CN116254277B

CN116254277B - 小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40及其应用

Info

Publication number: CN116254277B
Application number: CN202310533054.3A
Authority: CN
Inventors: 王建锋; 王晓杰; 康振生; 汤春蕾; 王宁; 何佳妮
Original assignee: Shenzhen Research Institute Of Northwest University Of Agriculture And Forestry Science And Technology
Current assignee: Shenzhen Research Institute Of Northwest University Of Agriculture And Forestry Science And Technology
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2023-07-11
Anticipated expiration: 2043-05-12
Also published as: CN116254277A

Abstract

本发明公开了一种小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40及其应用，包含所述基因TaWRKY40全长的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。在小麦植株体内过表达小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40，可以增加小麦对条锈病病菌的抗性。本发明利用反向遗传学方法分析转录因子TaWRKY40在小麦抗条锈菌过程中的作用，发现TaWRKY40基因在小麦与条锈菌互作非亲和组合中诱导表达，采用农杆菌介导的基因沉默技术沉默TaWRKY40基因，确定TaWRKY40基因在小麦抗条锈病中起正调控作用，并利用该转录因子创制了广谱抗锈的品系，为抗条锈品种的培育提供了优良的小麦材料。

Description

小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种小麦转录因子基因TaWRKY40及其应用。

背景技术

小麦病虫害严重影响小麦（Triticum aestivum）的产量和质量。其中，由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起的小麦条锈病是一种危害极其严重的流行性真菌病害，不断寻找新抗原、选育新的抗条锈病品种，并保持抗病的持久性，是小麦抗条锈病研究和小麦育种工作者面临的难题。

植物先天性免疫系统通过两层系统来对抗入侵的病原微生物。当通过质膜定位的模式识别受体（PRR）感知到称为微生物/病原体相关分子模式（MAMPs/PAMP）的保守分子结构时，就会触发植物免疫的第一层。由该模式触发的免疫称为PAMP /模式触发免疫（PTI）；适应的病原菌获得了许多抑制植物免疫的毒力机制，例如通过分泌效应蛋白来抑制植物免疫。作为对策，植物进化出先天免疫系统的第二层，以直接或间接识别这种效应蛋白，从而引发效应蛋白触发的免疫（ETI）。

在植物生长发育和应答外界环境刺激中，存在复杂的调控网络及其信号传导，而转录因子在其中扮演着十分重要的角色。最近的进展表明，信号整合是由转录因子（TF）调节网络决定的。转录重编程是植物免疫力的主要特征，并受离散转录复合物中相关的TF和共调节蛋白的控制。转录因子（反式作用因子）通过与靶基因上游特定的DNA元件（顺式作用元件）结合，来激活或抑制靶基因的转录活性，进而调控靶基因的时空特异性表达。

WRKY转录因子是一类广泛存在于高等植物中的转录因子超级家族，是调控植物许多生物过程的信号网络的组成部分。WKRY转录因子具有多种生物学功能，在植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等过程中发挥着重要的作用。在DNA水平上，WRKY转录因子可与靶基因启动子中的W-box TTGAC（C/T）结合，通过自调节叉调节激活或抑制下游基因的表达调控其反应。在蛋白水平上，WRKY转录因子可以与多种蛋白相互作用，包括MAP激酶、组蛋白去乙酰化酶、抗性R蛋白、多种转录因子等，以调节植物的生长发育或各种应激反应。因此从DNA和蛋白水平研究小麦与条锈菌互作过程中转录因子调控抗病信号通路，揭示转录因子抗条锈病的分子机理，对于优良抗性品种的培育、抗性品种的合理利用及小麦条锈病的持久控制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提出一种小麦转录因子基因TaWRKY40，可以利用该基因改良小麦及其他作物的抗病性状，培育出抗病转基因新品种。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40，包含所述基因TaWRKY40全长的开放阅读框，所述开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明验证了TaWRKY40基因在条锈菌侵染下的表达谱，据此得出所述基因TaWRKY40受小麦条锈菌诱导表达。

进一步地，所述基因TaWRKY40及其编码的小麦WRKY转录因子TaWRKY40与小麦抗条锈病免疫调控相关。

所述基因TaWRKY40在小麦抗条锈病免疫反应中具有正调控作用。小麦植株对外源病菌的防御能力或程度与所述基因TaWRKY40的表达量正相关，即过表达所述基因TaWRKY40可增强小麦对条锈病病菌的抗性。

采用RNA干扰技术沉默TaWRKY40基因的表达，小麦对条锈菌的抗病性降低。进一步得出，所述基因TaWRKY40具有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的特异性基因片段，沉默所述特异性基因片段可降低所述基因TaWRKY40的表达量。

所述基因TaWRKY40是小麦WRKY转录因子TaWRKY40的编码基因，其在植物体内过量表达时，可以通过增强植物的PTI途径赋予植物一定的抗病性。由此，本发明进一步给出一种小麦WRKY转录因子TaWRKY40，其由所述的基因TaWRKY40编码。小麦WRKY转录因子TaWRKY40与小麦抗条锈病免疫调控相关。

如上所述，基因TaWRKY40在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用，可以利用该基因改良小麦及其他作物的抗病性状，培育出抗病转基因植物新品种。为此，本发明请求保护所述的小麦转录因子基因TaWRKY40，以及所述的小麦WRKY转录因子TaWRKY40及它们在小麦抗条锈品种培育中的应用。本领域普通技术人员结合现有技术，可以实现所述基因TaWRKY40在小麦植株体内的过量表达，提高小麦植株对外源病菌的防御能力或程度。

为利用所述基因TaWRKY40及其编码的小麦WRKY转录因子TaWRKY40创制小麦抗病材料，本发明提供了一种小麦抗条锈品种培育方法。该方法实现在小麦植株体内过表达所述的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40，增强小麦对条锈病病菌的抗性。

本发明还请求保护一种表达载体，其包含所述的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40全长的开放阅读框，所述开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。为进一步拓展所述基因TaWRKY40的应用领域或途径，本发明还请求保护一种表达载体，其包含所述基因TaWRKY40具有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的特异性基因片段。

为了完整无异议地理解本发明的技术方案，需要补充说明的是，本发明所述小麦WRKY转录因子基因用倾斜字体“TaWRKY40”表示，所述小麦WRKY转录因子蛋白用非倾斜字体“TaWRKY40”表示。当然，本领域普通技术人员根据本发明的记载，可以清楚、完整地理解相关基因及其编码蛋白的含义与表述。

通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：

（1）与传统的抗病育种技术相比，植物抗病基因工程技术可以突破物种间的生殖隔离和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内实现目标性状的定向改良，给作物提供更为全面而持续、广谱且特异的保护。

（2）本发明通过基因功能研究，发现TaWRKY40基因在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用，即TaWRKY40基因能够提高小麦抗条锈病的能力。

（3）TaWRKY40基因在植物体内过量表达时，可以转录激活一系列下游抗病功能基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果。

附图说明

图1为小麦品种Suwon11二叶接种小麦条锈菌CYR23和CYR31处理后的TaWRKY40基因的表达谱分析图。

图2为T2代TaWRKY40基因RNAi纯合植株（L1、L2、L7）接非亲和小种CYR23后14d的表型图。

图3为T2代TaWRKY40基因RNAi纯合植株（TaWRKY40RNAi#L1、TaWRKY40RNAi#L2、TaWRKY40RNAi#L7）与野生型（WT）比较mRNA水平TaWRKY40的表达情况，**表示P值<0.01。

图4为T2代TaWRKY40基因RNAi纯合植株（TaWRKY40RNAi#L1、TaWRKY40RNAi#L2、TaWRKY40RNAi#L7）与野生型（WT）比较条锈菌菌落生物量的平均值和误差分析，**表示P值<0.01。

图5为T2代TaWRKY40基因过表达植株（L2、L4、L7）接亲和小种CYR31后14d的表型图。

图6为T2代TaWRKY40基因过表达植株（TaWRKY40OE#L2、TaWRKY40OE#L4、TaWRKY40OE#L7）与野生型（WT）比较mRNA水平TaWRKY40的表达情况，**表示P值<0.01。

图7为T2代TaWRKY40基因过表达植株（TaWRKY40OE#L2、TaWRKY40OE#L4、TaWRKY40OE#L7）与野生型（WT）比较条锈菌菌落生物量的平均值和误差分析，**表示P值<0.01。

图8为T2代TaWRKY40基因过表达植株（WRKY40-T₂-OE-L2、WRKY40-T₂-OE-L4、WRKY40-T₂-OE-L7）与野生型（WT）比较相关防御基因TaPR1、TaPR2和TaPR5 mRNA水平表达情况，*表示P值<0.05，**表示P值<0.01。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案清楚、完整地进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例描述了小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40的分离克隆。

以正常土培的小麦品种水源11为材料，在小麦二叶期采用毛笔接种法分别接种亲和小种CYR23、非亲和小种CYR31并进行保湿，于接种后24h、48h、72h、96h、120h时，对叶片进行采集，并在-80℃的环境下保存。

利用快速通用植物RNA提取试剂盒（购自北京华越洋生物技术有限公司）提取样品总RNA，采用逆转录酶M-1632（购自Thermo scientific）将总RNA逆转录合成cDNA第一链，反应条件为：42℃，1h；95℃，5min。

然后以此cDNA为模板，利用TaWRKY40基因特异性引物F1（5’-ATGTCCCCCGTGCCAAGCCC-3’，）和R1（5’-TTACAAAAAATGGAAGAATCTGATA-3’，）进行PCR扩增，扩增出含有TaWRKY40基因全长编码框的DNA片段，反应条件为：95℃预变性3min；95℃，30sec，54℃，30sec，72℃，40sec，35个循环；72℃延伸2min。

将获得的PCR产物进行T连接，构建到T-Vector pMD^TM19载体（购自Takara），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自唯地生物），筛选测序正确的阳性克隆，命名为p19-TaWRKY40，扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

本实施例描述了小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40的表达谱分析。

以正常土培的小麦品种水源11为材料，在小麦二叶期采用毛笔接种法分别接种亲和小种CYR23、非亲和小种CYR31并进行保湿，设立对照组为水，于接种后24h、48h、72h、96h、120h时，对叶片进行采集，并在-80℃的环境下保存。

利用快速通用植物RNA提取试剂盒（购自北京华越洋生物技术有限公司）提取样品总RNA，运用DNase I消化基因组DNA污染后，采用逆转录酶M-1632（购自Thermoscientific）将总RNA逆转录合成cDNA第一链，反应条件为：42℃，1h；95℃，5min。

以cDNA为模板，以TaEF基因（NCB登录号：Q03033.1）为内参基因（TaEF基因扩增引物为：F2:5’-TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT-3’和R2:5’-ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT-3’），利用TaWRKY40基因特异引物F3（5’-AGCGCATGAGGAAGGTGGAT-3’）和R3（5’-TGCATCTGTAGTAGTACCTGGGAAAG-3’）进行实时定量PCR，反应条件：95℃预变性3min；95℃，15sec；60℃，30sec，40个循环。结果如图1所示。

由图1可见，TaWRKY40能被条锈菌诱导表达并且在非亲和反应体系中72h和96h显著上调表达，表明TaWRKY40是一个与植物抗病防御反应相关的转录因子。

实施例3

本实施例描述了TaWRKY40基因RNAi植株的产生和抗病鉴定。

通过数据库对比（http://plants.ensembl.org/index.html）及特异性分析，发现TaWRKY40基因位于编码区的一段序列特异性较高（核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），因此以此特异性基因片段为基础构建TaWRKY40基因沉默载体。

以条锈菌侵染小麦叶片cDNA文库作为模板，以TaWRKY40基因特异性引物F4（5’-G GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCATCTGCTTTGATTCATCCGGGG-3’）和R4（5’-GGGGACCACTT TGTACAAGAAAGCTGGGTCCAGGCTGTCTTTTGCTCCACAAC-3’）（其中下划线序列为gateway接头序列）扩增出TaWRKY40基因特异片段，将此特异片段通过gateway反应中的BP反应插入到pDonr221载体获得中间载体，再通过LR反应将此片段重组至终载PC336上得到终载PC336-TaWRKY40-RNAi，即TaWRKY40基因沉默载体，如图2~4所示。图2~4为T2代TaWRKY40基因RNAi纯合植株（L1、L2、L7）减弱小麦对条锈菌抗性的检测图。

以小麦品种Fielder为转化受体，采用农杆菌侵染小麦幼胚的方法将TaWRKY40基因RNAi载体导入到受体材料中，再进行潮霉素抗性愈伤组织的筛选、预再生、再生、生根等步骤得到T0代转基因植株。

将T0代转基因植株进行阳性植株鉴定并进行抗病性鉴定后加代至T2。将TaWRKY40T2代RNAi材料催芽处理后穴播在70×70×80cm花盆里，每盆播种9穴，每穴1粒种子，同时播种野生型材料。待材料长至二叶一心时接种非亲和小种CYR23，12℃下黑暗保湿培养24h，再移至正常生长条件（光照16h，温度14℃；黑暗8h，温度10℃为一个生长周期）培养。期间采集相应时间点RNA样品。14天后进行表型观察、统计并拍照，结果如图2所示。图2为T2代TaWRKY40基因RNAi纯合植株（L1、L2、L7）接非亲和小种CYR23后14d的表型图。通过荧光定量PCR检测TaWRKY40基因表达情况及条锈菌生物量，实验重复3次。结果如图3和4所示。图3为T2代TaWRKY40基因RNAi纯合植株（TaWRKY40RNAi#L1、TaWRKY40RNAi#L2、TaWRKY40RNAi#L7）与野生型（WT）比较mRNA水平TaWRKY40的表达情况，**表示P值<0.01，图4为T2代TaWRKY40基因RNAi纯合植株（TaWRKY40RNAi#L1、TaWRKY40RNAi#L2、TaWRKY40RNAi#L7）与野生型（WT）比较条锈菌菌落生物量的平均值和误差分析，**表示P值<0.01。

由图2~4可以看出沉默植株相对于野生型植株表达量显著下降，并且TaWRKY40沉默后各株系与野生型相比接非亲和菌株CYR23后叶片不同程度产孢，条锈菌生物量显著增加，从而说明沉默TaWRKY40能够显著降低小麦对条锈病的抗性。

实施例4

本实施例描述了TaWRKY40基因过表达转基因小麦的产生及其抗病性鉴定。

以p19-TaWRKY40质粒为模板，以引物F5（5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCCCCGTGCCAAGCC-3’）和R5（5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAAGCGTAATCTGG AACATCGTATGGGTACAAAAAATGGAAGAATCTGATAGAA-3’）（其中下划线序列为gateway接头序列，点式下划线序列为HA标签蛋白序列），获得带gateway反应接头和HA标签的TaWRKY40全长编码框序列，将此序列通过gateway反应中的BP反应插入到pDonr221载体获得中间载体，再通过LR反应将此片段重组至终载pANIC-6E上得到终载pANIC-6E-TaWRKY40-HA-OE，即TaWRKY40基因过表达载体。

同样，通过农杆菌介导的转化法将TaWRKY40基因过表达载体导入受体材料，获得转基因植株（具体方法同TaWRKY40基因沉默转基因植株）。

T0代转基因植株进行阳性植株鉴定并进行抗病性鉴定后加代至T2。将TaWRKY40T2代过表达材料催芽处理后穴播在70×70×80cm花盆里，每盆播种9穴，每穴1粒种子，同时播种野生型材料。待小苗长至二叶一心时接种亲和小种CYR31，12℃黑暗保湿培养24h，再移至正常生长条件（光照16h，温度14℃；黑暗8h，温度10℃为一个生长周期）培养。期间采集相应时间点RNA样品。14天后进行表型观察、统计并拍照，结果如图5所示。并通过荧光定量PCR检测TaWRKY40基因表达情况、防御相关基因（PR基因）及条锈菌生物量，实验重复3次。结果如图6~8所示。图6为T2代TaWRKY40基因过表达植株（TaWRKY40OE#L2、TaWRKY40OE#L4、TaWRKY40OE#L7）与野生型（WT）比较mRNA水平TaWRKY40的表达情况，**表示P值<0.01。图7为T2代TaWRKY40基因过表达植株（TaWRKY40OE#L2、TaWRKY40OE#L4、TaWRKY40OE#L7）与野生型（WT）比较条锈菌菌落生物量的平均值和误差分析，**表示P值<0.01。图8为T2代TaWRKY40基因过表达植株（WRKY40-T₂-OE-L2、WRKY40-T₂-OE-L4、WRKY40-T₂-OE-L7）与野生型（WT）比较相关防御基因TaPR1、TaPR2和TaPR5 mRNA水平表达情况，*表示P值<0.05，**表示P值<0.01。

由图6~8可以看出过表达植株相对于野生型植株表达量显著增加，并且TaWRKY40过表达后各株系与野生型相比接非亲和菌株CYR31后叶片产孢减少，条锈菌生物量显著下降，同时PR基因表达量显著上调表达，说明过表达TaWRKY40能够显著提高小麦对条锈病的抗性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40在小麦抗条锈品种培育中的应用，其特征在于，所述基因TaWRKY40的开放阅读框的序列为如SEQ ID NO.1所示的序列，所述基因TaWRKY40的特异性基因片段的序列为如SEQ ID NO.2所示的序列，沉默所述特异性基因片段可降低所述基因TaWRKY40的表达量；所述基因TaWRKY40及其编码的小麦WRKY转录因子TaWRKY40与小麦抗条锈病免疫调控相关，过表达所述基因TaWRKY40可增强小麦对条锈病病菌的抗性。

2.一种小麦抗条锈品种培育方法，其特征在于，在小麦植株体内过表达权利要求1所述的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY40，增强小麦对条锈病病菌的抗性。