CN113122552B - 黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用。本发明发现一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4相应病原真菌灰霉菌的侵染，且其过表达能明显提高对病原真菌灰霉菌的感病性。在定量接种灰霉孢子悬浮液后，过表达CsGRX4的转基因株系病斑面积显著大于野生型对照，上述结果表明黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在拟南芥中的过量表达提高了转基因植株(拟南芥)对病原真菌灰霉菌的感病性。

Description

黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用。
背景技术
在蔬菜生产中，植物真菌病害一直是限制蔬菜产量和品质提高的重要影响因素。蔬菜作物对真菌侵染的反应可分为抗病或者易感，一些关键基因或转录因子在病原菌侵染和对病原菌的防御反应中起非常重要的作用。当植物容易感染病害时，病原菌通过侵染从而诱导一些关键基因上调表达或者抑制植物的防御反应，包括与病害防御反应密切相关的信号通路、抗病基因表达的调控，从而引起病害的发生。因此，发现或者鉴定植物的关键易感基因从而了解植物的感病机制，进而对植物的抗病或感病进行调控以及在此基础上进行抗病种质的创制非常重要。若进行敲除或抑制该基因的表达使植物获得更强的抗病性，可进行抗病种质培育的应用；另外也可以将该基因导入杂草中使其更容易感病进而逐渐消亡。
黄瓜灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一种腐生型真菌病害。这种病害的发生具有流行性强、发生普遍、危害性强等特点。近年随着设施种植年限的增长、病原菌抗药性逐渐增加，设施内高湿、密闭的环境更容易导致这种真菌病害的发生，导致灰霉病等腐生型病害有逐年加重的趋势。灰霉菌不仅能够侵染黄瓜的茎、叶等组织，还能侵染黄瓜的花器官及果实，导致黄瓜植株、果实腐烂，甚至死亡，进而影响黄瓜产量。当病害发生率高达70％以上时，能够使黄瓜产量下降20％-30％，极大的降低了种植农户的经济收入，严重制约了黄瓜生产，成为保护地农业可持续发展的主要限制障碍因素之一。
亟需明确黄瓜灰霉病感病的机理及主要响应基因，并明确其分子机制，在此基础上进行抗病种质的创制，对黄瓜的优质高产意义重大。
越来越多的证据表明编码植物谷氧还蛋白的GRX基因积极参与植物生长发育和病害的防御响应，尤其是腐生型真菌灰霉菌的防御响应。例如拟南芥中CC类型谷氧还蛋白基因ROXY19(即GRX480也称为ROXY19，因拟南芥中第一个GRX敲除的突变体被命名为roxy1而得名)、ROXY18(即GRXS13)、ROXY1的表达受灰霉菌诱导，且ROXY18、ROXY1敲除植株表现为抗病，而在拟南芥中过表达ROXY18和ROXY1这两个基因，转基因植株表现为感病，不仅如此，水稻中的CC型谷氧还蛋白OsROXY1、OsROXY2过表达时在灰霉菌侵染下表现为易感性，说明GRX响应病原菌胁迫并参与灰霉病抗性反应的调控。
人们已经了解了其他植物部分谷氧还蛋白基因参与灰霉真菌病害调控，但黄瓜中谷氧还蛋白基因参与灰霉真菌病害响应及其功能还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用。
为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在提高转基因植株灰霉菌感病性方面的应用。
上述转基因植株为拟南芥。
黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4，该基因的编码区序列如SEQ NO.1所示。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
本发明发现一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4相应病原真菌灰霉菌的侵染，且其过表达能明显提高对病原真菌灰霉菌的感病性。在定量接种灰霉孢子悬浮液后，过表达CsGRX4的转基因株系病斑面积显著大于野生型对照，上述结果表明黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在拟南芥中的过量表达提高了转基因植株(拟南芥)对病原真菌灰霉菌的感病性。
附图说明
图1为灰霉菌侵染引起的CsGRX4基因表达；
图2为野生型对照(WT)和转基因株系CsGRX4-2(OE2)、CsGRX4-4(OE4)和CsGRX4-5(OE5)在添加3.5mg/L草甘膦(PPT)的MS培养基上的生长情况；
图3为野生型对照(WT)和转基因株系CsGRX4-2(OE2)、CsGRX4-4(OE4)和CsGRX4-5(OE5)中CsGRX4的基因表达；
图4为野生型对照(WT)和转基因株系CsGRX4-2(OE2)、CsGRX4-4(OE4)和CsGRX4-5(OE5)在灰霉菌侵染下病斑情况；
图5为野生型对照(WT)和转基因株系CsGRX4-2(OE2)、CsGRX4-4(OE4)和CsGRX4-5(OE5)在灰霉菌侵染下的病斑大小；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在提高转基因植株(拟南芥)病原真菌灰霉菌的感病性。
本发明根据同源重组技术，参照华北型黄瓜9930的基因组序列，以黄瓜叶片总RNA反转录合成的cDNA第一条链为模板，通过聚合酶链式反应技术首次扩增了谷氧还蛋白基因CsGRX4。该基因编码区序列全场为339bp，编码133个氨基酸，分析表明该基因具有保守的CCM_结构及ALW_的C末端序列，该基因的编码区序列如SEQ NO.1所示：
ATGTCCACCTCCTCCCTCGAGGATCCCGTCGACCGTATAGAGCGGTTGGCAGCTGAGAACGCTGTCGTCATATTCAGCGTTAGTACATGTTGTATGTGTCACGCTATAAAACGGTTGTTTTGTGGAATGGGAGTGAATCCAACAGTCTACGAACTCGACGAAGATCCAAGAGGAGGGGACATGGAGAAGGCACTCATGAGACTTTTGGGAAGCTCCTCTCCTGTTCCTGTCGTGTTTATCGGTGGGAAACTCGTGGGTGCCATGGATAGAGTCATGGCCTCTCATATTAGTGGAACTCTTGTTCCTCTTCTTAAAGATGCTGGAGCTCTCTGGCTTTGA
为进一步研究黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在灰霉病抗病反应中的具体功能，构建了PB2HA-35S-CsGRX4植物过表达载体。对野生型拟南芥进行遗传转化，筛选获得转基因纯合株系。灰霉菌侵染转基因株系及野生型对照，发现黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4基因过量表达的不同拟南芥株系病斑面积显著大于野生型对照，表现出植株感病性。
以下是黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4的编码序列及灰霉菌侵染实验功能验证的具体步骤：
A黄瓜幼苗获得。黄瓜种子55℃温汤浸种，37℃催芽，种子露白以后种植于草炭、蛭石、珍珠岩混合比例3：1：1的基质中。光照培养箱培养，保持日夜温度为26℃/23℃，16/8的光周期。待生长至两叶一心，使用喷壶将含有灰霉孢子的悬浮液(1.0×105个孢子/mL)均匀喷洒至黄瓜叶片正面，直至有水滴滴落，对照喷施等量的无菌水。接种后，将幼苗培养于光照培养箱中，温度保持在24±2℃，16/8h的光周期，相对湿度80％-90％。分别在0、12、24、48hpi收获地上部样品。
B通过黄瓜数据库搜索CsGRX4基因序列，避开保守结构域设计特异性定量引物。CsGRX4-RT-F:5’-ATC CAA CAG TCT ACG AAC TCG ACG AAG-3'和CsGRX4-RT-R:5'-CCA CCGATA AAC ACG ACA GGA ACA G-3'。
C以灰霉菌侵染下样品提取RNA，反转录成cDNA，以其为模板，设计的特异性引物进行实时定量PCR，检测黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在灰霉菌侵染下的基因表达。
D黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4响应灰霉菌侵染的情况下，利用同源重组技术，以黄瓜叶片总RNA反转录合成的cDNA第一条链为模板，扩增得到黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4基因的序列；
E将黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4基因的编码区序列插入CaMV35S启动子下游，构建了植物过量表达载体通过蘸花法将其转入哥伦比亚型拟南芥中。筛选获得生长良好的黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4转基因纯合株系(OE2、OE4、OE5)。
F以灰霉菌侵染下样品提取RNA，反转录成cDNA，以其为模板，设计的特异性引物进行实时定量PCR，检测黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在转基因株系(OE2、OE4、OE5)中的表达。
G移液器吸取10μL灰霉孢子悬浮液接种于叶片正面主脉两侧。接种后2.5天(dpi)使用image J软件测量侵染面积，鉴定野生型对照(WT)和CsGRX4转基因株系OE2、OE4、OE5的灰霉抗病性。
H参见图4-5，图4为野生型对照(WT)和CsGRX4转基因株系OE2、OE4、OE5在灰霉菌侵染2.5d观察发病状况。野生型对照(WT)和CsGRX4转基因株系OE2、OE4、OE5叶片表面出现水渍状病斑，出现典型的腐生病状且呈传播状态，转基因株系叶片表现出较为严重的腐烂表型。图5为野生型对照(WT)和CsGRX4转基因株系OE2、OE4、OE5在灰霉菌侵染2.5d病斑面积统计。野生型对照(WT)病原菌侵染叶片平均面积为0.16mm2，而CsGRX4转基因株系OE2、OE4、OE5在灰霉菌接种2.5d的平均病斑面积分别为0.290mm2、0.293mm2和0.520mm2，显著大于野生型对照(WT)。小写字母表示野生型对照与转基因株系的差异显著性(p<0.05)。
本发明鉴定了黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4过表达转基因株系(OE2、OE4、OE5)能明显降低拟南芥病原真菌灰霉菌的抗病性。在灰霉菌侵染下CsGRX4转基因株系(OE2、OE4、OE5)的病斑面积显著大于野生型对照。
以上结果表明黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在拟南芥中的过量表达提高了植株的灰霉感病性。
本发明改良植物抗病性的方法，包括将植物中所述基因CsGRX4或其同源基因进行过表达使其更加感病；相应的，若进行敲除或抑制该基因的表达使植物获得更强的抗病性，可以提高植物抗病性并进行抗病种质培育的应用；另外也可以将该基因导入杂草中使其更容易感病进而逐渐消亡。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 西北农林科技大学
<120> 黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgtccacct cctccctcga ggatcccgtc gaccgtatag agcggttggc agctgagaac 60
gctgtcgtca tattcagcgt tagtacatgt tgtatgtgtc acgctataaa acggttgttt 120
tgtggaatgg gagtgaatcc aacagtctac gaactcgacg aagatccaag aggaggggac 180
atggagaagg cactcatgag acttttggga agctcctctc ctgttcctgt cgtgtttatc 240
ggtgggaaac tcgtgggtgc catggataga gtcatggcct ctcatattag tggaactctt 300
gttcctcttc ttaaagatgc tggagctctc tggctttga 339

Claims (2)

1.黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在提高转基因植株灰霉菌感病性方面的应用，其特征在于：该基因的编码区序列如SEQ NO.1所示：
ATGTCCACCTCCTCCCTCGAGGATCCCGTCGACCGTATAGAGCGGTTGGCAGCTGAGAACGCTGTCGTCATATTCAGCGTTAGTACATGTTGTATGTGTCACGCTATAAAACGGTTGTTTTGTGGAATGGGAGTGAATCCAACAGTCTACGAACTCGACGAAGATCCAAGAGGAGGGGACATGGAGAAGGCACTCATGAGACTTTTGGGAAGCTCCTCTCCTGTTCCTGTCGTGTTTATCGGTGGGAAACTCGTGGGTGCCATGGATAGAGTCATGGCCTCTCATATTAGTGGAACTCTTGTTCCTCTTCTTAAAGATGCTGGAGCTCTCTGGCTTTGA。
2.如权利要求1所述的黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4在提高转基因植株的灰霉菌感病性方面的应用，其特征在于：所述的转基因植株为拟南芥。
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