KR101315342B1 - ＩｂＬＥＡ14 유전자의 리그닌 생합성 조절자로서의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 이용하여 식물의 리그닌 생합성을 증가시키는 방법, 상기 IbLEA14 유전자를 이용한 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 IbLEA14 유전자를 포함하는 식물체의 리그닌 생합성 증가용 조성물 및 상기 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체로부터 얻어지는 바이오에너지에 관한 것이다.

Description

ＩｂＬＥＡ14 유전자의 리그닌 생합성 조절자로서의 용도{Use of IbLEA14 gene as lignin biosynthesis regulator}
본 발명은 고구마 뿌리 유래의 IbLEA14 유전자의 리그닌 생합성 조절자로서의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 이용하여 식물의 리그닌 생합성을 증가시키는 방법, 상기 IbLEA14 유전자를 이용한 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 IbLEA14 유전자를 포함하는 식물체의 리그닌 생합성 증가용 조성물 및 상기 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체로부터 얻어지는 바이오에너지에 관한 것이다.
고구마(Ipomoea batatas L. Lam)는 비교적 척박한 땅에도 재배가 가능할 뿐만 아니라 헥타르당 생산량이 약 22톤으로 높아 식량과 가축사료로 이용되는 대표적인 뿌리작물이다. 특히 고구마는 건물 중의 약 70%가 전분으로 이루어져 주정의 원료 작물로 오래전부터 이용되었으며, 바이오에탄올 생산을 위한 친환경 대체에너지 작물로 최근 재조명되고 있다.
최근 급속한 산업화와 인구증가에 의해 지구규모의 환경문제와 식량문제가 제기되고 있어 사막화지역, 공해지역, 추운 지역 등의 조건이 불리한 지역에서도 잘 자라는 환경재해 내성 농작물 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히 조건 불리 지역에 적합한 산업용 고구마를 개발하기 위하여 분자육종에 의한 환경재해 내성 형질전환 고구마 연구가 시도되고 있다(Kim et al. Mol Breeding 24, 233-244, 2009).
식물 세포벽의 리그닌화(lignification)는 다양한 환경 스트레스에 대한 반응성으로 증가되며, 이는 또한 식물 생장의 감소 및 식물 조직의 구조적 견고함과 연관된다. 리그닌(lignin)은 일반적으로 p-쿠마릴 알코올(p-coumaryl alcohol), 코니프릴 알코올(conifryl alcohol), 시나필 알코올(sinapyl alcohol)과 같은 모노 리그놀의 탈수소 중합화에 의해 생성되며, 이러한 모노 리그놀은 세포질내에서 다양한 모노 리그놀 생합성 관련 효소들에 의해 3 단계의 과정을 통해 만들어진다. 첫 단계는 PAL (phenylalanine ammonia-lyase), C4H (cinnamate 4-hydroxylase), 4CL (4-coumarate:coenzyme A ligase)과 같은 일반적인 페닐 프로파노이드 생합성 경로의 효소들에 의해 이루어지며, 다음 단계는 모노 리그놀의 메틸화에 관련된 COMT (caffeic acid-O-methyl-transferase), CCAOMT (caffeoyl coenzyme A O-methyl-transferase), SAMS (S-adenosyl-L-methionine synthetase), F5H (ferulate-5-hydroxylase)와 같은 효소들에 의해 이루어진다. 마지막 단계로 CCR (hydroxycinnamoyl-CoA:NADPH oxidoreductase)과 CAD (cinnamyl alcohol dehydrogenase)에 의해 모노 리그놀 생합성이 완성된다.
리그닌은 병원균 감염에 대한 물리적 방어 작용뿐만 아니라 건조, 저온, 고광 및 자외선과 같은 다양한 비생물학적 환경재해에 대한 식물의 방어 기작과도 연관된다(Moura et al. J Integr Plant Biol, 52, 360-376, 2010). 특히 건조 스트레스 동안 리그닌 생합성은 세포벽의 물에 대한 불침투성과 관련된 방향족 화합물인 리그닌의 속성 때문에, 세포내의 증산 작용 감소와 건조 조건 동안 정상조건의 팽압 유지를 도와줌으로써 식물의 건조 내성과 연관된다. 그러므로 식물의 리그닌화의 조절은 건조 내성 식물 개발을 위한 하나의 좋은 방법이 될 것으로 생각된다.
본 발명의 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 단백질은 종자가 건조되면서 성숙되는 동안 다량 발현되는 LEA 단백질 그룹들 중 하나로서, LEA 단백질은 종자 성숙뿐만 아니라 건조 스트레스에서도 역시 발현된다. LEA 단백질은 특정한 세포 구조를 보호하거나 이온을 격리하고 세포의 수분 요구량을 최소화로 유지시켜서 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시킨다고 보고되고 있다(Baker et al. Plant Mol Biol 11, 277-291, 1988; Dure et al. Plant Mol Biol 12, 475-486, 1989). 대부분의 LEA 단백질들은 세포질에 존재하며, 친수성 아미노산 잔기들로 구성되어 랜덤 코일(random coil) 혹은 알파-나선(α-helices)으로 이루어져 있다. 하지만 LEA14 단백질은 소수성 아미노산 잔기들이 많이 존재하며 3차 구조를 가지고 있다(Cuming et al. Kluwer Academic Publishers, Dordercht, The Netherlands, pp 753~780, 1999). 최근 애기장대에서 cDNA 마이크로어레이 실험을 한 결과, 건조, 저온 및 염 등과 같은 스트레스 조건에서 LEA14가 정상조건보다 5배 이상 발현되는 것을 확인하였다. 또한, LEA14 단백질은 건조 및 염 등의 다양한 환경 스트레스뿐만 아니라 기계적인 상처에 의해서도 발현이 유도됨이 보고되었다(Seki et al. Plant Cell 13, 61-72, 2001; Singh et al. Protein Sci 14, 2601-2609, 2005). 목화, 콩 및 애기장대 등의 다양한 식물들에서 LEA14가 확인되었으며, 이들은 스트레스 조건에서 식물호르몬인 앱시스산(ABA)에 대해 의존적이거나 독립적으로 발현이 되었다(Wise et al. BMC Bioinformatics 4, 52-70, 2003; Bies-Etheve et al. Plant Mol Biol 67, 107-124, 2008). 하지만 아직 LEA14 유전자의 리그닌 조절에 관한 기능이 보고된 바는 없다.
한국공개특허 제2003-0021618호에는 현사시나무 유래 CCoAOMT 유전자를 이용하여 현사사나무의 리그닌 함량을 감소시키는 방법이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2010-0108057호에는 겨울우산버섯 유래 라카아제 유전자로 형질전환된 리그닌 분해 활성이 강화된 형질전환체가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고구마 뿌리 유래 IbLEA14 유전자를 도입시킨 형질전환 고구마 캘러스에서 리그닌 함량의 증가 및 리그닌 생합성 관련 유전자들의 발현 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 이용하여 식물의 리그닌 생합성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IbLEA14 유전자를 이용한 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IbLEA14 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IbLEA14 유전자를 포함하는 식물체의 리그닌 생합성 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체로부터 얻어지는 바이오에너지를 제공한다.
본 발명의 고구마 뿌리 유래 IbLEA14 유전자는 고구마 캘러스에서 모노 리그놀 생합성 유전자들의 발현 조절을 통해 리그닌 함량을 증가시킨다. 따라서, IbLEA14 유전자를 이용하면 리그닌 함량의 변화를 통해 조건 불리 지역에 적합한 환경 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 개발하거나 바이오 연료 작물을 개발하는데 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2를 이용하여 형질전환시킨 고구마 캘러스 라인에서 항생제 선발 마커 유전자인 HPT (hygromycin phosphotransferase) 및 IbLEA14 cDNA의 도입 여부를 게놈 DNA의 PCR로 분석한 것이다.
도 3은 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2로 형질전환시킨 고구마 캘러스 라인에서 IbLEA14의 발현 양상을 Realtime PCR로 분석한 것이다.
도 4는 IbLEA14 유전자가 과발현된 형질전환 고구마 캘러스에서 IbLEA14 단백질의 발현 수준을 FLAG-tag 항체를 이용하여 분석한 것이다.
도 5는 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2로 형질전환시킨 고구마 캘러스 라인에서 리그닌 염색법 및 정량분석을 이용하여 리그닌의 함량을 분석한 것이다.
도 6은 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2로 형질전환시킨 고구마 캘러스 라인에서 모노 리그놀 생합성 관련 유전자들의 발현 양상을 Realtime PCR로 분석한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbLEA14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 리그닌 생합성을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 IbLEA14 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 IbLEA14 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
IbLEA14 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 IbLEA14 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 쌍자엽 식물은 십자화과, 가지과, 장미과 또는 메꽃과에 속하는 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는, 식물체의 리그닌 생합성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 IbLEA14 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 리그닌 생합성을 증가시킬 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체로부터 얻어지는 바이오에너지를 제공한다. 바이오에너지는 바이오매스를 이용하여 만들어지는 지속가능한 에너지를 말하며, 본 발명의 바이오매스인 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체로부터 생물학적, 화학적, 물리적 변환 과정을 통해 액체연료(바이오에탄올, 바이오디젤), 바이오가스, 고체연료(바이오펠렛) 형태의 바이오에너지를 생산할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 고구마 IbLEA14 유전자의 과발현 벡터 및 RNAi 발현억제 벡터의 제조 및 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 고구마 캘러스
건조 처리한 고구마(Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. White star) 식물체의 실뿌리에서 제작된 고구마 cDNA 라이브러리에서 IbLEA14 유전자를 분리하여, 그 기능 분석을 위해 형질전환 발현 벡터를 제작하였다.
IbLEA14의 과발현을 위해 IbLEA14에 대한 코딩 영역 특이적 프라이머는 attB1와 attB2 염기서열을 포함한 정방향(5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCTGGTGGACAAG-3'; 서열번호 2) 및 역방향(5'-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGCAGCTTCTGCCTC-3'; 서열번호 3) 프라이머를 사용하였다. PCR 최종 산물은 BP 클로나제(clonase) 재조합 반응을 이용한 Invitrogen사의 pDONR 207 벡터에 도입하였으며, BP 클로나제 반응 후 DNA 단편들은 N 말단에 FLAG-tag가 포함된 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2에 CaMV35S 프로모터의 발현조절이 되도록 삽입하였다. 재조합 플라스미드는 아그로박테리움 EHA105 균주를 이용해 고구마 캘러스에 형질전환 하였다(도 1).
형질전환 고구마 캘러스에 도입된 IbLEA14와 HPT 항생제 선발 마커 유전자는 게놈 PCR을 통해 확인하였다(도 2). CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)으로 고구마 캘러스 라인들의 게놈 DNA를 추출한 후, IbLEA14와 HPT 항생제 선발 마커 유전자의 특이적 프라이머 및 Accel Taq Premix 키트(Genedocs사)를 사용하여 도입 여부를 조사하였다. IbLEA14에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3'; 서열번호 4) 및 역방향 (5'-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3'; 서열번호 5) 프라이머를 사용하였으며, HPT 에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GATGTAGCAGGGCGTGGA-3'; 서열번호 6) 및 역방향(5'-GATGTTGGCGACCTCGTA TT-3'; 서열번호 7) 프라이머를 사용하였다. 상기 실험 결과, 두 종류의 벡터가 삽입된 형질전환 캘러스에서 IbLEA14 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있었다.
형질전환 고구마 캘러스의 도입된 IbLEA14 유전자의 발현 수준을 분석하기 위해 Realtime PCR을 수행하였다(도 3). CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)으로 고구마 캘러스로부터 총 RNA를 추출한 후, RNA 2 ㎍을 사용하여 MMLV Reverse Transcription System cDNA 합성 키트(Promega사)로 cDNA를 합성하였다. IbLEA14 유전자 특이적 프라이머 및 Accel Taq Premix 키트(Genedocs사)를 사용하여 IbLEA14 유전자의 발현 양상을 조사하였다. IbLEA14에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3'; 서열번호 4) 및 역방향(5'-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3'; 서열번호 5) 프라이머를 사용하였다. 상기 실험 결과, 과발현 캘러스 라인 3, 7, 8, 11 및 12번은 비형질전환체보다 7배 이상 높은 발현수준을 보였으며, RNAi 라인 2, 5, 9 및 10번은 비형질전환체보다 약 80% 낮은 발현 수준을 보였다.
과발현된 형질전환 고구마 캘러스에 도입된 IbLEA14 단백질의 발현 수준을 분석하기 위해, FLAG-tag 항체를 이용해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 4). 과발현된 7, 8 및 11번 캘러스 라인에서 IbLEA14 단백질이 강한 발현을 나타내었다. 따라서, 상기 결과를 통해 IbLEA14 유전자가 과발현되거나 발현억제된 형질전환 고구마 캘러스가 성공적으로 제작된 것을 확인하였다.
실시예 2: IbLEA14 형질전환 캘러스에서 리그닌의 정량 분석 및 리그닌 생합성 유전자의 발현 분석
형질전환 캘러스에서 리그닌 양의 변화를 확인하기 위해 리그닌 염색 및 정량 분석을 수행하였다(도 5). 리그닌 염색을 위해 고구마 캘러스를 1% 플로로글루시놀(phloroglucinol) 용액에서 16시간 동안 배양하였으며, 멸균수에 세척 후 50% HCl에서 배양하였다(Mlickova et al. Plant Physiol Biochem 42, 753-761, 2004). 리그닌 정량 분석을 위해 티오글리콜산(thioglycolic acid) 방법을 이용하였다(Hatfield and Fukushima, Crop Sci 45, 832-839, 2005). IbLEA14가 과발현된 캘러스 라인들 중 특히 8번이 높은 리그닌 축적을 나타냈으며, RNAi 라인들은 대조군 캘러스와 유사한 결과를 보였다. 리그닌의 정량 분석 결과, 대조군 캘러스에 비해 7 및 8번 과발현 라인들이 1.9 및 3.3배 더 높은 리그닌 양을 나타내었다. 따라서, IbLEA14의 과발현이 형질전환 캘러스에서 리그닌의 양을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
IbLEA14 형질전환 캘러스에서 리그닌 생합성과 연관된 모노 리그놀 생합성 유전자들의 발현 변화를 Realtime PCR을 통해 조사하였다(도 6). PAL 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-CCTTGCACGGTGGCAACTTC-3'; 서열번호 8) 및 역방향(5'-TTGGCAAAGCGCAACGAGAT-3'; 서열번호 9) 프라이머를 사용하였으며, C4H 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-ATCGAGTGGGGCATTGCAGA-3'; 서열번호 10) 및 역방향(5'-TTGGCGTCGTGGAGGTTCAT-3'; 서열번호 11) 프라이머를 사용하였으며, 4CL 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-TATTTGAATGATCCGGCGGC-3'; 서열번호 12) 및 역방향(5'-ACAGCAGCATCTGCAATCATCG-3'; 서열번호 13) 프라이머를 사용하였으며, SAMS 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-AATTGTGCGGGACACTTGCC-3'; 서열번호 14) 및 역방향(5'-AGGGGTCTCATCGGTGGCAT-3'; 서열번호 15) 프라이머를 사용하였으며, COMT 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-CGACAGCCCGATGACAAACC-3'; 서열번호 16) 및 역방향(5'-GAATCCGGTCCAGCATGACG-3'; 서열번호 17) 프라이머를 사용하였으며, CCAOMT 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-AAAGAAGGCCCAGCATTGCC-3'; 서열번호 18) 및 역방향(5'-TTCCTCATTGGAGCATCGGG-3'; 서열번호 19) 프라이머를 사용하였으며, CAD 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-TGGTTGGGGAACCAATGCAC-3'; 서열번호 20) 및 역방향(5'-GCTTTTCGCCTTTTCCTGGG-3'; 서열번호 21) 프라이머를 사용하였다. IbLEA14가 과발현된 형질전환 캘러스에서 세포질내의 모노 리그놀 생합성 관련 유전자인 PAL, C4H, 4CL, COMT, CCAOMT, SAMS 및 CAD의 발현이 증가하였으며, RNAi 라인들은 감소된 경향을 보였다. 따라서, 고구마 캘러스에서 IbLEA14의 과발현에 의한 리그닌의 합성 증가는 모노 리그놀 생합성 관련 유전자들의 발현 조절을 통해 이루어진다는 것을 알 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는 과발현 재조합 벡터를 메꽃과(Convolvulaceae) 식물세포에 형질전환시켜 IbLEA14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 메꽃과 식물의 리그닌 생합성을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IbLEA14 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는 과발현 재조합 벡터로 메꽃과(Convolvulaceae) 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 메꽃과 식물세포로부터 메꽃과 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 메꽃과 식물체의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 IbLEA14 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항의 방법에 의해 제조된 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 메꽃과 식물체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 따른 메꽃과 식물체의 종자.
  9. 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는 과발현 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌 생합성이 증가된 형질전환 메꽃과(Convolvulaceae) 식물체.
  10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마(Ipomoea batatas) 유래 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 유전자를 포함하는, 식물체의 리그닌 생합성 증가용 조성물.
  11. 삭제
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