KR101325046B1 - 자스몬산 유도발현 시스-액팅 인자 및 이의 용도 - Google Patents

자스몬산 유도발현 시스-액팅 인자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TCCTGA의 염기서열로 이루어진, 자스몬산 및 그 유도체에 의해 특정유전자의 발현을 유도하는 프로모터의 시스-액팅 인자(cis-acting element), 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하여 외부 자극에 의해 목적 유전자의 발현을 유도하여 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하여 외부 자극에 의해 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법 및 TCCTGA의 염기서열로 이루어진 시스-액팅 인자를 포함하는, 외부 자극에 대해 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

자스몬산 유도발현 시스-액팅 인자 및 이의 용도{Jasmonates inducible cis-acting promoter element and uses thereof}
본 발명은 자스몬산 유도발현 시스-액팅 인자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TCCTGA의 염기서열로 이루어진, 자스몬산 및 그 유도체에 의해 특정유전자의 발현을 유도하는 프로모터의 시스-액팅 인자(cis-acting element), 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하여 외부 자극에 의해 목적 유전자의 발현을 유도하여 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물세포를 형질전환하여 외부 자극에 의해 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법 및 TCCTGA의 염기서열로 이루어진 시스-액팅 인자를 포함하는, 외부 자극에 대해 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하기 위한 조성물을 제공한다.
유전자 조작 기술의 발달과 함께 형질전환 식물체가 생산되고 있는 현실에서, 형질전환 식물체에 대한 생리학적, 생화학적, 유전학적 연구들은 식물의 대사과정이나 발달과정을 이해하는데 많은 도움을 주었다. 예로써, 특정 유전자의 과다 발현, 조직 특이적 발현, 그리고 발현 억제 등은 발달과정에 따라 시간적, 공간적으로 발현을 다르게 하는 다양한 프로모터의 존재와 이용가능성 때문에 가능하였다는 것이 밝혀졌으며, 이로 인해 형질전환체를 생산하는데 있어서 이러한 기술 적용의 급격한 증가를 가져왔다.
일반적으로 프로모터는 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상 부쪽에 위치하는 유전자 부위로서, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서(enhancer) 등으로 이루어져 있다. 그리고, 이러한 프로모터 중에는 모든 식물체 조직에서 모든 시간대에 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터와 발달시기, 시간적 및 위치적 영향을 받으며 발현을 유도하는 프로모터가 있다.
식물 프로모터를 사용하고 식물 호르몬을 유도체로 사용하는 시스템에 대한 연구가 진행되었는데, 살리실산 메칠에스터(MeSA)를 유도체로 사용하는 PR-1a 프로모터와(Gorlach et al., Plant Cell 8: 629-643, 1996), 제초제의 유독 효과로부터 식물의 저항성을 증진시키는 사페너(Safener)로 알려진 농약인 벤젠설포마이드(benzensulfomide)를 유도체로 사용하는 In2-2 프로모터가 대표적인 예이다(De Veylder et al., Plant Cell Physiol. 38: 568-577, 1997).
또 다른 경우는 상처에 의해 유도되는 단백질 분해효소 억제자 유전자(Pin2)의 프로모터를 이용한 형질전환 담배를 예로 들 수 있다. 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질 유전자와 재조합한 후 형질전환 담배를 제조하였다. 이후에 담뱃잎을 수확하고 이를 종이 절단기로 잘게 자른 후 2 내지 6시간 방치하면, 상처를 입은 담뱃잎에서 목적하는 유전자의 발현이 유도되어 형질전환시킨 재조합 단백질이 생합성되는데, 이로부터 단백질을 추출, 정제한 사례가 보고되고 있다.
이상 기술한 바와 같이, 식물체 조직에서 모든 시간대에 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 대신 특정 조건 또는 특정 시기에 목적 유전자의 발현을 유도함으로써 상시적 발현에 따른 부작용 내지는 문제점을 해결하기 위한 유도성 프로모터를 개발하기 위한 연구가 계속해서 있어 왔다.
한편, 식물에서 성장을 조절할 뿐만 아니라, 물리적 또는 해충에 의한 상처, 또는 병원균의 침입에 대항하는 저항성을 매개하는 대표적인 물질 중의 하나가 자스몬산(jasmonic acid)과 자스몬산 메칠에스터(jasmonic acid methylester; MeJA)이다(Creelman and Mullet, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 355-381, 1992).
본 발명자들은 애기장대와 배추에서 자스몬산 메칠화효소를 암호화하는 유전 자를 클로닝한 바 있다(Song et al.,Plant Mol. Biol. 42: 647-655). 또한 한국등록특허 제0379143호에서는 '자스몬산 메칠화 효소 유전자 및 이를 이용하여 병충해 및 스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '자스몬산 유도발현 시스-액팅 인자 및 이의 용도'에 관해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 배추 유래의 자스몬산 메칠화효소(NTR1) 유전자의 프로모터 및 애기장대 유래의 자스몬산 메칠화효소(JMT) 유전자의 프로모터를 분석한 결과, TCCTGA의 염기서열로 이루어진 자스몬산 메칠화효소 유전자 프로모터의 시스-액팅 인자(cis-acting element)가 식물체에 대한 외부 자극에 반응하여 목적 유전자의 발현을 유도하는데 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 실제로 6개의 염기서열을 포함한 애기장대 JMT 유전자 프로모터 28bp 부분을 4반복하여 연결시킨 인위적인 DNA를 합성하여 CaMV 35S 프로모터의 TATA 박스 염기서열과 연결한 후 GUS 유전자와 재조합시킨 벡터를 제조한 후, 이를 애기장대 식물에 도입하여 형질전환 식물을 만들었고, 이 식물체에 자스몬산 또는 메칠자스몬산을 처리하여 목표 유전자인 GUS 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과 발현이 증가되었다. 이를 통해 본 발명의 시스-액팅 인자가 유도성 프로모터로 효율적으로 사용될 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 TCCTGA의 염기서열로 이루어진, 자스몬산 및 그 유도체에 의해 특정유전자의 발현을 유도하는 프로모터의 시스-액팅 인자(cis-acting element)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 재조합하는 단계;
상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환 식물체에 외부 자극을 가하여 상기 시스-액팅 인자가 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 재조합하는 단계;
상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환 식물체에 외부 자극을 가하여 상기 시스-액팅 인자가 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 단계를 포함하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TCCTGA의 염기서열로 이루어진 시스-액팅 인자를 포함하는, 외부 자극에 대해 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하기 위한 조성물을 제공한다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 자스몬산 메칠화 효소 유전자의 시스-액팅 인자는 식물체에 대한 외부 자극에 반응하여 활성화되는 중요한 역할을 수행하므로, 상기 자스몬산 메칠화 효소 유전자의 시스-액팅 인자에 인체 치료용 유전자나 유용한 대사 산물의 생합성에 관여하는 유전자를 포함한 다양한 유전자를 연결하여 이를 식물체에 도입한 후, 생산된 형질전환 식물체 외부에서 자스몬산 메칠에스터 등을 직접 가하거나 식물체 내에서 자스모네이트 생산을 유도할 수 있는 외부자극(상처, 수분부족 등)을 통해 상기 형질전환 식물체로부터 대량의 목적 단백질을 얻을 수 있다. 또한 자스몬산 메칠에스터 등과 같은 화학물질을 처리하여 일반적인 성장에는 영향을 미치지 않으면서 물리적 상처나 병해충에 대하여 효과적으로 저항성을 보이는 식물체를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 수분 부족 및 높은 염도 등 각종 환경 스트레스에 대한 저항성이 높은 식물체를 얻을 수 있는 이점이 있다. 따라서, 농약의 사용을 감소시킴과 아울러 병에 대한 저항성을 증가시킬 수 있으므로, 경제 작물 등의 수확량 확대에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 JA-반응성 전사 조절 인자를 포함하는 BcNTR1 및 AtJMT 프로모터를 이용한 형질전환 애기장대의 MeJA 처리 후 재조합 GUS 유전자의 노던 블럿 분석을 나타낸다. BcNTR1(4.4kb, A) 및 AtJMT(4.5kb, B)의 프로모터 구조는 GUS 유전자에 각각 연결되었다.
도 2는 AtJMT에서 JA-반응성 시스-인자(JARE)의 위치를 나타낸다. (A) 5'-결실된 프로모터 시리즈(검은색 바)는 GUS 코딩 영역(흰색 바)의 업스트림에 클로닝 되었고, 애기장대로 형질전환되었다. 각 형질전환 식물체의 RT-PCR 분석은 MeJA 처리 1시간 후 수행되었다. JARE는 -2500 및 -2000 사이 영역에 위치되었다. (B) -2500 및 -2000 사이 추가적인 프로모터 결실 구조체를 나타내었고, MeJA 처리에 반응하는 GUS 유전자 발현을 나타내었다. 추정의 JARE는 -2294 및 -2280(회색 바)의 영역에 위치되었다. 기존에 자스모네이트에 반응하는 대표적인 시스-액팅 인자인 G-박스의 위치는 -2529, -2406 및 -2342(▼)에 나타내었다.
도 3은 BcNTR1 프로모터에서 JARE의 위치를 나타낸다. (A) JA 반응 테스트를 위한 BcNTR1 프로모터 결실 구조체의 구조(좌) 및 MeJA 처리 후 형질전환 애기장대의 노던 블럿 분석(우)를 나타낸다. (B) BcNTR1 프로모터는 NPfr1에서 AtJMT 프로모터와 서열 동일성의 영역 A(-3518에서 -3480)를 갖는다. NP4-A 구조체에서, A 영역은 NP4.0으로부터 결실되었다. GUS는 MeJA 처리 후 형질전환 식물체에서 RT-PCR에 의해 분석되었다. JARE는 A 영역, -3518에서 -3480에 있다. (C) 도 2B의 JP2294에서 추정의 JARE-포함 영역 및 NPfr1에서 A 영역 사이의 서열 정렬을 나타낸다. JP2294 및 NP4-A 사이의 동일 서열 인자(추정의 JARE)는 굵게 나타내었다.
도 4는 JARE-포함 형질전환 식물체의 MeJA 반응을 나타낸다. (A) 다중 결합의 JARE-포함 구조체(4×JARE-GUS)의 모식도 및 이것의 돌연변이 버전(4×mJARE-GUS)을 나타낸다. JARE를 포함하는 AtJMT 프로모터(-2305에서 -2278)는 4반복 되었고, 이것을 CaMV 35S로부터 최소 프로모터(TATA)를 포함하는 GUS 리포터와 연결시켰다. JARE(TCCTGA) 및 이것의 돌연변이 버전은 굵게 나타내었다. (B) 각 형질전환 식물체에서 GUS의 RT-PCR 분석은 MeJA 처리 후 수행되었다. (C) 4×JARE-GUS 및 4×mJARE-GUS 형질전환 식물체의 MeJA 처리 유(+)무(-)에 따른 4시간 후 GUS 염색을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TCCTGA의 염기서열로 이루어진, 자스몬산 및 그 유도체에 의해 특정유전자의 발현을 유도하는 프로모터의 시스-액팅 인자(cis-acting element)를 제공한다.
본 발명의 TCCTGA의 염기서열로 이루어진 시스-액팅 인자는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 서열번호 1의 프로모터 서열의 2208~2213(프로모터의 -2292∼-2286에 해당함)에 해당하는 서열 또는 배추(Brassica campestris) 유래의 서열번호 2의 프로모터 서열의 941~946(프로모터의 -3484∼-3479에 해당함)에 해당하는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 TCCTGA의 염기서열로 이루어진 시스-액팅 인자는 프로모터 내의 특정 위치보다는 TCCTGA라는 염기서열이 역할을 하는 것이다. 왜냐하면, TCCTGA를 TTTTTT의 돌연변이시켜 형질전환하여 시스-액팅 인자의 활성을 분석하면 돌연변이체는 활성이 없다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, TCCTGA를 포함하는 4개의 반복서열로 형질전환시켜 시스-액팅 인자의 활성을 분석하면 GUS 활성을 나타내는 것으로 보아, TCCTGA를 포함하는 주변 서열이 중요한 것이 아니라, TCCTGA 서열 자체가 시스-액팅 인자로서 역할을 하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "시스-액팅 인자(cis-acting element)"는 구조 유전자로부터의 DNA 상류 영역의 프로모터 내에 존재하며 전사제어 인자나 RNA 중합효소가 염기배열을 인식하여 결합하는 DNA 분자를 말한다. 본 발명의 시스-액팅 인자는 "식물 프로모터"와 마찬가지로 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 시스-액팅 인자는 TCCTGA의 염기서열로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 TCCTGA를 포함하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열이 4반복으로 연결된 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 TCCTGA 염기 서열로 이루어진 시스-액팅 인자, 시스-액팅 인자를 포함하는 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 3의 염기서열이 4반복으로 연결된 서열번호 4의 염기서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입되어 유도성 프로모터로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.
용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
상기 TCCTGA 염기 서열로 이루어진 시스-액팅 인자, 시스-액팅 인자를 포함하는 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 3의 염기서열이 4반복으로 연결된 서열번호 4의 염기서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 식물 발현 벡터는 상기 TCCTGA 염기 서열로 이루어진 시스-액팅 인자, 시스-액팅 인자를 포함하는 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 3의 염기서열이 4반복으로 연결된 서열번호 4의 염기서열의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은
상기 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 재조합하는 단계;
상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환 식물체에 외부 자극을 가하여 상기 시스-액팅 인자가 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환된 식물체는 캘러스로부터 뿌리를 유도하여 전 식물(whole plant)로 재분화시키는 조직배양방법 등 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 무성번식될 수 있다.
바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대이다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과(Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과(Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae),(연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과(Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과(Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과(Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과(Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과(Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과(Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과(Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과(Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과(Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과(Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과(Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은
상기 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 재조합하는 단계;
상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환 식물체에 외부 자극을 가하여 상기 시스-액팅 인자가 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 단계를 포함하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 목적 단백질은 안티트립신(antitrypsin), 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), 아비딘(avidin), 콜레라 톡신(cholera toxin), 유로키나제(neurokinase) 및 소마토트로핀(somatotropin)과 같은 인체 치료용 단백질; 리보좀 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein; RIP), 자스몬산 메칠화효소(jasmonic acid carboxyl methyltransferase), 트레할로스 생합성효소(trehalose synthase), 식물 디펜신 1.2(plant defensin 1.2), 티오닌 합성효소(thionine synthase), 글루카나제(glucanase), 키티나제(chitinase), 페닐알라닌 암모니아 분해효소(phenylalanine ammonia lyase), 찰콘 합성효소(chalcone synthase), 글루타치온 전이효소(glutathione transferase), 안쓰라니레이트 합성효소(anthranilate synthase), 저장 단백질(storage protein), 칼모듈린(calmodulin), 트립토판 합성효소(tryptophan synthase), 단백질 분해 억제자 Ⅱ(proteinase inhibitor Ⅱ), NO 합성효소(nitric oxide synthase), 시스테민(systemin), 지방산 과산화효소(fatty acid peroxidase) 및 산화알렌 합성효소(allene oxide synthetase)와 같은 식물 방어에 관련된 단백질; 및 타닌(tannin), 시나핀(sinapine), 사포닌(saponin), 알리신(allicin), 스피노신(spinosin), 신나믹산(cinnamic acid), 플라보노이드(flavonoid), 터페노이드(terpenoid), 카테킨(catechin), 비타민(vitamin), 페니실린(penicillin), 인돌(indole), 인슐린(insulin), 프로스타그란딘(prostaglandin), 텍솔(taxol), 알리솔(alisol), 리신(ricin) 및 피페린(piperine)과 같은 유용한 대사 산물 생합성에 관여하는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체에 대한 외부 자극은 식물체에 상처가 가해지는 경우 또는 화학물질이 처리되는 경우일 수 있고, 바람직하게는 상기 식물체에 가해지는 상처는 식물 조직을 으깨거나 칼 또는 가위로 자르는 것에 의한 물리적 상처 또는 해충에 의한 상처이거나, 진균병, 세균병, 바이러스병으로부터 선택된 병원균의 감염에 의한 상처일 수 있고, 상기 화학물질이 처리되는 경우는 자스몬산(jasmonic acid), 자스몬산 메칠에스터(jasmonic acid methylester) 및 자스몬산 유도체로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 화학물질이 처리되는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 진균병, 세균병, 바이러스병은 도열병균, 담배 모자이크 바이러스(TMV), 감자 역병균, 밀감 잿빛곰팡이병균, 수박 만할병균, 오이 노균병균등 다양한 병원균과 해충일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 TCCTGA의 염기서열로 이루어진 시스-액팅 인자(cis-acting element)를 포함하는, 외부 자극에 대해 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 시스-액팅 인자는 TCCTGA의 염기서열로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 TCCTGA를 포함하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열이 4반복으로 연결된 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 자스몬산 혹은 메칠자스몬산 처리에 따른 JMT 프로모터 및 NTR1 프로모터의 작동
JMT 프로모터 전체길이(4502bp)와 NTR1 프로모터 전체길이(4424bp)를 GUS 유전자와 재조합하여 애기장대에 도입하였다. 형질전환된 식물체에 자스몬산 혹은 메칠자스몬산을 처리(분무)하여 목표 유전자인 GUS 유전자의 발현을 조사한 결과 유전자 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 1). 실시예 1의 결과에 대한 실험방법은 한국등록특허 제0379143호에 기재된 방법으로 수행되었다.
따라서 이 두 프로모터에는 자스몬산에 반응하는 인자(cis-element)가 존재하고 있다는 것을 알 수 있다. 또한 두 유전자는 기능상 같은 효소를 코딩하므로 동일한 시스-인자가 존재할 것으로 추정할 수 있다.
실시예 2: 자스몬산 메칠화효소 ( JMT ) 유전자 프로모터에 존재하는 시스 - 액팅 인자( cis - acting element )의 위치 분석
애기장대 게놈 DNA에서 4504bp 길이의 프로모터를 PCR을 통해 클로닝하였고, 추가로 5'으로부터 길이가 500씩 짧은 프로모터 부위를 PCR을 통해 증폭시킨 후 각각의 프로모터를 식물 형질전환 벡터에 재조합하였다. 기본벡터로서 카나마이신(kanamycin) 저항성 선별 유전자, CaMV 35S 프로모터, 그리고 GUS (β-glucuronidase) 유전자를 가진 pBI21 벡터를 사용하였다. 기본 벡터인 pBI121 벡터를 HindⅢ와 BamHI으로 절단하여 CaMV 35S 프로모터를 제거한 후 증폭된 각각의 프로모터 절편(클로닝을 위해 HindIII와 BamHI 효소 절단 인식부위를 포함한 프라이머를 통해 증폭)들을 삽입하여 재조합 플라스미드(JP시리즈)를 제조하였다(도 2). 각각의 JMT 유전자 프로모터를 증폭하기 위하여 순방향 프라이머 (HindIII 포함) 및 역방향 프라이머 (BamHI)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응은 94℃에서 5 분간 방치한 후, 94℃ 30 초; 65℃ 30 초; 72℃ 2 분의 반응을 30 회 반복하였고, 마지막 단계에서는 72℃에서 5분간 추가 반응시키는 조건으로 수행하였다. 이렇게 하여 얻어진 PCR 산물을 PCR 정제 키트(다인바이오, 한국)를 이용하여 정제한 이후, 제한효소 HindⅢ 및 BamHI으로 절단하고, 같은 효소들로 절단된 기본 벡터와 접합하였다.
상기 재조합 플라스미드 JP 시리즈 벡터들을 급속 냉동-해동법(freeze-thaw method; Holster M. et al., Mol. Gen. Gene t. 163: 181-187, 1978)을 이용하여 아그로박테리움 AG5922(Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163: 181-18 7, 1978)에 도입하였다. 우선, 아그로박테리아(C58C1)를 5㎖ YEP(yeast extract-pepton) 배지에서 28℃로 24 시간 배양한 후, 4℃에서 5,000rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 균주 펠렛을 20 mM 염화칼륨 용액 1 ㎖에 재현탁시키고, 제조한 벡터 DNA를 약 1㎍ 정도 넣어준 뒤, 액체 질소에서 5 분, 37℃에서 5 분간 처리하였다. 여기에 1㎖ YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 2∼4시간 배양하여 회수한 후, 재조합 벡터로 형질전환된 균주만을 선별하기 위해 리팜피신(25㎍/㎖), 젠타마이신(25㎍/㎖) 및 카나마이신(25㎍/㎖)을 포함하는 YEP 배지에서 28℃로 2∼3 일간 배양하였다.
이후, 상기에서 선별된 균주를 감염시켜 애기장대를 형질전환시켰다. 형질전환 식물체의 제조는 공지의 아그로박테리움 형질전환법을 이용하였다. 항생제를 포함하는 YEP 배지에서 밤새 배양한 아그로박테리아를 원심분리한 후, Silwet L-77(Lehle Seeds, 미국) 0.05%를 가한 MS 배지에 OD600에서 0.8이 될 때까지 현탁하였다. 여기에 꽃이 피기 시작하는 애기장대를 거꾸로 하여 꽃대 부분을 15분간 담근 후 22℃로 유지되는 식물 생장상으로 옮겨 배양하였다. 상기 식물체로부터 얻은 종자를 카나마이신 배지에서 발아시켜 선별하고 카나마이신 저항성을 보이는 형질전환체를 토양에 이식하여 제 2세대 종자를 얻었다. 이를 다시 카나마이신 배지에서 선별하여 카나마이신 감수성 개체가 나오지 않는 제 2세대 종자를 순수 2배체로 인식하고 이 식물체를 대상으로 실험을 계속하였다. 재조합 DNA가 올바르게 삽입되었는지 여부를 서던 블럿을 수행하여 재조합 DNA가 안정적으로 삽입되었음을 확인할 수 있었다(데이터 미제시).
도 2에 나타낸 바와 같이, 두 프로모터에 동일하게 존재하는 인자를 찾아내기 위하여 먼저 JMT 프로모터를 5'부터 500bp 만큼 짧게 결실된 프로모터를 GUS 유전자와 재조합하여 JP4.5 - JP0.5까지 총 9개의 재조합 벡터를 만들어 각각 애기장대에 도입하였다. 이후 형질전환된 식물체 각각을 마찬가지로 자스몬산 처리한 후 GUS 유전자를 살펴본 결과 상위 2500 이후에는 자스몬산 반응 인자가 존재하지 않음을 알 수 있었고, 2500-2000 사이에 자스몬산 반응 인자가 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 2A). 조금 더 범위를 줄이기 위하여 추가적인 5개의 프로모터 결실 재조합 벡터를 애기장대 도입하여 조사한 결과 상위 2294와 2280 위치 부근에 이 인자가 존재함을 알 수 있었다(도 2B).
실시예 3: 자스몬산 메칠화효소 ( NTR1 ) 유전자 프로모터에 존재하는 시스 -액팅 인자( cis - acting element )의 위치 분석
이전에 클로닝된 NTR1 4424bp 길이의 프로모터를 PCR을 통해 도 3과 같은 다양한 길이의 프로모터를 증폭하여 식물체가 NTR1 유전자 프로모터를 포함하도록 형질전환시키기 위해서 상기 NTR1 유전자 프로모터를 식물 형질전환 벡터에 재조합하였다.
상기 재조합 플라스미드들은 위의 JMT 프로모터 재조합 벡터들과 마찬가지 방법으로 아그로박테리움을 통해서 애기장대를 형질전환하여 같은 방법으로 형질전환 식물체를 선별하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2와 마찬가지 방법으로 NTR1 프로모터의 결실된 프로모터를 GUS 유전자와 재조합하여 NP4.0, NP3.0, NP2.0, NPfr1까지 총 4개의 재조합 벡터를 만들어 각각 애기장대에 도입하였다. 이후 형질전환된 식물체 각각을 마찬가지로 자스몬산 처리한 후 GUS 유전자를 살펴본 결과 상위 3807-3256 사이에 자스몬산 반응 인자가 존재하고 있음을 알 수 있었다. 조금 더 범위를 줄이기 위하여 이 부위를 JMT 프로모터의 염기서열과 비교분석하여 보존된 염기서열이 존재하는 부위 (-3518과 -3480 사이)가 존재함을 알 수 있었고 이 부분을 결실시킨 추가적인 재조합 벡터(NP4-A)를 애기장대에 도입하여 조사한 결과 이 위치 부근에 자스몬산에 반응하는 인자가 존재함을 알 수 있었다. 상기 JMT와 NTR1 프로모터 결과를 통해 발견된 두 부분의 프로모터 염기서열을 서로 비교분석한 결과 6개의 공통된 염기서열이 존재함을 알 수 있었고, 이 서열이 자스몬산에 반응하는 시스-인자(JARE)임을 추정할 수 있었다.
실시예 4: 형질전환 식물체에서 외부 자극에 대한 GUS 발현 검정
각각의 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대에서 JMT 그리고 NTR1 유전자의 프로모터 절편들이 자스몬산 또는 메칠자스몬산에 의한 유전자 발현 유도 기능을 하는지 검증하기 위하여 각각의 형질전환체에 자스몬산 또는 메칠자스몬산을 100 uM 농도로 물에 희석하여 분무 처리하였다. 처리 1시간 이후 각각의 형질전환체 잎을 샘플링하여 액체질소로 얼린 후 갈아서 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA를 역전사 효소(reverse transcriptase)를 통해 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 GUS 유전자 발현을 보기 위해 제작된 프라이머를 이용하여 PCR하였다. 또한 이후 안정적으로 기능을 발휘하는지를 확인하기 위하여 GUS 염색을 실시하였다. 형질전환된 애기장대 식물 씨앗을 MS 고체배지에 파종해서 3 주간 재배한 후, 메칠자스모네이트를 4시간 처리한 이후 다음과 같은 방법을 통해 염색하였다. GUS 염색은 헤멜리 등(Hemerly et al., Plant Cell 5: 1711-1723, 1993)의 방법에 따라 수행하였다. 먼저, GUS 유전자가 도입된 형질전환된 담배의 잎을 잘라서 90% 아세톤 용액에서 15 분간 고정한 후, 100 mM 포스페이트 완충 용액(sodium phosphate, pH 6.8)으로 5 번 세척하였다. 세척한 시료를 염색 용액(100 mM sodium phosphate, pH 6.8; 0.5 mM K3(Fe[CN]6); 0.5 mM K4(Fe[CN]6); 0.1% Triton X-100; 10 mM EDTA; 0.5㎎/㎖ 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid)(Gold Biotechnology, St. Louis, MO, 미국)에 담근 후 37℃에서 24 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 70% 에탄올 용액을 사용하여 클로로필을 포함한 다른 색소를 제거한 후 GUS 염색 정도를 관찰하였다.
실시예 5: JARE ( Jasmoate responsive - cis element )의 자스몬산 반응성 조사
자스몬산에 특이적으로 반응하는 프로모터 인자를 찾기 위해 상기 도시된 다양한 프로모터 결실 돌연변이체에서 GUS 유전자 발현을 조사한 결과 JMT 프로모터 상위 2294에서 2280 부위 및 NTR1 프로모터 상위의 3518과 3480 부위가 자스몬산 반응에 중요하다는 것을 알게 되었다. 이 부위의 염기서열을 서로 비교한 결과 양쪽 부위에 공통적으로 존재하는 특정 염기서열 TCCTGA을 발견하였고, 따라서 이 염기서열이 자스몬산에 특이적으로 반응하는데 중요한 역할을 할 것으로 추정하였다. 이를 증명하기 위해 JMT 프로모터에서 상기 염기서열을 포함하는 28 bp의 프로모터 부위를 4반복되는 인위적인 염기서열을 제작하여 CaMV 35S 프로모터의 TATA 박스 염기서열부위와 연결하여 pCambia 1391Z 벡터에 클로닝하였다. 한편으로 특정 염기서열 TCCTGA가 자스몬산 특이적 반응에 관여하는지 알아보기 위해 대조군으로 상기 염기서열을 모두 T로 변이시킨 DNA도 같은 방법으로 제작하였다(도 4). 상기 재조합 플라스미드들은 위의 JMT과 NTR1 프로모터 재조합 벡터들과 마찬가지 방법으로 아그로박테리움을 통해서 애기장대를 형질전환하여 같은 방법으로 형질전환 식물체를 선별하였다.
그 결과, 자스몬산 메칠에스터를 처리한 후 GUS가 체계적으로 발현되는지 조사한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 동일한 개체 내 자스몬산 메칠에스터를 처리하지 않은 식물체에서는 GUS 유전자의 발현이 유도되지 않았고 처리한 식물체에서는 유도됨을 확인할 수 있었다. 또한, 자스몬산에 반응하는 것으로 생각되는 특정 염기서열(JARE)를 돌연변이 시킨 mJARE 식물체에서는 유도발현되지 않음을 알 수 있었다. 따라서 자스몬산에 특이적으로 반응하는 프로모터 염기서열(TCCTGA; JARE)을 찾아내었고, 이를 통해 JARE 만으로도 자스몬산 반응에 충분히 역할을 할 수 있다는 것을 다시 확인할 수 있었다.
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Claims (13)

  1. TCCTGA의 염기서열로 이루어진, 자스몬산 및 그 유도체에 의해 특정유전자의 발현을 유도하는 프로모터의 시스-액팅 인자(cis-acting element).
  2. 제1항의 시스-액팅 인자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
  3. 제2항의 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 재조합하는 단계;
    상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
    상기 형질전환 식물체에 외부 자극을 가하여 상기 시스-액팅 인자가 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
  4. 제3항의 방법에 의해 제조된 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체.
  5. 제4항에 따른 식물체의 종자.
  6. 제2항의 재조합 식물 발현 벡터에 목적 유전자를 재조합하는 단계;
    상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
    상기 형질전환 식물체에 외부 자극을 가하여 상기 시스-액팅 인자가 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 단계를 포함하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 목적 단백질은 안티트립신(antitrypsin), 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), 아비딘(avidin), 콜레라 톡신(cholera toxin), 유로키나제(neurokinase) 및 소마토트로핀(somatotropin)과 같은 인체 치료용 단백질; 리보좀 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein; RIP), 자스몬산 메칠화효소(jasmonic acid carboxyl methyltransferase), 트레할로스 생합성효소(trehalose synthase), 식물 디펜신 1.2(plant defensin 1.2), 티오닌 합성효소(thionine synthase), 글루카나제(glucanase), 키티나제(chitinase), 페닐알라닌 암모니아 분해효소(phenylalanine ammonia lyase), 찰콘 합성효소(chalcone synthase), 글루타치온 전이효소(glutathione transferase), 안쓰라니레이트 합성효소(anthranilate synthase), 저장 단백질(storage protein), 칼모듈린(calmodulin), 트립토판 합성효소(tryptophan synthase), 단백질 분해 억제자 Ⅱ(proteinase inhibitor Ⅱ), NO 합성효소(nitric oxide synthase), 시스테민(systemin), 지방산 과산화효소(fatty acid peroxidase) 및 산화알렌 합성효소(allene oxide synthetase)와 같은 식물 방어에 관련된 단백질; 및 타닌(tannin), 시나핀(sinapine), 사포닌(saponin), 알리신(allicin), 스피노신(spinosin), 신나믹산(cinnamic acid), 플라보노이드(flavonoid), 터페노이드(terpenoid), 카테킨(catechin), 비타민(vitamin), 페니실린(penicillin), 인돌(indole), 인슐린(insulin), 프로스타그란딘(prostaglandin), 텍솔(taxol), 알리솔(alisol), 리신(ricin) 및 피페린(piperine)과 같은 유용한 대사 산물 생합성에 관여하는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 식물체에 대한 외부 자극은 식물체에 상처가 가해지는 경우 또는 화학물질이 처리되는 경우인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물체에 가해지는 상처는 식물 조직을 으깨거나 칼 또는 가위로 자르는 것에 의한 물리적 상처 또는 해충에 의한 상처이거나, 진균병, 세균병, 바이러스병으로부터 선택된 병원균의 감염에 의한 상처인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 화학물질이 처리되는 경우는 자스몬산(jasmonic acid), 자스몬산 메칠에스터(jasmonic acid methylester) 및 자스몬산 유도체로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 화학물질이 처리되는 경우인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. TCCTGA의 염기서열로 이루어진 시스-액팅 인자(cis-acting element)를 포함하는, 외부 자극에 대해 목적 유전자의 발현을 유도하여 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하기 위한 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시스-액팅 인자는 TCCTGA를 포함하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 시스-액팅 인자는 서열번호 3의 염기서열이 4반복으로 연결된 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
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