서열번호 22), 그리고 OsUBQ5: 5'-GACTACAACATCCAGAAGGAGTC-3'(서열번호 23)과 5'-TCATCTAATAACCAGTTCGATTTC-3'(서열번호 24)과 같다. 형질전환 애기장대 식물을 위해, UBQ (At5g20620) 프라이머: 5'-GTGGTGCTAAGAAGAGGAAGA-3'(서열번호 25)과 5'-TCAAGCTTCAACTTCTTCTTT-3'(서열번호 26)을 PCR 대조군으로 사용하였다(Cho et al, 2009, Plant Physiology 149, 745-759). RT-PCR 분석은 이전에 기술된 방법(Cho et al, 2005, Plant Cell Reports 24, 225-236)으로 실시하였고, 적어도 3번 반복하여 유사한 결과를 얻었다.

인 시투 혼성화 ( in situ hybridization )

채집된 3 및 5 DAF(days after fertilization) 자실들은 4% 파라포름알데히드, 0.25% 글루타르알데히드를 함유하는 50mM 소듐 포스페이트 완충액에서 1시간 동안 고정시켰고, 그 다음 에탄올의 graded series 로 탈수시키고, 마지막으로 paraplast plus (Sigma)에 포매시켰다. 그 다음에 포매된 샘플들을 마이크로톰(Microm HM360)을 사용하여 조심스럽게 종단면 또는 횡단면으로 절단했다. 절단된 7㎛ 절편들은 슬라이드에 마운팅되었고 Kouchi & Hata (1993, Molecular & General Genetics 238, 106-119) 그리고 Hirose 등(2002, Plant & Cell Physiology 38, 1389-1396)의 변형된 방법을 이용하여 인 시투 혼성화에 사용하였다. 혼성화 프로브(probe)를 만들기 위해, OsTMT2 cDNA의 중앙 루프 영역의 523 bp 단편이 pBluescript II SK(+)(Stratagene, La Jolla, CA)의 BamHI과 EcoRI 부위에 서브클로닝 되었다. 이 벡터는 BamHI 또는 EcoRI로 절단하여 선형화되었고, 디곡시제닌 (DIG)-표지 믹스(Roche)와 T3 또는 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관 내 전사에 의해 표지되었다. DIG로 표지된 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프로브는 구축물의 T3 또는 T7 프로모터로부터 각각 합성되어졌고, 그 다음에 약 100 내지 200 염기로 가수분해되었다. 그 절편들은 DIG로 표지된 센스 및 안티센스 프로브로 42℃에서 16시간 동안 혼성화되었다. 혼성화된 프로브는 anti-DIG 알칼라인 포스파타제 컨쥬게이트(Roche)를 이용하여 면역학적으로 검출되었다. NBT (Nitro blue tetrazolium chloride)/BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidine salt) ready-to-use 정제(tablets)(Roche)가 기질로 이용되었다.

분리된 잎 엽육 액포 내로 글루코스의 흡수와 가용성 당의 정량

OsTMT1의 글루코스 수송 능력을 조사하기 위해, 손상되지 않은 잎의 엽육 액포가 야생형, tmt1 -2-3 와 OsTMT1 형질전환 식물로부터 분리되었다. 식물들은 8시간-광/16시간-암의 광주기(90 μmol/m²s)하 22℃ 토양에서 4 내지 5주 동안 키워졌고, 액포 분리전에 50 μmol/m²s 명조건에서 5일동안 키워졌다. ¹⁴C-글루코스를 이용한 수송실험에서 액포의 분리와 그 이용은 Wormit 등(2006, Plant Cell 18, 3476-3490)의 방법에 의해 실시되었다. 수송은 125 μM ¹⁴C-글루코스(비활성: 300 mCi mmol^-1)과 1 mM Mg^{2 +}-ATP를 이용하여 15분 동안 행해졌다.

가용성 당 함량의 측정을 위해, 야생형, tmt1 -2-3 와 OsTMT1 형질전환 식물로부터 채집된 애기장대 잎들은 미리 냉각된 어댑터가 있는 TissueLyser (Qiagen-Retsch GmbH, Haan, Germany)를 사용하여 미세한 분말로 만들어서 냉동시켰다. 그 다음에 총 100mg의 잎 분말은 80℃에서 1시간 동안 80% 에탄올을 이용하여 추출되었고, 추출물은 수분을 증발시킨뒤 멸균수에 용해시켰다. 당 함량의 분광 정량(Spectroscopic quantification)은 Lee 등(2008, Plant , Cell & Environment 31, 1851-1863)의 방법에 의해 실시되었다.

실시예 1: OsTMT1 과 OsTMT2 의 클로닝

레퍼런스(reference) 서열((Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490)로서 AtTMT 이성질형(isoform)을 이용한 벼 주석이 달린(annotated) 서열 데이터베이스의 체계적인 블라스트 서치(BLAST search)는 4개의 벼(Oryza sativa) TMT 유전자; OsTMT1 (LOC_Os10g39440), OsTMT2(LOC_Os02g13560), OsTMT3(LOC_Os03g03680), 그리고 OsTMT4 (LOC_Os11g40540)를 동정하였다. OsTMTs 와 AtTMTs 사이의 유사성을 비교하기 위해, 그리고 다른 식물 종으로부터 TMT 서열들을 동정하기 위해, 본 발명은 아미노산 서열비교를 기초로 근연접합법을 이용하여 계통수를 만들었다. 이 분석을 통해 동정한 4개의 OsTMT 중에서 OsTMT3 또는 OsTMT4 보다는 OsTMT1과 OsTMT2가 AtTMTs와 더 가까운 진화적 관계를 보여준다는 것을 나타내었다(도 1). 사실 OsTMT1과 OsTMT2는 본 발명의 계통수에서 보리 유래 2개의 추정 당 트랜스포터, 즉 HvSTP1과 HvSTP2를 가지는 단자엽식물(monocot) 서브그룹을 형성하는데, 그것들은 초기 종자 발달 동안에 자실의 모계 및 자계 조직 사이의 당 비율을 조절하는데 관여한다고 제안되었다(Weschke et al, 2003, The Plant Journal 33, 395-411). 이 단자엽식물 서브그룹은 또한 사탕수수 유래의 추정 당 트랜스포터인 PST type 2a를 포함하는데, 그것은 AtTMTs와 상동성이 있다(Casu et al, 2003, Plant Molecular Biology 52, 371-386). HvSTP1, HvSTP2와 PST type 2a의 토노플라스트 위치와 각 당 트랜스포터 기능은 아직 결정되지 않았다. AtTMT와 포도 유래 추정 당 트랜스포터인 VvHT6는 쌍자엽(dicot) 서브그룹을 형성한다(도 1). 이 발견은 OsTMT1과 OsTMT2의 위치와 기능을 더 규명하게 하였다. 게다가, OsTMT1과 OsTMT2는 액포성 글루코스 트랜스포터 서브패밀리로 알려진 애기장대 VGT 그룹, 또는 원형질막의 당 트랜스포터 서브패밀리인 애기장대 STP 그룹과 어떤 유의적인 상동성을 보이지는 않았다(데이타 미제시).

OsTMT1과 OsTMT2의 전장 cDNA는 번역 개시 코돈의 업스트림 영역과 종결코돈의 다운스트림 영역을 포함하는 유전자 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분리되었다. 서열 분석과 그들의 게놈 클론과의 비교는 그 두 개의 유전자들이 6개의 엑손으로 구성된 게놈 구조를 가지고 5'UTR에 인트론을 포함한다는 것을 보여주었다(도 2). 그 연역된 아미노산 서열들은, 12개의 예상된 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인과 TMT 패밀리의 특징인 트랜스멤브레인 도메인 6과 7 사이에 약 340개의 아미노산 잔기들의 매우 큰 친수성 중앙 루프를 가지는, 각각 740과 746개 아미노산의 OsTMT1 (GenBank 등록번호 GU066765)과 OsTMT2 (등록번호 GU066766)를 보여주었다(도 3). 그들의 AtTMTs에 대한 실제적인 구조적 유사성은 OsTMT1과 OsTMT2가 토노플라스트에 위치하는 모노사카라이드 트랜스포터의 멤버라는 것을 제안한다.

실시예 2: OsTMT - GFP 융합 단백질의 세포하 위치

OsTMT1과 OsTMT2의 세포하 위치를 결정하기 위해, 본 발명은 CaMV35S 프로모터의 조절하에 OsTMT1 - GFP 또는 OsTMT2 - GFP 구축물을 발현하는 형질전환 벼 캘러스를 만들었다. 이러한 형질전환 캘러스의 분석은 OsTMT1-GFP 가 캘러스내에 크고 작은 액포의 토노플라스트에 위치한다는 것을 보여준다(도 4a). 원형질막으로부터 토노플라스트-localized GFP 시그널을 구분하기 위해, 형질전환 벼 캘러스는 주로 원형질막을 염색하고, 식물을 포함하는 다양한 진핵세포에서 세포내(endocytic) 경로를 따르는 것으로 알려진 친유성 스티릴 염료인 FM4-64로 염색되었다(Ueda et al, 2001, The EMBO journal 20, 4730-4741). 그러나, GFP 시그널은 많은 영역에서 FM4-64의 시그널과 잘 합쳐지지 않았는데, 이는 OsTMT1이 원형질막에 위치하지 않는다는 것을 나타낸다(도 4b). 또한, OsTMT1의 토노플라스트 위치는 OsTMT1 - GFP를 과발현하는 형질전환 애기장대 식물들의 엽육세포로부터 분리된 원형질체에서 증명되었다. 이는 엽록소 자가형광(autofluorescence)을 가지는 엽록체에 의해 만입(indent)된 액포 토노플라스트의 존재에 의해 분명하게 보여졌다(도 4c). 유사한 결과들이 OsTMT1 - GFP를 발현하는 벼와 애기장대 세포에서 발견되었다(도 5). 이러한 결과들은 OsTMT1과 OsTMT2가 토노플라스트에는 존재하고, 원형질막으로는 타겟팅되지 않는다는 것을 분명하게 나타낸다.

실시예 3: OsTMT1 과 OsTMT2 의 발현 분석

벼에서 OsTMT1과 OsTMT2 유전자의 시공간적(spatiotemporal) 발현 프로필을 조사하기 위해, 반정량 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과들은 잎, 뿌리, 꽃 그리고 미성숙 종자를 포함한 실험에 사용된 모든 벼 기관들에서 OsTMT1과 OsTMT2 전사체의 유의적인 수준을 나타내었다(도 6a). 미성숙 종자의 분석은 OsTMT1과 OsTMT2가 종자 껍질에서 우선적으로 발현이 되고, 배유에서는 발현이 되지 않는다는 것을 보여주었다(도 6b). 15 DAF(days after fertilization)까지의 다른 발달 단계들에서 채집된 일련의 벼 종자들에 대해 OsTMT1과 OsTMT2의 RT-PCR 분석을 수행하였다. 벼 종자들은 pre-storage phase(1-6 DAF)동안 발생하는 배유세포의 세포화(cellularization)와 증식(proliferation)을 이용하여 주로 세로로 신장되며, 그 다음에 starch-filling milky phase(7-15 DAF) 동안 두꺼워진다(Hirose et al, 2002, Plant & Cell Physiology 43, 452-459). 두 OsTMT들의 발현은 starch-filling phase에 비해 pre-storage phase동안 더 높은 것이 발견되었는데, 이는 초기 종자 발달 동안에 모든 기관, 특히 종자 껍질에서 OsTMT1과 OsTMT2의 역할을 제안한다(도 6c).

다음으로 OsTMT 유전자 발현에 대한 가용성 당의 효과를 조사하기 위해, 내인성 당이 고갈된 잘려진 잎들은 175mM 수크로스, 글루코스, 프룩토스 또는 만니톨을 포함하는 MS 배지로 처리되었다. RT-PCR 분석은 잘 알려진 당-유도성(sugar-inducible) 유전자 OsGBSSII (Dian et al, 2003, Planta 218, 261-268)의 발현과 유사하게, OsTMT1과 OsTMT2의 수준이 수크로스, 글루코스 또는 프룩토스의 12시간 및 24시간 처리에 의해 증가된 반면, 만니톨은 아무런 영향이 없었다(도 6d).

AtTMT 유전자는 염분, 가뭄 그리고 저온과 같은 환경 스트레스에 의해 현저하게 과발현되는 것이 이미 알려져 있다. 본 발명은 OsTMT1과 OsTMT2의 발현이 그러한 스트레스 자극에 의해 변화하는지를 조사하였다. 본 발명은 저온(4℃), 염분(250mM NaCl) 또는 가뭄에 노출된 벼 샘플에서 OsTMT1과 OsTMT2의 발현에 어떤 유의적이거나 재생 가능한 변화를 관찰하지는 못하였는데, 이는 아마도 OsTMT가 AtTMT와는 분명히 구별되는 기능을 가진다는 것을 나타낸다(도 7). 이용가능한 퍼블릭 마이크로어레이(public microarray) 또는 Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) 데이터 또한 일관성있게도 이러한 환경 스트레스에 대한 반응에서 이 유전자들의 어떤 유의적인 변화를 나타내지는 않았다(데이터 미제시).

실시예 4: OsTMT 프로모터- GUS 형질전환 벼의 조직화학적 분석

OsTMT1과 OsTMT2의 발현은 OsTMT1 프로모터-GUS(pOsTMT1 - GUS)와 OsTMT2 프로모터-GUS (pOsTMT2 - GUS) 융합 구축물을 각각 발현하는 형질전환 벼의 조직화학적 GUS 분석에 의해 조사되었다. OsTMT1과 OsTMT2의 약 2.5 kb 5' 업스트림 단편은 GUS 프로모터 유전자에 전사적으로 융합되었다. pOsTMT1 - GUS 또는 pOsTMT2 - GUS를 발현하는 형질전환 벼 식물 중에서 GUS 발현에 유의적인 변화는 발견되지 않았다(데이터 미제시). 가장 높은 GUS 강도를 가지는 각 대표 라인이 다음 분석에 주로 사용되었다. 조직화학적 분석에 의해, 본 발명은 GUS 활성이 잎, 뿌리, 꽃 그리고 미성숙 종자들을 포함하는 실험에 사용된 모든 벼의 기관에서 검출가능하다는 것을 보여주었다(도 8과 9).

pOsTMT1 - GUS 와 pOsTMT2 - GUS 형질전환 벼 라인의 미성숙 잎들에서, GUS 활성은 엽육세포, 유관속초 세포 그리고 관다발(vascular bundles)(관유 세포와 체관부 반세포(phloem companion cell) 그러나 성숙 후생목부 세포(mature metaxylem cells)는 아님)을 포함하는 대부분의 세포에서 검출된다(도 8). 가장 높은 OsTMT1 발현은 유관속초 세포에서 관찰되었다. 표피세포에서, GUS 발현은 pOsTMT1 - GUS 라인에서 매우 가장자리에 있었다(도 8a). 그러나 pOsTMT2 - GUS 라인에서는 리포터(reporter) 발현의 수준이 엽육세포와 표피세포를 포함한 다른 영역과 비교했을 때, 관유 세포와 체관부 반세포에서 더 높았다(도 8b).

pOsTMT1 - GUS 와 pOsTMT2 - GUS 라인의 뿌리에서, 강한 GUS 활성들이 관다발 조직의 반세포에서 관찰되었고(도 8c와 8d), 반면에 꽃에서는 리포터의 발현이 안껍질(palea)과 바깥껍질(lemma)에서만 약하게 검출되었고, 엽맥(vein)에서는 비교적 높은 발현을 보였다. GUS 활성은 수술(stamens)을 포함한 pOsTMT1 - GUS 와 pOsTMT2-GUS 라인의 다른 내부 기관들에서는 관찰되지 않았다(도 8e 내지 8h).

pOsTMT1 - GUS 와 pOsTMT2 - GUS 두 개의 형질전환 벼 라인 중 발달하고 있는 미성숙 종자들에서, GUS의 발현은 7-8 DAF 종자 껍질의 관조직에서 풍부하게 발견되었다(도 9a와 9b). OsTMT1과 OsTMT2의 발현을 더 조사하기 위해서, pOsTMT1 - GUS 와 pOsTMT2-GUS 형질전환 벼 라인의 미성숙 종자들은 종단면 또는 횡단면으로 절단되었다. 5 DAF 미성숙 종자에서, OsTMT1과 OsTMT2는 등쪽(dorsal side)의 주관세포(main vascular cell)(도 9c와 9d)와 모계부분(maternal portion)의 nucellar projection, 크로스 세포층(cross cell layers) 그리고 튜브 세포층(tube cell layers)에서 높게 발현되었지만, 자계부(filial part)의 호분(aleurone) 또는 부호분(subaleurone) 세포에서는 발현되지 않았다(도 9e와 9f). 두 형질전환 라인에서 GUS 활성은 12-15 DAF 미성숙 종자의 등쪽(검은색 화살표)의 관조직에서 가장 높았다(도 9g와 9h). 주목할만한 점은, 이 미성숙 종자들의 배아에서 GUS 발현이 오직 pOsTMT2 - GUS 라인에서만 관찰되었다는 것이다(도 9h).

OsTMT2의 내인성 발현은 미성숙 벼 종자들의 인 시투 혼성화 연구에 의해 더 조사되었다. 이 실험들은 OsTMT2가 3 DAF 미성숙 종자들의 등쪽의 주 관다발 및 nucellar projection과 외피를 둘러싸는 옆쪽(lateral side)의 관유 조직에서 주로 발현된다는 것을 보여주었다(도 9i와 9j). 또한 5 DAF 미성숙 종자에서, OsTMT2 발현은 모계부(maternal part)의 옆쪽의 크로스 세포층과 튜브 세포층에서 관찰되었다(도 9k와 9l). 이는 먼저 실시한 RT-PCR의 결과들(도 6b) 및 GUS 발현의 조직화학 분석(도 9a 내지 9h)과 매우 일치하는 것이다.

실시예 5: OsTMT1 을 발현하는 형질전환 애기장대 돌연변이체 tmt1 -2- 3 으로부터 분리된 액포를 사용하여 모노사카라이드 수송의 분석

효모 헥소스 트랜스포터(hexose transporter)-결핍 돌연변이체의 기능적 상보성(complementation)을 통해 TMT 패밀리에 속하는 당 트랜스포터의 활성을 보여주기 위한 실패한 몇몇 시도들이 이전에 있었다(Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490). 유사하게, OsTMT1과 OsTMT2는 내인성 글루코스 트랜스포터가 결핍된 효모 돌연변이체 RE700A에서 글루코스 수송 활성을 보완하지 않는다는 것을 본 발명은 보여주었다. 저온 처리된 애기장대 tmt1 -2-3 트리플 넉아웃 돌연변이체로부터 분리된 액포로 글루코스의 흡수는 야생형 대조군보다 현저하게 더 낮다는 것이 이전의 보고에서 나타났다(Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490). 따라서, 본 발명은 CaMV35S 프로모터-OsTMT1을 발현하는 형질전환 애기장대 tmt1 -2-3 라인들을 사용하여 OsTMT1에 대한 보충(complementation) 실험을 설계하였고, RT-PCR 분석에서 중등도(OsTMT1 - OX1) 또는 강한(OsTMT1 - OX2) 트랜스진(transgene) 발현을 가지는 두 개의 독립적 동형접합체(homozygous) 형질전환 라인들을 선별하였다(도 10a).

tmt1 -2-3 돌연변이체 백그라운드에서 OsTMT1 발현이 tmt1 -2-3 돌연변이체 액포 내로 감소된 글루코스 수송 활성을 회복할 수 있는지를 결정하기 위해서, 본 발명은 야생형, tmt1 -2-3 그리고 OsTMT1 형질전환 식물들로부터 엽육 액포를 분리하였다. 글루코스 흡수율은 tmt1 -2-3에서 매우 낮았고(0.5 pmolμL^-1 액포 min^-1, R²=0.364), 애기장대 야생형 식물에서 상당히 높았다(2.4 pmol μL^-1 액포 min^-1, R²=0.75)(도 10b). 이는 tmt1 -2-3 돌연변이 라인이 액포 내로 글루코스를 수송하는 능력이 현저하게 감소하였다는 것을 보여주는 이전의 데이터와 일치한다(Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490). 중요하게도, OsTMT1 - OX1 과 OsTMT1 - OX2 식물들의 액포는 야생형 애기장대에서 관찰된 것(OsTMT1 - OX1 과 OsTMT1-OX2에 대해, 각각 3.0 pmol μL^-1 액포 min^-1, R²=0.766 과 4.0 pmol μL^-1 액포 min^-1, R²=0.979) 보다 훨씬 더 높은 수송 활성을 나타내었다. 또한 가장 높은 OsTMT1의 발현을 보이는 OsTMT1 - OX2 라인의 액포 내로 글루코스의 흡수는 중등도의 OsTMT1의 발현을 보이는 OsTMT1 - OX1 식물보다 현저하게 더 높다는 것은 주목할 만하다(도 10b). 이 결과는 AtTMTs와 유사한 방법으로, 벼에서 OsTMTs가 모노사카라이드 당을 액포 내로 수송한다는 것을 강하게 제안한다.

액포 글루코스 수송은 애기장대에서 저온 인큐베이션 동안 강하게 과발현된다는 것이 이전에 보고되었다(Wormit et al, 2006, Plant Cell 18, 3476-3490). OsTMT1을 발현하는 형질전환 tmt1 -2-3 돌연변이 라인에서 당 함량이 저온 스트레스 조건하에 야생형 수준으로 복구되는지를 조사하기 위해, 야생형, tmt1 -2-3, 그리고 OsTMT1 형질전환 애기장대 식물들이 저온 챔버(9℃)로 옮겨졌고, 24시간 동안 빛을 계속 주면서 인큐베이션 되었다. 저온처리한 야생형 식물에서, 글루코스, 프룩토스 그리고 수크로스는 고농도로 축적된 것이 발견되었다(각각 7.18, 4.41 그리고 9.50 μmol g fresh weight (fw)^-1, 도 10c). 그러나, tmt1 -2-3 돌연변이 애기장대 식물은 야생형과 비교했을때 현저하게 더 낮은 헥소스 수준을 함유한다. 대조적으로, OsTMT1을 발현하는 형질전환 tmt1 -2-3 라인은 tmt1 -2-3 돌연변이 식물과 비교했을 때 저온 처리 24시간에 걸쳐 증가된 헥소스 수준을 보여주었다. 또한 OsTMT1 - OX2 라인은 야생형과 유사한 수준에서 글루코스와 프룩토스를 함유하였다. 저온 스트레스하에서 OsTMT1을 발현하는 형질전환 tmt1 -2-3 돌연변이 식물에서 헥소스 수준의 유의적인 증가는 tmt1 -2-3 돌연변이체에서 OsTMT1이 AtTMT 유전자의 역할을 복구할 수 있다는 증거를 더 지지한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> OsTMT1 gene involved in vacuolar sugar transport from rice <130> PN10009 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2755 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 aaatctcccc taaaagcttc ccaatttggc gagaattccc catatatttg ccccatctcg 60 gcgtcccaac gagcccttcc agattcccag ccgcctctct tcttgttagg ggatccgaaa 120 tctcggtgga cgagagactt ggtggtaaga ttcgccggcc atggcgggcg ccgtgctggt 180 cgccatcgcg gcctccatcg gcaacttgct gcagggctgg gataatgcaa ccattgcagg 240 tgcggtactg tacatcaaga aggaattcaa cttgcagagc gagcccctta tcgaaggcct 300 gatcgtggcc atgtcgctca ttggggcgac gatcatcacg acgttctctg gagcagtggc 360 tgattctttt ggtaggcggc ccatgctgat cgcgtcggct gtcctctact ttgttagtgg 420 gctagtgatg ctttgggcgc caaatgtgta tgtgttgctc ttggcgaggc tcattgacgg 480 gttcgggatc ggtttggctg tcacgcttgt accattgtac atctctgaga ctgccccgac 540 ggacatcaga ggactgctaa acacgctgcc gcagttcagt gggtctggag ggatgttcct 600 ttcatactgc atggtatttg gcatgtccct catgccacag ccagattgga ggatcatgct 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Gly Val Lys His Ala Leu Phe Val Gly Ile Gly Ile 515 520 525 Gln Ile Leu Gln Gln Phe Ala Gly Ile Asn Gly Val Leu Tyr Tyr Thr 530 535 540 Pro Gln Ile Leu Glu Gln Ala Gly Val Gly Val Leu Leu Ala Asn Ile 545 550 555 560 Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ile Leu Ile Ser Gly Leu Thr Thr 565 570 575 Leu Leu Met Leu Pro Ser Ile Gly Ile Ala Met Arg Leu Met Asp Met 580 585 590 Ser Gly Arg Arg Phe Leu Leu Leu Ala Thr Ile Pro Ile Leu Ile Val 595 600 605 Ala Leu Ala Ile Leu Ile Leu Val Asn Ile Leu Asp Val Gly Thr Met 610 615 620 Val His Ala Ser Leu Ser Thr Val Ser Val Ile Leu Tyr Phe Cys Phe 625 630 635 640 Phe Val Met Gly Phe Gly Pro Ile Pro Asn Ile Leu Cys Ala Glu Ile 645 650 655 Phe Pro Thr Thr Val Arg Gly Ile Cys Ile Ala Ile Cys Ala Leu Thr 660 665 670 Phe Trp Ile Gly Asp Ile Ile Val Thr Tyr Thr Leu Pro Val Met Leu 675 680 685 Asn Ala Ile Gly Leu Ala Gly Val Phe Gly Ile Tyr Ala Val Val Cys 690 695 700 Ile Leu Ala Phe Leu Phe Val Phe Met Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly 705 710 715 720 Met Pro Leu Glu Val Ile Thr Glu Phe Phe Ser Val Gly Ala Lys Gln 725 730 735 Ala Lys Glu Asp 740 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 forward primer <400> 3 aaatctcccc taaaagcttc c 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 reverse primer <400> 4 gaactagtac tcggctatgc taa 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 forward primer <400> 5 aagaggtgga agaagaggga t 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 reverse primer <400> 6 tattatgaac cccaacatag tagc 24 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 forward primer <400> 7 gctctagact tggtggtaag attcgccg 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 reverse primer <400> 8 ccctcgagag tcctccttgg cctgctttgc 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 forward primer <400> 9 gctctagagg ggtgaagatg tcgggtgct 29 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 reverse primer <400> 10 ccctcgagag gcctttgtag cctgcatttg 30 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 forward primer <400> 11 ccctcgagaa acctaaactt gaaatgtgct a 31 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 reverse primer <400> 12 cgcctaggcg aatcttacca ctgcacaaga a 31 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 forward primer <400> 13 gcgtcgacat cgtgattctt tctttcaaac 30 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 reverse primer <400> 14 gctctagact tcacccctct ccgatccc 28 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 forward primer <400> 15 gaagtcatca ccgagttctt c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT1 reverse primer <400> 16 tacagggaga agaattccaa a 21 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 forward primer <400> 17 gtctttggta tatacgcagt tgtt 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsTMT2 reverse primer <400> 18 agtggacatg aataacatga aaat 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsGBSSII forward primer <400> 19 taggtgtcac tgaatggcta gaac 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsGBSSII reverse primer <400> 20 tggcccacat ctctaagtaa catc 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Act1 forward primer <400> 21 ggaactggta tggtcaaggc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Act1 reverse primer <400> 22 agtctcatgg atacccgcag 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUBQ5 forward primer <400> 23 gactacaaca tccagaagga gtc 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUBQ5 reverse primer <400> 24 tcatctaata accagttcga tttc 24 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBQ forward primer <400> 25 gtggtgctaa gaagaggaag a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBQ reverse primer <400> 26 tcaagcttca acttcttctt t 21

Claims (10)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 당의 액포 내 수송에 관여하는 벼 유래의 OsTMT1(Oryza sativa tonoplast monosaccharide transporter 1) 단백질.
2. 제1항의 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
6. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 벼 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물체.
7. 제5항의 형질전환된 식물체의 종자.
8. 제4항의 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 OsTMT1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 액포 내로 당 수송을 증가시키는 방법.
9. 제8항의 방법에 의해 제조된 액포 내에 당이 증가된 식물체.
10. 제2항의 유전자를 포함하는, 식물체의 액포 내로 당 수송을 증가시키기 위한 조성물.

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