KR101315069B1 - 식물의 유전자 침묵을 억제하는 새로운 ｔｃｖ 외피 단백질 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TCV(Turnip crinkle virus)의 외피 단백질(coat protein: CP)의 4번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 다른 아미노산으로 변이된 TCV의 CP 변이체, 상기 TCV의 CP 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시키는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자의 침묵 억제가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 TCV의 CP 변이체 유전자를 포함하는, 식물체 내의 외래 유전자의 침묵 억제 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 유전자 침묵을 억제하는 새로운 ＴＣＶ 외피 단백질 변이체 및 이의 용도{New TCV coat protein variant suppressing plant gene silencing and uses thereof}
본 발명은 식물의 유전자 침묵을 억제하는 새로운 TCV 외피 단백질 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 TCV(Turnip crinkle virus)의 외피 단백질(coat protein: CP)의 4번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 다른 아미노산으로 변이된 TCV의 CP 변이체, 상기 TCV의 CP 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시키는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자의 침묵 억제가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 TCV의 CP 변이체 유전자를 포함하는, 식물체 내의 외래 유전자의 침묵 억제 증진용 조성물에 관한 것이다.
식물은 세포 발달뿐만 아니라 병원균이나 외부 스트레스에 대한 저항성 반응의 하나로 꼬마 RNA 침묵(sRNA silencing)이라는 중요한 기작을 가지고 있다. 보다 자세하게는, 세포 내 단일 가닥의 RNA들이 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA-polymerase, RdRp)에 의해 이중 가닥의 RNA가 되면, 다이서(dicer)라는 단백질에 의해 18-30여개 염기 길이의 꼬마 간섭 RNA(siRNA)들로 잘려진다. 잘려진 이중 가닥의 꼬마 RNA들이 단일 가닥으로 풀리게 되면 아고뉴트(Agonaute, Ago)라는 단백질과 결합하여 RNA에 의해 유도되는 침묵 복합체(RNA-Induced-Silencing-Complex, RISC)를 형성한다. 이 복합체의 꼬마 RNA가 전사 RNA의 상보적인 염기 서열 부위와 특이적으로 결합을 하면, 전사 RNA들은 Ago에 의해 특정 길이의 작은 조각인 꼬마 RNA들로 깨져서 유전자 발현이 억제가 된다. 이러한 기작을 통하여 식물은 자신의 유전자 발현을 조절할 뿐 아니라, 외부 침입 병원균, 특히 바이러스에 대하여 방어 수단으로 이용하며, 특히 방어기작에 관여하는 유전자 침묵을 전사 후 유전자 침묵(posttranscriptional gene silencing, PTGS)이라고 부르고 있다. 초기에 유전자 침묵이 시작된 세포에서 기작 과정 중 증폭된 꼬마 RNA들이 10-15개의 이웃세포들로 이동, 신호로 작용하여 침묵 기작이 새롭게 활성화되고, 새로 형성된 꼬마 RNA들은 다시 이웃 세포로 이동함으로써, 유전자 침묵은 식물체 내에서 단계적으로 일어난다.
식물의 바이러스는 절대적인 기생 병원체로서, 대부분의 식물 바이러스는 단일가닥의 포지티브 RNA 게놈(+ssRNA geneome)을 가지고 있다. 바이러스가 숙주 식물 내로 침입을 하여 자신들의 RdRp에 의해 단일 가닥에서 이중 가닥 RNA가 형성되면, 식물의 꼬마 RNA 침묵 방어 기작이 유도가 되고 바이러스 게놈들이 깨지게 되어 식물체 내 바이러스의 복제 과정이 저해가 된다. 이러한 기작을 이용하여 관심 유전자의 기능을 연구하는 목적으로 그 유전자의 기능이 상실된 돌연변이체를 얻기 위해 바이러스에 의한 유전자 침묵을 유도하는 방법인 Virus-Induced-Gene-Siencing(VIGS)를 사용하고 있다. 만약 바이러스가 식물이 가지고 있는 유전자 염기 서열을 내포하고 있으면, 식물은 바이러스 침입시 그것에 대한 꼬마 RNA들을 만들어 결과적으로 자신의 유전자도 함께 깨트리게 된다. 예로써 형광 단백질이 형질전환된 식물에 형광 단백질 유전자를 지닌 바이러스를 감염 시, 바이러스 감염이 시작된 부위와 전이된 부위에 식물의 형광 단백질 발현이 억제됨을 관찰할 수 있다. 반면 대부분의 식물 바이러스들은 이러한 숙주 식물들의 유전자 침묵 방어 기작을 방해하기 위하여, 자신들의 게놈상에 침묵을 억제(silencing suppression)하는 기능을 가진 유전자를 포함하고 있고 이를 침묵 억제자(silencing suppressor)라고 한다. 바이러스들 마다 숙주 세포 내 침묵 기작 경로에 다양하게 작용하여, 방어 작용을 방해 또는 억제시켜서 숙주 세포 내 증폭을 가능하게 한다.
20면체의 구조로 이루어진 TCV 바이러스는 Tombusviridae 과의 Carmovirus 속에 속한 종으로, 약 4천 염기서열(4kb)의 포지티브 센스(positive sense) 단일 가닥 RNA 게놈 내 2개의 RdRp인 p28/88(kDa)과 2개의 이동단백질인 p8(kDa) 또는 p9(kDa)와 38(kDa)의 외피 단백질을 인코딩하는 유전자를 가지고 있고 애기장대를 포함한 여러 식물 종에 감염을 일으킨다.
식물은 병원체가 침입하여 감염이 되면, 더 이상의 확산을 막기 위해 감염된 부위에 급속히 세포 사멸(hyper-reponse, HR)을 일으킨다. 애기장대 식물 중 Dijon17은 HRT(HR to TCV)라는 저항성 유전자를 코딩하여 TCV 바이러스의 외피 단백질과 상호작용, HR 저항성 반응을 나타내는 것으로 알려져 있다. TCV 외피 단백질의 4번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 아스파라진(asparagine, N)으로 치환되거나 5번째 아미노산 프롤린(Proline, P)이 세린(serine, S)으로 치환된 자연적 돌연변이 외피 단백질들(D4N, P5S)은 이러한 HR 반응이 나타나지 않는다. TCV의 외피 단백질은 식물의 저항성 유전자(HRT)와 결합하여 저항성 반응을 유도할 뿐만 아니라 침묵 억제자로서 기능을 한다.
침묵 기작 과정 중 형성된 이중 가닥 RNA에 결합하여 다이서의 기능을 방해함으로써 유전자 침묵을 억제하는 것으로 알려져 있다. TCV의 외피 단백질 외에도, 대표적인 식물 바이러스 유래 억제자로서 Tombusviridae과에 속하는 다른 종의 바이러스인 Tomato bushy stunt virus(TBSV)의 P19, Potyvirus에 속하는 Tobacco etch virus(TEV) 및 Potato virus Y(PVY)의 helper component proteinase(HC-Pro), Potexvirus에 속한 Potato virus X(PVX)의 P25, Cucumovirus에 속한 Cytomegalovirus(CMV)의 2b등이 있으며, 이들은 각각, 침묵 기작의 다양한 경로에 관여하여 유전자 침묵 억제자로서 역할을 한다고 알려져 있다.
식물의 유전자 기능 연구를 목적으로, 식물 게놈 상에 관심 유전자를 인위적으로 도입할 수 있는 아그로박테리움(Agrobacterium transformation)의 Ti 플라스미드 방법을 이용한다. 하지만 외래 유전자 도입에 대한 방어기작으로서, 식물의 유전자 침묵이 일어나 식물 세포 내 관심 유전자의 발현이 감소하거나 억제되어, 유전자 기작 연구에 어려움이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 침묵 기작을 억제할 수 있는 유전자를 함께 발현시킴으로, 관심 유전자의 발현 효율 및 지속성을 증가시키는데 이용하고 있다. 자연적으로 발견된 TCV 외피 단백질의 돌연변이형인 D4N 또는 P5S도 억제 기능이 있는 것으로 알려져 있으나 그것의 효율은 명확하지 않다.
한국특허공개 제2009-0112599호에는 한국산 인동식물 감염 바이러스를 이용한 전사 후 유전자 침묵현상의 억제활성을 갖는 단백질이 개시되어 있으나, 본 발명의 침묵 억제 변이체와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 TCV 바이러스 외피 단백질의 기능 연구 목적으로, 새로운 변이형들을 유도하기 위하여 외피 단백질의 단일 아미노산을 치환하고, 또한 그들의 세포 내 위치를 관찰하기 위해 C- 또는 N-말단에 형광 단백질을 융합한 구축물들을 제조하고, 이들로부터 4번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 티로신(tyrosine, Y)으로 치환된, D4Y 변이체의 외래 유전자에 대한 유전자 발현 침묵을 억제하는 기능이 증진되었음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 TCV(Turnip crinkle virus)의 외피 단백질(coat protein: CP)의 4번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 다른 아미노산으로 변이된 TCV의 CP 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TCV의 CP 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시키는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자의 침묵 억제가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 TCV의 CP 변이체 유전자를 포함하는, 식물체 내의 외래 유전자의 침묵 억제 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 식물체를 이용한 빠르고 편한 외래 유용유전자 과다발현 기법을 제공할 수 있으며, 바이러스 단백질을 이용한 새로운 식물 형질전환 기법을 제공할 수 있으며, 식물의 병 저항성 기능 향상 기법을 제공할 수 있다. 따라서, 병 저항성 기능이 향상된 식물 및 이에 연관된 작물의 생산성 증대를 기대할 수 있으며, 식물체 내에서 인간 병원균의 백신 단백질 생산이 가능할 수 있다.
도 1은 TCV의 CP와 CP 돌연변이를 처리하고 식물의 외래도입 유전자의 침묵 기작을 억제하는 기능을 확인한 결과이다. (A) 표시된 유전자를 전달하는 아그로박테리움들을 침윤시켰다. 식물의 유전자침묵 억제를 UV 아래에서 관찰하고 식물체 내에서의 형광단백질 발현을 비교한 것이다. 침윤 후 7일에 사진을 촬영하였다. (B) 침윤 후 7일에 관찰한 식물 잎 조직을 취하여 식물체 내 형광 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅 실험으로 확인한 결과이다. 동량의 단백질을 항-GFP 항체를 이용하여 GFP 단백질량을 비교하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TCV(Turnip crinkle virus)의 외피 단백질(coat protein: CP)의 4번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 다른 아미노산으로 변이된 TCV의 CP 변이체를 제공한다.
본 발명의 TCV의 CP 변이체에서, 상기 다른 아미노산은 티로신(Y)일 수 있으나, 식물체 내에서 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시킬 수 있는 아미노산이면 이에 제한되지 않는다. 상기 변이체는 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
TCV(Turnip crinkle virus)는 Carmovirus 속에 속하는 식물 바이러스이며, 이의 외피 단백질(coat protein, CP)은 유전자 침묵 억제자로서 식물 저항성 반응 중의 하나인 유전자 침묵 경로에 간섭하여 침묵 기작을 저해시킨다. TCV의 침묵 억제에 대한 기작 연구를 위하여 자연적인 돌연변이체 외 새로운 변이 외피 단백질들을 제조하였다. 게놈 상에 이미 형광 단백질 유전자가 도입된 형질전환 식물체 잎에 아그로박테리움을 이용하여 형광 단백질과 외피 단백질이 융합된 염기서열을 넣어줌으로써, 식물 세포 내 유전자 침묵 기작을 유도하였다. 외피 단백질의 4번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 티로신(tyrosine, Y)으로 변이된 D4Y를 제조하였고 외피 단백질과 그것의 변이체들 간의 세포 내 위치를 관찰하기 위하여 형광단백질을 융합시켰다. 외래 형광단백질 유전자 도입으로 유도되는 내부 형광 단백질 발현 침묵이 D4Y에 의해 억제되어 형광이 강하게 보이고 D4Y가 본래 외피 단백질 유전자의 침묵 억제 기능보다 증가함을 관찰하였다. In-vivo 실험 방법으로, 침묵 억제자들에 의해 회복되는, 내부 형광 유전자 단백질 발현 수준을 비교하였고, D4Y 억제에 의한 형광 단백질 발현량 증가를 확인하였다.
본 발명은 또한, 상기 TCV의 CP 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 5의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, TCV의 CP 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 식물 발현 벡터에서, TCV의 CP 변이체 유전자의 5'말단에 외래 유전자가 인프레임(in frame)으로 위치하는 것이 바람직하다. 외래 유전자가 TCV의 CP 변이체 유전자의 3'말단에 위치하는 것보다 5'말단에 위치하는 것이 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시켰다 (실시예 2 참고).
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 TCV의 CP 변이체 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
TCV의 CP 변이체-암호화 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 TCV의 CP 변이체 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시키는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자의 침묵 억제가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한, TCV의 CP 변이체 유전자를 포함하는, 식물체 내의 외래 유전자의 침묵 억제 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 TCV의 CP 변이체 유전자는 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 TCV의 CP 변이체 유전자를 포함하며, 상기 변이체 유전자를 식물에 형질전환함으로써 식물체 내의 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: TCV 의 외피 단백질 (CP)과 외피 단백질 돌연변이 유전자 구축물 제조
TCV 외피 단백질(CP)과 돌연변이 외피 단백질들의 식물체 내에서의 유전자 침묵에 대한 억제 기능을 관찰하기 위하여 보유하고 있는 35S:GFP 구축물과 대조구인 35S:P19, 35S:CP, 35S:D4N, 35S:P5S, 35S:CP:GFP, 35S:D4N:GFP, 35S:P5S:GFP 구축물들을 사용하였다. 그리고 TCV의 CP의 염기서열(서열번호 1), TCV의 CP의 아미노산 서열(서열번호 2), TCV의 CP의 D4N 염기서열(서열번호 3), TCV의 CP의 D4N 아미노산 서열(서열번호 4), TCV의 CP의 D4Y 염기서열(서열번호 5), TCV의 CP의 D4Y 아미노산 서열(서열번호 6)의 N-말단에 GFP 변이형인, 황색 형광 단백질(yellow fluorescence protein, YFP)이 융합된 구축물을 제조하기 위하여, 각 유전자들의 특이적인 정방향 프라이머(CP-5'-CACCATGGAAAATGATCCTAGAGTCCG-3'(서열번호 7), D4N-5'-CACCATGGAAAATAATCCTAGAGTCCG-3'(서열번호 8), D4Y-5'-AAAATGGAAAATTATCCTAGAGTCCGG-3'(서열번호 9))와 역방향 프라이머는 동일한 것(5'-CTAAATTCTGAGTGCTTCAATT-3'(서열번호 10))을 사용하여 PCR 기법으로 증폭하고 gateway 클로닝 벡터 플라스미드인 pBin:YFP:attR의 35S 프로모터와 nos 종결자(terminator) 사이에 재조합을 이용하여 클로닝 하였다. 클로닝한 구축물을 아그로박테리움에 형질전환하고 항생제(50mg/L kanamycin, 50mg/L rifampicin) 저항성을 이용하여 형질전환된 아그로박테리움을 선발하여 이용하였다.
실시예 2: 형광단백질이 N-말단에 융합된 TCV 외피 단백질 의 돌연변이체에 의한 유전자침묵 억제 기능 향상
TCV의 외피 단백질(CP)과 다양한 돌연변이 외피 단백질(D4N, D4Y)을 이용하여 만든 구축물들의 유전자침묵 억제 효율을 확인하기 위하여, GFP 형질전환 담배(Nicotiana benthamiana)에서 녹색형광단백질(GFP)을 과발현시켜 확인하였다. GFP를 갖고 있는 아그로박테리움(35S:GFP)과 유전자침묵 억제 유전자를 갖고 있는 아그로박테리움(35S:P19, 35S:CP, 35S:D4N, 35S:CP:GFP, 35S:D4N:GFP, 35S:P5S:GFP, 35S:YFP:CP, 35S:YFP:D4N 또는 35S:YFP:D4Y)을 LB 배지 5ml (50mg/L kanamycin, 50mg/L rifampicin)에 접종 후, 28℃에서 16시간 배양하고 배양액을 3000rpm으로 상온에서 원심분리하여 세포를 모으고 침윤 용액(10 mM MgCl2, 10 mM MES, 및 200 uM acetosyringone)에 재현탁하였다. 침윤 용액 속의 세포 농도를 OD600 = 0.2로 맞추고 상온에서 3시간 동안 아그로박테리움의 병원성 유전자(virulence gene)를 활성화시켰다. 35S:GFP 아그로박테리움을 유전자침묵 억제 유전자를 갖고 있는 각각의 아그로박테리움 또는 음성 대조구인 유전자침묵 억제유전자를 형질전환하지 않은 아그로박테리움(GV2260) 현탁액과 1:1 비율로 섞고, GFP 형질전환 담배의 성숙한 잎에 주사기를 이용하여 각 현탁액을 주입하고 처리한 식물을 23℃, 습도 20%, 400 μmol m-2 s-1 광도로 명조건 16시간/암조건 8 시간으로 키웠다. 아그로박테리움 처리 2일째부터 UV (365nm) 아래에서 형광 단백질 발현을 관찰하여 유전자침묵 억제 효율을 비교하였다.
그 결과, 식물의 유전자침묵을 억제하는 양성 대조구(P19와 TCV의 CP)에서는 식물의 유전자 침묵 기능이 억제되어 형광 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 억제 효과는 P19 처리에 의해 더 강하게 유도되었다. 유전자침묵 억제 유전자를 처리하지 않은 음성 대조구(GV2260, MOCK)에서는 외부로부터 도입된 형광 단백질 유전자에 의해 유도되는 식물의 유전자침묵에 의해 식물이 갖고 있는 형광 단백질 발현도 사라진 것을 관찰하였다. 형광 단백질이 CP의 C-말단에 융합된 35S:CP:GFP는 음성 대조구인 MOCK을 처리한 것보다 형광단백질의 유전자 침묵이 빠르고 강하게 일어나는 것을 관찰하였다. 반면, CP의 N-말단에 형광단백질을 붙여준 구축물(35S:YFP:CP, 35S:YFP:D4N, 35S:YFP:D4Y)을 처리한 것은 형광단백질의 발현이 35S:CP 처리보다 강하고 P19를 처리한 것과 비슷한 수준을 보였으며 35S:YFP:D4N과 35S:YFP:D4Y가 35S:YFP:CP보다 유전자침묵 억제효과가 더 높은 것을 확인할 수 있었다(도 1A). 이 결과로 CP의 아미노산의 치환과 함께 N-말단에 형광단백질을 융합시키는 것이 CP가 갖고 있는 유전자침묵 억제 기능을 향상시키는 것을 알 수 있다.
위의 결과를 단백질 수준에서 확인하기 위하여 잎의 각 처리구에서 같은 면적의 조직을 채취하여 단백질을 분리하였다. 실험 방법은 채취한 조직을 액체 질소로 얼리고 티슈라이저 (tissuelyser, RETSCH사)를 이용하여 곱게 마쇄한 후, 식물의 단백질 추출 용액(8M Urea, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris-HCl, 90mM KOH, pH8.0) 200ul를 넣고 30초간 vortexing한 후 얼음에서 20분 동안 처리하였다. 13000rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리 후, 상층액을 취하여 각 샘플별로 동량의 단백질을 12% 아크릴아마이드 젤에서 크기별로 분리하고 단백질을 PVDF 막으로 옮겨 GFP 항체를 이용하여 형광단백질을 검출하였다.
그 결과, UV에서 관찰한 결과와 동일하게 35S:YFP:D4Y와 35S:YFP:D4N 처리구에서 식물의 형광단백질 크기인 25kDa의 GFP 밴드가 35S:P19와 비슷하고 35S:YFP:CP보다는 강하게 검출되었다. 그리고 외피 단백질 (D4Y, D4N, CP)과 형광단백질이 융합되어 나타나는 70kDa의 GFP 밴드가 35S:YFP:D4Y 처리구에서는 35S:YFP:D4N 또는 35S:YFP:CP 처리구보다 낮은 농도로 검출되지만 25kDa GFP 밴드는 더 높은 수준으로 검출되어 35S:YFP:D4Y가 식물의 유전자침묵 기능을 가장 효율적으로 억제하는 것을 알 수 있다(도 1B).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. TCV(Turnip crinkle virus)의 외피 단백질(coat protein: CP)의 4번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 티로신(Y)으로 변이된 TCV의 CP 변이체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  4. 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 TCV(Turnip crinkle virus)의 CP(coat protein) 변이체를 코딩하는 유전자.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  6. 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, TCV의 CP 변이체 유전자의 5'말단에 외래 유전자가 인프레임(in frame)으로 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 식물 발현 벡터.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항 또는 제7항의 재조합 식물 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및
    상기 외래 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 담배 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 TCV(Turnip crinkle virus)의 CP(coat protein) 변이체를 이용한 외래 유전자의 침묵 억제를 증진시키는 담배 식물체의 제조 방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자의 침묵 억제가 증진된 형질전환 담배 식물체.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는, TCV(Turnip crinkle virus)의 외피 단백질(coat protein: CP)의 4번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 티로신(Y)으로 변이된 TCV의 CP 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체 내의 외래 유전자의 침묵 억제 증진용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 TCV의 CP 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
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