KR101270231B1 - 식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 ＡｔＳＺＦ2 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtSZF2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법, 애기장대 유래 AtSZF2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 애기장대 유래 AtSZF2 유전자를 포함하는 식물의 염 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 ＡｔＳＺＦ2 유전자 및 이의 용도{AtSZF2 gene increasing salt stress resistance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 AtSZF2 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtSZF2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법, 애기장대 유래 AtSZF2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 애기장대 유래 AtSZF2 유전자를 포함하는 식물의 염 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물에 관한 것이다.

콩은 사료 작물로서 염분 농도가 0.2% 토양 조건에서 건물 수확량이 69~77% 수준이며, 0.3% 이상인 토양 조건에서는 염 피해가 심해 수확량이 크게 감소한다. 식물이 염 스트레스를 받으면 세포의 대사와 이온의 항상성을 억제하는 작용을 하기 때문에 아주 치명적이다(Zhu et al., 2003, Curr. Opin. Plant Biol. 6: 441-445). 토양에 염이 일정 수준 이상 축적되면 식물은 뿌리를 통해 수분을 흡수하지 못하게 되고 식물 세포의 대사 활동에도 타격을 입게 된다. 따라서 염의 농도가 높으면 높을수록 식물로 흡수되는 수분의 양이 감소하기 때문에 작물의 생산량이 감소하며 결국 작물이 말라 죽게 된다.

작물은 가뭄(drought), 염(salt) 및 저온(cold)과 같은 환경 스트레스에 민감하여 이로 인한 피해는 곧 바로 작물의 생산성 감소로 이어진다(Ma et al. 2006, J. Exp. Bot. 57: 1097-1107). 그러나 식물은 외부 환경 스트레스에 반응하는 자체 유전자를 가지고 있어 외부 및 내부 스트레스에 대해 다양한 유전자를 발현시킴으로써 변화된 환경에 적응하며 살아간다(Hasegawa et al. 2000, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. 51: 463-499).

최근 많은 연구자들은 환경 스트레스에 대한 유전자들의 기능에 관심을 가지며 활발히 연구하고 있고, 많은 육종가들은 교배를 통해 품종 개량을 하여 내염성 작물을 개발하고자 많은 시도를 하고 있다. 기존의 품종개량 기술은 각각 원하는 특성을 지난 유사한 종들을 교배하여 생성된 잡종 중 목적하는 품종만을 찾아내는 것으로, 한 품종을 개발하기 위해서는 많은 시행착오와 시간이 소요되는 것이 일반적이다. 이에 비해 유전자재조합 기술은 원하는 특성을 지닌 유전자를 다른 생물체에 직접 삽입함으로써 목적하는 품종만을 바로 얻을 수 있다. 또한 삽입하고자 하는 유전자는 같은 생물종에서뿐만 아니라 서로 다른 생물종에서도 얻을 수 있어, 품종개량의 폭이 넓은 것이 특징이며, 종래의 품종개량에 비하여 그 소요시간이 짧다는 것 또한 장점이다.

현재 유전자변형 작물에 대해 논란은 많지만 전 세계적으로 시장이 확대되고 있다. 1980년대부터 미국을 중심으로 형질전환기술이 꾸준히 개발되었고, 유전자변형 콩이 생산된 지 15년 이상이 되었다. 많은 유전자의 도입이 형질전환을 통해 시도되었고, 그 중에서도 글리포세이트(glyphosate)와 같은 제초제에 대한 저항성 및 해충 저항성이 농업적으로 널리 활용되고 있다(Stewart et al., 1996, Plant Physiol 112: 121-129). UN에 따르면, 세계 인구는 1997년 60억 명, 2000년 62억 명, 2010년 70억 명, 앞으로도 계속 증가하여 2070년에는 100억 명에 이를 것으로 추정되고 있다. 이러한 인구 증가로 세계의 식량 수요도 계속 증가할 것이기 때문에 유전자변형 작물의 개발은 반드시 필요하다. 따라서 분자 육종 기술을 토대로 스트레스 저항성 유전자의 조절을 통한 저항성 작물을 개발하려는 연구가 진행되고 있으며, 새로운 작물의 개발은 곧 전체 생산량의 증가를 가져올 것으로 기대하고 있다.

형질전환 효율을 높이기 위한 연구는 미국을 중심으로 여러 연구실에서 경쟁적으로 진행되어 다양한 처리 조건과 실험 조건이 개선되면서 고효율의 형질전환 기술이 개발되었다(Paz et al., 2005, Plant Cell Rep 25: 206-213). 미국의 몇몇 실험실에서 개발된 고효율의 형질전환 기술은 기존에 사용하던 방법에 새로운 보완을 하여 이루어졌다. 국내의 경우 다른 작물과 달리 콩에 있어서는 안정적이며 고효율인 형질전환 기술을 확립하지 못하였으며, 일부 실험실에서 부분적인 성공사례는 있었으나 지속적인 결과 도출에는 실패하였다.

AtSZF2 유전자는 염 스트레스에 의하여 유도되는 전사 인자(transcription factor)로서 이 유전자를 식물에 형질전환하면 스트레스 때에 작용하는 많은 유전자들이 활성화되어 결과적으로 식물이 스트레스에 대해 저항성을 가지게 되는 것이다. 상기 유전자는 C₃H-형 징크 핑거(C₃H-type zinc finger) 단백질로 애기장대(Arabidopsis)에서의 염 스트레스 반응에 관련이 있으며, NaCl 처리에 의해 빠르게 일시적으로 유도된다(Sun et al., 2007, Plant cell Physiol. 48(8): 1148-1158).

유전자를 분리하고 기능을 밝히는 연구는 많이 이루어지고 있지만 실질적으로 작물에 다른 종의 유전자를 형질전환하여 저항성을 나타내는 형질전환체를 생산하는 것은 어렵다. 특히 형질전환 자체가 어려운 콩에 있어서는 더욱 그렇다. 염 스트레스에 관련된 유전자를 생명공학 기술을 이용하여 복제(copy) 수가 1개인 형질전환체를 생산하여, 형질전환체가 염 스트레스에 저항성을 보인다는 보고는 없었다.

한국등록특허 제10-1052565호에는 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 콩 유래 RNA 헬리카제 유전자가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-1049874호에는 식물체의 내염성을 증가시키는 감자 유래의 StMyb 유전자가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 유래 AtSZF2 유전자를 이용하여 형질전환시킨 콩에서 염 스트레스에 대한 저항성이 증가한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtSZF2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 AtSZF2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 AtSZF2 유전자를 포함하는 식물의 염 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 이용하면 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 콩 식물체를 제조할 수 있으므로, 콩의 생산량 증대 및 식량 수요의 충족에 유용할 것으로 사료된다.

도 1은 콩 형질전환 벡터를 나타내는 모식도이다.
도 2는 AtSZF2 유전자가 삽입된 콩 형질전환체의 생장 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 AtSZF2 유전자의 삽입 여부를 알아보기 위해 수행한 PCR 결과를 나타낸 것이다. 각각의 숫자는 형질전환체 라인을 나타낸다. M: 마커(marker), PC: 양성 대조군(positive control), WT: 야생형(wildtype), EV: 공벡터(empty vector).
도 4는 AtSZF2 유전자의 삽입 여부를 알아보기 위해 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 각각의 숫자는 형질전환체 라인을 나타낸다. WT: 야생형(wildtype).
도 5는 AtSZF2 유전자의 삽입 여부를 알아보기 위해 수행한 서던 블로팅 결과를 나타낸 것이다. 각각의 숫자는 형질전환체 라인을 나타낸다. WT: 야생형(wildtype).
도 6은 염화나트륨의 처리 시간(0, 4, 7, 11, 14 및 16일)에 따른 야생형 및 형질전환 식물체 잎의 표현형(A) 및 클로로필 함량(B)을 나타낸 것이다. WT: 야생형(wildtype), EV: 공벡터(empty vector), 4 및 6: 형질전환체 라인.
도 7은 염화나트륨의 처리 시간(0, 1, 3, 5, 7 및 10일)에 따른 야생형 및 형질전환 어린 식물체의 표현형(A), 이온 누출률(Ion leakage)(B) 및 클로로필 함량(C)을 나타낸 것이다. WT: 야생형(wildtype), EV: 공벡터(empty vector), 4 및 6: 형질전환체 라인.
도 8은 염 스트레스와 관련된 마커 유전자의 발현을 나타낸 것이다. 각각의 숫자는 형질전환체 라인을 나타낸다. WT: 야생형(wildtype), EV: 공벡터(empty vector), GmDREB2: Glycine max dehydration responsive element binding 2, GmDREB3: Glycine max dehydration responsive element-binding protein 3, GmOLPb: Glycine max Osmotin-Like Protein b, GmERF3: Glycine max AP2/ERF(ethylene response factor) type transcription factor, GmPHD2: Glycine max GmPHD(plant-homeo-domain)-type transcription factor 2, GmGT-2A: Glycine max trihelix transcription factor(GT-2A), GmGT-2B: Glycine max trihelix transcription factor(GT-2B), GmbZIP62: Glycine max basic/leucine zipper protein 62, GmWRKY54: Glycine max WRKY-type transcription factor 54, 18S: Glycine mas 18S ribosomal RNA.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtSZF2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 AtSZF2 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 AtSZF2 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

AtSZF2 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜메파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, AtSZF2 유전자는 전술한 바와 같다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 대두(Glycine max)이다.

상기 쌍자엽 식물은 콩과(Leguminosae), 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는, 식물의 염 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 AtSZF2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 AtSZF2 유전자를 포함하며, 상기 AtSZF2 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

콩 형질전환 벡터 제작

포항공대 제노마인에서 Entry-AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2)를 분양받았다. 상기 분양받은 Entry-AtSZF2를 목적 벡터(Destination vector)인 pB2GW7.0에 삽입하기 위해서 invitrogen사의 Gateway^® LR Clonase^TM Enzyme mix Kit를 사용하였다. 그 다음 invitrogen사의 DH5α를 컴피턴트 세포(competent cell)를 사용하여 형질전환하였다. 상기 제조된 pB2GW7.0- AtSZF2 벡터는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주에 형질전환하였다.

콩 형질전환체 생산 및 T ₁ 종자 생산

종자 소독 및 침지

종자는 강염산(12 N HCl 5 ㎖)과 락스(12% 차아염소산나트륨 100 ㎖)를 혼합하여 발생시킨 염소 기체에 20시간 동안 소독을 한 뒤 1% 차아염소산나트륨에서 10분간 교반하면서 2차 소독을 하였다. 그 후 10분 간격으로 멸균수로 3회 세척하였다. 상기 소독한 종자를 50 ㎖ 튜브에 넣고 멸균수를 부어 20시간 동안 상온에서 침지시켰다.

아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens )의 준비

pB2GW7.0- AtSZF2 벡터가 삽입된 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105 균주를 사용하였다. 상기 균주를 고체 YEP 배지(스펙티노마이신 50 ㎎/ℓ, 리팜피신 25 ㎎/ℓ, 펩톤 10 g/ℓ, 염화나트륨 5 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, 한천 1.5 % (w/v), pH 7.0)에 스트리킹(streaking)한 후 25℃에서 배양하여 생성된 단일 콜로니를 같은 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 10 ㎖에 넣고 OD₆₅₀ 0.8이 될 때까지 25℃에서 250 rpm으로 교반하였다. 상기 다 자란 배양액에 30% 글리세롤 저장용액을 10 ㎖ 넣고 볼텍싱한 뒤, 1.5㎖ 튜브에 1㎖씩 분주하여 액체 질소로 급속 냉각한 다음 -70℃에서 보관하였다. 접종 하루 전에, 상기 보관해 놓은 아그로박테리움 튜메파시엔스(컴피턴트 세포) 1㎖를 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 200㎖에 넣고 OD₆₅₀이 0.8~1.0이 될 때까지 25℃에서 250 rpm으로 교반하였다.

접종 당일에 액체 YEP 배지 200 ㎖을 50 ㎖씩 나눠서 20℃, 3,270×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각각의 튜브에 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스 펠렛을 액체 공배양 배지(B5 염 0.32 g/ℓ, 벤질아데닌 1.67 ㎎/ℓ, MES(N-morpholinoethane sulphonic acid) 20 mM, 지베렐린산(gibberellic acid) 0.25 ㎎/ℓ, 아세토시린곤(acetosyringone) 0.2 mM, L-시스테인 3.3 mM, 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate) 1.0 mM, DTT 1.0 mM, 수크로스 3% 및 pH 5.4)에 고농도 및 저농도로 나누어 부유시켰다. 상기 고농도 농축액은 액체 공배양 배지를 5 ㎖ 넣고, 저농도는 액체 공배양 배지를 15 ㎖ 넣어 만들었다.

접종 및 공배양

침지해 놓은 종자의 양 떡잎 사이로 수술용 칼(scalpel)을 넣어 하배축까지 수직으로 자르고 종피를 제거하였다. 배축(Hypocotyl)을 떡잎 밑 약 1 ㎝ 되는 곳에서 자른 후, 배축이 붙어있는 한 쪽을 수술용 칼(＃11 칼날)로 8~10회 정도 상처를 내었다. 이 때 수술용 칼에 5 ㎖ 농축액을 묻힌 다음 타겟 부위에 상처를 내었다. 대략 50개 정도의 외식편(explant)을 15 ㎖ 농축액이 든 튜브에 넣고 초음파 처리 20초, 데시케이터 및 다이어프램 펌프를 이용한 진공 처리를 30초 동안 한 뒤 30분 동안 접종시켰다.

상기 외식편을 튜브에서 꺼내 멸균한 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤, 고체 공배양 배지(액체 공배양 배지와 동일, 한천 0.5 %)에도 여과지를 한 장 깔고 향배축면을 아래로(adaxial side down) 10개체를 올려두었다. 미세공(micropore)으로 봉한 뒤 25℃, 18시간의 광주기에서 5일 동안 공배양 하였다.

세척 및 신초 유도

5일간 공배양(co-cultivation) 후에 제균을 위해서 액체 1/2 신초 유도배지(B5 염 1.6 g/ℓ, 벤질아데닌 835 ㎕/ℓ, MES 1.5 mM, 수크로스 1.5 %, 세포탁심 250 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린(ticarcillin) 100 ㎎/ℓ 및 pH 5.6)에 10분 동안 간단히 세척하였다. 외식편을 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤 선발 항생제가 없는 신초 유도배지-①(B5 염 3.2 g/ℓ, 벤질아데닌 1.67 ㎎/ℓ, MES 3 mM, 한천 0.6 %, 수크로스 3 %, 세포탁심 250 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린 100 ㎎/ℓ 및 pH 5.6)에 한 플레이트당 5개체씩 배축 부분이 배지에 고착되고 재분화될 부분이 30℃ 정도의 각도로 평평한 면이 위로 향하도록(flat side up) 치상하였다. 각각의 플레이트를 미세공으로 봉한 뒤 25℃, 18시간의 광주기에서 배양시켰다.

2주 후 신초가 나온 외식편을 선발 항생제가 들어있는 신초 유도배지-②(B5 염 3.16 g/ℓ, MES 3 mM, 벤질아데닌 1.67 ㎎/ℓ, 수크로스 3 %, 한천 0.6 %, 세포탁심 500 ㎎/ℓ, DL-포스피노트리신(DL-phosphinothricin) 10 ㎎/ℓ 및 pH 5.6)에 치상하였는데, 이 때 신초을 제외한 나머지 부분은 잘라버리고 향배축면을 아래로(adaxial side down) 치상하였다.

신초 신장

2주 후 갈변한 신초/신초 패드(pad)는 수술용 칼(＃15 칼날)로 깎아내고 선발 항생제가 들어있는 신초 신장배지(MS 염 4.4 g/ℓ, MES 3 mM, 지베렐린산 0.5 ㎎/ℓ, 아스파라긴 50 ㎎/ℓ, 피로글루타민산(Pyroglutamic acid) 100 ㎎/ℓ, 인돌아세트산 0.1 ㎎/ℓ, 제아틴-리보시드(Zeatin-riboside) 1 ㎎/ℓ, 수크로스 3 %, 한천 0.8 %, 세포탁심 250 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린 100 ㎎/ℓ, DL-포스피노트리신 5 ㎎/ℓ, pH 5.6)에 치상하였다. 2주마다 새로운 신초 신장배지로 옮겨주면서 신초의 갈변 부위는 수술용 칼(＃15 칼날) 윗면으로 제거하고 신초 패드는 조금씩 계속 깎아내어 배지가 잘 흡수되도록 하였다.

뿌리 형성 및 잎 페인팅( leaf painting )

신초 신장배지에서 선발을 거치면서 신장된 신초가 4 ㎝ 이상 일 때 수술용 칼(＃11 칼날)로 잘라 발근배지(MS 염 4.4 g/ℓ, MES 3 mM, 아스파라긴 25 ㎎/ℓ, 피로글루타민산 25 ㎎/ℓ, 수크로스 3 %, 한천 0.8 %, 세포탁심 50 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린 50 ㎎/ℓ, pH 5.6)로 옮겼다. 이때 잘라서 분리해낸 신장된 신초의 밑 부분을 1 ㎎/㎖ 인돌부틸산에 3분 동안 담가뒀다가 빼내어 발근배지가 들어있는 시험관에 넣었다. 1~2주가 경과한 후 2개 이상의 뿌리가 나오면 3차 증류수로 배지를 씻어내고 상토(바이오 프러그 2호, 흥농종묘)와 버미큘라이트를 2:1로 섞어 넣은 작은 화분(6 ㎝ × 6 ㎝ × 5.6 ㎝)에 심었다. 상기 화분은 다시 마젠타 박스(Magenta box) 안에 넣어 25℃, 18시간의 광주기에서 생장시켰다. 10일 정도 경과 후 100 ㎎/ℓ DL-포스피노트리신으로 잎 페인팅(leaf painting)을 하였다.

종자수확

잎 페인팅으로 유전자 도입을 확인한 식물체를 큰 화분(20 ㎝ × 20 ㎝ × 20 ㎝)으로 옮겨 심고 투명한 플라스틱 덮개(12 ㎝ × 12 ㎝ × 18 ㎝)에 10개의 작은 구멍을 만들어 씌운 후 식물체가 적당히 자랐을 때 덮개를 제거하고 종자를 수확하였다.

삽입 유전자의 도입 확인

PCR 및 서던 분석

형질전환체들의 잎은 CTAB(certyltrimethyl-ammonium bromide) 방법을 통해서 총 게놈 DNA를 분리하였다. 도입 유전자인 AtSZF2와 선별항생제 유전자인 BAR의 서열을 이용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다. AtSZF2-F (5'-GCA GAC GGG TCG GGT CTA AGA AGA -3'; 서열번호 2) 및 AtSZF2-R (5'-CTT GTC TCT ACT CGC TGC ACC ATT3'; 서열번호 3), BAR -F (5'-ATG AGC CCA GAA CGA CGC CC-3'; 서열번호 4) 및 BAR -R (5'-TCA GAT TTC GGT GAC GGG CA-3'; 서열번호 5)이다.

또한 T-DNA의 삽입 여부를 알아보기 위해 LB(left board) 및 RB(right board) 부분도 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다. LB 부분은 left board-F (5'-TGG CTG GTG GCA GGA TAT ATT GTG-3'; 서열번호 6) 및 BAR-R (5'-AGA CAA GCA CGG TCA ACT TCC GTA-3'; 서열번호 7)를 사용하고 RB 부분은 AtSZF2-F (5'-CAG TCT CCT GAG ATG TCT GTT ATG-3'; 서열번호 8) 및 right board-R (5'-TTA AAC TGA AGG CGG GAA ACG ACA-3'; 서열번호 9)를 사용하였다.

광안콩(야생형) 및 형질전환체로부터 분리한 5 ㎍ 게놈 DNA를 제한효소를 이요하여 밤새 절단(overnight digestion)하였고, 상기 절단한 DNA를 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동하였다. 상기 분리된 DNA를 Hybond-N⁺ 나일론 막(Amersham Pharmacia, Piscataway, USA)으로 이동시켰다. 그 후, 비오틴-표지(Biotin-labeled) TPSP와 대두(soybean) AtSZF2 유전자 프로브를 이용하여 프로빙하였다. DNA 프로브 준비는 Nick Translation System(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 수행하였다. 상기 비오틴-표지된 DNA는 스트렙타비딘 알칼라인 포스파타제(streptavidin alkaline phosphatase)와 CDP-Star^®(Applied Biosystems, Bedford, MA)를 이용하여 화학발광을 통해 확인하였다.

RT - PCR

Plant RNA Purification Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 광안콩(야생형) 및 형질전환체의 잎에서 총 RNA 추출하였다. RT-PCR은 Maxime RT-PCR PreMix (iNtRON, KOREA)를 이용하였다. 도입유전자인 AtSZF2 , 선별유전자인 BAR 및 비생물적 스트레스-반응(abiotic stress-responsive) 마커 유전자의 전사 수준을 알아보기 위해 반정량 RT-PCR을 수행하였다.

염 스트레스 처리

광안콩 및 형질전환체의 종자를 rock wools(urmedia, Korea)에 발아시켜서 식물생장 단계(vegetative stage 2, V2-stage)까지 키웠다. 실험은 잎과 어린 식물에서 각각 수행되었다. 잎의 경우, V2-단계까지 자란 어린 식물체에서 1-마디(1-node)의 잎을 분리하여 200 mM 염화나트륨 용액이 든 플레이트에 16일 동안 띄운 후 잎 상태를 관찰하였다. 어린 식물의 경우, V2-단계까지 자란 식물체를 200 mM 염화나트륨 용액이 포함되어 있는 호아글란드 용액(Hoagland's solution)에 담구고 10일 동안 관찰하였다.

이온 누출률( Ion leakage ) 측정

이온 누출률의 측정은 Lee 등(2007, plant physiology, 164, 1626-1638)의 방법에 따라 수행되었다. 서로 다른 기간 동안 염 스트레스(200 mM 염화나트륨)를 받은 어린 식물체의 2-마디에서 잎을 분리하였다. 상기 분리한 잎을 10 mL 멸균수가 들어 있는 플레이트에 24시간 동안 담가두었다. 하루가 지난 후 플레이트에 있는 용액을 전도도계(Conductivity meter) (Model EC-400L, istek, Korea)로 측정하였다. 상기 측정값을 A라고 한다.

플레이트에 있는 용액과 용액 안에 있는 잎을 100℃에서 20분간 가열하였고 식힌 다음, 플레이트에 있는 용액을 다시 전도도계(Model EC-400L, istek, Korea)로 측정하였다. 상기 측정값을 B라고 한다. 이온 누출률은 하기와 같이 계산하였다.

(측정값 A/측정값 B) × 100.

클로로필 함량 측정

0.1 g 잎을 액체 질소에서 막자사발을 이용해서 분쇄한 후 80% 아세톤 1 ml 넣고 25℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 상등액은 분광광도계를 이용하여 A663 및 A643에서 측정하였다. 클로로필 함량은 Arnon (1949, plant physiology, 24, 1-15)의 방법으로 수행하였다.

실시예 1: 형질전환 벡터 및 형질전환체의 생산

게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용해서 분양받은 AtSZF2 유전자를 pB2GW7.0 벡터를 넣어서 형질전환용 벡터를 제작하였다(도 1). AtSZF2 유전자가 삽입된 형질전환체는 식물의 분화를 거쳐 11개의 형질전환체를 생산하였다(도 2).

T₀ 형질전환체에서 삽입 유전자를 확인하기 위해 PCR, RT-PCR 및 서던 블로팅을 수행하였다(도 3 내지 5).

PCR을 수행한 결과, 대부분의 형질전환체에서 도입유전자인 AtSZF2과 선발항생제인 Bar의 삽입을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, LB(left board) 및 RB(right board) 부분도 증폭된 것을 확인하였다. 그리고 RT-PCR을 수행한 결과, 대부분의 형질전환체에서 도입유전자인 AtSZF2과 선발항생제인 Bar가 발현되는 것을 확인하였다. 이들 형질전환체 중에서 비교적 식물 상태가 정상적이며 종자 수도 많은 개체를 선발하여 서던 블로팅을 한 결과, 형질전환체 6번만 한 개의 복제(copy) 수를 보였고 나머지 형질전환체에서 두 개 이상의 복제(copy) 수를 보였다.

실시예 2: 염 스트레스 처리- 잎 및 어린 식물

염 스트레스에 대한 저항성을 관찰하기 위해, 대조군 및 형질전환체의 잎을 200 mM 염화나트륨으로 처리하였다. 그 결과, 대조군(광안콩, 공벡터)에 비하여 콩 형질전환체 4 및 6에서 염 스트레스에 대한 저항성을 강하게 나타내었다(도 6A).

또한, 16일 동안 염 스트레스를 처리한 잎의 클로로필을 측정해 본 결과, 대조군에 비해서 콩 형질전환체 4 및 6에서 클로로필 함량이 높게 나온 것을 알 수 있었다(도 6B).

분리한 잎에서 실험한 결과와 마찬가지로, 어린 식물체에서도 대조군에 비해 콩 형질전환체 4 및 6에서 염 스트레스에 대한 저항성이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었고(도 7A), 염 스트레스에 따른 식물체의 손상을 알아보기 위해 클로로필 함량 분석과 이온 누출률을 측정해 본 결과, 표현형에서 보이는 것과 마찬가지로 대조군에 비해 콩 형질전환체 4 및 6에서 식물체의 손상 정도가 낮은 것을 알 수 있었다(도 7B 및 7C).

또한, 염 스트레스에 관련된 마커 유전자의 발현 정도는 대조군에 비해 콩 형질전환체에서 더 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 대두 식물세포에 형질전환시켜 AtSZF2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 대두 식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법.
2. 삭제
3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 대두 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 대두 식물세포로부터 대두 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 대두 식물체의 제조 방법.
4. 삭제
5. 제3항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 염 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 대두 식물체.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제5항에 따른 대두 식물체의 종자.
9. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtSZF2(Arabidopsis thaliana SALT-INDUCIBLE ZINC FINGER PROTEIN 2) 유전자를 포함하는, 대두 식물의 염 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물.

Images