KR101270232B1 - 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 ｐａｃ 다중 발현 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 ｐａｃ 다중 발현 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로모터와 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 PAC 다중 발현 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 방법, 프로모터와 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 PAC(Psy -2A-TP-CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 식물의 카로티노이드 함량 증가용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 ＰＡＣ 다중 발현 유전자 및 이의 용도{PAC multiple expression gene increasing carotenoid content of plant and uses thereof}
본 발명은 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 PAC 다중 발현 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 프로모터와 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 PAC 다중 발현 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 방법, 프로모터와 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 PAC(Psy-2A-TP-CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 식물의 카로티노이드 함량 증가용 조성물에 관한 것이다.
콩은 잘 알려진 쌍떡잎 작물로서 여러 생육 조건에서도 생육이 가능하므로 전 세계에서 재배되고 있다. 콩은 다른 곡류에 비해 알갱이가 크고 단백질 함량이 40%로 영양이 풍부하며, 단백질 및 지방 함량이 60%로 치즈와 같은 가공식품을 제외하고 단백질과 지방을 가장 많이 함유하고 있는 독특한 작물이다. 특히 쌀을 주식으로 하는 동양인에게 경제적인 단백질원인 동시에 2차 대사 산물도 포함하고 있어서 콩의 기능적인 면을 개선하고자 형질전환을 포함하는 품종 개발 기술을 꾸준히 탐구하고 있다.
1차 대사 산물은 탄수화물, 단백질, 핵산 및 지질 등으로 세포의 기능을 수행하는데 없어서는 안 될 필수 화합물을 일컫는다. 반면, 식물체에서는 생존에 필수적이지 않는 화합물이 많이 있는데 이를 2차 대사 산물이라고 한다. 2차 대사 산물은 구조 및 합성 과정에 따라 크게 알칼로이드(alkaloids), 테르펜(terpen), 페놀 화합물(phenolic compound), 그리고 기타 화합물(other compound) 등으로 나눌 수 있다.
카로티노이드는 식물, 세균, 조류(algae), 곰팡이에서 합성되는 황색, 오렌지색, 및 적색 천연색소로 널리 분포된 이소프레노이드(isoprenoid)의 서브패밀리(subfamily)이다(Goodwin TW, Britton G: Distribution and analysis of carotenoids. In: Plant Pigments. Edited by Goodwin TW. London: Academic Press; 1988: 61-132). 카로티노이드는 카로틴(carotene)과 크산토필 (xanthophyll)의 총칭이다. 카로티노이드는 식물의 세포 내 색소체에서 합성되어 저장된다. 잎 등 클로로필이 있는 조직의 엽록체와 과실, 종자, 꽃 등 클로로필이 없는 조직의 잡색체에 축적된다. 엽록체의 카로티노이드는 광합성을 할 때 광흡수에 관여하며 과다한 빛 에너지로부터 세포를 보호한다. 과실, 종자, 꽃 등의 카로티노이드는 붉은색 계열의 색깔을 가지므로 자신의 종자를 번식하기 위한 동물 유인의 도구로써 사용하기도 하며 식물호르몬인 ABA(앱시스산) 합성을 위한 전구물질이기도 하다. 카로티노이드를 생합성 할 수 없는 동물에서는 음식물을 통해 카로티노이드를 섭취하게 되는데 이는 비타민 A 전구체로서 이용한다. 또한 항산화 물질 및 암 발생 예방 물질로서 영양성과 기능성이 우수한 화합물로 입증되어 왔다(Ha et al., 2003, Korean J. Plant Biotechnology Vol. 30, No. 1, 81~95).
카로티노이드 생합성 유전자들에 대한 연구는 1990년대 초반부터 본격화되었고, 현재까지 거의 모든 종류의 카로티노이드 생합성에 관련된 유전자들이 분리되었다. 이를 기초로 하여 2000년에 황금쌀(golden rice)이 개발되면서 카로티노이드 대사공학을 위한 성공적인 첫 걸음마가 시작되었다(Ha et al., 2003, Korean J. Plant Biotechnology Vol. 30, No. 1, 81~95). 카로티노이드가 생성되지 않는 식물 조직에서 베타카로틴 및 카로티노이드의 생성을 시도한 연구는 수선화(Narcissus pseudonarcissus) Psy 유전자를 벼 배유-특이적(endosperm-specific) 글루텔린(glutelin) 프로모터 Gt1에 연결하여 생성된 벼 종자에서 피토엔(phytoene) 성분이 검출된 시도에서 시작되었다(Burkhardt et al., 1997, Plant J 11: 1071~1078). 3년 뒤 독일 프라이브룩 대학 피터 베이어(Peter Beyer) 교수와 스위스 연방공과대학 인고 포트리쿠스(Ingo Potrykus) 교수의 공동연구에서, Gt1 :: Psy /35S:: tp :: CrtI와 Gt1 :: Lcy의 이중 형질전환에 의해 벼 종자에서 베타카로틴이 생성되어 쌀이 황금색으로 변한 이른 바 황금쌀(GoldenRice, GR)이 사이언스지에 발표되었다(Ye et al., 2000, Science 287: 303-305). 국내의 경우, 농촌진흥청 국립농업과학원 하선화 박사가 Glb :: P sy ::2 A :: tp :: C rtI와 Glb :: P sy :: I RES :: tp :: C rtI의 벼 형질전환을 통해 베타카로틴을 생성하는 벼를 생산하여 Plant Biotechnology에 발표하였다(Ha et al., 2003, Korean J. Plant Biotechnology Vol. 30, No. 1, 81~95).
아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카 등 최소한 26개국 이상의 나라는 쌀을 주식으로 한다. 특히 서남아시아에서는 5세 이하의 어린이의 70%가 비타민 A 결핍증(avitaminosis A)에 의해 고통을 받고 있다. 유니세프(UNICEF, United Nations Children's Fund)가 발표한 보고서에 의하면 영양학적으로 증가된 비타민 A 함량에 의해 매년 1세에서 4세 사이의 어린이 100~200만 명이 목숨을 구할 것이라고 예측되었다. 황금쌀의 베타카로틴 함유량이 쌀 100 g 당 200 ㎍ 정도라고 볼 때 매일 쌀 300 g으로부터 RAD 기준의 1/10 정도의 프로비타민 A를 섭취하게 되는 것이다 (Giuliano et al., 2000, Trends Plant Sci 5: 406~409).
그 동안 우리나라의 콩 형질전환은 조직배양을 통한 콩 식물체 재분화 기술에 있어서 미흡한 점이 많았고, 다른 작물과 달리 외래 유전자 도입이 어려워 안정적인 형질전환 기술 체계가 아직 확립되지 못하였다. 일부 실험실에서 부분적인 성공 사례는 있었으나 지속적인 결과 도출에는 실패하였다. 본 발명자들은 미국과 일본을 방문하며 연구한 결과 2006년에 자체 개발기술로 국내 품종으로 제초제 저항성 형질전환 콩을 생산하였고, 현재 국내 발굴 유용 유전자를 이용한 콩 형질전환체를 대량 생산할 수 있게 되었다.
콩이 가장 많이 이용되고 있는 품목은 콩나물 33.2%, 장류 31.2%, 두부 26.6% 및 두유 9.0% 등으로 흔히 잘 알려진 콩 가공식품형태로 소비되고 있다. 콩 전통식품의 세계화와 콩 관련 산업 활성화를 위해서는 원료인 콩의 기능성 강화와 품질의 고급화 가공기술의 개발이 무엇보다도 시급한 것으로 사료된다. 동양의 전통식품으로만 알려져 있던 콩 식품은 최근 건강 기능성 성분을 다량 함유한 식품으로서 우수성이 크게 알려지면서 서양에서도 콩 식품 관련 산업규모가 크게 성장하고 있다. 따라서, 본 발명자들은 콩의 카로티노이드 함량을 증가시키기 위해 β-콘글라이신(β-conglycinin) 프로모터 및 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 이용하여 콩을 형질전환시켰다.
한국공개특허 제2011-0052865호에는 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 베타카로틴 히드록실라제 유전자가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2011-0052862호에는 식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 라이코펜 ε-사이클라아제 유전자가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 β-콘글라이신(β-conglycinin) 프로모터 및 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 콩에서 카로티노이드 함량이 증가한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 프로모터와 고추(Capsicum annuum) 유래 Psy(phytoene synthase) 유전자, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래 2A 뉴클레오티드 서열, 벼(Oryza sativa) 유래 TP(transpeptide) 유전자 및 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) 유래 CrtI(carotene desaturase) 유전자가 5'에서 3' 방향으로 순서대로 연결된 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 PAC 다중 발현 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로모터와 고추(Capsicum annuum) 유래 Psy(phytoene synthase) 유전자, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래 2A 뉴클레오티드 서열, 벼(Oryza sativa) 유래 TP(transpeptide) 유전자 및 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) 유래 CrtI(carotene desaturase) 유전자가 5'에서 3' 방향으로 순서대로 연결된 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는, 식물의 카로티노이드 함량 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, β-콘글라이신(β-conglycinin) 프로모터 및 PAC(Psy -2A-TP-CrtI) 다중 발현 유전자를 이용하면 야생형에 비해 20~36배 카로티노이드 함량이 증가된 콩 식물체를 제조할 수 있으므로, 콩의 기능성 강화 및 고품질화뿐만 아니라 콩 식품산업의 활성화에도 유용할 것으로 사료된다.
도 1은 β-콘글라이신 프로모터 및 35S 프로모터를 이용한 두 가지 재조합 벡터(β-PAC 및 35S-PAC)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 벡터 β-PAC 및 35S-PAC를 이용하여 형질전환시킨 콩 식물체의 생장 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 β-PAC T0 및 35S-PAC T0 형질전환체의 T1 종자(A), T2 종자(B), 그리고 야생형 및 라인(line) 13 종자의 단면(C)을 나타낸 것이다. WT: 야생형, EV: 공벡터(empty vector).
도 4는 β-PAC T0 형질전환체와 35S-PAC T0 형질전환체에서 삽입 유전자를 확인하기 위해 수행한 PCR 결과를 나타낸 것이다. NC: 음성 대조군, PC: 양성 대조군.
도 5는 β-PAC T0 형질전환체와 35S-PAC T0 형질전환체에서 삽입 유전자를 확인하기 위해 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. NC: 음성 대조군.
도 6은 β-PAC T0 형질전환체와 35S-PAC T0 형질전환체에서 삽입 유전자를 확인하기 위해 수행한 서던 블로팅(Southern blotting) 결과를 나타낸 것이다. NC: 음성 대조군, EV: 공벡터.
도 7은 β-PAC 형질전환체와 35S-PAC 형질전환체의 잎 및 종자에서 삽입 유전자의 발현을 확인하기 위해 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. NC: 음성 대조군, EV: 공벡터.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터와 고추(Capsicum annuum) 유래 Psy(phytoene synthase) 유전자, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래 2A 뉴클레오티드 서열, 벼(Oryza sativa) 유래 TP(transpeptide) 유전자 및 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) 유래 CrtI(carotene desaturase) 유전자가 5'에서 3' 방향으로 순서대로 연결된 PAC(Psy-2A-TP-CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 PAC 다중 발현 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터는 프로모터와 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함할 수 있으며, 이외에도 터미네이터, 선발 마커 등을 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 바람직하게는 β-콘글라이신(β-conglycinin) 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 카로티노이드는 α-카로틴(α-carotene) 또는 β-카로틴(β-carotene)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 PAC 다중 발현 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 PAC 다중 발현 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
PAC 다중 발현 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜메파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 β-PAC 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 본 발명은 프로모터와 고추(Capsicum annuum) 유래 Psy(phytoene synthase) 유전자, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래 2A 뉴클레오티드 서열, 벼(Oryza sativa) 유래 TP(transpeptide) 유전자 및 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) 유래 CrtI(carotene desaturase) 유전자가 5'에서 3' 방향으로 순서대로 연결된 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, PAC 다중 발현 유전자는 전술한 바와 같다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 대두(Glycine max)이다.
상기 쌍자엽 식물은 콩과(Leguminosae), 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 PAC(Psy -2A- TP - CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는, 식물의 카로티노이드 함량 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 PAC 다중 발현 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 PAC 다중 발현 유전자를 포함하며, 상기 PAC 다중 발현 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 카로티노이드 함량을 증가시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
콩 형질전환 벡터 제작
농촌진흥청 농업생명공학연구원 하선화 박사에게서 Entry-PAC (Psy-2A-CrtI)을 분양받았다. 분양받은 Entry-PAC를 목적 벡터(Destination vector)인 pB2GW7.0 및 pB2GW7.0-β(35S 프로모터를 β-콘글라이신(β-conglycinin) 프로모터로 대체한 벡터)에 삽입하기 위해서 Invitrogen사의 Gateway® LR ClonaseTM Enzyme mix Kit를 사용하였다. 그 다음에 Invitrogen사의 DH5α를 컴피턴트 세포(competent cell)를 사용하여 형질전환하였다. 상기 제조된 pB2GW7.0- PAC와 pB2GW7.0-β- PAC 벡터는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주에 형질전환하였다.
콩 형질전환체 생산 및 T 1 종자 생산
종자 소독 및 침지
종자는 강 염산(12N HCl 5㎖)과 락스(12% 차아염소산나트륨 100 ㎖)를 혼합하여 발생시킨 염소 기체에 20시간 동안 소독을 한 뒤, 1% 차아염소산나트륨에서 10분간 교반하면서 2차 소독을 하였다. 멸균수를 이용하여 10분 간격으로 3회 세척하였다. 상기 소독한 종자를 50㎖ 튜브에 넣고 멸균수를 부어 20시간 동안 상온에서 침지시켰다.
아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens )의 준비
pB2GW7.0- PAC 및 pB2GW7.0-β- PAC 벡터가 삽입된 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105 균주를 사용하였다. 상기 균주를 고체 YEP 배지(스펙티노마이신 50 ㎎/ℓ, 리팜피신 25 ㎎/ℓ, 펩톤 10 g/ℓ, 염화나트륨 5 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, 한천 1.5 % (w/v), pH 7.0)에 스트리킹(streaking)한 후 25℃에서 배양하여 생성된 단일 콜로니를 같은 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 10 ㎖에 넣고 OD650 0.8이 될 때까지 25℃에서 250 rpm으로 교반하였다. 상기 다 자란 배양액에 30% 글리세롤 저장용액을 10 ㎖ 넣고 볼텍싱한 후, 1.5㎖ 튜브에 1㎖씩 분주하여 액체 질소로 급속 냉각한 다음 -70℃에서 보관하였다. 접종 하루 전에, 상기 보관해 놓은 아그로박테리움 튜메파시엔스(컴피턴스 세포) 1㎖를 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 200㎖에 넣고 OD650이 0.8~1.0이 될 때까지 25℃에서 250 rpm으로 교반하였다.
접종 당일에 액체 YEP 배지 200㎖을 50㎖씩 각각 나눠서 20℃, 3,270×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각각의 튜브에 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스 펠렛을 액체 공배양 배지(B5 염 0.32 g/ℓ, 벤질아데닌 1.67 ㎎/ℓ, MES(N-morpholinoethane sulphonic acid) 20 mM, 지베렐린산(gibberellic acid) 0.25 ㎎/ℓ, 아세토시린곤(acetosyringone) 0.2 mM, L-시스테인 3.3 mM, 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate) 1.0 mM, DTT 1.0 mM, 수크로스 3% 및 pH 5.4)에 고농도 및 저농도로 나누어 부유시켰다. 상기 고농도 농축액은 액체 공배양 배지를 5 ㎖ 넣고, 저농도는 액체 공배양 배지를 15 ㎖ 넣어 만들었다.
접종 및 공배양
침지해 놓은 종자의 양 떡잎 사이로 수술용 칼(scalpel)을 넣어 하배축까지 수직으로 자르고 종피를 제거하였다. 배축(Hypocotyl)을 떡잎 밑 약 1 ㎝ 되는 곳에서 자른 후, 배축이 붙어있는 한 쪽을 수술용 칼(＃11 칼날)로 8~10회 정도 상처를 내었다. 이 때 수술용 칼에 5 ㎖ 농축액을 묻힌 다음 타겟 부위에 상처를 내었다. 대략 50개 정도의 외식편(explant)을 15 ㎖ 농축액이 든 튜브에 넣고 초음파 처리 20초, 데시케이터 및 다이어프램 펌프를 이용한 진공 처리를 30초 동안 한 뒤 30분 동안 접종시켰다.
상기 외식편을 튜브에서 꺼내 멸균한 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤, 고체 공배양 배지(액체 공배양 배지와 동일, 한천 0.5 %)에도 여과지를 한 장 깔고 향배축면을 아래로(adaxial side down) 10개체를 올려두었다. 미세공(micropore)으로 봉한 뒤 25℃, 18시간의 광주기에서 5일 동안 공배양 하였다.
세척 및 신초 유도
5일간 공배양 후에 제균을 위해서 액체 1/2 신초 유도배지(B5 염 1.6 g/ℓ, 벤질아데닌 835 ㎕/ℓ, MES 1.5 mM, 수크로스 1.5 %, 세포탁심 250 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린(ticarcillin) 100 ㎎/ℓ 및 pH 5.6)에 10분 동안 간단히 세척하였다. 외식편을 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤 선발 항생제가 없는 신초 유도배지-①(B5 염 3.2 g/ℓ, 벤질아데닌 1.67 ㎎/ℓ, MES 3 mM, 한천 0.6 %, 수크로스 3 %, 세포탁심 250 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린 100 ㎎/ℓ 및 pH 5.6)에 한 플레이트당 5개체씩 배축 부분이 배지에 고착되고 재분화될 부분이 30℃ 정도의 각도로 평평한 면이 위로 향하도록(flat side up) 치상하였다. 각각의 플레이트를 미세공으로 봉한 뒤 25℃, 18시간의 광주기에서 배양시켰다.
2주 후 신초가 나온 외식편을 선발 항생제가 들어있는 신초 유도배지-②(B5 염 3.16 g/ℓ, MES 3 mM, 벤질아데닌 1.67 ㎎/ℓ, 수크로스 3 %, 한천 0.6 %, 세포탁심 500 ㎎/ℓ, DL-포스피노트리신(DL-phosphinothricin) 10 ㎎/ℓ 및 pH 5.6)에 치상하였는데, 이 때 신초을 제외한 나머지 부분은 잘라버리고 향배축면을 아래로(adaxial side down) 치상하였다.
신초 신장
2주 후 갈변한 신초/신초 패드(pad)는 수술용 칼(＃15 칼날)로 깎아내고 선발 항생제가 들어있는 신초 신장배지(MS 염 4.4 g/ℓ, MES 3 mM, 지베렐린산 0.5 ㎎/ℓ, 아스파라긴 50 ㎎/ℓ, 피로글루타민산(Pyroglutamic acid) 100 ㎎/ℓ, 인돌아세트산 0.1 ㎎/ℓ, 제아틴-리보시드(Zeatin-riboside) 1 ㎎/ℓ, 수크로스 3 %, 한천 0.8 %, 세포탁심 250 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린 100 ㎎/ℓ, DL-포스피노트리신 5 ㎎/ℓ, pH 5.6)에 치상하였다. 2주마다 새로운 신초 신장배지로 옮겨주면서 신초의 갈변 부위는 수술용 칼(＃15 칼날) 윗면으로 제거하고 신초 패드는 조금씩 계속 깎아내어 배지가 잘 흡수되도록 하였다.
뿌리 형성 및 잎 페인팅( leaf painting )
신초 신장배지에서 선발을 거치면서 신장된 신초가 4 ㎝ 이상 일 때 수술용 칼(＃11 칼날)로 잘라 발근배지(MS 염 4.4 g/ℓ, MES 3 mM, 아스파라긴 25 ㎎/ℓ, 피로글루타민산 25 ㎎/ℓ, 수크로스 3 %, 한천 0.8 %, 세포탁심 50 ㎎/ℓ, 반코마이신 50 ㎎/ℓ, 티카실린 50 ㎎/ℓ, pH 5.6)로 옮겼다. 이때 잘라서 분리해낸 신장된 신초의 밑 부분을 1 ㎎/㎖ 인돌부틸산에 3분 동안 담가뒀다가 빼내어 발근배지가 들어있는 시험관에 넣었다. 1∼2주가 경과한 후 2개 이상의 뿌리가 나오면 3차 증류수로 배지를 씻어내고 상토(바이오 프러그 2호, 흥농종묘)와 버미큘라이트를 2:1로 섞어 넣은 작은 화분(6 ㎝ × 6 ㎝ × 5.6 ㎝)에 심었다. 상기 화분은 다시 마젠타 박스(Magenta box) 안에 넣어 25℃, 18시간의 광주기에서 생장시켰다. 10일 정도 경과 후 100 ㎎/ℓ DL-포스피노트리신으로 잎 페인팅(leaf painting)을 하였다.
종자수확
잎 페인팅으로 유전자 도입을 확인한 식물체를 큰 화분(20 ㎝ × 20 ㎝ × 20 ㎝)으로 옮겨 심고 투명한 플라스틱 덮개(12 ㎝ × 12 ㎝ × 18 ㎝)에 10개의 작은 구멍을 만들어 씌운 후 식물체가 적당히 자랐을 때 덮개를 제거하고 종자를 수확하였다.
삽입 유전자의 도입 확인
PCR 및 서던 분석
형질전환체들의 잎은 CTAB(certyltrimethyl-ammonium bromide) 방법을 통해서 총 게놈 DNA를 분리하였다. 도입 유전자인 PAC과 선별항생제 유전자인 BAR의 서열을 이용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다. PAC-F (5'-AAT CCC TTC GCC ACC TCA TCC ATT-3'; 서열번호 2) 및 PAC-R (5'-CAT GTA ATG CTG CTC AAG GTA CGC-3'; 서열번호 3), BAR -F (5'-ATG AGC CCA GAA CGA CGC CC-3'; 서열번호 4) 및 BAR -R (5'-TCA GAT TTC GGT GAC GGG CA-3'; 서열번호 5)이다. 또한 T-DNA의 삽입 여부를 알아보기 위해 LB(left board) 및 RB(right board) 부분도 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다. LB 부분은 left board-F (5'-TGG CTG GTG GCA GGA TAT ATT GTG-3'; 서열번호 6) 및 BAR-R (5'-AGA CAA GCA CGG TCA ACT TCC GTA-3'; 서열번호 7)를 사용하고 RB 부분은 PAC-F (5'-AAT CCC TTC GCC ACC TCA TCC ATT-3'; 서열번호 2)와 right board-R (5'-TTA AAC TGA AGG CGG GAA ACG ACA-3'; 서열번호 8)를 사용하였다.
광안콩 및 각각의 형질전환체 라인별로 약 30 ㎍ 게놈 DNA를 HindIII로 밤새 절단(overnight digestion)하였다. 상기 절단한 DNA를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하였다. 상기 분리된 DNA를 모세관 현상을 이용하여 나일론 막(Hybond-N+, Amersham, UK)으로 이동시켰다. 상기 DNA가 부착된 나일론 막은 [32P] dCTP로 표지된 프로브와 LaddermanTM labeling kit(Takara, Japan)를 사용하여 0.25 M 염화나트륨, 0.1 M 인산나트륨(pH 7.2), 0.25 mM EDTA, 7% SDS 및 50% 포름아마이드가 포함된 용액과 함께 55℃에서 24시간 동안 혼성화(hybridization)시켰다. 상기 막은 2× SSC/0.1% SDS로 55℃에서 10분간 세척하였고, X-ray 필름에 3일간 -80℃에서 노출시켰다.
RT - PCR
Plant RNA Purification Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 광안콩 및 형질전환체의 잎과 종자에서 총 RNA를 추출하였다. RT-PCR은 Maxime RT-PCR PreMix(iNtRON, KOREA)를 사용하였다. 도입유전자인 PAC과 선별유전자인 BAR의 전사 수준을 알아보기 위해 반정량 RT-PCR을 수행하였다.
카로티노이드 추출 및 HPLC 분석
콩 종자를 Ye 등(Science, 287, 303-305 (2000)) 및 Paine 등(Nat. Biotechnol, 23, 482-487 (2005))의 방법으로 곱게 갈았다. 0.1% 부틸 하이드록시톨루엔(butyl hydroxytoluene, BHT)이 포함되어 있는 아세톤을 이용하여 상기 0.1 g의 샘플에서 카로티노이드를 추출하였다. 가수분해 후 디에틸 에테르 및 0.1% BHT가 포함되어 있는 추출액의 유기물층을 액체 질소로 진공 건조시켰다. 나머지는 아세톤으로 용해하였고 HPLC로 분석하기 전에 0.45-㎛ Teflon PTFE 멤브레인 필터로 여과시켰다. 모든 추출액을 추출하는 과정은 단백질 색소체가 분해되는 것을 피하기 위해서 부드러운 빛 아래서 수행하였다. HPLC 시스템은 오토-샘플러(auto-sampler), 컬럼 오븐(column oven), 바이너리 펌프(binary pump) (Agilent, Santa Clara, CA, USA), YMC ODS C-30 column(3 l m, 4.6 mm × 250 mm; YMC Europe, Germany)이 장착된 Agilent 1100 시리즈로 구성되었다. UV-가시광선 검출기는 472 nm에서 라이코펜을, 그리고 450 nm에서 α-카로틴, β-카로틴, β-크립토크산틴(β-cryptoxanthin), 루테인(lutein) 및 제아크산틴(zeaxanthin)을 측정하는데 사용되었다. Chemstation software (Agilent)는 HPLC 시스템을 작동하고 데이터를 계산하는데 사용되었다. 총 카로티노이드의 양은 라이코펜, α-카로틴, β-카로틴, β-크립토크산틴, 루테인 및 제아크산틴의 합을 계산하였다.
실시예 1: 형질전환체 벡터 및 형질전환체 생산
종자에 특이적으로 반응하는 β-콘글라이신 프로모터와 모든 식물체에서 과발현되는 35S 프로모터를 사용하여 두 가지 형질전환용 벡터를 제작하였다(도 1). PAC 유전자가 삽입된 형질전환체는 도 2와 같이 식물의 분화를 거쳐 형질전환체를 21개체(β-PAC) 및 19개체(35S-PAC)를 각각 생산하였다.
실시예 2: T 1 및 T 2 종자의 색 조사
β-PAC T0 형질전환체에서 T1 종자를 수확하였다. 수확한 T1 종자 중 4개의 라인에서 적색을 지닌 종자를 확보할 수 있었다. 반면, 35S-PAC T0 형질전환체에서 T1 종자를 수확하였지만 단 한 개의 라인에서도 적색을 나타내는 종자는 확보할 수 없었다. 상기 확보된 T1 종자를 파종하여 T2 종자를 수확하였다. 그 결과, T2 종자에서도 적색 계열의 색을 나타내었다(도 3).
실시예 3: 삽입 유전자의 도입 확인
β-PAC T0 형질전환체와 35S-PAC T0 형질전환체에서 삽입 유전자를 확인하기 위해 PCR, RT-PCR 및 서던 블로팅(Southern blotting)을 수행하였다(도 4 내지 6). 종자에서도 삽입유전자의 발현을 확인하기 위해서 RT-PCR(도 7)을 수행하였다.
PCR을 수행한 결과, 대부분의 형질전환체에서 도입유전자인 PAC과 선발항생제인 Bar의 삽입을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, LB(left board) 및 RB(right board) 부분도 증폭된 것을 확인하였다. 그리고 형질전환체 중에서 적색계열의 종자를 나타낸 형질전환체와 그렇지 않은 형질전환체를 선발하여 서던 블로팅을 한 결과, 대부분의 형질전환체에서 두 개 또는 세 개 이상의 copy 수를 보였다. 마지막으로 서던 블로팅을 실험한 동일한 형질전환체들을 이용하여 잎과 종자에서 RT-PCR을 수행한 결과, 종자보다 잎에서 도입유전자인 PAC의 발현이 더 높게 나타났다.
실시예 4: β- PAC 과 35S- PAC 형질전환체의 카로티노이드 성분
두 종류의 형질전환체에서 확보된 종자를 가지고 카로티노이드 분석을 한 결과, 광안콩(WT, 야생형) 및 공벡터(EV)에 비해서 β-PAC T2 종자의 전체 카로티노이드 함량이 적게는 20배, 많게는 36배가 증가한 것을 알 수 있었다. 그에 반해 35S-PAC T2 종자의 전체 카로티노이드 함량은 1.5배나 2.2배 정도 증가한 것을 알 수 있었다. 상기 결과에서 흥미로운 점은 β-카로틴 함량만 증가한 것이 아니라 α-카로틴 함량도 같이 증가한 것이다(표 1).
Figure 112011066051048-pat00001
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 프로모터와 고추(Capsicum annuum) 유래 Psy(phytoene synthase) 유전자, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래 2A 뉴클레오티드 서열, 벼(Oryza sativa) 유래 TP(transpeptide) 유전자 및 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) 유래 CrtI(carotene desaturase) 유전자가 5'에서 3' 방향으로 순서대로 연결된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PAC(Psy-2A-TP-CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 PAC 다중 발현 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 β-콘글라이신(β-conglycinin) 프로모터인 것을 특징으로 하는 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 카로티노이드는 α-카로틴(α-carotene) 또는 β-카로틴(β-carotene)인 것을 특징으로 하는 식물의 카로티노이드 함량을 증가시키는 방법.
  5. 프로모터와 고추(Capsicum annuum) 유래 Psy(phytoene synthase) 유전자, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래 2A 뉴클레오티드 서열, 벼(Oryza sativa) 유래 TP(transpeptide) 유전자 및 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) 유래 CrtI(carotene desaturase) 유전자가 5'에서 3' 방향으로 순서대로 연결된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PAC(Psy-2A-TP-CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 식물체의 제조 방법.
  6. 제5항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 카로티노이드 함량이 증가된 형질전환 식물체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 대두(Glycine max)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  9. 제6항에 따른 식물체의 종자.
  10. 고추(Capsicum annuum) 유래 Psy(phytoene synthase) 유전자, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래 2A 뉴클레오티드 서열, 벼(Oryza sativa) 유래 TP(transpeptide) 유전자 및 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) 유래 CrtI(carotene desaturase) 유전자가 5'에서 3' 방향으로 순서대로 연결된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PAC(Psy-2A-TP-CrtI) 다중 발현 유전자를 포함하는, 식물의 카로티노이드 함량 증가용 조성물.
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Sun-Hwa Ha 등. Plant Biotechnology Journal. 8(8), 페이지 928-938 (2010)*
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Sylvain Chamberland 등. Plant Molecular Biology. 19(6), 페이지 937-949 (1992)*

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