CN115386583A - 黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。本发明黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7的编码区序列如SEQ NO.1所示，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7序列中的ALWL结构域和CCMC酶活性位点用于抑制茉莉酸信号通路；过表达转基因植株负调控对灰霉病的抗性。本发明将植物中所述基因CsGRX7进行过表达使植物的活性氧更容易激发，茉莉酸信号通路受抑制而对病害更易感，在田间栽培可将其作为易感的标记植物，及时对其进行病害感染的田间观察，根据其病害进程及时进行病害防治；相应的，若进行降低该基因的表达使植物获得较强的抗性，并进行抗病种质培育的应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。
背景技术
灰霉病由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起，常常由幼嫩的开花部位进行侵染，尤其是环境湿度大时病原菌累积，导致幼果从开花的部位感病，从而造成化瓜。黄瓜(Cucumis sativus L.)作为一种喜温类蔬菜，由于其喜温怕寒的特性，多在设施中进行栽培，但设施中较高的湿度和温度极易造成灰霉病的发生与蔓延，且连年种植也极易引起病原菌的积累，从而造成严重的连作障碍。
随着设施黄瓜栽培的快速发展和栽培面积的扩大，低温高湿的环境条件使灰霉病的发生越来越严重。在对灰霉病等真菌性病害的反应中，一些关键的调控基因在应对病原菌侵染和防御反应中起非常重要的作用，在病原菌侵染过程中，它们通过调控关键基因编码的蛋白氧化还原状态的改变、活性氧的诱导以及关键信号通路的调节等，积极参与对病害的防御反应，使植物表现为对病害敏感或者抗病。尤其通过对病害的防御反应，使植株对病原菌的侵染表现出敏感反应，诱导植物的防御反应或者启动相应基因的表达，从而正调控或者负调控病原菌侵染进程。因此，挖掘植物关键的调控基因，通过解析调控基因的功能从而明晰病原菌对植物的致病机理，对病原菌的侵染进行防御非常重要。
目前生产上灰霉病主要集中在幼嫩的开花部位进行侵染，环境湿度大时幼果易感病，从而造成化瓜。在发病初期，由于病害发病部位在开花部位，尤其是湿度大的时候容易发病，症状隐藏，难以观察，等病害进程加快造成化瓜时，再进行防治就会太晚。因此，随着人们对病害潜在机制了解的日益深入，利用易感植株作为标记植物对病害及时进行观察，或者利用基因敲除技术敲除易感基因降低其表达水平，培育灰霉病抗病种质。黄瓜灰霉病的抗病育种研究及品种创制进展较为缓慢，因此，明确黄瓜对灰霉病抗性反应的机理，提高和改良黄瓜灰霉病的抗病性，对黄瓜抗病种质创制具有重要的理论和实践意义。
近年来，越来越多的证据表明植物CC型谷氧还蛋白基因对植物氧化还原调节及信号通路的调控方面发挥了重要作用。谷氧还蛋白(GRX)是广泛存在于原核和真核生物一类小分子蛋白，可通过巯基(-SH-)与二硫键(-S-S-)形式之间的交换来参与机体在各种环境下复杂的蛋白质氧化修复和调节过程，从而实现对蛋白功能的调控。CC型是陆生植物中所特有的一类谷氧还蛋白，具有多种生物学功能，如参与氧化应激及细胞凋亡、花器官发育、响应干旱及盐等非生物胁迫，以及植物抗病反应等。但黄瓜中的CC型谷氧还蛋白如何参与黄瓜防御灰霉病等问题人们还不甚明了，关于它在参与调控相应的信号通路中的作用还不清楚，因此，研究黄瓜谷氧还蛋白基因在灰霉胁迫下是如何发挥作用的，其关键结构域对于信号通路调控的作用等，有助于人们明确谷氧还蛋白参与的氧化还原调控机制，能够进一步了解黄瓜在抵御灰霉侵染进程中的信号转导机制，从而为黄瓜的病虫害防治及抗病育种等研究奠定基础。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，将植物中所述基因CsGRX7进行过表达使植物的活性氧更容易激发，茉莉酸信号通路受抑制而对病害更易感，在田间栽培可将其作为易感的标记植物，及时对其进行病害感染的田间观察，根据其病害进程及时进行病害防治；相应的，若进行降低该基因的表达使植物获得较强的抗性，并进行抗病种质培育的应用。
为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7，其特征在于：该基因的编码区序列如SEQ NO.1所示。
黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。
进一步，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在过表达植株中通过增加活性氧的累积，抑制茉莉酸信号通路。
进一步，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7序列中的ALWL结构域和CCMC酶活性位点用于抑制茉莉酸信号通路；过表达转基因植株负调控对灰霉病的抗性。
进一步，转基因植株为拟南芥。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
1)本发明黄瓜CC型谷氧还蛋白CsGRX7的氨基酸序列具备CCMS酶活性位点和C末端ALWL结构域；参与了灰霉菌侵染条件下活性氧的积累。
2)本发明黄瓜CC型谷氧还蛋白CsGRX7参与了茉莉酸JA信号通路的抑制，其中CsGRX7氨基酸序列中ALWL结构域和CCMC活性位点是抑制JA信号通路必需的。黄瓜谷氧还蛋白基因过表达能明显负调控对灰霉菌的抗性。在定量接种灰霉孢子悬浮液后，CsGRX7过表达拟南芥叶片病斑面积显著大于野生型。上述结果表明黄瓜CC型谷氧还蛋白基因CsGRX7负调控植株对灰霉菌的抗性反应。
附图说明
图1为CsGRX7氨基酸序列的酶活性位点和氨基酸末端的保守结构域及对酶活性位点和末端保守结构域的突变。其中，A：CsGRX7氨基酸序列的酶活性位点和氨基酸末端的保守结构域；B：CsGRX7酶活性位点和末端保守结构域突变前后的氨基酸序列比对；C：对构建的植物表达载体pB2HA-CsGRX7SSMS及pB2HA-CsGRX7ALWA酶切检测；其中M泳道为DL2000Marker；a泳道为pB2HACsGRX7SSMS酶切检测；b泳道为pB2HACsGRX7ALWA酶切检测。
图2为CsGRX7瞬时表达对华北型黄瓜No.26活性氧爆发的影响。其中，A：CsGRX7在黄瓜子叶中的表达情况；B：flg22诱导后不同处理对活性氧含量爆发的影响；C：定量测定flg22诱导后不同处理的活性氧曲线下面积。
图3黄瓜CsGRX7基因的原生质体瞬时转化对LUC酶活性的影响，其酶活性的高低可以反映茉莉酸JA信号通路的标记基因PDF1.2的表达水平。
图中：在原生质体瞬时表达体系中荧光素酶作为ORA59转录因子的报告基因，而EIN3(ethylene insensitive 3)作为激发子，其表达可激发ORA59的表达，其酶活性的高低可以反映ORA59的表达水平。其中CsGRX7 ALWA是代表将CsGRX7的结构域ALWL突变为ALWA；CsGRX7 CCMS将CCMC活性中心位点突变为SSMS，以观察上述位点突变对JA信号通路的影响。
图4为突变体、野生型(WT)和转基因株系灰霉菌侵染后病斑情况。其中，A为突变体、野生型(WT)和转基因株系OE3、OE4和OE6在灰霉菌侵染下病斑情况；B为突变体、野生型(WT)和转基因株系OE3、OE4和OE6在灰霉菌侵染下的病斑大小。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，构建了pBI221-CsGRX7植物过表达载体，并通过瞬时转化将其导入抗病种质华北型黄瓜No.26的叶圆片中，利用flg22处理植物叶片通过刺激ROS的产生，来判断活性氧的产生及积累情况；原生质体瞬时转化体系中LUC酶活性的高低可以反映JA信号通路的标记基因PDF1.2的表达水平，通过黄瓜CsGRX7基因瞬时转化原生质体表达体系分析CsGRX7基因对茉莉酸信号通路的影响；对CsGRX酶活性中心位点CCMC/S以及C末端的ALWL结构域进行点突变，判断酶活性结构域和C末端的ALWL结构域点突变对茉莉酸信号通路的影响；通过定量接种灰霉孢子悬浮液，研究了黄瓜CC型谷氧还蛋白基因CsGRX7过量表达转基因株系及野生型对照、突变体在灰霉菌侵染下的抗病性差异。
根据同源重组技术，参照华北型黄瓜9930的基因组序列，以黄瓜叶片总RNA反转录合成的cDNA第一条链为模板，通过聚合酶链式反应技术首次扩增了黄瓜CC型谷氧还蛋白基因CsGRX7。该基因编码区序列全长为387bp，编码128个氨基酸，分析表明该基因具有保守的CCMC酶活位点及ALWL的C末端结构域。
为进一步研究黄瓜CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，构建了pBI221-CsGRX7植物过表达载体，并通过瞬时转化将其转入抗病种质华北型黄瓜No.26中，利用flg22处理植物叶片通过刺激ROS的产生情况，来判断植物的PTI抗病反应；通过CsGRX7参与了JA信号通路的抑制，其中CsGRX7氨基酸序列中ALWL结构域和CCMC活性位点是抑制JA信号通路必须的。并通过定量接种灰霉孢子悬浮液，研究了黄瓜CC型谷氧还蛋白基因CsGRX7过量表达转基因株系及野生型对照在灰霉菌侵染下的抗病性。
以下是黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7的编码序列及其负调控灰霉菌抗性反应的实验功能验证的具体步骤：
ATGATGCATTATCAAGCAGAGCGTTCATGGGAGTACTACATGCCGGTGACGGCATCAGCATCAAGAGACCCCGTGGACCGAGTAATCCGGCTAGCGGCGGAGAGTGCAGTGGTGATATTCAGTGTGAGCAGCTGCTGCATGTGCCACGCTCTCAAGAGGTTGCTTTGTGGAATGGGAGTAAGCCCGACGGTGTACGAGCTGGACCATGACCCCAGAGGCAAAGACATTGAAAGAGCTTTGATGAGGCTGGTTGGAGCCACCTCGCCACCAGTCCCCGTCGTCTTCATCGGCGGGAAGCTCGTAGGGTCCATGGATAGAGTTATGGCTTCTCATATTAATGGAACTTTGGTTCCTCTTCTCAAGGAAGCTGGGGCCTTGTGGCTCTAG
A黄瓜幼苗的获得。挑选饱满干净的黄瓜种子，55℃温汤浸种15min，常温水中浸泡4h左右后于28℃下催芽，露白后播种至8×8cm营养钵进行育苗。在GZH-500A智能型光照培养箱中培养，培养条件为光照150μmol m-2s-1，光周期16/8h，昼夜温度26/22℃，湿度80-90％。当幼苗长至两叶一心时进行灰霉菌接种处理。
B通过黄瓜数据库搜索谷氧还蛋白基因CsGRX7基因序列，避开保守结构域设计特异性定量引物。CsGRX7-RT-F:5’-CAA GAG GTT GCT TTG TGG AAT G-3’和CsGRX7-RT-R:5’-GAT GAA GAC GAC GGG GAC TG-3’。
C以瞬转3d后的黄瓜子叶为材料，经RNA提取及反转录，反转录成cDNA，以其为模板，设计的特异性引物进行实时定量PCR，检测No.26中CC型谷氧还蛋白基因CsGRX7的基因表达。
D以瞬转3d的No.26黄瓜幼苗为试验材料，用打孔器将黄瓜子叶打成叶圆片，将叶圆片在无菌水中孵育12h，使用100nM的flg22对叶圆片进行诱导，利用鲁米诺测定法通过全波长多功能酶标仪(Infinite M200pro Tecan，瑞士)测定ROS水平。并对上述4个处理flg22诱导的ROS曲线下面积进行定量，以未进行CsGRX7瞬时过表达的No.26的ROS曲线下面积计算百分比。每个处理3次重复，每次重复至少使用5片叶圆片。共转化CsGRX7引发了叶圆片中更多的ROS爆发，推测CsGRX7可能促进了灰霉菌侵染条件下活性氧的爆发，如图2所示。
E.重组质粒的大量提取。对质粒进行大量提取，并通过拟南芥原生质体的制备及转化。拟南芥原生质体的制备，参考Yoo等的方法(Yoo et al.,2007)，原生质体制备好以后，参考Zander等的方法(Zander et al.,2012)进行原生质体转化。将pB2HA(15μg)，pB2HAEIN3、pB2HA(各7.5μg)，pB2HAEIN3、pB2HAGRX370(各7.5μg)，pB2HAEIN3、pB2HAGRX480(各7.5μg)，pB2HAEIN3、pB2HACsGRX7(各7.5μg)，pB2HAEIN3、pB2HACsGRX7ALWL(各7.5μg)，pB2HAEIN3、pB2HACsGRX7SSMS(各7.5μg)分别与pBGWL7:ORA59(5μg)和CaMV35S:LUC(1μg)进行共转化，其中以只存在pB2HA的处理为空白对照，以对ORA59启动子有抑制作用的拟南芥GRX480作阳性对照，以对ORA59启动子无激活作用的GRX370作阴性对照。每个处理设置3次重复。转化完成后收集原生质体，通过全波长多功能酶标仪进行进行双荧光素酶活性的检测，以EIN3存在且不存在谷胱甘肽的情况下(即EIN3处理)获得的相对LUC活性为100％，其它处理相对LUC活性计算方法为各处理LUC活性/EIN3处理LUC活性×100％。CsGRX7及其重要结构域ALWL结构域和CCMC活性位点的作用，结果表明CsGRX7可抑制萤火虫荧光素酶LUC的活性，表明它可抑制ORA59启动子的表达，即抑制了JA信号通路；将CsGRX7末端ALWL结构域和CCMC活性位点分别突变成ALWA和SSMS，发现对LUC酶活性的抑制作用分别显著降低了39.63％和16.34％，表明这两个结构域是CsGRX7抑制JA信号通路所必需的，如图3所示。
F.过表达拟南芥材料的获得。将野生型及CsGRX7过表达拟南芥种子播种在含有蛭石的基质中，于GZH-500A智能型光照培养箱中培养，光照培养箱环境设置为光照强度为50-75μmol m-2s-1；光照时长13h/d；光照期间温23℃；黑暗期间温度20℃；相对湿度为40-65％。待拟南芥长至4-5周大小时，对其进行灰霉菌接种。在拟南芥叶脉两侧分别滴10μL灰霉孢子悬浮液，并以滴同样体积的ddH2O为对照，接种后将拟南芥罩上透明罩保湿，并放置于培养箱中继续培养3d，3d后对接种叶片进行拍照，试验设置3次重复，每次重复处理5株拟南芥。使用image J软件测量病斑面积，鉴定突变体、野生型对照(WT)和CsGRX7转基因株系OE3、OE4、OE6的灰霉抗病性。
H.抗病性的鉴定。对突变体、野生型对照(WT)和CsGRX7转基因株系OE3、OE4、OE6在灰霉菌侵染3d观察发病状况。在接种灰霉菌3d后，与野生型拟南芥相比，CsGRX7过表达株系的病斑面积明显较大。而突变体病斑不明显。经过对病斑面积测算，OE6过表达株系的病斑面积是野生型的6.22倍，OE4过表达株系病斑面积较小，其病斑面积是野生型的2.87倍。而突变体病斑不明显。和野生型相比，3个过表达株系的病斑面积显著增加。说明CsGRX7过表达拟南芥与野生型相比更加感灰霉病。小写字母表示野生型对照与转基因株系的差异显著性(p<0.05)，如图4所示。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
Claims (5)
1.黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7，其特征在于：该基因的编码区序列如SEQ NO.1所示。
2.黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。
3.如权利要求2所述的黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，其特征在于，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在过表达植株中通过增加活性氧的累积，抑制茉莉酸信号通路。
4.如权利要求3所述的黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，其特征在于，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7序列中的ALWL结构域和CCMC酶活性位点用于抑制茉莉酸信号通路；过表达转基因植株负调控对灰霉病的抗性。
5.如权利要求4所述的黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，其特征在于，所述的转基因植株为拟南芥。
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