KR102493485B1 - CaATP1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래 신규 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 단백질 탈인산화 효소를 암호화하는 CaATP1 유전자의 기능을 규명하였다. CaATP1 단백질은 ABA 신호전달의 음성 조절자로 기능하며, 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서는 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소하고 반대로 상기 CaATP1 유전자가 침묵된 식물체에서는 건조 스트레스에 대한 저항성이 증진되는 효과를 확인하였는바, CaATP1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CaATP1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 {CaATP1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaATP1 in plants}

본 발명은 고추 유래 신규 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

지구온난화로 인한 기후 변화는 식물의 성장과 발달에 영향을 미치는 다양한 환경 스트레스를 심화시켜왔다. 이 중 가뭄, 추위, 고염도에 의한 수분 부족은 작물의 수확량 감소로 이어지는 중요한 환경적 스트레스이다. 식물은 물 부족에 적응하기 위해 그들의 성장과 발달을 제한하고, 호르몬 수준의 변화를 통해 방어 반응을 위한 에너지 균형을 유지해 왔다. 식물은 수분 손실을 줄이기 위해 스트레스와 관련된 유전자의 유도, 앱시스산(abscisic acid; 이하 'ABA')의 생합성 및 축적을 포함한 방어 메커니즘을 발전시켜왔다. 이러한 방어 메커니즘은 분자학, 생화학 및 유전학 연구에서 광범위하게 탐구되어 왔으나, 건조 스트레스 대응과 관련된 정확한 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀진바 없다.

ABA는 건조 스트레스에 대응한 방어 메커니즘과 관련하여 제정된 주요 식물 호르몬이다. 건조 스트레스에 의해 신호가 자극되면, ABA는 스트레스 관련 유전자의 발현 유도, 기공의 개방/폐쇄 조절 및 여러 대사 산물의 축적을 포함한 세포 방어 메커니즘을 유도한다. ABA 신호전달 경로는 ABA 수용체(PYR/PYLs/RCARs)에 의한 신호 수용에 의해 시작되며, 이는 PP2Cs(type 2C protein phosphatases)와 상호 작용하여 이를 억제하고, SnRK2 타입 인산화효소(kinase)의 활성화를 유도한다. 건조 스트레스에 의한 식물 방어 메커니즘에서 ABA 의존성 단백질 인산화 및 탈인산화는 매우 중요하다고 알려져 있으며, SnRK2.2/2.3/2.6을 포함한 SnRK2 타입 인산화효소는 ABA 신호전달 경로에서 양성 조절자 역할을 하는 다운스트림 전사인자 및 이온 채널을 인산화시킨다. 이와는 대조적으로, 그룹 A PP2C는 SnRK2 타입 인산화효소의 비활성화를 통해 ABA 신호전달을 억제함으로써 ABA의 음성 조절자로서 기능한다.

한편, 유비퀴틴화(ubiquitination)에 의한 단백질 안정성의 조절은 건조 스트레스에 대한 방어 반응과 관련된 중요한 과정으로, 특히 호르몬 신호전달에서 다양한 세포 과정을 조절하는 번역 후 변형(post-translational modification)이다. 이러한 과정은 E1(유비퀴틴 활성화 효소)에 의해 활성화되고, E2(유비퀴틴 결합 효소)로 전달되는 유비퀴틴에서 시작하여, E3 유비퀴틴 리가아제가 26S 프로테아좀 매개 단백질 분해를 유도하는 유비퀴틴을 표적 단백질에 부착하는, 세 가지 효소의 순차적 작용에 의해 촉매된다. 특히, 유비퀴틴 E3 리가아제는 표적 단백질을 인식하고 모집하는 역할을 한다고 알려져 있으며, 단일 또는 다중 서브유닛으로 분류될 수 있는 수백 또는 수천 개의 멤버로 구성된다. RING(really interesting new gene) 타입 E3 리아가제는 단일 서브유닛을 갖는, 비생물적 스트레스의 조절에 관여하는 단백질이다. ABA 신호전달과 관련된 몇 가지 주요 구성 요소는 유비퀴틴-26S 프로테아좀 시스템(ubiquitin-26s proteasome system; UPS)에 의해 양성 및 음성으로 조절된다. 예를 들어, KEG(KEEP ON GOING)는 ABA 책임 전사인자 ABI5(ABA-Insensitive5)를 분해시킨다. SDIR1(Salt- and Drought-Induced Really Interesting New Gene Finger 1)은 ABA 신호전달 중에 ABI5, ABF3 및 ABF4를 조절하는 SDIRIP1(SDIR1-Interacting Protein 1)과 직접 상호 작용하고, 이를 분해시킨다. AIP2(ABA-Insensitive 3 [ABI3] Interaction Protein 2)는 ABI3 조절 안정성에 의한 ABA 관련 종자 발아의 음성 조절제이다. 또한, 여러 연구에서 PP2C의 안정성이 UPS에 의해 조절된다는 보고가 있다. 첫째로, U-box E3 리가아제 PUB12 및 PUB13은 PYR1 및 ABA의 존재하에서 직접 상호 작용하고 ABI1로 분해된다. RING 타입 E3 리가아제 RGLG1, RGLG5 및 PIR1은 ABA의 존재하에서 PP2CA의 안정성을 조절한다. BPM3 및 BPM5는 CRL3 E3 리가아제의 기질로서, PP2CA와 직접 상호 작용하고, ABA의 존재하에서 PP2CA 안정성을 조절한다. 그러나 ABA 신호전달 경로와 안정성에 영향을 미치는 요인은 불분명한데, 이러한 요인은 건조 스트레스에 반응하여 미상의 E3 리가아제에 의해 조절되기 때문이다.

본 발명자들은 이전의 연구를 통해 고추의 RING-타입 유비퀴틴 E3 리가아제인 CaAIRF1이 고추 그룹 A PPC2, CaADIP1 및 CaAIPP1과 상호 작용하고 이들을 유비퀴틴화한다는 사실을 보고한바 있다. 상기 연구에서는 유전적, 생화학적 분석을 통해 CaAIRF1이 건조 스트레스에 대한 반응에서 ABA 신호전달에 양성 조절자 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 위 CaAIRF1 외에 고추 cDNA에서 ABA에 의해 유도되는 C3HC4 타입 RING 핑거 단백질인 CaAIRE1(Capsicum annuum ABA Induced RING-type E3 ligase 1)이 어떤 단백질들과 상호 작용하는지에 대해서는 전혀 밝혀진 바가 없었다.

Baek, W., Lim, C. W., and Lee, S. C. (2017). Functional analysis of the pepper protein phosphatase, CaAIPP1, and its interacting partner CaAIRF1: modulation of ABA signaling and the drought stress response. Plant Cell Environ. 40, 2359-2368.

본 발명자들은 E3 리가아제와 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응간의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추 유래 탈인산화 효소(phosphatase) 유전자, CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1)을 동정하였으며, ABA 신호전달 경로에서 양성 조절자 역할을 하는 E3 리가이제 CaAIRE1(Capsicum annuum ABA Induced RING-type E3 ligase 1)이 상기 CaATP1의 안정성을 조절함으로써 ABA 신호전달 및 건조 스트레스에 대한 반응을 조절함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 음성 조절자(negative regulator)인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaATP1 단백질을 암호화하는 CaATP1 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CaATP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaATP1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaATP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CaATP1 단백질을 암호화하는 CaATP1 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 CaATP1 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CaATP1 유전자는 고추로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 CaATP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CaATP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 건조 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 단백질 탈인산화 효소를 암호화하는 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 유전자를 동정하였다. CaATP1 단백질은 ABA 신호전달의 음성 조절자로 기능하며, 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서는 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소하고 반대로 상기 CaATP1 유전자가 침묵된 식물체에서는 건조 스트레스에 대한 저항성이 증진되는 효과를 확인하였는바, CaATP1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 100 μM 앱시스산(ABA) 처리 및 가뭄 스트레스에 의한 고추 식물 잎에서의 CaAIRE1 유전자의 발현 패턴을 분석한 도이다.
도 1b는 담배(Nicotiana benthamiana) 표피 세포에서 CaAIRE1의 세포내 위치를 확인한 도이다.
도 1c는 GST 태그된 CaAIRE1 단백질을 사용한 시험관내 자가 유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 1d는 식물 세포에서 CaAIRE1의 생체내 유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 CaAIRE1 침묵 고추 식물(TRV2:CaAIRE1)의 잎에서 CaAIRE1 발현 수준을 qRT-PCR로 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 CaAIRE1 침묵 고추 식물의 잎에서 시간의 흐름에 따른 증산 수분 손실을 나타낸 도이다.
도 2c는 CaAIRE1 침묵 고추 식물의 잎에서 ABA 처리에 따른 기공 크기 변화를 확인한 도이다.
도 2d는 CaAIRE1 침묵 고추 식물의 잎 온도를 비교 확인한 도이다.
도 2e는 CaAIRE1 침묵 고추 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성 표현형을 비교 확인한 도이다.
도 3a는 CaAIRE1-OX(과발현) 애기장대에서 ABA 처리에 따른 발아율을 확인한 도이다.
도 3b는 CaAIRE1-OX 애기장대에서 ABA 처리에 따른 뿌리 길이를 확인한 도이다.
도 3c는 야생형 및 CaAIRE1-OX 애기장대의 잎에서 CaAIRE1 및 ABA 반응성 유전자 발현의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 CaAIRE1-OX 애기장대 잎의 생중량(fresh weight) 비율 변화를 나타낸 도이다.
도 4b는 CaAIRE1-OX 애기장대 잎에서 ABA 처리에 따른 기공 크기 변화를 확인한 도이다.
도 4c는 CaAIRE1-OX 애기장대 식물의 잎 온도를 확인한 도이다.
도 4d는 CaAIRE1-OX 애기장대 식물에서 가뭄 스트레스에 의한 표현형을 확인한 도이다.
도 5a는 CaAIRE1과 PP2C(type 2C protein phosphatase) 간의 상호 작용에 대한 효모 이중잡종화 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 CaATP1을 사용한 CaAIRE1의 시험관내 풀다운 분석(pull-down assay) 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 CaAIRE1과 CaATP1 간의 상호 작용에 대한 BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5d는 CaATP1에 대한 무세포 분해 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5e는 CaAIRE1에 의한 CaATP1의 생체내 유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 CaATP1 단백질의 추정 아미노산 서열로부터 탈인산화효소 도메인을 나타낸 도이다.
도 6b는 CaATP1 단백질의 계통수(Phylogenetic tree) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6c는 담배 식물의 잎에서 CaATP1의 세포내 위치를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6d는 다양한 발달 단계 및 조직에서 CaATP1의 발현 수준을 조사한 도이다(YL, young leaf; RT, root; ST, stem; CT, cotyledon; FEL, fully expanded leaf; PT, petiole; TR, tap root; LR, lateral root; FL, flower; FRT, fruit).
도 6e는 각각 탈수, 만니톨 및 ABA 처리에 따른 CaATP1 전사체의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 7a는 대조군(TRV2:00) 및 CaATP1 침묵 고추(TRV2:CaATP1) 식물에서 CaATP1 전사체 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 TRV2:00 및 TRV2:CaATP1 고추 식물의 분리된 잎에서 증산 수분 손실을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7c는 ABA 처리 후 3시간 동안 열 이미징 카메라에 의한 CaATP1 침묵 고추 식물의 잎 표면 온도를 나타낸 도이다.
도 7d는 TRV2:00 및 TRV2:CaATP1 고추 식물에서 ABA에 의한 기공 폐쇄를 확인한 도이다.
도 7e는 CaATP1 침묵 고추 식물의 향상된 가뭄 내성을 평가한 도이다.
도 8a는 ABA에 노출된 야생형(WT) 및 형질전환 식물(CaATP1-OX, CaADIP1-OX 및 CaAIPP1-OX)의 종자 발아율을 나타낸 도이다.
도 8b는 다양한 농도의 ABA에 노출된 야생형 및 형질전환 식물의 자엽 녹화 비율(rate of cotyledon greening)을 나타낸 도이다.
도 8c는 다양한 농도의 ABA에 노출된 야생형 및 형질전환 식물의 잎 표면 온도를 나타낸 도이다.
도 8d는 다양한 농도의 ABA에 노출된 야생형 및 형질전환 식물의 뿌리 생장 정도를 나타낸 도이다.
도 9a는 ABA 처리에 따른 야생형(WT) 및 CaATP1-OX 식물의 기공개도를 비교하여 나타낸 도이다.
도 9b는 정상적으로 급수된 야생형 및 CaATP1-OX 식물에서 분리된 잎의 생중량을 나타낸 도이다.
도 9c는 야생형 및 CaATP1-OX 식물의 건조 스트레스에 대한 저항성 표현형을 확인한 도이다.

식물은 극한의 환경 조건에서도 생존을 위한 방어 메커니즘을 발전시켜 왔으며, 특히 앱시스산(abscisic acid; ABA)는 환경 스트레스에 대한 적응과 관련된 주요 식물 호르몬으로 알려져 있다. 본 발명자들은 고추 유래 타입 2C 단백질 탈인산화 효소 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1)을 분리하였고, 상기 유전자를 침묵시킨 형질전환 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 저항성 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절자인, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 단백질 및 이를 암호화하는 CaATP1 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자인 CaATP1은 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaATP1 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 유전자인 CaATP1은 고추로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "음성 조절자(negative regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaATP1은 건조 스트레스에 대한 조절에서 억제하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해, CaATP1 유전자가 과발현되는 경우 ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소될 수 있고, 반대로 CaATP1 유전자의 발현이 억제되거나 CaATP1 단백질의 활성이 억제되는 경우 건조 스트레스에 대한 저항성이 증진될 수 있다.

본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, 단백질 탈인산화 효소인 CaATP1을 동정하였고, 앱시스산(ABA)의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스산 또는 건조 스트레스와 CaATP1 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.

우선, 본 발명의 일 실시예에서는, CaAIRE1 넉다운 고추 식물은 건조 스트레스에 대한 내성이 감소하며, 반대로 CaAIRE1 과발현 식물은 ABA 민감도 및 건조 스트레스에 대한 내성이 향상됨을 확인하였고, 상기 CaAIRE1은 CaATP1과 직접 상호 작용하며, 유비퀴틴화를 통해 CaATP1의 안정성을 조절함을 밝혀냈다(실시예 3 내지 실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, ABA를 처리한 조건에서 CaATP1의 발현이 저해된 고추 및 정상 대조군 고추 식물의 잎에서 잎 온도, 기공개도, 수분손실량, 생존율, 스트레스 반응 유전자의 발현 등을 측정함으로써 CaATP1 유전자 침묵에 의한 ABA 민감도 향상 효과를 확인하였고, 실제로 CaATP1 발현이 저해된 식물에서 대조군에 비해 건조 스트레스 저항성이 강화되는 것을 확인하였다(실시예 8 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaATP1을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물체를 제작하여 ABA를 처리한 조건에서 야생형 식물체와 CaATP1 과발현 식물체의 발아율, 녹색 자화, 뿌리 생장율 측정을 통해 CaATP1이 식물체의 건조 스트레스 저항성을 감소시키는 음성 조절자로 작용함을 확인하였으며(실시예 9 참조), 실제로 애기장대 식물에서 CaATP1 유전자 과발현시 건조 저항성이 감소됨을 잎 온도, 기공개도, 수분손실량 측정을 통해 확인하였다(실시예 10 참조).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CaATP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 CaATP1 단백질을 코딩하는 유전자의 ORF(open reading frame)를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 제공한다.

바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 기술인 VIGS(virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵(virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사 후 유전자 침묵현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염 식물체에 바이러스 유전체와 상동성이 있는 내성유전자가 발현될 때 내성유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어 기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사 후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.

본 발명에서는, CaATP1의 ORF 영역을 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaATP1 유전자의 발현을 성공적으로 억제한 바 있다.

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래 될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

용어 "재조합 벡터" 또는 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

상기 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaATP1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 억제제는 CaATP1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaATP1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 항체, 또는 앱타머(aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에서, 상기 CaATP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaATP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다. 상기 CaATP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계는 전술한 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 안티센스 뉴클레오티드, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 항체, 또는 앱타머 등을 이용하여 제한 없이 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

본 발명에서는 고추(Capsicum annuum L., cv. Nockwang), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 담배(Nicotiana benthamiana)가 사용되었다. 애기장대 종자 표면을 멸균한 후 24℃에서 MS 배지 플레이트를 사용하여 발아시켰다. 고추와 담배는 각각 27℃ 및 25℃에서 증기 소독된 배합토[피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)]에 뿌려졌다. 상기 애기장대, 고추 및 담배의 성장을 위해 배양실을 장일 조건으로 유지하였다(16시간 광 / 8시간 암주기).

1-2. 바이러스-유도 유전자 침묵(Virus-induced gene silencing; VIGS)

CaAIRE1- 또는 CaATP1- 침묵 고추 식물은 기존에 알려진 방법에 의해 담배얼룩바이러스(Tobacco rattle virus; TRV) 기반 바이러스 유도 유전자 침묵 시스템을 사용하여 생성하였다. 304 bp 길이의 CaAIRE1 cDNA의 단편을 pTRV2 벡터에 삽입하고 동결-해동 방법(freeze-thaw method)을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 도입하였다. pTRV2:CaAIRE1을 운반하는 형질전환된 아그로박테리아를 TRV1과 함께 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD600=0.2). CaATP1의 경우는 cDNA의 261 bp 단편이 pTRV2 벡터 구축물에 사용되었다. 음성 대조군으로는 TRV2:00 벡터가 사용되었다. 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.

1-3. 형질전환 애기장대 식물의 생성

아그로박테리아(A. tumefaciens) 매개 애기장대(Arabidopsis)의 형질전환은 플로랄 딥(floral dip) 방법을 사용하여 수행되었다. CaAIRE1 과발현 계통의 생성을 위해 코딩 서열(CA5g17640, 고추 유전체 데이터베이스 버전 1.55)을 게이트웨이 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하여 35S-프로모터에 의해 제어되는 GFP 융합 벡터(p326GFP)에 클로닝(cloning) 하였다. 35S:CaATP1 작제물 또한 게이트웨이 시스템을 사용하여 생성하였다. 코딩 서열(CA6g24830, 고추 유전체 데이터베이스 버전 1.55)은 p326GFP 벡터에 클로닝 하였다. 형질전환 돌연변이체는 처음에 25 μg mL^-1의 포스피노트리신(phosphinothricin)을 함유하는 MS 한천 배지에서 선택되었다. 클로닝 및 형질전환 확인에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.

유전자	용도	서열번호	방향	서열 (5' - 3')
CaAIRE1	Cloning	3	F	ATGAACAATCGAGGAAGGTACCCT
		4	R	TTGGCAATAAATTGCCTGATCGATA
	RT-PCR	5	F	CTCGGTCTGCTTGGAAAAAG
		6	R	CAAACTGGGCAAACCTTCAT
	VIGS	7	F	TCTAGAAGCTGCATTCGCTCTTGCTGC
		8	R	CTCGAGTGTCCACAACCAAAAGCCATG
CaATP1	Cloning	9	F	ATGGCAGAGGTTTGTTTTGGAGTTG
		10	R	CTAGCTCTCCGTTTTGTTCTTCAGAT
	RT-PCR	11	F	ATGGCAGAGGTTTGTTTTGGAGTTG
		12	R	AATTGGTGCCAAAATAATATTAGGCG
	VIGS	13	F	TCTAGAGATGAAGTGTAGAGAGAGATTAC
		14	R	CTCGAGACAATAATCTTGTCAGGTG
AtActin8	RT-PCR	15	F	CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA
		16	R	GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT
CaActin1	RT-PCR	17	F	GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT
		18	R	CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT
RD29B	RT-PCR	19	F	GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG
		20	R	ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA
RAB18	RT-PCR	21	F	GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT
		22	R	GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA
ABI5	RT-PCR	23	F	CAGTGGAGAAAGTAGTGGAGAGAAG
		24	R	CCCTTGACTTCAAACTCTCAAAATA

1-4. 세포 내 위치(Subcellular localization) 및 이분자 형광 상보성 분석(bimolecular fluorescence complementation assay)

CaAIRE1 및 CaATP1의 세포 내 위치를 조사하기 위해, 정지 코돈이 없는 CaAIRE1 및 CaATP1의 전장 cDNA를 p326GFP 벡터에 서브클로닝 하여 GFP 재조합 단백질을 생성하였다. BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation) 분석을 위해 CaAIRE1 및 CaATP1 cDNA를 각각 VYNE 및 CYCE 벡터에 클로닝 하였다. 일과성 발현을 위해, 이들 작제물(construct)을 함유한 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 균주 GV3101을 p19 균주와 혼합하여 유전자 침묵을 방지하고, 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 담배 식물(N. benthamiana) 잎의 배축면에 공침시켰다. 현미경 분석의 경우, 공침 후 3일이 경과한 뒤에 하부 표피 세포를 LSM 이미지 브라우저 소프트웨어로 구동되는 공초점 현미경(모델 Zeiss 710 UV/Vis Meta, Germany)을 이용하여 분석하였다.

1-5. RNA 분리 및 qRT-PCT(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)

스트레스 조건에서 CaAIRE1 및 ABA 반응 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, Rneasy Mini 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 ABA (100 μM) 또는 탈수 처리한 고추 및 애기장대 잎 조직으로부터 분리한 총 RNA를 사용하였다. 모든 RNA 샘플은 제조사의 프로토콜에 따라 Transcript First Strand cDNA 합성 키트(Roche, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 CFX96 Touch^TM Real-time PCR 검출 시스템(Bio-rad)에서 적절한 프라이머(상기 표 1 참조)와 함께 iQ^TM SYBR Green Supermix를 사용하여 수행하였다. 내부 대조군으로는 CaACT1(hot pepper actin1 gene)과 AtACT8(Arabidopsis actin8 gene)을 사용하였다. 각 반응은 세 번의 독립적인 실험으로 수행되었다.

1-6. 재조합 단백질 발현 및 정제

GST(glutathione) 및 MBP(maltose binding protein) 융합 단백질을 발현시키기 위해 CaAIRE1 및 CaATP1의 전장 코딩 서열을 증폭하여 pGEX 4T-3(GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden) 및 pMAL-c2X(New England Biolabs) 벡터에 각각 삽입하였다. 이들 작제물은 대장균 균주 BL21(DE3)에 형질전환 되었다. 재조합 단백질은 BL21 세포에서 0.1 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)에 의해 유도되었다. 재조합 단백질은 제조사의 지침에 따라 GST 및 MBP 융합 단백질에 대해 각각 글루타티온 세파로스 4 패스트 플로우(glutathione sepharose 4 fast flow; GE-healthcare Bio-Sciences) 및 아밀로스(New England Biolabs)를 사용하여 정제되었다.

1-7. 풀다운 분석(pull-down assay)

MBP가 태그된 CaAIRE1 및 GST가 태그된 CaATP1 단백질은 대장균 균주 BL21(DE3)에서 발현되었다. 단백질 풀다운 분석을 위해, GST가 태그된 CaATP1 단백질은 프리-클리어된 MBP-태그 CaAIRE1 및 MBP와 함께 4에서 2시간 동안 배양되었다. 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA 및 0.5% Triton X-100)으로 5회 세척한 후, 샘플을 GST-용리 완충액(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 환원된 글루타티온) 및 4X Laemmli 단백질 버퍼와 혼합하였다. 이후 샘플을 끓인 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 적절한 항체가 존재함을 확인하였다.

1-8. 시험관내 유비퀴틴화 분석(In vitro ubiquitination assay)

500 ng의 정제된 GST-CaAIRE1은 250 ng의 재조합 인간 UBE1(Boston Biochemicals, USA), 250 ng의 재조합 인간 H5b(Enzo Life Sciences, USA) 및 10 μg의 소 유비퀴틴(bovine ubiquitin; Sigma-Aldrich)을 포함하는 유비퀴틴화 반응 완충액[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM dithiothreitol 및 2 mM ATP)과 혼합하였다. 30℃에서 3시간 동안 배양한 후 반응된 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 항-유비퀴틴(Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 항-MBP 항체(New England Biolabs, USA)를 사용한 면역블롯팅을 수행하여 분석하였다. 또한, 일과성 발현된 담배 잎에서 정제된 GFP 융합 CaAIRE1 단백질을 얻기 위해, 면역침강법을 사용하였다.

1-9. 무세포 분해 분석(Cell-free degradation assay)

세포 조추출물은 추출 완충액(10 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 10 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM DTT 및 0.1% Triton X-100)을 사용하여 CaAIRE1 침묵 고추 식물과 CaAIRE1 과발현(overexpression; OX) 형질전환 애기장대 식물의 잎으로부터 준비되었다. 조추출물 샘플(50 μg)은 50 μM MG132를 포함하거나 포함하지 않은 상태에서 표시된 시점까지 GST가 태그된 CaATP1(500 ng)과 함께 배양되었다. CaATP1 분해를 조사하기 위해, 항-GST 항체를 사용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. 모든 분석은 각 시험당 두 복제물을 사용하여 독립적으로 3회 반복하였다.

1-10. 공면역침전 분석(Co-immunoprecipitation assay)

CaAIRE1 및 CaATP1 사이의 생체내 상호 작용을 조사하기 위해, GFP::CaATP1 및 HA::CaAIRE1 또는 HA::CaAIRE1CH(시스테인 348 및 350을 히스티딘으로 변경) 융합 단백질을 담배 잎에 침투(Agro-infiltration)시켜 일시적으로 발현시켰다. 공침 3일 후, 잎에 50 μM MG132를 침투시킨 다음 12시간 후에 수확하였다. 총 단백질은 GTEN 추출 완충액[5 mM DTT, 10% 글리세롤, 0.5 M 수크로스, 150 mM Tris-MES (pH 7.5), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, complete protease inhibitor (Roche), 0.2 % Triton X-100 및 2% PVPP]를 사용하여 추출하였다. 추출된 단백질을 Pierce^TM 항-HA 아가로스(Thermo Scientific)와 함께 배양한 다음 도 5에 표시된 항체를 사용하여 면역블롯 분석을 수행하였다.

1-11. 효모 이중잡종화 분석(Yeast two-hybrid assay)

ABA 신호전달과 관련된 구성요소 간의 상호 작용을 조사하기 위해, 전장 CaAIRE1을 pGBKT7 벡터에 미끼(bait)로서 삽입하고, 단백질 탈인산화효소 유전자(CaADIP1, CaAIPP1 및 CaATP1)를 pGADGH 벡터에 먹이(prey)로서 클로닝하였다. 이들 벡터는 리튬 아세테이트 방법(lithium acetate method)을 사용하여 효모 균주 AH109 세포로 공동 형질전환 시켰다. 반응 후, 단백질-단백질 상호 작용을 선택하기 위해 표시된 아미노산이 결핍된 SD 최소 배지에서 형질전환체를 생장시켰다.

1-12. 열화상 분석(Thermal imaging analysis) 및 기공개도(stomatal aperture)의 생물학적 정량

열화상 분석을 위해, 첫 번째와 두 번째 잎이 모두 자라는 4주된 고추 식물과 3주 또는 4주된 애기장대 식물을 100 μM ABA로 처리하였다. 열화상 이미지는 적외선 카메라(FLIR systems; T420)를 사용하여 얻었으며, 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.2 소프트웨어로 측정하였다.

기공개도(stomatal aperture)의 측정을 위해, 고추 및 애기장대 잎에서 표피 껍질을 채취하고, 기공 개방 용액[SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH (pH 6.5), 10 μM CaCl₂]에 부유시켰다. 3시간 동안 배양한 후, 완충액을 각각 0, 10 또는 20 μM의 ABA(Sigma, USA)를 포함하는 새로운 SOS로 교체하였다. 추가로 2.5시간 배양 후, 각각 개별 샘플에서 100개의 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경으로 무작위로 관찰하고, Image J 1.46r (http://imagej.nih.gov/ij)를 사용하여 기공의 너비와 길이를 측정하였다. 각 실험은 세 번 수행하였다.

1-13. 탈수 스트레스(dehydration stress) 처리

CaAIRE1 또는 CaATP1의 가뭄 내성을 조사하기 위해, 증산 수분 손실(transpirational water loss)을 측정하였다. 6엽 단계의 고추와 3주령 애기장대 식물에서 잎을 분리하여 배양 접시에 넣고, 상대습도 40%의 생장챔버에서 유지시켰다. 생중량(fresh weight) 손실은 표시된 각각의 시점에서 측정되었다. 모든 실험은 최소 3회 반복되었다. 가뭄 내성 분석은 4엽 단계의 유전자 침묵 고추와 3주령 애기장대 식물을 사용하여 수행되었다.

1-14. 통계적 분석

통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test를 이용하여 수행되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차를 나타내며, P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다(*P < 0.05, ***P < 0.001).

실시예 2. CaAIRE1의 식별 및 분자적 특징 분석

이전 연구에서 본 발명자들은 그룹 A PP2C의 안정성을 조절함으로써 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하는 E3 리가아제를 식별하고 특성화한 바 있다(Baek et al., 2017, Lim et al., 2017). 비생물적 스트레스에 대한 ABA 반응을 조절하는 새로운 주요 E3 리가아제를 조사하기 위해, ABA를 처리한 고추 잎에서 RNA-seq 분석을 통해 ABA 유도 C3HC4 타입 RING 도메인 단백질 CaAIRE1(ABA-Induced RING-type E3 ligase 1)을 분리하였다.

CaAIRE1은 362개 아미노산 잔기를 암호화하는 1089-bp의 ORF(open reading frame)을 포함하며 분자량은 40.1 kDa이다. 본 발명자들은 qRT-PCR(quantitative reverse transcription-PCR) 분석을 사용하여 ABA 및 가뭄 스트레스에 대한 반응에 따른 CaAIRE1의 발현 패턴을 조사하였다.

먼저, 도 1a에 나타낸 바와 같이, CaAIRE1 전사체의 유도는 ABA 처리 후 2시간이 경과한 시점에서 처음 관찰되었으며, 6시간이 경과한 시점에서 가장 강하게 유도되는 것으로 나타났다. 가뭄 처리는 또한 CaAIRE1 발현을 약간 유도하였다. 이러한 결과는 CaAIRE1의 기능이 ABA 및 건조 스트레스와 관련이 있음을 시사하는 것이다.

또한, 식물 세포에서 CaAIRE1 단백질의 세포 내 위치를 조사하기 위해 CaAIRE1-GFP의 융합 단백질을 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 표피 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 그 결과 도 1b에 나타난 바와 같이, CaAIRE1-GFP의 녹색 형광 신호는 핵에서 검출되었으며, 이는 CaAIRE1이 핵 내에서 기능함을 나타내는 것이다.

CaAIRE1은 RING 도메인을 가지고 있기 때문에, 본 발명자들은 CaAIRE1이 유비퀴틴 E3 리가아제 활성을 나타내는지 여부를 조사하기 위해 시험관내 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 정제된 GST-CaAIRE1 재조합 단백질을 E1 및 E2 효소와 함께 또는 이들 없이 배양하고, 항-GST 및 항-유비퀴틴 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.

그 결과 도 1c에 나타난 바와 같이, 추가 래더 밴드는 모든 효소를 함유한 샘플에서 검출되었으며, 이러한 결과는 CaAIRE1이 E3 리가아제 활성을 가짐을 나타내는 것이다.

이어서, E3 리가아제 RING 도메인이 생체내에서 E3 리가아제 활성에 중요한 역할을 하는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 CaAIRE1 및 돌연변이된 CaAIRE1(CaAIRE1CH; 시스테인 348 및 350을 히스티딘으로 변경)를 GFP와 융합하여 작제물을 제작하였으며, 이를 담배 식물에 일시적으로 발현시켰다.

그 결과 도 1d에 나타난 바와 같이, 끌린 신호(dragged signal)는 CaAIRE1-GFP에서 감지되었지만 CaAIRE1CH-GFP에서는 감지되지 않았다. 상기와 같은 결과는 RING 도메인이 CaAIRE1 E3 리가아제 활성에 중요하다는 사실을 시사하는 것이다.

실시예 3. CaAIRE1 넉다운(knock-down) 고추 식물의 내성 표현형 감소 효과

ABA 및 건조 스트레스에 대한 CaAIRE1의 생물학적 기능을 조사하기 위해, 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기술을 사용하여 일시적으로 넉다운된 고추 식물을 제조하였다. 먼저, VIGS 분석의 효율성을 확인하기 위해 빈 벡터(TRV2:00) 대조군 및 CaAIRE1 침묵(TRV:CaAIRE1) 고추 잎을 사용하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다.

그 결과 도 2a에 나타난 바와 같이, CaAIRE1 침묵 고추 식물에서의 발현 수준은 대조군 고추 식물과 비교하여 발현 수준이 현저히 낮음을 확인하였다.

본 발명자들은 상기 형질전환된 식물과 대조군 식물에서 분리된 고추 잎의 생중량을 측정하여, 스트레스에 노출되는 동안 변경된 표현형의 반응을 조사하고, 증산 속도를 측정하였다. 그 결과 도 2b에 나타난 바와 같이, 증산 수분 손실은 대조군 잎과 비교하여 CaAIRE1 침묵 고추 잎에서 유의하게 더 높음을 발견하였다.

이에, 감소된 증산 속도가 ABA 매개 기공 폐쇄의 변화에 의해 영향을 받는 것인지 확인하기 위해 기공개도(도 2c)와 잎의 온도(도 2d)를 측정하였다. 먼저, 도 2c에 나타난 바와 같이, ABA가 없는 경우의 기공 크기는 CaAIRE1 침묵 식물과 대조군 식물간에 유의한 차이가 없었다.

그러나 10 및 20 μM ABA를 처리한 경우 CaAIRE1 침묵 고추 식물의 기공개도는 대조군 식물의 기공개도보다 더 컸다. 또한 기공의 개폐를 제어함으로써 증발 냉각에 의한 잎 표면의 온도가 변화하였는지 확인한 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이 100 μM ABA의 존재하에서 CaAIRE1 침묵 식물의 표면 온도는 대조군 식물의 표면 온도보다 상당히 낮은 것으로 나타났다.

변화된 증산 수분 손실과 ABA 민감도가 건조 스트레스에 대한 반응에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, 두 식물 모두 10일 동안 급수를 제한하여 가뭄 조건에 노출시킨 다음, 재급수 하고 12시간 후에 확인하였다. 그 결과 도 2e에 나타난 바와 같이, 최적의 조건에서 성장했을 경우에는 CaAIRE1 침묵 고추와 대조군 식물 사이의 표현형 차이를 감지할 수 없었다(도 2e의 좌측 패널).

그러나 두 식물 모두 가뭄(건조) 스트레스를 받고 다시 급수하였을 때, CaAIRE1 침묵 고추 식물은 대조군 식물에 비해 가뭄에 민감한 표현형(drought-sensitive phenotype)이 감소한 것으로 나타났다(도 2e의 중간 및 우측 패널). 재급수시 CaAIRE1 침묵 고추 식물은 25% 정도만이 회복한 반면, 모든 대조군 식물은 재급수 후 다시 생장하는 모습을 나타냈다. 이러한 결과는 CaAIRE1 발현의 억제가 ABA 매개 기공 폐쇄에 영향을 줌으로써 가뭄 스트레스에 대한 민감성을 증가시켰음을 보여주는 것이다.

실시예 4. CaAIRE1 과발현 형질전환 애기장대 식물의 향상된 ABA 민감도 확인

상기 실시예 3에서는 CaAIRE1 침묵 고추 식물이 ABA에 대한 무감각화에 의해 가뭄에 대한 내성이 감소하는 것으로 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 35S 프로모터로 CaAIRE1이 과발현된 애기장대 식물('CaAIRE1-OX'로 표시함)을 생성하여 추가적인 역유전학 분석을 수행하였다. 먼저, RT-PCR 분석을 통해 CaAIRE1 전사체의 발현은 CaAIRE1-OX 식물에서만 검출됨을 확인하였다(도 3c 좌측 밴드 이미지 참조). 따라서 이러한 식물을 추가 표현형 분석을 위해 선택하였다.

종자 발아 및 묘목 성장은 ABA에 의해 음성적으로 조절되는 발달 과정이다. 따라서 ABA의 유무에 따른 발아율과 1차 뿌리 생장을 측정하여 야생형 및 CaAIRE1-OX 식물의 종자 발아 및 발아 후 생장을 확인하였다. 먼저, ABA 처리 전에는 야생형 식물과 형질전환 식물 사이의 표현형 차이를 관찰할 수 없었다. 그러나, 도 3a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 0.5 μM 및 1.0 μM ABA를 함유하는 MS 배지에서 CaAIRE1-OX 종자의 발아율은 야생형 종자의 발아율과 비교하여 현저히 낮았다.

또한, ABA에 대한 반응으로서 1차 뿌리 생장을 평가한 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 야생형 식물에 비해 CaAIRE1-OX 식물에서 1차 뿌리 생장이 더 크게 억제된다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 향상된 수준의 CaAIRE1 발현이 종자의 발아 및 발아 후 생장 단계 동안 ABA 과민성(hypersensitivity)을 부여했음을 시사하는 것이다.

실시예 5. CaAIRE1 -OX 식물의 강화된 가뭄 내성 확인

상기 실시예 4에서 살펴본 바와 같이 CaAIRE1-침묵 고추와 CaAIRE1-OX 식물은 각각 가뭄에 민감한 표현형과 ABA 과민성 표현형을 나타냈다. 따라서 본 발명자들은 CaAIRE1-OX 식물이 건조 스트레스에 반응하여 변화된 표현형을 보이는지 여부를 조사하였다. 먼저, 형질전환된 식물과 대조군 식물로부터 분리된 로제트 잎(rosette leave)의 생중량을 측정하여 증산 수분 손실을 추산하였다. 그 결과 도 4a에 나타난 바와 같이, CaAIRE1-OX 잎의 생중량 감소는 야생형 잎보다 낮은 양상을 보였다.

상기와 같은 변형된 표현형이 ABA 민감도의 차이로 인해 발생한 것인지 여부를 확인하기 위해, 기공개도(도 4b)와 잎의 온도(도 4c)를 측정하였다. 그 결과 도 4b에 나타난 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우에는 야생형 식물과 CaAIRE1-OX 식물 간에 유의한 차이를 관찰할 수 없었으나, 10 μM ABA를 처리한 경우에는 CaAIRE1-OX 잎의 기공 크기가 야생형 잎의 기공 크기와 비교하여 유의하게 작았다.

또한, 도 4c에 나타난 바와 같이 CaAIRE1-OX 식물은 ABA 처리 후 야생형 식물보다 낮은 잎 온도를 보였는바, 이러한 결과는 향상된 CaAIRE1의 발현 수준이 기공 폐쇄에 영향을 미친다는 것을 의미하는 것으로서, CaAIRE1도 가뭄에 대한 반응에 영향을 미칠 것으로 예상할 수 있었다.

상기 가능성을 테스트하기 위해, 야생형 및 CaAIRE1-OX 식물의 가뭄에 대한 반응을 분석하였다. 그 결과 도 4d에 나타난 바와 같이, 10일 동안 급수를 중단하여 가뭄 스트레스를 유발한 후 다시 2일 동안 급수하였을 때, CaAIRE1-OX 식물은 야생형 식물보다 시들어진 표현형이 더 적게 나타났다(도 4d의 중간 및 하단 패널). 또한, 2일 동안 재급수한 경우 CaAIRE1-OX 식물의 70-83.3%가 생장을 재개한 반면 대조군 식물은 회복되지 못하였다.

이러한 표현형 분석을 기반으로, 본 발명자들은 CaAIRE1이 스트레스 반응 유전자의 발현에도 영향을 미쳐 CaAIRE1-OX 식물의 표현형을 변경하였다고 가정하였다. 이에, RAB18 및 ABI5를 포함한 스트레스 반응 유전자의 발현을 조사하기 위해 ABA가 처리된 야생형 및 CaAIRE1-OX 형질전환 식물 잎에 대한 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과 도 3c의 우측 그래프에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 두 유전자는 ABA 처리 후 야생형 식물보다 CaAIRE1-OX 식물에서 더 많이 유도되었음을 확인하였다.

실시예 6. CaAIRE1에 의한 유비퀴틴화를 통한 CaATP1 안정성 조절 확인

CaAIRE1은 E3 리가아제 활성을 가지며 ABA에 대한 민감도 조절과 관련이 있다. 따라서 본 발명자들은 CaAIRE1이 ABA 신호전달 구성 요소 단백질의 안정성을 제어함으로써 ABA 신호전달에 영향을 미친다는 가설을 세웠다. 가능한 표적을 찾기 위해, 일대일 효모 이중잡종화 분석(yeast two-hybrid assay)을 수행하여 ABA 신호전달의 음성 조절자인 고추 그룹 A PP2C에서 CaAIRE1 상호 작용자를 검색하였다.

그 결과 도 5a에 나타난 바와 같이, CaAIRE1은 CaADIP1, CaAIPP1 및 Ca6g24830과 직접 상호 작용한다는 것을 발견하였다. 특히, Ca6g24830은 다른 단백질보다 CaAIRE1과 더 강한 상호 작용을 나타냈다. 따라서 본 발명자들은 상기 Ca6g24830을 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1)로 명명하고 추가 연구를 수행하였다.

CaAIRE1과 CaATP1의 상호 작용을 확인하기 위해, 풀다운 분석을 수행하였다. 그 결과 도 5b에 나타난 바와 같이, CaAIRE1은 CaATP1과 직접 상호 작용했지만, GST와는 상호 작용하지 않았다.

나아가, 생체 내에서 상기와 같은 상호 작용을 조사하기 위해 담배 식물(N. benthamiana)의 잎을 사용하여 BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation) 분석을 수행하였다. 그 결과 도 5c에 나타난 바와 같이, 잎 세포 핵에서 노란색 형광(YFP)을 관찰했으며, 이는 CaAIRE1이 핵에서 CaATP1과 상호 작용함을 의미하는 것이다.

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 CaAIRE1이 E3 리가아제 활성을 가지고 있음을 확인하였는바(도 1c 및 도 1d), CaATP1 단백질 안정성이 유비퀴틴화 매개 26S 프로테아좀 시스템을 통해 CaAIRE1에 의해 조절되는지 여부를 조사하였다. CaATP1 단백질의 안정성은 먼저 무세포 분해 분석(cell-free degradation assay)을 사용하여 평가되었다. 태그된 재조합 단백질 GST-CaATP1을 CaAIRE1 침묵 고추(TRV2:CaAIRE1) 및 대조군 고추(TRV2:00) 잎에서 추출한 조추출물과 함께 배양하였다. 도 5d의 면역블롯 분석에 따르면, CaATP1 단백질 수준은 대조군 식물보다 TRV2:CaAIRE1 식물에서 덜 감소하였다(도 5d의 상단 패널). GST-CaATP1을 CaAIRE1-OX 및 야생형 식물 추출물과 함께 배양했을 때 GST-CaATP1 수준은 야생형 식물 추출물보다 CaAIRE1-OX에서 더 많이 감소하였다(도 5d의 하단 패널). 이러한 분해 패턴은 26S 프로테아좀 시스템의 억제제인 MG132에 의해 완전히 차단되었다. 이러한 결과는 CaAIRE1이 26S 프로테아좀 시스템을 통한 CaATP1 안정성의 조절과 관련이 있음을 증명하는 것이다.

CaAIRE1이 CaATP1을 직접 유비퀴틴화 하는지 조사하기 위해, CaATP1-HA를 CaAIRE1-GFP 및 CaAIRE1CH-GFP와 공동 발현시켜, 생체내 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 그 결과 도 5e에 나타난 바와 같이, 상부 스미어 밴드(smear band)는 CaAIRE1과 함께 CaATP1을 발현한 식물에서 검출되었지만, GFP 공동발현 식물에서는 검출되지 않았다(도 5e의 상단 패널). 추가 밴드는 CaAIRE1 식물보다 CaATP1을 CaAIRE1CH와 공동발현한 식물에서 더 적었다(도 5e의 하단 패널). 이러한 결과는 CaAIRE1이 CaATP1과 직접 상호 작용하고 26S-프로테아좀 시스템을 통해 유비퀴틴화를 매개하였음을 시사하는 것이다.

실시예 7. CaATP1의 분자적 특성 확인

CaATP1의 추정 아미노산 서열은 Ser/Thr 탈인산화 효소 패밀리에서 발견되는 탈인산화 효소 도메인(103-409 aa)을 갖는 417개의 아미노산을 포함하는 단백질을 암호화한다(도 6a 참조). 또한, 이웃-결합법(Neighbor-Joining method)을 사용하여 애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 고추(Capsicum annuum)에서의 다른 PP2C 계열과의 진화 역사를 조사하였다. Mega X 분석 데이터에 따르면, CaATP1은 CaAIPP1 및 AtPP2CA와 밀접한 관계가 있으며, CaADIP1과 상대적으로 먼 관계를 갖는다(도 6b 참조).

본 발명자들은 또한 GFP 태그 단백질과 융합된 CaATP1의 세포내 위치를 확인하였다. 녹색 형광(GFP) 신호가 핵에서 검출되었는데, 이는 CaATP1이 핵에서 기능한다는 것을 나타내는 것이다(도 6c 참조).

CaATP1을 추가로 특성화하기 위해, 다양한 발달 단계 및 조직에서 CaATP1의 발현 수준을 조사하였다. 실시간 RT-PCR 분석은 상기 유전자가 대부분의 성숙한 식물 꽃(FL)에 축적되어 있음을 보여주었다(도 6d 참조). 또한, 탈수, 만니톨 및 ABA 처리에 따라 CaATP1 전사체의 유도가 검출되었다(도 6e 참조).

실시예 8. CaATP1 침묵 고추 식물의 강화된 가뭄 내성 확인

CaATP1의 기능이 ABA 신호전달과 어떻게 연관되어 있는지 알아보기 위해 본 발명자들은 CaATP1로 VIGS 분석을 수행하였다. 먼저, 도 7a에 나타난 바와 같이 반-정량적 RT-PCR 분석을 수행하여 VIGS 효율성을 조사한 결과, CaATP1의 전사 수준은 대조군 식물(TRV2:00)에서보다 TRV2:CaATP1 고추 식물에서 유의하게 낮았다.

이어서, TRV2:CaATP1 및 TRV2:00 고추 식물의 4엽 단계에서 분리된 잎의 생중량을 측정하여 증산 수분 손실을 조사하였다. 그 결과 도 7b에 나타난 바와 같이, 증산 수분 손실은 TRV2:00 식물보다 TRV2:CaATP1 고추 식물에서 더 낮았다.

잎 표면 온도는 외부 ABA를 처리한 잎에 대하여 측정되었다. 그 결과 도 7c에 나타난 바와 같이, TRV2:CaATP1 고추 식물은 대조군 식물보다 더 높은 온도를 보였다. 이러한 결과는 CaATP1이 ABA 민감도에 대해 부정적인 영향을 미친다는 것을 의미하는 것이다.

본 발명자들은 상승된 잎의 온도가 서로 다른 기공 크기에서 기인한 것인지 여부를 추가로 조사하였다. 그 결과 도 7d에 나타난 바와 같이, 기공의 크기는 10 및 20 μM ABA를 처리한 TRV2:00 대조군 식물보다 TRV2:CaATP1 고추 식물에서 더 작은 것으로 나타났다.

추가적으로 본 발명자들은 14일 동안 급수를 중단함으로써 가뭄 스트레스에 대한 반응을 조사하고, 이후 재급수하여 24시간 경과 후의 식물 생존율을 결정하였다. 그 결과 도 7e에 나타난 바와 같이, 잘 성장하는 조건에서, TRV2:CaATP1과 TRV2:00 식물 사이에는 유의한 차이가 발견되지 않았다(도 7e의 좌측 패널). 그러나 급수를 중단하였다가 재급수 하였을 때 TRV2:CaATP1 고추 식물은 대조군 식물보다 더 내성이 강한 표현형을 보였다(도 7e의 중간 및 우측 패널). TRV2:CaATP1 및 TRV2:00 식물은 각각 약 75.5% 및 15% 비율로 성장을 재개하였다. 이러한 결과는 CaATP1이 ABA 매개성 신호전달을 통해 가뭄 내성에 음성적 조절자로서 기능함을 시사하는 것이다.

실시예 9. CaATP1 -OX 식물의 ABA 민감도 감소 확인

상기 실시예 8에서 살펴본 바와 같이 CaATP1-OX 식물은 가뭄 내성이 감소하였다. 따라서 본 발명자들은 CaATP1이 ABA 신호전달에 부정적인 영향을 미친다고 가정하였다. 상기 가설을 검증하기 위해, CaATP1을 항상 발현하는 CaATP1-OX 식물을 생성하였다(도 3c 참조).

먼저, 발아 및 묘목 단계 동안 CaATP1-OX, CaADIP1-OX 및 CaAIPP1-OX 식물에서 ABA에 대한 반응의 표현형 분석을 수행하였다. 그 결과 도 8a에 나타난 바와 같이 정상적인 성장 조건에서 CaATP1-OX 식물은 다른 식물보다 더 빠르게 발아하였다. 이에 반해, 야생형과 다른 형질전환 식물은 식재 3일 후 동일한 발아율을 보였다. 또한, ABA를 처리한 경우 CaATP1-OX, CaADIP1-OX 및 CaAIPP1-OX 식물은 야생형 식물보다 ABA에 대해 더 둔감한 반응을 나타냈으며, CaATP1-OX 식물은 CaADIP1-OX 및 CaAIPP1-OX 식물보다 더 높은 발아율을 나타냈다.

또한, 자엽 녹화(cotyledon greening) 및 뿌리 생장 측정과 관련된 표현형 분석을 수행하였다. 그 결과 도 8b 내지 도 8d에 나타난 바와 같이, ABA의 존재하에 CaATP1-OX 식물은 다른 형질전환 및 야생형 식물에 비해 가장 ABA에 민감하지 않은 표현형인 것으로 확인되었다. 묘목 단계에서 ABA의 존재하에 야생형 및 형질전환 식물의 잎 표면 온도를 조사한 결과, CaATP1-OX 식물은 야생형 및 기타 다른 형질전환 식물보다 잎의 온도가 낮았다. 이러한 결과는 CaATP1이 ABA 신호전달의 음성 조절자로서 지배적인 역할을 할 수 있음을 의미하는 것이다.

실시예 10. CaATP1 -OX 식물의 건조 스트레스 내성 감소 확인

감소된 잎 온도가 기공개도에 의해 영향을 받는지 조사하기 위해, 야생형 및 CaATP1-OX 식물에서 ABA에 대한 반응에 따른 기공 개방의 변화를 관찰하였다. 그 결과 도 9a에 나타난 바와 같이, 기공개도는 ABA 존재 여부와 관계 없이 야생형 식물보다 CaATP1-OX 식물에서 항상 더 컸다. 그러나 ABA가 존재하는 경우 개도의 차이는 더욱 컸다.

본 발명자들은 다음으로 잘 급수된 3주령의 야생형 및 CaATP1-OX 식물에서 잎을 분리하고 생중량을 측정함으로써 증산 속도를 측정하였다. 그 결과 도 9b에 나타난 바와 같이, 잎의 온도 및 기공개도 결과와 일치되게, 탈리 후 6시간이 경과한 시점에서 야생형 식물(42.5%)보다 CaATP1-OX 식물(48.1% 및 45.4%)에서의 증산 수분 손실이 더 높았다.

또한, 본 발명자들은 15일 동안 급수를 중단한 후 재급수한지 3일이 경과한 시점에서의 생존율을 측정하여 가뭄 스트레스에 대한 반응을 조사하였다. 그 결과 도 9c에 나타난 바와 같이, CaATP1-OX 식물은 야생형 식물보다 가뭄 조건에 더 저항성을 나타냈다. 종합하면, CaATP1은 ABA 매개 신호전달을 통해 건조 스트레스에 대한 반응에서 음성적인 조절자 역할을 수행하는 것이다.

상기 결과들을 통해 CaATP1이 ABA 매개 기공폐쇄 및 건조 스트레스에 대한 반응 마커 유전자의 발현을 유도함으로써 고추 식물뿐만 아니라 애기장대에서도 건조 환경에 반응하는 음성 조절자로 작용함을 최초로 밝힌 것이다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> CaATP1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaATP1 in plants <130> MP20-147 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 416 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CaATP1 (Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) <400> 1 Met Ala Glu Val Cys Phe Gly Val Val Thr Glu Thr Glu Thr Ser Pro 1 5 10 15 Pro Cys Gln Ser Asn Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg Met 20 25 30 Glu Leu Arg Lys Leu Asn Ile Ile Thr Ser Glu Thr Glu Ser Gly Ile 35 40 45 Lys Arg Pro Lys Leu Lys Leu Leu Ser Gly Ser Val Ser Arg Ile Cys 50 55 60 Asp Asn Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ser Asp Glu Glu Arg Glu Asp Gln 65 70 75 80 Leu Ile Leu Ala Glu Ser Thr Asn Gly Gly Ser Pro Pro Asn Ile Ile 85 90 95 Leu Ala Pro Ile Leu Gly Ser Leu Asn Ser Thr Leu Val Ile Arg Ser 100 105 110 Val Leu Ala Cys Pro Lys Phe Gly Phe Ser Ser Val Cys Gly Arg Arg 115 120 125 Arg Asp Met Glu Asp Ala Val 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for CaActin1 RT-PCR <400> 17 gacgtgacct aactgataac ctgat 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CaActin1 RT-PCR <400> 18 ctctcagcac caatggtaat aactt 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RD29B RT-PCR <400> 19 gttgaagagt ctccacaatc acttg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RD29B RT-PCR <400> 20 atacaaatcc ccaaactgaa taaca 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RAB18 RT-PCR <400> 21 ggaagaaggg aataacacaa aagat 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RAB18 RT-PCR <400> 22 gcgttacaaa ccctcattat tttta 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ABI5 RT-PCR <400> 23 cagtggagaa agtagtggag agaag 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ABI5 RT-PCR <400> 24 cccttgactt caaactctca aaata 25

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진, CaATP1 단백질을 암호화하는 CaATP1 유전자.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 CaATP1 유전자는 고추로부터 분리된 것을 특징으로 하는, CaATP1 유전자.
   
5. 제3항의 CaATP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
   
6. CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 CaATP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
8. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaATP1(Capsicum annuum CaAIRE1 Interacting Target Phosphatase 1) 단백질의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법.
   
9. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된, 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는, 식물체.

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