CN107338207A - 用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌sw17(Bacillus amyloliquefaciens sw17)及其应用，该菌保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.14365；该菌对由灰葡萄孢菌引起的草莓灰霉、番茄灰霉和黄瓜灰霉病菌具有抑制作用，抑菌率在62％‑74％之间。本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌sw17是从示范果园的健康果树的根际土壤中分离获得的，无生态毒性，安全性高，抑菌效果好，且培养简单，周期短，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。

Description

用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物种质资源的开发与利用领域，具体涉及一种用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

灰霉病又称灰腐病、白点病，是作物生产中发生的主要病害之一，多由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)侵染所致。灰葡萄孢菌是葡萄孢属(Botrytis)真菌，有性态是富氏葡萄孢盘菌(Botryotiniafuckeliana Whetzel.)，自然状态下不常见，可以引起200多种双子叶植物的灰霉病，包括茄科(Solanaceae)[番茄、辣椒(Capsicum annuum Linn.)等]、葫芦科(Cucurbitaceae)[黄瓜(Cucumis sativus Linn.)、西葫芦(Cucurbita pepoLinn.)等]、蔷薇科(Rosaceae)[草莓、海棠(Malus spectabilis Borkh.)等]、葡萄科(Vitaceae)等，还能引起蚕豆(Vicia faba Linn.)赤斑病、花腐病、英腐病等。最近报道灰葡萄孢菌有1400多个寄主，其中大多数是双子叶植物。灰葡萄孢菌可以在植物生长的各个时期侵染，造成落花落果、果实腐烂等，对作物生产造成严重损失，并可以对采后果实的储存和运输等造成重要损失，湿度适宜时在受害植物表面产生灰色霉层和孢子堆，有些受害部位还可以产生菌核。灰葡萄孢菌能够以菌核、分生孢子和菌丝体随病残组织在土壤中越冬。其菌核和分生孢子的抗逆能力都很强，尤其菌核是主要的越冬器官，在土壤中可存活8～10个月。翌年环境适宜时，菌核萌发产生分生孢子梗和大量分生孢子，分生孢子成熟后脱落，靠雨水、气流、农事操作等进行传播侵染，可以从自然孔口、伤口、衰老器官或幼嫩组织直接侵入。灰霉病是低温、高湿病害，灰葡萄孢菌在5～30℃均能生长发育，适宜生长温度在20-24℃，分生孢子在5～30℃均可萌发，萌发需要相对湿度在80％以上。随着我国设施栽培面积的不断扩大，蔬菜灰霉病有迅速发展蔓延的趋势，特别是在环境条件适合时，可形成灾害性病害并造成严重的经济损失。据四川省的调查数据显示，灰霉病危害茄子，苗期发病率平均为22.4％，高的达78.3％；番茄、黄瓜、草莓等均有不同程度的损失，因该病减产达20％～50％。灰霉病不仅能引起田间损失，甚至在果实的储存和运输中也会造成严重危害，使得果实的储存期变短，品质变差。

目前，农业生产中对灰霉病的防治以化学药剂为主，主要有两类，一类是治疗性杀菌剂，另一类是保护剂。治疗性杀菌剂主要有苯并咪唑类(如多菌灵、二甲酰亚胺类)和N-苯氨基甲酸酯类(如多霉灵)；保护剂有预防作用，如百菌清、大生、代森锰锌、克菌丹等。灰霉病菌寄主范围广，繁殖快，遗传变异大，长期连续使用同一药剂易产生抗药性，国内外均有抗性菌株出现，国内江西、广西、上海、山东、山西、北京、辽宁等省市的田间和大棚中的多种蔬菜上均有出现；国外西班牙、意大利、智利、加拿大等地的草莓和番茄等作物上均发现抗性菌株。灰霉病已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯基氨基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类杀菌剂产生抗性。化学农药对环境和农产品的污染直接影响人类的健康，为了保证农产品的卫生和安全，利用微生物之间的寄生、拮抗作用已成为防治灰霉病的大势所趋。

在种类繁多的微生物群体中芽孢杆菌是研究最多的生防菌候选菌，已证明芽孢杆菌属中的许多种都具有合成抗菌活性物质——抗菌多肽的能力，而且芽孢杆菌可以形成芽孢，细胞壁不含内毒素，除个别种外绝大多数对人畜无害，具有较强的抗逆性和良好的环境适应性及环境友好性，是最理想的微生物杀菌剂资源。

虽然很多种芽孢杆菌都已被开发用于制备微生物杀菌剂，但由于芽孢杆菌种群即菌株的多样性，不同芽孢杆菌乃至同一芽孢杆菌的不同菌株均具有不同的抗菌谱、抗菌活性和抗菌特点，筛选具有不同作用对象的高效芽孢杆菌生防菌剂仍是现在乃至今后相当长一段时间内各国科研工作关注的课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用，对植物灰霉病菌具有持续高效拮抗作用。

本发明所采用的技术方案为：

用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：

保藏名称为解淀粉芽孢杆菌sw17(Bacillus amyloliquefaciens sw17)；

保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏编号为CGMCC No.：14365；

保藏日期为2017年6月29日。

含有所述解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂，其特征在于：

所述生防菌剂中解淀粉芽孢杆菌的浓度为1×10⁹～10¹⁰CFU/mL。

制备所述生防菌剂的方法，其特征在于：

步骤一：将解淀粉芽孢杆菌sw17(Bacillus amyloliquefaciens sw17)CGMCCNo.：14365接种于培养液中培养至培养液OD₆₀₀为0.5～0.8，获得种子液；

步骤二：按照1～2％的接种量，将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，发酵温度控制在35～37℃，发酵周期为36～48h；

步骤三：发酵结束后，调节发酵液中解淀粉芽孢杆菌的浓度至1×10⁹～10¹⁰CFU/mL，获得所述生防菌剂。

步骤二中，发酵培养基的配方为：蔗糖30.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母粉3.0g/L，FeSO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KH₂PO₄ 5.0g/L，NaCl 5.0g/L，余量为水，初始pH 7.2。

含有所述解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂的应用，其特征在于：

所述生防菌剂作为植物灰霉病病菌的抑制剂。

所述植物灰霉病包括由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)感染引起的草莓灰霉病、番茄灰霉病和黄瓜灰霉病。

本发明具有以下优点：

本发明所述解淀粉芽孢杆菌来源于苹果示范园区苹果根际土壤，属于环境有益菌，该菌种能够较好地定植于果园环境，并对植物灰霉病菌具有持续高效拮抗作用，平板抑菌试验表明：该生防菌对于由灰葡萄孢菌侵染引起的草莓灰霉病、番茄灰霉病、黄瓜灰霉病等具有较高的生物防治效果，防效分别达到60.82％、62.86％和71.38％；发酵液抑菌试验表明：菌剂对三种植物的灰霉病菌的生物防效分别达到62％-74％，同比高于化学农药——多菌灵的防效；同时，组织离体试验也证明，该生防菌对三种灰霉病具有较好的生物防效。

附图说明

图1：生防菌sw17的菌落形态图。

图2：生防菌sw17对植物灰霉病的平板抑制试验；

a1:草莓灰霉病的对照平板；a2：生防菌sw17对草莓灰霉病的拮抗效果；

b1:番茄灰霉病的对照平板；b2：生防菌sw17对番茄灰霉病的拮抗效果；

c1：黄瓜灰霉病的对照平板；c2：生防菌sw17对黄瓜灰霉病的拮抗效果。

图3：生防菌sw17 16s rRNA系统进化树。

图4：生防菌sw17发酵液稀释1000倍液对灰霉病菌的平板拮抗效果图；

a.生防菌sw17发酵液稀释1000倍液对番茄灰霉病菌的平板拮抗效果图；

b.生防菌sw17发酵液稀释1000倍液对草莓灰霉病菌的平板拮抗效果图；

c.生防菌sw17发酵液稀释1000倍液对黄瓜灰霉病菌的平板拮抗效果图；

最左侧为无菌水对照，中间为1000稀释的多菌灵对照，右侧为1000倍稀释的sw17发酵液。

图5：生防菌sw17对灰霉叶片离体防效试验；

a.生防菌sw17对草莓灰霉叶片离体防效试验；

b.生防菌sw17对番茄灰霉叶片离体防效试验；

c.生防菌sw17对黄瓜灰霉叶片离体防效试验；

左侧为生防菌菌悬液处理过的植物组织叶片，右侧为对照组，不做任何处理。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及的用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌，于2017年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌sw17(Bacillus amyloliquefaciens sw17)，保藏编号为CGMCC No.：14365。

1、解淀粉芽孢杆菌sw17的分离、筛选与鉴定：

(1)分离与筛选：

从陕西省延安市洛川县示范苹果园中，采集健康苹果根际土壤，用保鲜袋带回；

称取土样10g，加入装有90mL无菌水的三角瓶中，三角瓶中装有玻璃珠30颗，37℃、180rpm震荡30min，静置后获得土壤悬液；

将土壤悬液稀释成10^-5、10^-6、10^-7，吸取不同稀释度的土壤悬液100μL涂布于NA培养基上，置于37℃培养24h，挑取颜色、形态等不同的细菌单菌落纯化、保存；

采用平板对峙法测定分离到的细菌对植物病原真菌的抑菌活性。将草莓灰霉病菌、番茄灰霉病菌和黄瓜灰霉病菌分别在PDA平板上活化3d，用打孔器在菌落边缘打取菌块(直径5mm)，接种到PDA平板中央。培养1d后，在距离灰霉病菌块2cm处的2个对称点处接种待测细菌，25℃培养，随时观察抑菌结果。采用下列公式计算：

抑菌率(％)＝(各对照菌落半径－各处理菌落半径)/各对照菌落半径×100％。

试验结果如图2和表1所示，由此可以看出：sw17菌株对各种灰霉病菌有较好的拮抗作用。

表1 sw17对多种灰霉病病菌的抑制率

病原真菌	番茄灰霉	草苺灰霉	黄瓜灰霉
				抑菌率(％)	62.86	60.82	71.38

(2)鉴定:

将筛选到的抑菌效果较好的sw17菌株进行形态学和16S rDNA序列鉴定。

形态学观察:将sw17菌株在NA培养基平板上划线接种，37℃培养18h，观察菌落特征。菌落呈白色、半透明、稍隆起、圆形扁平、光滑湿润有粘性(见图1)。

16S rDNA序列测定：采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA ExtractionKit，提取sw17菌株的基因组DNA，根据细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸lmin30s，共30个循环；最后72℃延伸1Omin。

PCR扩增产物送去华大基因有限公司进行测序。经测序，sw17菌株的16S rDNA序列长度为1458bp，具体序列为SEQ ID NO：1。

将测序结果在NCBI GenBank上进行序列比对，发现其与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens FZB42)的16S rDNA序列相似性高达99％，初步确定sw17菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。利用MEGA4.1软件进行聚类分析，构建进化树。结果表明，sw17与Bacillus amyloliquefaciens FZB42处于一个小分支。由此，结合形态特征，进一步说明sw17菌株为解淀粉芽抱杆菌。

2、生防菌剂的制备：

(1)将sw17菌株接种到LB培养液中，于37℃下，180rpm振荡培养12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；

LB培养液的配方为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，调节pH值为7.0；

(2)当培养至OD600值在0.5～0.8之间时，将种子液以1：100体积比加入装有70L发酵培养液的100L发酵罐中，37℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量1vvm，罐压0.05-0.1KPa。发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度约为1×10⁹CFU/mL，获得生防菌剂。

发酵培养液的配方为(g/L)：蔗糖30.0，牛肉膏5.0，酵母粉3.0，FeSO₄0.4，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄5.0，NaCl 5.0，初始pH 7.2；最佳发酵条件为：37℃，pH 7.0，180rpm摇床培养24h。

3、解淀粉芽孢杆菌sw17发酵液的抑菌效果(与多菌灵比较)：

解淀粉芽孢杆菌sw17菌株对各种灰霉病菌(Botrytis cinerea)的拮抗作用均采用抑菌圈法进行测定。

将sw17发酵液和多菌灵分别稀释1000倍，每个皿中加入1mL的稀释液，然后倒入20mL融化的PDA培养基，混合摇匀，冷却后待用；

将草莓灰霉病菌、番茄灰霉病菌和黄瓜灰霉病菌在PDA平板上活化3d，用打孔器在菌落边缘打取菌块(直径5mm)，接种到含有sw17和多菌灵稀释液的PDA平板中央，以加无菌水的PDA为对照，25℃培养，随时观察测量菌落半径，计算sw17菌株对病原真菌生长的抑菌率，每个处理重复3次。

采用下列公式计算抑菌率：对病菌生长的抑菌率(％)＝(各对照菌落半径－各处理菌落半径)/各对照菌落半径×100％。

试验结果见图4和表2，结果显示：sw17菌株对各供试病原菌抑菌率在62％-74％之间。

表2 sw17发酵液与多菌灵对灰霉病菌的抑菌效果比较

病原真菌	sw17	多菌灵
			番茄灰霉	69.70％	21.21％
草苺灰霉	62.63％	12.50％
			黄瓜灰霉	74.55％	9.09％

4、解淀粉芽孢杆菌sw17对离体叶片防效测定：

选取枝条前端的健康植物叶片，清洗干净表面浮尘，而后置于0.6％的次氯酸钠溶液中，表面消毒5min，再用无菌水冲洗2-3次，自然晾干，用无菌水浸湿的已灭菌的脱脂棉包裹住叶柄基部，25℃保湿备用。将解淀粉芽孢杆菌发酵液浸润叶片表面，定殖过夜，在处理好的每个叶片的相同部位制造针刺伤口(3-5针)后，将培养3d的病原真菌菌饼(D＝5mm)接种于针刺伤口处，无菌水处理作为对照。25℃保湿，观察离体叶片上的发病情况。结果见图5，可见sw17能较好的抑制灰霉病菌的发病，具有微生物农药开发潜质。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 陕西省微生物研究所

<120> 用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌sw17（Bacillus amyloliquefaciens sw17）

<400> 1

actttttggt caagttgtcg gcggctggct cctaaaaggt tacctcaccg acttcgggtg 60

ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120

gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga 180

tccgaactga gaacagattt gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt 240

ctgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300

cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca 360

actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420

acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt 480

gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540

ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc 600

caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta 660

gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt 720

tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca 780

tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc 840

ccagtttcca atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc 900

gcctgcgagc cctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc 960

ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg kgccgcccta 1020

tttgaacggc acttgttctt ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac 1080

tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc 1140

ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct 1200

acgcatcgtc gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat 1260

ctgtaagtgg tagccgaagc caccttttat gtctgaacca tgcggttcaa acaaccatcc 1320

ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta 1380

ctcacccgtc cgccgctaac atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gacttgcatg 1440

tatagcacgc gccctcac 1458

Claims (6)

1.用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：

保藏名称为解淀粉芽孢杆菌sw17(Bacillus amyloliquefaciens sw17)；

保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏编号为CGMCC No.：14365；

保藏日期为2017年6月29日。

2.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂，其特征在于：

所述生防菌剂中解淀粉芽孢杆菌的浓度为1×10⁹～10¹⁰CFU/mL。

3.制备权利要求2所述生防菌剂的方法，其特征在于：

步骤一：将解淀粉芽孢杆菌sw17(Bacillus amyloliquefaciens sw17)CGMCC No.：14365接种于培养液中培养至培养液OD₆₀₀为0.5～0.8，获得种子液；

步骤二：按照1～2％的接种量，将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，发酵温度控制在35～37℃，发酵周期为36～48h；

步骤三：发酵结束后，调节发酵液中解淀粉芽孢杆菌的浓度至1×10⁹～10¹⁰CFU/mL，获得所述生防菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备生防菌剂的方法，其特征在于：

步骤二中，发酵培养基的配方为：蔗糖30.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母粉3.0g/L，FeSO₄0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KH₂PO₄ 5.0g/L，NaCl 5.0g/L，余量为水，初始pH 7.2。

5.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂的应用，其特征在于：

所述生防菌剂作为植物灰霉病病菌的抑制剂。

6.根据权利要求5所述的生防菌剂的应用，其特征在于：

所述植物灰霉病包括由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)感染引起的草莓灰霉病、番茄灰霉病和黄瓜灰霉病。