KR102555526B1 - CaFIRF1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 및 이를 이용한 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것으로서, 상기 유전자의 발현이 침묵된 식물체는 건조 또는/및 염 스트레스에 대한 내성이 증가하는 것을 확인하여 완성된 것이다. 즉, 본 발명에 따른 CaFIRF1은 건조 또는/및 염 스트레스 저항성의 음성 조절자로 기능할 수 있으므로, 상기 단백질의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등을 적절히 개량할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 고추 유래 신규 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 유전자, 단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 또는/및 염 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것이다.
지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산 (abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화한다.
ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절 인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절한다고 알려졌으나, 완전한 ABA 신호전달경로는 아직 규명되지 않았다. 식물 세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야 한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려졌다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.
오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 매우 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.
한편, 26S 프로테아좀에 의한 유비퀴틴화 (ubiquitination)는 진핵 세포에서 공통된 단백질 변형 메카니즘이다. 식물에서의 유비퀴틴화는 전사 인자, 호르몬 수용체 및 손상된 단백질과 같은 대상의 다양한 세포내 신호 프로세스에 필수적이다. 유비퀴틴화는 E1 (ubiquitin activating enzyme), E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 및 E3 (ubiquitin ligase)로 구성되는 3가지 효소의 연속적인 작용에 의해 일어나는 중요한 번역 후 조절과정이다. 유비퀴틴이 E1에 의해 활성화되면, 활성화된 유비퀴틴은 E2로 전달되고 E3 리가아제가 유비퀴틴과 표적 단백질을 결합시킨다. 이러한 과정에서 E3 리가아제가 표적 단백질을 결정하고 이에 결합한다. E3 리가아제는 다수의 다중 이성체를 가지고 있으며, 표적 단백질의 특성을 결정한다. 상기 E3 리가아제는 구조적 도메인이 단일 혹은 다중 서브유닛이 포함되는지에 따라 두 종류의 슈퍼패밀리로 구분된다. 이 때, 슈퍼패밀리 중 하나는, Really Interesting New Gene (RING), Homology to E6-AP Carboxyl Terminus (HECT) 및 U-box E3 리가아제로 구성되고, 다른 하나는, CULLIN4-Damaged-specific DNA binding protein1 (CUL4-DDB1), Anaphase Promoting Complex(APC) 및 Skp1-Cullin-Fbox (SCF) E3 리가아제로 구성된다.
한편, 애기장대의 게놈은 1,400개 이상의 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하고 있으며, 상기 E3 유비퀴틴 리가아제는 RING 도메인의 유형에 따라 여덟 개의 서브 그룹으로 세분화된 E3 U-box 리가아제를 포함하는 약 477개의 RING finger 도메인을 포함한다. 하지만, 현재까지는 단지 몇 종류의 RING type E3 리가아제의 정확한 기능만이 밝혀져 있는 실정(한국 등록 특허 10-1335440)이다.
식물체의 건조 또는/및 고염 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 또는/및 고염 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.
Catala, R., Ouyang, J., Abreu, I.A., Hu, Y., Seo, H., Zhang, X. and Chua, N.H. (2007) The Arabidopsis E3 SUMO ligase SIZ1 regulates plant growth and drought responses. The Plant cell, 19, 2952-2966.
본 발명자들은 고추에서 건조 또는/및 염(salt) 민감성 RING finger 단백질 유전자인 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1)를 규명하였으며, 상기 유전자를 침묵시킬 경우, 식물의 건조 또는/및 염 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하여, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명의 목적은, 건조 또는 염 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator)인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 CaFIRF1 단백질을 암호화하는 CaFIRF1 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 CaFIRF1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 건조 또는 염 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 또는 염 스트레스에 대한 음성적 조절인자(negative regulator)인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CaFIRF1 단백질을 암호화하는 CaFIRF1 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CaFIRF1 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CaFIRF1 유전자는 고추로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 CaFIRF1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CaFIRF1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme), PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드, 화합물, 펩타이드, 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 항체, 및 압타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CaFIRF1 단백질의 발현 억제는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 또는 염 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 형질전환 식물체는 고추일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 및 이를 이용한 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것으로서, 상기 유전자의 발현이 침묵된 식물체는 건조 또는/및 염 스트레스에 대한 내성이 증가하는 것을 확인하여 완성된 것이다. 즉, 본 발명에 따른 CaFIRF1은 건조 또는/및 염 스트레스 저항성의 음성 조절자로 기능할 수 있으므로, 상기 단백질의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등을 적절히 개량할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 CaFIRF1 단백질 및 다른 식물종의 C3H1C5-type RING finger 단백질들에 대하여 RING domain 아미노산 서열의 다중 서열 정렬 결과를 나타낸 것이다: S. lycopersicum (NCBI genebank accession No. NP_001266128.1), S. tuberosum (XP_006338634.1), N. tabacum (NP_001312603.1), C. eugenioides (XP_027154294.1), S. indicum (XP_011097362.1), C. sinensis (XP_028126364.1), M. truncatula (XP_003618769.1), G. max (XP_003553280.1), O. sativa cv. Japonica (XP_015616475.1) 및 A. thaliana (NP_196946.1)
도 2는 다른 식물 유전자와 비교하여 CaFIRF1 단백질의 계통수 분석(phylogenetic tree analysis) 결과를 나타낸다. 스케일 바는 유전적 거리를 나타낸다.
도 3은 성숙한 고추 식물의 다양한 조직에서 CaFIRF1 발현 패턴을 확인한 결과이다. 잎에서의 상기 유전자의 발현 수준을 1.0으로 설정한 후 상대적 발현량을 계산했다.
도 4는 비생물학적 스트레스 (탈수(잎을 떼어 냄), 250 mM의 NaCl, 600 mM의 만니톨, 100 μM의 ABA) 처리 후, 시간에 따른 CaFIRF1 유전자 발현 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 내부 대조군으로 고추 PP2A (CaPP2A) 유전자를 사용하였다. 모든 데이터(ΔΔCT values)는 3개의 독립적인 실험(>95%)의 평균을 나타낸다.
도 5는 CaFIRF1의 세포 내 위치(Subcellular localization) 분석 결과를 나타낸다. Agroinfiltration 방법을 사용해 Pro35S:CaFIRF1-GFP 작제물을 니코티아나 벤타미아나 식물의 잎에서 일시적으로 발현시키고, GFP 단백질이 융합된 CaFIRF1의 세포 내 위치를 분석하였다. FM4-64(적색 형광 단백질 융합시킴)는 원형질막의 마커로 사용되었다. 흰색 막대 = 20μm.
도 6a는 in vitro 상에서, CaFIRF1의 자가-유비퀴틴화(Auto-ubiquitination)를 확인한 것으로, 유비퀴틴, E1 (UbE1) 및 E2 (UBCH5b)의 존재하에 MBP-CaFIRF1 융합 단백질은 E3 유비퀴틴 리가제 활성(E3 ubiquitin ligase activity)을 나타내었다. CaFIRF1 자가-유비퀴틴화를 검출하기 위해서, anti-MBP 항체 및 anti-ubiquitin 항체를 이용하여 MBP-CaFIRF1 융합 단백질이 검출되었고, 이동된 밴드(shifted band)는 유비퀴틴 분자의 부착을 나타낸다.
도 6b는 in vivo 상에서, CaFIRF1의 자가-유비퀴틴화(Auto-ubiquitination)를 확인한 결과를 나타낸다. Nicotiana benthamiana 잎에, 35S:CaFIRF1-GFP을 발현시키고, anti-GFP 항체 및 anti-plant ubiquitin 항체를 이용하여 면역블롯(Immunoblot) 분석을 수행하였다.
도 7a는 CaFIRF1 침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1) 실험군에서 음성 대조군(TRV2:00) 대비 건조(가뭄) 스트레스에 대한 내성이 증가한 결과를 그 표현형으로 확인한 것이다. 3주령(agroinfiltration 후 2주 차)의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 14일간 단수하여 가뭄(건조) 스트레스를 가하고, 3일간 재급수한 뒤 식물 표현형을 관찰하였다.
도 7b는 도 7a의 건조 스트레스 처리 실험에서, 다시 물주기를 수행하고 3일 후에 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 생존율을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 7c는 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2: CaFIRF1) 잎에서 발생하는 증산 수분 손실(transpirational water loss) 정도를 비교하기 위해, 각 식물에서 잎을 분리하여 9시간 동안 매 시간 간격으로 잎의 생체중(fresh weight)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7d는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2: CaFIRF1)로부터 잎 껍질(Leaf peels)을 확보한 후 0, 10, 또는 20 μM의 ABA를 포함하는 기공 개방 용액 (stomatal opening solution, SOS) 완충액에서 2시간 동안 배양한 뒤, 기공개도를 비교하기 위해 기공을 촬영한 대표적 이미지이다.
도 7e는 상기 도 7d 실험에서, 기공 개도 측정결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 현미경으로 임의의 100개 기공을 촬영한 뒤 기공 구멍의 너비 대 길이 비율(width to length ratios of stomatal apertures)을 측정하여 나타낸 것이다. 각 계통의 4개 식물의 잎 껍질로부터 평균 기공 개도를 계산했다. 모든 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 7f는 100 μM의 ABA를 처리 전 및 후에, 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 잎 표면 온도를 확인하기 위해 열 화상 이미지를 촬영한 결과를 나타내는 대표적 이미지이다.
도 7g는 상기 도 7f 실험에서 100 μM의 ABA를 처리 전 및 후에 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 잎 표면 온도를 정량적으로 확인한 결과로, 각 계통의 20개의 식물의 잎 온도로부터 평균 온도를 계산했다. 본 출원 명세서 및 도면 전체에서 Asterisk(*)는 TRV2:00와 TRV2:CaFIRF1 식물 간의 유의미한 차이(significant difference)가 존재함을 나타낸다(Student's t-test; * P < 0.05).
도 7h는 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 가뭄 스트레스를 가한 후, 식물 잎에서 스트레스 반응 관련 유전자 (CaOSR1, CaNCED3, CaRAB18 및 CaDREBLP1)의 발현 변화를 qRT-PCR 방법으로 정량적으로 평가한 결과를 나타낸다. 음성 대조군 식물의 가뭄 스트레스 처리 0시간 시점에서의 각 유전자의 발현량을 1.0으로 설정하였으며, CaPP2A 유전자에 대해 정규화하여 상대적 발현량을 나타냈다.
도 8a는 CaFIRF1 침묵에 의한 식물체의 염분 스트레스 내성 변화를 확인하기 위해, 3주령(agroinfiltration 2주 후) 정상 환경에서 배양된 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)을, 물, 200 mM NaCl 용액, 또는 250 mM NaCl 용액이 담긴 플라스틱 용기에서 4일 동안 배양한 뒤 표현형을 관찰한 결과이다.
도 8b는 상기 도 8a의 실험에서, 염분 스트레스 처리 4일 후 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 생존률을 정량적으로 나타낸 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8c는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 200 mM의 NaCl 용액을 20시간 처리한 뒤 전해질 누출 정도를 측정한 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8d는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 200 mM의 NaCl 용액을 20시간 처리한 뒤 지질 과산화 산물인 말론알데히드 수준을 측정한 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8e는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 200 mM의 NaCl 용액을 20시간 처리한 뒤 프롤린 함량 수준을 측정한 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8f는 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 250 mM의 NaCl 용액을 처리한 후 각 타임포인트 경과 후(0, 4, 8 시간)의 스트레스 관련 유전자 CaOSR1, CaRAB18 및 CaP5CS의 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다. 염분 스트레스 처리 0시간 시점의 음성 대조군 식물의 각 유전자들의 발현을 1.0으로 설정하였으며, CaPP2A 유전자에 대해 발현 값을 정규화하여 상대적 발현량을 나타냈다.
도 2는 다른 식물 유전자와 비교하여 CaFIRF1 단백질의 계통수 분석(phylogenetic tree analysis) 결과를 나타낸다. 스케일 바는 유전적 거리를 나타낸다.
도 3은 성숙한 고추 식물의 다양한 조직에서 CaFIRF1 발현 패턴을 확인한 결과이다. 잎에서의 상기 유전자의 발현 수준을 1.0으로 설정한 후 상대적 발현량을 계산했다.
도 4는 비생물학적 스트레스 (탈수(잎을 떼어 냄), 250 mM의 NaCl, 600 mM의 만니톨, 100 μM의 ABA) 처리 후, 시간에 따른 CaFIRF1 유전자 발현 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 내부 대조군으로 고추 PP2A (CaPP2A) 유전자를 사용하였다. 모든 데이터(ΔΔCT values)는 3개의 독립적인 실험(>95%)의 평균을 나타낸다.
도 5는 CaFIRF1의 세포 내 위치(Subcellular localization) 분석 결과를 나타낸다. Agroinfiltration 방법을 사용해 Pro35S:CaFIRF1-GFP 작제물을 니코티아나 벤타미아나 식물의 잎에서 일시적으로 발현시키고, GFP 단백질이 융합된 CaFIRF1의 세포 내 위치를 분석하였다. FM4-64(적색 형광 단백질 융합시킴)는 원형질막의 마커로 사용되었다. 흰색 막대 = 20μm.
도 6a는 in vitro 상에서, CaFIRF1의 자가-유비퀴틴화(Auto-ubiquitination)를 확인한 것으로, 유비퀴틴, E1 (UbE1) 및 E2 (UBCH5b)의 존재하에 MBP-CaFIRF1 융합 단백질은 E3 유비퀴틴 리가제 활성(E3 ubiquitin ligase activity)을 나타내었다. CaFIRF1 자가-유비퀴틴화를 검출하기 위해서, anti-MBP 항체 및 anti-ubiquitin 항체를 이용하여 MBP-CaFIRF1 융합 단백질이 검출되었고, 이동된 밴드(shifted band)는 유비퀴틴 분자의 부착을 나타낸다.
도 6b는 in vivo 상에서, CaFIRF1의 자가-유비퀴틴화(Auto-ubiquitination)를 확인한 결과를 나타낸다. Nicotiana benthamiana 잎에, 35S:CaFIRF1-GFP을 발현시키고, anti-GFP 항체 및 anti-plant ubiquitin 항체를 이용하여 면역블롯(Immunoblot) 분석을 수행하였다.
도 7a는 CaFIRF1 침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1) 실험군에서 음성 대조군(TRV2:00) 대비 건조(가뭄) 스트레스에 대한 내성이 증가한 결과를 그 표현형으로 확인한 것이다. 3주령(agroinfiltration 후 2주 차)의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 14일간 단수하여 가뭄(건조) 스트레스를 가하고, 3일간 재급수한 뒤 식물 표현형을 관찰하였다.
도 7b는 도 7a의 건조 스트레스 처리 실험에서, 다시 물주기를 수행하고 3일 후에 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 생존율을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 7c는 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2: CaFIRF1) 잎에서 발생하는 증산 수분 손실(transpirational water loss) 정도를 비교하기 위해, 각 식물에서 잎을 분리하여 9시간 동안 매 시간 간격으로 잎의 생체중(fresh weight)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7d는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2: CaFIRF1)로부터 잎 껍질(Leaf peels)을 확보한 후 0, 10, 또는 20 μM의 ABA를 포함하는 기공 개방 용액 (stomatal opening solution, SOS) 완충액에서 2시간 동안 배양한 뒤, 기공개도를 비교하기 위해 기공을 촬영한 대표적 이미지이다.
도 7e는 상기 도 7d 실험에서, 기공 개도 측정결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 현미경으로 임의의 100개 기공을 촬영한 뒤 기공 구멍의 너비 대 길이 비율(width to length ratios of stomatal apertures)을 측정하여 나타낸 것이다. 각 계통의 4개 식물의 잎 껍질로부터 평균 기공 개도를 계산했다. 모든 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 7f는 100 μM의 ABA를 처리 전 및 후에, 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 잎 표면 온도를 확인하기 위해 열 화상 이미지를 촬영한 결과를 나타내는 대표적 이미지이다.
도 7g는 상기 도 7f 실험에서 100 μM의 ABA를 처리 전 및 후에 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 잎 표면 온도를 정량적으로 확인한 결과로, 각 계통의 20개의 식물의 잎 온도로부터 평균 온도를 계산했다. 본 출원 명세서 및 도면 전체에서 Asterisk(*)는 TRV2:00와 TRV2:CaFIRF1 식물 간의 유의미한 차이(significant difference)가 존재함을 나타낸다(Student's t-test; * P < 0.05).
도 7h는 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 가뭄 스트레스를 가한 후, 식물 잎에서 스트레스 반응 관련 유전자 (CaOSR1, CaNCED3, CaRAB18 및 CaDREBLP1)의 발현 변화를 qRT-PCR 방법으로 정량적으로 평가한 결과를 나타낸다. 음성 대조군 식물의 가뭄 스트레스 처리 0시간 시점에서의 각 유전자의 발현량을 1.0으로 설정하였으며, CaPP2A 유전자에 대해 정규화하여 상대적 발현량을 나타냈다.
도 8a는 CaFIRF1 침묵에 의한 식물체의 염분 스트레스 내성 변화를 확인하기 위해, 3주령(agroinfiltration 2주 후) 정상 환경에서 배양된 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)을, 물, 200 mM NaCl 용액, 또는 250 mM NaCl 용액이 담긴 플라스틱 용기에서 4일 동안 배양한 뒤 표현형을 관찰한 결과이다.
도 8b는 상기 도 8a의 실험에서, 염분 스트레스 처리 4일 후 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 생존률을 정량적으로 나타낸 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8c는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 200 mM의 NaCl 용액을 20시간 처리한 뒤 전해질 누출 정도를 측정한 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8d는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 200 mM의 NaCl 용액을 20시간 처리한 뒤 지질 과산화 산물인 말론알데히드 수준을 측정한 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8e는 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 200 mM의 NaCl 용액을 20시간 처리한 뒤 프롤린 함량 수준을 측정한 결과이다. 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 8f는 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 250 mM의 NaCl 용액을 처리한 후 각 타임포인트 경과 후(0, 4, 8 시간)의 스트레스 관련 유전자 CaOSR1, CaRAB18 및 CaP5CS의 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다. 염분 스트레스 처리 0시간 시점의 음성 대조군 식물의 각 유전자들의 발현을 1.0으로 설정하였으며, CaPP2A 유전자에 대해 발현 값을 정규화하여 상대적 발현량을 나타냈다.
본 발명은 건조 또는/및 염 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator)인 CaFIRF1(Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1)에 관한 것으로서, 상기 유전자의 발현이 침묵된 식물체는 가뭄 및 염 스트레스에 대한 내성이 증가하는 것을 확인하여 완성된 것이다.
이에, 본 발명은 건조 또는 염 스트레스에 대한 음성적 조절인자이자 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 단백질, 및 이를 암호화하는 CaFIRF1 유전자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 CaFIRF1 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 상기 CaFIRF1 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 CaFIRF1 유전자는 고추로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 CaFIRF1 유전자는 고추 녹광 품종에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자인 CaFIRF1의 cDNA는, 1,455bp ORF(open reading frame)를 포함하고, 484 개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이들은 53.306 kD의 분자량, 5.59의 등전점(PI)을 가진 것으로 추정되었다.
본 발명에서 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 단백질은, 이의 기능적 동등물을 포함하는 의미이다. 상기 기능적 동등물이란, 공지의 CaFIRF1 단백질을 구성하는 아미노산 서열(바람직한 일례로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 모태가 된 상기 공지의 CaFIRF1 단백질(바람직한 일례로, 서열번호 1로 표시되는 표시되는 폴리펩티드)과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서 '실질적으로 동질의 생리활성'이란 식물체의 건조 또는 염 스트레스를 조절하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 CaFIRF1의 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys,Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 CaFIRF1 의 기능적 동등물에는, CaFIRF1 단백질의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 CaFIRF1의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 CaFIRF1의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 CaFIRF1의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은, 원본 서열(아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 1, 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 2)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후, 원본 서열에 대한 후보 서열의 동일 매칭 잔기(아민노산 잔기 또는 염기)의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열 상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있어서, CaFIRF1 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에 있어서 비생물학적 스트레스 또는 환경적 스트레스 등에 대한 저항성 (내성)의 "음성 조절인자 (negative regulator)"란 발현 또는 활성이 증가할수록 식물체의 스트레스 저항성을 감소시키는 유전자 및/또는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaFIRF1은 가뭄 및 염 스트레스 내성에 대한 음성 조절인자로 기능하는 단백질을 코딩하므로, CaFIRF1 유전자 발현이 억제되면 건조 및 염(고염) 스트레스에 대한 내성이 증가하고, 반대로 CaFIRF1 유전자가 과발현되면 건조 및 염 스트레스에 대한 내성이 감소하는 것이 특징이다.
본 발명자들은 식물체의 비생물학적 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, 고추로부터 CaFIRF1 (Capsicum annuum FAF1 Interacting RING Finger protein 1) 유전자를 동정하였고, 건조 및 염 스트레스에 대한 식물체의 내성과 상기 유전자의 연관성을 규명하고자 하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 CaFIRF1의 분자적 특성을 분석한 결과 모든 조직에서 CaFIRF1 유전자의 발현이 관찰됐으며, 특히 줄기 및 꽃에서 상대적으로 특히 높은 수준으로 발현되고, CaFIRF1 단백질은 세포질에 위치한다는 것을 확인하였다 (실시예 2 및 실시예 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 고추에서 CaFIRF1 유전자 발현을 침묵시킨 후 가뭄 스트레스에 대한 반응을 관찰한 결과, CaFIRF1-침묵 고추 식물은 가뭄 환경에서 생존율이 증가하고, 스트레스-관련 마커 유전자들의 발현이 증가하며, 기공을 통한 수분 손실이 감소하는 것을 확인한 바, CaFIRF1 유전자가 고추의 가뭄 스트레스에 대한 내성의 음성 조절인자로 기능함을 확인하였다 (실시예 6).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 고추에서 CaFIRF1 유전자 발현을 침묵시킨 후 고염 스트레스에 대한 반응을 관찰한 결과, CaFIRF1-침묵 고추 식물은 고염 환경에서 생존율이 증가하고, 스트레스-관련 마커 유전자들의 발현이 증가하며, 염분 스트레스 마커인 전해질 누출 감소, 지질 과산화 감소 및 프롤린 생합성이 증가한 것을 확인한 바, CaFIRF1 유전자가 고추의 염 스트레스에 대한 내성의 음성 조절인자로 기능함을 확인하였다 (실시예 7).
또한 본 발명은 CaFIRF1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 기술인 VIGS (virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵 (virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사 후 유전자 침묵현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염 식물체에 바이러스 유전체와 상동성이 있는 내성유전자가 발현될 때 내성유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵 (VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어 기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사 후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.
본 발명에서는, CaFIRF1의 ORF 영역을 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV (Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaFIRF1 유전자의 발현을 성공적으로 억제한 바 있다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래 될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자, 번역 조절 요소(translation control element) 또는 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.
용어 "재조합 벡터" 또는 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.
상기 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 또 다른 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법 (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 (EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터일 수 있다.
또한 본 발명은 CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 또는 염(고염) 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
상기 억제제는 CaFIRF1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), 리보자임 (ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme), PNA (peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaFIRF1 단백질에 상보적으로 결합하여(특이적으로 결합하여) 활성을 억제하는 화합물, 펩티드 (Peptide), 펩티드 미메틱스 (peptide mimetics), 항체, 또는 압타머(aptamer, 앱타머) 중 어느 하나인 것이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 발현 또는 활성 억제의 대상이되는 상기 CaFIRF1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것 또는 이의 기능적 동둥물일 수 있다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 기능적 동등물에 대해서는, 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바를 참고로 하여 이해된다. 이에 제한되지 않으나, 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 96% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 97% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 98% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 99% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 또는 염(고염) 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
상기 CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계는 전술한 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 안티센스 뉴클레오티드, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 항체, 또는 압타머(aptamer) 등을 이용하여 제한 없이 이루어질 수 있다.
본 발명에 의하면, CaFIRF1의 발현을 억제시키는 경우 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 효과를 가지므로, 본 발명은 구체적 일 양태로서, 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 CaFIRF1의 발현을 억제하는 구조 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 상기에서 CaFIRF1의 발현을 억제하는 구조 유전자는 CaFIRF1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(이에 제한되지 않으나, 예를 들어 서열번호 2)에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 발현 억제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 유전자 '넉 아웃(knock-out)' 방식에 의해 수행될 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 일례로 상기 넉 아웃은 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템에 의해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "CRISPR-Cas9" 또는 "CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템"은, 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA(gRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 단백질로 구성된다. 상기 용어, "gRNA(guide RNA)"는, RNA를 편집할 때 수식반응의 주형이 되는 염기순서정보를 갖는 45~70 뉴클레오티드 가량의 작은 RNA를 지칭하는데, gRNA의 5'측 영역은 RNA 편집되는 mRNA의 일부와 상보적 순서로 되어 있고, 이 영역을 매개로 하여 mRNA에 결합되며, 3'측 영역에는 편집 후의 최종적 mRNA의 순서에 상보적 염기순서가 존재하고, 그 순서정보에 따라 우리딘(uridine) 염기의 삽입이나 결실이라는 RNA 수식반응이 일어난다.
이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 세포나 동물에 플라스미드(Plasmid) DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 억제 할 수 있는 넉아웃(knock-out)이 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃(knock-out)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 결실, 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절(down-regulation)을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 또는 염 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 예를 들면 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 식물 재료 및 성장 조건
본 발명에서는 고추 (Capsicum annuum L., cv. Nockwang) 및 담배 (Nicotiana benthamiana)가 사용되었다. 고추 종자는 29 ℃의 어두운 곳에서 5일간 발아시켰다. 담배 종자 및 고추 묘목은 증기 소독된 배합토 [피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v], 사토(sand), 및 양토 (loam soil) 1:1:1(v/v/v)에서, 24 ℃, 상대 습도 60 % 조건의 백색 형광 (130 μmol photons m-2S-1)하에서 성장시켰다.
2. 서열 정렬 (Sequence alignment)
아미노산 서열 및 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) web server는 RING finger를 식별하는데 사용하였다. 아미노산 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다.
3. 계통수 분석(phylogenetic tree analysis)
BLAST 검색은 CaFIRF1의 추론된 아미노산 서열을 이용하여 수행되었으며, 가장 유사한 서열은 Arabidopsis thaliana로부터 수집하였다. 기본 설정으로 Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 다중 서열 정렬(Multiple sequence alignment)을 수행했다. 계통수(phylogenetic tree)는 MEGA 소프트웨어(버전 7.0)로 neighbor-joining method를 사용하여 그려졌다. 부트스트랩 값(Bootstrap values)은 1000개의 부트스트랩 복제물로부터 계산되었으며 각 분기점(branch point)에 표시되었다. CaFIRF1 단백질의 계통수 분석 결과는 도 2에 도시하였다.
4. 세포 내 위치(Subcellular localization) 분석
세포 내에서 CaFIRF1 단백질의 위치를 확인하기 위해, 콜리 플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 포함하는 이원 벡터 p326-GFP에, 종결코돈이 없는 전장 CaFIRF1 cDNA를 삽입하여, 35S:CaFIRF1-GFP 작제물 (construct)을 제조하였다. 이어서 GFP-표지된 CaFIRF1를 도입한 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101을, 균주 p19 (1 : 1 비율, OD600 = 0.5)와 혼합하여 유전자 침묵을 방지한 후, 완전히 팽창된 4 주령의 담배잎에 함께 침투시켜, 상기 작제물의 일시적 발현을 유도하였다. 2일 내지 3일 후 공초점 현미경 (510 UV/Vis Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 GFP 신호를 관찰하였다.
5. 바이러스-유도성 유전자 침묵 (Virus-induced gene silencing, VIGS)
CaFIRF1-침묵 고추 식물은 담배얼룩바이러스(Tobacco rattle virus; TRV) 기반 바이러스 유도 유전자 침묵 시스템을 사용하여 생성했다. CaFIRF1-cDNA의 단편을 pTRV2 벡터에 삽입하고 동결-해동 방법(freeze-thaw method)을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 도입하였다. TRV2:CaFIRF1을 운반하는 형질전환된 아그로박테리아를 TRV1과 함께 고추의 완전히 자란 자엽 (fully expanded cotyledons)에 침투시켰다 (각 균주별 OD600=0.2). CaFIRF1의 경우는 cDNA의 212 bp 단편(서열번호 2의 268-479)이 pTRV2 벡터 구축물에 사용되었다. 음성 대조군으로는 TRV2:00 벡터가 사용되었다. 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.
클로닝, PCR, 및 VIGS에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타냈다.
| Primer | sequence (5'-3') | |
| For cloning | ||
| CaFIRF1 CDS (CA02g30250) |
Forward (서열번호 3) |
ATGGGTGGAAAGAGTTCAAGAGAG |
| Reverse (서열번호 4) |
TCAGTAGAGCTTTATTCGGGTTTG | |
| CAFIRF1 CDS (w/o stop codon) |
Forward (서열번호 5) |
CCCGAATAAAGCTCTACAAGGGCGAATTCGACCC |
| Reverse (서열번호 6) |
GGGTCGAATTCGCCCTTGTAGAGCTTTATTCGGG | |
| CaFIRF1CC (C441S/C444S) |
Forward (서열번호 7) |
GGTTGGTAAGGCTAATGGGGCTAACCTGATTGTCATATGTAGAA |
| Reverse (서열번호 8) |
TTCTACATATGACAATCAGGTTAGCCCCATTAGCCTTACCAACC | |
| CaFIRF1CH (C455S/H457Y) |
Forward (서열번호 9) |
CGCAACATGTCTGATACCCACTGCCGAAAGCCATGTC |
| Reverse (서열번호 10) |
GACATGGCTTTCGGCAGTGGGTATCAGACATGTTGCG | |
| For VIGS | ||
| CaFIRF1 VIGS | Forward (서열번호 11) |
TCTAGAAGGATTGCAGATAATTATAATTCC |
| Reverse (서열번호 12) |
CTCGAGGCCAAGGTTTTTCCAATTATAG | |
| For RT-PCR | ||
| CaFIRF1 RT | Forward (서열번호 13) |
TTCTACATATGACAATCAGGTTTGCC |
| Reverse (서열번호 14) |
TCAGTAGAGCTTTATTCGGGTTTG | |
| CaPP2A RT (CA11g01360) |
Forward (서열번호 15) |
GCTGCTAATAACTTAAAGCGTCTTG |
| Reverse (서열번호 16) |
TCTATCCTTAGTGGCAGTAACAACC | |
| CaOSR1 RT (CA03g17780) |
Forward (서열번호 17) |
ATGGAGGCACAACTGCACCGTC |
| Reverse (서열번호 18) |
GGCCCACCATGAACTTCTGCAC | |
| CaRAB18 RT (CA02g22060) |
Forward (서열번호 19) |
ATGTCGCACTACGAGAACCAATATAG |
| Reverse (서열번호 20) |
ATCATCCTCAGAGCTGCTGGAGC | |
| CaNCED3 RT (CA08g03620) |
Forward (서열번호 21) |
TTAAGGATCTTAAGCGTGGTTATGT |
| Reverse (서열번호 22) |
AGATTAGTTCAAGAACGTGAATTGG | |
| CaDREBLP1 RT (CA03g16520) |
Forward (서열번호 23) |
GGAATTTCAAAAGAATCATCTAGCA |
| Reverse (서열번호 24) |
AGCTAGAAGAGTACTGCATCCAAAA | |
| CaP5CS RT (CA06g06110) |
Forward (서열번호 25) |
ACAAGATTTAGTGATGGGTTCCGC |
| Reverse (서열번호 26) |
GCTGAAACACTTGTAATCCCAGGATA | |
6. 재조합 단백질 발현 및 정제
GST(glutathione) 또는 MBP(maltose binding protein) 융합 단백질을 발현시키기 위해 CaFIRF1의 전장 코딩 서열을 증폭하여 pGEX 4T-3(GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden) 및 pMAL-c2X(New England Biolabs) 벡터에 각각 삽입하였다. 이들 작제물은 대장균 균주 BL21(DE3)에 형질전환 되었다. 재조합 단백질은 BL21 세포에서 0.1 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)에 의해 유도되었다. 재조합 단백질은 제조사의 지침에 따라 GST 또는 MBP 융합 단백질에 대해 각각 글루타티온 세파로스 4 패스트 플로우(glutathione sepharose 4 fast flow; GE-healthcare Bio-Sciences) 및 아밀로스(New England Biolabs)를 사용하여 정제되었다.
7. 풀다운 분석(pull-down assay)
MBP가 태그된 CaFIRF1 또는 GST가 태그된 CaFIRF1 단백질은 대장균 균주 BL21(DE3)에서 발현되었다. 단백질 풀다운 분석을 위해, GST가 태그된 CaFIRF1 단백질은 프리-클리어된 MBP-태그 CaFIRF1 및 MBP와 함께 2시간 동안 배양되었다. 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA 및 0.5% Triton X-100)으로 5회 세척한 후, 샘플을 GST-용리 완충액(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 환원된 글루타티온) 및 4X Laemmli 단백질 버퍼와 혼합하였다. 이후 샘플을 끓인 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 적절한 항체가 존재함을 확인하였다.
8. RNA 추출 및 RNA 추출 및 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)
각 타겟 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해, Rneasy Mini 키트 (Qiagen, USA)를 사용하여 고추 잎으로부터 추출한 총 RNA를 사용했다. 모든 시료는 TRI-Reagent®-RNA/DNA/Protein 시약 (Molecular Research Center, USA)을 처리하여 DNA와 단백질을 제거한 후, 2-propanol을 처리하여 RNA를 침전시켰다. 주형을 위한 1 μg 총 RNA는 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader를 사용하여 정량화 되었다. cDNA는 iScriptTM cDNA synthesis kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 Transcriptor first strand cDNA synthesis kit(Roche)을 사용하여 합성하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQTMSYBR Green Supermix(Bio-Rad) 및 적절한 프라이머와 함께 FX96 TouchTM Real-Time PCR detection system (Bio-Rad)을 이용하여 증폭시켰다. 내부 대조군으로는 CaPP2A를 사용하였다. 각 반응은 세 번의 독립적인 실험으로 수행되었다.
9. 야생형 고추에 비생물학적 스트레스(ABA, 만니톨, 탈수 및 NaCl) 처리
각각 탈수(잎을 떼어 냄), 250 mM의 NaCl, 600 mM의 만니톨, 100 μM의 ABA을 처리한 야생형 고추 식물에서 CaFIRF1 유전자의 발현 패턴 변화를 확인하였다. 상기 탈수(건조) 스트레스 처리를 위해, 식물로부터 잎을 분리 및 회수하고, 3mm 여과 종이 위에서 두어 탈수시켰다. 각각의 처리 후 0, 2, 6, 12 및 24시간째에 잎을 회수하고, RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 실시하였다.
10. CaFIRF1
-
침묵 고추 식물에, ABA 및 건조(가뭄) 스트레스 처리, 염 스트레스 처리
3주령 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)을 무작위로 심은 후, 14일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그리고 회복되도록 3일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 식물체의 생존율을 계산하였다. 이때 CaFIRF1와 건조 스트레스 내성과의 연관성을 조사하기 위해, 증산 수분 손실(transpirational water loss)을 측정하였다. 이를 위해, 6엽기의 고추 식물로부터 분리 및 회수한 잎을 페트리접시 (petri-dish)에 놓았다. 상기 페트리접시를 40% 상대습도의 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.
염 스트레스는, 3주령 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2: CaFIRF1)을 200 mM NaCl 용액, 또는 250 mM NaCl 용액이 담긴 플라스틱 용기에서 20시간 이상 배양하는 방식으로 처리하였다.
11. 열화상 분석(Thermal imaging analysis) 및 기공개도(stomatal aperture)의 생물학적 정량
열화상 분석을 위해, 첫 번째와 두 번째 잎이 모두 자라는 3주된 고추 식물을 100 μM ABA로 처리하고, 열화상 이미지는 적외선 카메라(FLIR systems; T420)를 사용하여 얻었으며, 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.2 소프트웨어로 측정하였다.
기공개도(stomatal aperture)의 측정을 위해, 고추 잎에서 표피 껍질을 채취하고, 기공 개방 용액[SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH (pH 6.5), 10 μM CaCl2]에 부유시켰다. 3시간 동안 배양한 후, 완충액을 각각 0, 10 또는 20 μM의 ABA(Sigma, USA)를 포함하는 새로운 SOS로 교체하였다. 추가로 2.5시간 배양 후, 각각 개별 샘플에서 100개의 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경으로 무작위로 관찰하고, Image J 1.46r (http://imagej.nih.gov/ij)를 사용하여 기공의 너비와 길이를 측정하였다. 각 실험은 세 번 수행하였다.
12. 통계적 분석
통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test를 이용하여 수행되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차를 나타내며, P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다(*P<0.05, ***P<0.001).
실시예 1. CaFIRF1 유전자 및 단백질의 동정, 분자적 특성 분석
CaFIRF1의 cDNA는 1,455bp ORF(open reading frame)를 포함하고, 484 개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이들은 53.306 kD의 분자량, 5.59의 등전점 (pI; isoelectric point)을 가진 것으로 추정되었다.
ubiquitin-26S proteasome system에서 E3 ligase에 필수적인 C3H1C5-type RING finger 모티프는 CaFIRF1의 C-말단 부위에 위치함을 확인하였다. 또한, 아미노산 서열 정렬(sequence alignment)을 실시한 결과, CaFIRF1 단백질은 다른 RING type E3 ligase과 높은 상동성(70-89%)을 가지는 것을 확인하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, CaFIRF1 단백질은 RING finger motif를 포함하고 있으며, RING finger motif는 높은 상동성(82-97%)을 가지는 것을 확인하였다. 계통수 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
실시예 2. CaFIRF1 유전자의 식물 내 발현 패턴 확인
CaFIRF1 유전자의 조직 특이적 발현을 분석하기 위해, 성숙한 고추 식물의 다양한 조직으로부터 cDNA를 확보하여 qRT-PCR 분석을 수행했다. 그 결과, 모든 조직에서 CaFIRF1 유전자의 발현이 관찰됐으며, 특히 줄기 및 꽃에서 발현이 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
실시예 3. 비생물적 스트레스에 대한 CaFIRF1 유전자의 발현 양상 확인
탈수(잎을 떼어 냄), 250 mM의 NaCl, 600 mM의 만니톨, 100 μM의 ABA 처리 등 다양한 비생물학적 스트레스를, 야생형 고추 식물에 가한 후 CaFIRF1 유전자의 발현 변화를 확인했다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, ABA에 노출시 CaFIRF1 발현은 유의하게 유도되었고 6시간 후 최대 수준에 도달했다. 탈수 처리로 CaFIRF1 발현은 3-9시간까지 최대수준으로 유의하게 유도되었다. 상기 결과는 CaFIRF1 유전자가 ABA 의존 경로를 통하여 비생물 스트레스에 대한 적응 반응에 관여함을 의미한다. 또한 고염(250 mM NaCl) 스트레스에 노출 시에도, CaFIRF1 발현은 유의하게 유도되었고 12시간 후 최대 수준에 도달함을 확인하여, CaFIRF1이 염 스트레스 조절과 연관성이 있음을 확인하였다.
실시예 4. CaFIRF1의 세포 내 작용 위치 분석
CaFIRF1 단백질의 기능을 알아보기 위해서는 단백질의 세포 내 위치를 파악해야 하므로, 세포 내 국소화(subcellular localization) 실험을 수행했다. 웹-기반 툴인 WOLF-PSORT를 이용해 분석한 결과, CaFIRF1 단백질은 핵 및 세포질에 위치하는 것으로 예측됐다. 특히, GFP-태그된 CaFIRF1을 담배(Nicotiana benthamiana) 식물의 잎 표피세포에서 일시적으로 발현시켰을 때, GFP 형광 신호는 핵에서의 DAPI 신호와는 중첩되지 않았으며, 세포질에서만 관측됐다 (도 5). 특히, 상기 단백질의 국소화(localization)는 0.8 M의 만니톨 처리에 의한 표피세포의 원형질분리 유도를 통해 더욱 뒷받침되었다. 원형질 분리가 일어난 세포의 세포벽으로부터 희미해진 GFP 신호를 통해, CaFIRF1가 세포질 단백질임을 확인할 수 있었다.
실시예 5. CaFIRF1의 E3 ligase 활성 및 유비퀴틴 기능 확인
RING finger motif를 포함하는 E3 ligases는 생체 내에서 self-ubiquitination 활성을 나타내기 때문에, CaFIRF1 단백질이 E3 ligase로 기능하는지 확인하기 위해 각각 in vitro 및 in vivo 상에서 ubiquitination assay를 수행하였다. 35S:GFP 및 35S:CaFIRF1-GFP 융합단백질을 담배 (N. benthamiana) 잎에서 발현시켜, GFP-표지된 단백질을 정제하고, 정재된 융합단백질을 anti-GFP 및 anti-ubiquitin 항체를 사용하여 검출하였다.
도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, CaFIRF1-GFP 면역 블롯법을 통해 융합단백질의 유비퀴틴화 여부를 확인하였으며, CaFIRF1-GFP 발현 식물 세포에서 E3 ligase 활성을 나타내어, CaFIRF1이 E3 ubiquitin ligase로 작용함을 알 수 있었다.
실시예 6. CaFIRF1
-
침묵 고추 식물의 가뭄 스트레스 내성 증진 확인
VIGS 실험을 통해 실제 CaFIRF1 단백질이 가뭄 스트레스에 대해 식물에서 어떻게 반응하는지 관찰하였다. 먼저, CaFIRF1 유전자의 발현이 침묵된 고추 식물 (CaFIRF1-침묵 고추; TRV2:CaFIRF1)을 제조하고, CaFIRF1-침묵 고추에서 CaFIRF1 유전자 넉 아웃(knock-out)이 잘 된 것을 확인하였다.
이어서, CaFIRF1 유전자 침묵이 고추 식물의 가뭄 반응에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)에 14일간 급수를 중단하여 가뭄 스트레스를 가하고, 3일간 재급수하여 각 식물의 표현형 변화를 관찰했다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 정상 환경에서는 두 식물간에 표현형 차이가 없었으나, 14일 동안의 가뭄 스트레스를 가했을 때 음성 대조군에 비해 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)의 시들음 정도가 덜한 것을 확인하였다. 이와 같은 표현형 차이는 가뭄 스트레스 후 3일 동안 재급수한 뒤에 더욱 확연해졌다. 재급수 후의 생존율을 계산한 결과, 대조군 식물의 생존율은 23.4%에 불과한 반면 CaFIRF1-침묵 고추의 생존율은 57.8%에 달했다(도 7b).
CaFIRF1-침묵 고추의 가뭄(건조 스트레스) 저항성 증가가 수분 보유 능력의 변화에 의한 것인지 확인하기 위해, 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추에서 분리된 잎의 생중량 손실(fresh weight loss)을 측정했다. 그 결과, 같은 시점에서 CaFIRF1-침묵 고추 잎의 생중량은 대조군에 비해 더 높은 것으로 나타난 바, 수분 손실이 적게 일어난 것을 확인할 수 있었다 (도 7c).
식물은 증산작용에 의한 수분 손실을 방지하기 위해 기공을 닫는데, 식물 호르몬인 ABA가 기공 개폐를 조절한다. 따라서, 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추에 ABA를 처리한 뒤 기공개도를 관찰하였다. 그 결과, ABA를 처리하지 않았을 때에는 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추간에 기공 크기에 유의미한 차이가 없었으나, ABA를 처리한 뒤 기공 크기를 비교했을 때 대조군에 비해 CaFIRF1-침묵 고추 잎의 기공 크기가 현저히 작은 것을 관찰할 수 있었다(도 7d 및 도 7e). 이는 CaFIRF1-침묵 고추 잎에서 수분 손실이 적은 이유를 보여주는 결과이다.
잎의 기공이 닫히면, 수분 증발에 의한 냉각 효과가 감소하므로 잎 표면 온도가 증가한다. 이에, 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추에 ABA를 처리한 뒤 잎의 표면 온도를 관찰했다. 도 7f 및 도 7g 에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하였을 때 CaFIRF1-침묵 고추의 잎의 온도가 대조군에 비해 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
CaOSR1, CaNCED3, CaRAB18 및 CaDREBLP1과 같은 스트레스-관련 마커 유전자들의 발현이 식물체의 가뭄 스트레스 저항과 관련이 있음이 여러 연구를 통해 보고된 바, 고추에서의 CaFIRF1 발현 침묵이 상기 유전자들의 발현 변화를 유도하는지 확인했다. qRT-PCR을 통해 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추의 CaOSR1, CaNCED3, CaRAB18 및 CaDREBLP1 유전자 발현 수준을 확인한 결과, 모든 유전자가 대조군에 비해 CaFIRF1-침묵 고추에서 발현이 증가한 것으로 나타났다 (도 7h).
상기 결과들은 모두 식물에서 CaFIRF1 유전자의 발현 침묵이 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증진시킨다는 것을 보여준다. 즉, 상기 결과들은 CaFIRF1 유전자의 침묵이 기공을 통한 증발 수분 손실을 억제하고, 가뭄 스트레스 반응 유전자의 발현을 촉진함으로써 식물의 가뭄 스트레스 저항성을 향상시킨다는 것을 보여준다.
실시예 7. CaFIRF1
-
침묵 고추 식물의 염분 스트레스 내성 증가 확인
VIGS 실험을 통해 CaFIRF1 단백질이 염분(고염) 스트레스에 대해 식물에서 어떻게 반응하는지 관찰하였다.
먼저, 3주령의 음성 대조군(TRV2:00) 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물(TRV2:CaFIRF1)을 소금 용액에서 4일간 배양하여 염분 스트레스를 가한 후 표현형을 관찰했다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 고염 환경에서 CaFIRF1-침묵 고추 식물에 비해 대조군이 더 많이 시든 것으로 나타났다. 200 mM 또는 250 mM NaCl을 처리하였을 때 대조군 식물의 생존율은 각각 68.3%와 39.4%에 불과한 반면, CaFIRF1-침묵 고추의 생존율은 87.8%와 74.3%에 달했다(도 8b).
염분 스트레스는 전해질 누출 (electrolyte leakage) 및 지질 과산화 (lipid peroxidation)을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 CaFIRF1 유전자 침묵이 상기 두 가지 현상을 유도하는지 확인하기 위해, 3주령의 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물을 200 mM의 NaCl 용액에서 20시간 배양한 후, 전해질 누출 정도 및 지질 과산화 정도를 확인했다. 먼저 전해질 누출을 비교한 결과, 고염 스트레스를 가했을 때 대조군 식물에 비해 CaFIRF1-침묵 고추 식물에서 전해질 누출이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 8c). 또한, 지질 과산화에 의한 생성물인 말론알데히드(malondialdehyde, MDA) 함량 역시 대조군에 비해 CaFIRF1-침묵 고추 식물에서 현저히 감소한 것으로 나타났다(도 8d).
또한, 염분 스트레스는 프롤린 (proline) 생합성에 관여하는 유전자들의 발현을 촉진하여 프롤린 축적을 유도하는 것으로 알려져 있다. 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물에 염분 스트레스를 20시간 동안 가한 후, 두 식물에서 프롤린 함량을 비교했다. 그 결과, 도 8e에 나타낸 바와 같이, 염분 스트레스 처리 후 대조군에 비해 CaFIRF1-침묵 고추에서 프롤린 함량이 더욱 증가한 것을 확인할 수 있었다. 식물은 염 스트레스에 반응하여 아미노산의 일종인 proline을 축적 시킴으로써 삼투압 조절, 세포 구조의 안정화 및 활성 산소의 제거를 통하여 염 스트레스에 대해 내성을 부여한다. 따라서 CaFIRF1-침묵 고추에서 프롤린 함량이 증가한 것은 염 스트레스에 대한 내성이 강화 되었음을 의미한다.
분자 수준 및 생리적 수준에서 염분 스트레스 내성에 대한 CaFIRF1의 기능을 구체적으로 살펴보기 위해, 대조군 및 CaFIRF1-침묵 고추 식물에 염분 스트레스를 처리하고, 이에 따른 스트레스 관련 유전자 CaOSR1, CaRAB18 및 CaP5CS 유전자의 발현 변화를 확인했다. 도 8f에 나타낸 바와 같이, 고염 스트레스를 처리하였을 때 상기 유전자들의 발현은 대조군에 비해 CaFIRF1-침묵 고추에서 현저히 증가되어 있었다.
상기 결과들은 CaFIRF1 침묵(또는 발현 감소)은 스트레스 관련 유전자의 발현 및 세포막 안정성을 조절함으로써 염분 스트레스에 대한 식물체의 내성을 향상시킨다는 것을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
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drought and salt stress using CaFIRF1 in plants
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<210> 1
<211> 484
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CaFIRF1 protein
<400> 1
Met Gly Gly Lys Ser Ser Arg Glu Asp Ser Trp Arg Gln Thr Ser Ser
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Trp Asn Gln Tyr Glu Tyr Pro Pro Thr His Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Tyr Pro Gln Asp Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Gln Gln Gln
35 40 45
Ala Val Pro Ser Tyr Ala Pro Pro Pro Pro His Gln Gln Ala Val Pro
50 55 60
Ser Tyr Ala Pro Ala Pro Pro Gln Gln Asn Tyr Ala Ser His Ala Ser
65 70 75 80
Arg Pro Arg Leu Asp Arg Arg Tyr Ser Arg Ile Ala Asp Asn Tyr Asn
85 90 95
Ser Leu Asp Glu Val Thr Glu Ala Leu Ala Arg Ala Gly Leu Glu Ser
100 105 110
Ser Asn Leu Ile Val Gly Ile Asp Phe Thr Lys Ser Asn Glu Trp Thr
115 120 125
Gly Lys Arg Ser Phe Gly Asn Arg Ser Leu His His Ile Gly Gln Asn
130 135 140
Leu Asn Pro Tyr Glu Gln Ala Ile Ser Ile Ile Gly Lys Thr Leu Ala
145 150 155 160
Ala Phe Asp Glu Asp Asn Leu Ile Pro Cys Phe Gly Phe Gly Asp Ala
165 170 175
Ser Thr His Asp Gln Asp Val Phe Ser Phe Phe Pro Asp Glu Arg Phe
180 185 190
Cys Asn Gly Phe Glu Glu Val Leu Phe Arg Tyr Arg Glu Ile Val Pro
195 200 205
Gln Leu Lys Leu Ala Gly Pro Thr Ser Phe Ala Pro Val Ile Glu Met
210 215 220
Ala Met Thr Ile Val Glu Gln Ser Gly Gly Gln Tyr His Val Leu Leu
225 230 235 240
Ile Ile Ala Asp Gly Gln Val Thr Arg Ser Val Asp Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Gln Leu Ser Pro Gln Glu Gln Lys Thr Val Asp Ala Ile Val Gln Ala
260 265 270
Ser Lys Phe Pro Leu Ser Ile Ile Leu Val Gly Val Gly Asp Gly Pro
275 280 285
Trp Asp Met Met Lys Glu Phe Asp Asp Asn Ile Pro Ala Arg Asp Phe
290 295 300
Asp Asn Phe Gln Phe Val Asn Phe Thr Glu Ile Met Ala Lys Asn Val
305 310 315 320
Pro Gln Ser Arg Lys Glu Thr Glu Phe Ala Leu Ser Ala Leu Met Glu
325 330 335
Ile Pro Ser Gln Tyr Lys Ala Thr Met Glu Leu His Leu Leu Gly Gly
340 345 350
Gln Ser Gly Lys Ser Pro Ser Arg Val Ala Leu Pro Pro Pro Met Tyr
355 360 365
Gly Ala Thr Ser Val Gly Ala Ser Lys Pro Ser Arg Ala Thr Ser Phe
370 375 380
Gln Gln Pro Thr Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ser Pro Ala Asp Ala
385 390 395 400
Ala Pro His Phe Gln Gln Thr Ser Ser Ser Tyr Tyr Asn Ser Ala His
405 410 415
Pro Val Asp Thr Val Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Tyr Ile Ala Pro
420 425 430
Ser Ser Thr Tyr Asp Asn Gln Val Cys Pro Ile Cys Leu Thr Asn Pro
435 440 445
Lys Asp Met Ala Phe Gly Cys Gly His Gln Thr Cys Cys Asp Cys Gly
450 455 460
Arg Ala Leu Glu Asn Cys Pro Ile Cys Arg Ser Ser Ile Gln Thr Arg
465 470 475 480
Ile Lys Leu Tyr
<210> 2
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of CaFIRF1 CDS
<400> 2
atgggtggaa agagttcaag agaggatagt tggaggcaaa catcatcgac tagatcttct 60
tggaatcaat acgaatatcc tccaactcac tcatcatcat cttcttatcc tcaagatagt 120
tatagttatt catctcagca gcaggctgtt ccttcctatg cacctccacc accccaccag 180
caagctgttc cttcctatgc acctgcacca ccccaacaga attatgcctc tcatgcttca 240
agaccgaggc ttgaccggag atactcgagg attgcagata attataattc cctggatgag 300
gtgactgaag cccttgcacg agctggctta gagtcttcga atctaattgt tggtatcgat 360
ttcaccaaga gcaatgaatg gacaggtaag aggtcttttg gtaatcggag cctacatcac 420
attgggcaga atttgaaccc ctatgagcaa gcaatttcta taattggaaa aaccttggca 480
gcatttgatg aggataactt gattccgtgt tttggattcg gagatgcatc aactcatgat 540
caagatgtat tcagtttctt tcccgatgaa aggttttgta atggctttga ggaagttctg 600
tttcgttaca gagaaattgt tccccagttg aagcttgcag gacccacgtc atttgcccca 660
gtcattgaaa tggccatgac aatagttgag cagagtggag gccagtacca tgttctatta 720
atcatcgcag atgggcaggt aactagaagt gttgataccg gacgtggaca attaagtccc 780
caggagcaga aaacggtgga tgcaattgta caagcaagca agtttccctt gtcaattata 840
ctggttgggg ttggcgatgg accctgggat atgatgaagg aatttgatga taatattcct 900
gctcgggact ttgataattt ccagtttgtc aatttcacgg agatcatggc caaaaatgtg 960
cctcaatctc gaaaggagac ggagtttgct ctttcagcgt tgatggaaat cccttcacaa 1020
tataaagcga cgatggaact gcacctactg ggtgggcaaa gtggaaaatc tcccagtagg 1080
gtagctcttc cccctcctat gtatggggca acttctgtcg gtgcttcaaa gccctcgcgt 1140
gcaacgagtt ttcagcagcc tacaagctct tattatggtt atggaagccc tgcagatgca 1200
gctccgcatt ttcagcagac ttcaagttct tattataata gtgctcaccc agttgacact 1260
gttccatctg ctcctagctc tccctacatt gctcccagtt ctacatatga caatcaggtt 1320
tgccccattt gccttaccaa cccaaaagac atggctttcg gctgtgggca tcagacatgt 1380
tgcgattgcg ggagagcgct tgagaattgt ccaatatgtc gaagttcaat tcaaacccga 1440
ataaagctct actga 1455
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaFIRF1 CDS (CA02g30250)
<400> 3
atgggtggaa agagttcaag agag 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaFIRF1 CDS (CA02g30250)
<400> 4
tcagtagagc tttattcggg tttg 24
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CAFIRF1 CDS (w/o stop codon)
<400> 5
cccgaataaa gctctacaag ggcgaattcg accc 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CAFIRF1 CDS (w/o stop codon)
<400> 6
gggtcgaatt cgcccttgta gagctttatt cggg 34
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaFIRF1 CC (C441S/C444S)
<400> 7
ggttggtaag gctaatgggg ctaacctgat tgtcatatgt agaa 44
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaFIRF1 CC (C441S/C444S)
<400> 8
ttctacatat gacaatcagg ttagccccat tagccttacc aacc 44
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaFIRF1 CH (C455S/H457Y)
<400> 9
cgcaacatgt ctgataccca ctgccgaaag ccatgtc 37
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaFIRF1 CH (C455S/H457Y)
<400> 10
gacatggctt tcggcagtgg gtatcagaca tgttgcg 37
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaFIRF1 VIGS
<400> 11
tctagaagga ttgcagataa ttataattcc 30
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaFIRF1 VIGS
<400> 12
ctcgaggcca aggtttttcc aattatag 28
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaFIRF1 RT
<400> 13
ttctacatat gacaatcagg tttgcc 26
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaFIRF1 RT
<400> 14
tcagtagagc tttattcggg tttg 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaPP2A RT (CA11g01360)
<400> 15
gctgctaata acttaaagcg tcttg 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaPP2A RT (CA11g01360)
<400> 16
tctatcctta gtggcagtaa caacc 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaOSR1 RT(CA03g17780)
<400> 17
atggaggcac aactgcaccg tc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaOSR1 RT(CA03g17780)
<400> 18
ggcccaccat gaacttctgc ac 22
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaRAB18 RT (CA02g22060)
<400> 19
atgtcgcact acgagaacca atatag 26
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaRAB18 RT (CA02g22060)
<400> 20
atcatcctca gagctgctgg agc 23
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaNCED3 RT (CA08g03620)
<400> 21
ttaaggatct taagcgtggt tatgt 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaNCED3 RT (CA08g03620)
<400> 22
agattagttc aagaacgtga attgg 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaDREBLP1 RT(CA03g16520)
<400> 23
ggaatttcaa aagaatcatc tagca 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaDREBLP1 RT(CA03g16520)
<400> 24
agctagaaga gtactgcatc caaaa 25
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CaP5CS RT (CA06g06110)
<400> 25
acaagattta gtgatgggtt ccgc 24
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CaP5CS RT (CA06g06110)
<400> 26
gctgaaacac ttgtaatccc aggata 26
Claims (12)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaFIRF1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 CaFIRF1 단백질의 발현 억제는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제9항의 방법에 의해 건조 또는 염 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
- 제11항에 있어서,
상기 형질전환 식물체는 고추인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220067229A KR102555526B1 (ko) | 2022-05-31 | 2022-05-31 | CaFIRF1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220067229A KR102555526B1 (ko) | 2022-05-31 | 2022-05-31 | CaFIRF1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102555526B1 true KR102555526B1 (ko) | 2023-07-13 |
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ID=87160320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220067229A KR102555526B1 (ko) | 2022-05-31 | 2022-05-31 | CaFIRF1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102555526B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101335440B1 (ko) | 2012-04-04 | 2013-11-29 | 강원대학교산학협력단 | 식물의 내염성을 증가시키는 벼 유래의 ＯｓＲＩＮＧＣ2 유전자 및 이의 용도 |
| KR20180039212A (ko) * | 2016-10-07 | 2018-04-18 | 중앙대학교 산학협력단 | 고추 E3 ligase CaREL1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
| KR101926961B1 (ko) * | 2017-02-13 | 2018-12-07 | 중앙대학교 산학협력단 | 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaDIR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
| CN111996181A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-11-27 | 中国农业大学 | Drk蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用 |
-
2022
- 2022-05-31 KR KR1020220067229A patent/KR102555526B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101335440B1 (ko) | 2012-04-04 | 2013-11-29 | 강원대학교산학협력단 | 식물의 내염성을 증가시키는 벼 유래의 ＯｓＲＩＮＧＣ2 유전자 및 이의 용도 |
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| KR101926961B1 (ko) * | 2017-02-13 | 2018-12-07 | 중앙대학교 산학협력단 | 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaDIR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 |
| CN111996181A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-11-27 | 中国农业大学 | Drk蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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| Journal of Integrative Plant Biology, Vol.63, No.3, pp.484-493. * |
| NCBI GenBank Accession No. XM_016706159 (2022. 4. 5.)* * |
| NCBI GenBank Accession No. XP_016561645 (2022. 4. 5.)* * |
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