CN108004249B - 高粱抗蚜虫基因rmes1的克隆及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与植物抗蚜虫特性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明的抗蚜虫基因RMESl基因编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或编码由SEQ ID NO.2衍生的并且具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相同的功能的氨基酸序列。携带RMES1基因的高粱材料蚜虫抗性显著高于不携带RMESl基因或RMES1产生突变的材料，通过转基因方法或杂交方法将RMES1导入小麦基因组可以显著提高小麦的蚜虫抗性。本发明进一步提供了可以用于检测RMES1基因的试剂盒，所述试剂盒包含由序列SEQ ID NO.7和序列SEQ ID NO.8引物对组成的分子标记。

Description

高粱抗蚜虫基因RMES1的克隆及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，是采用分子生物学的方法克隆了一个新的编码具有LRR结构域蛋白的基因RMES1，该基因编码的RMES1蛋白是与植物抗蚜虫密切相关的蛋白，RMES1可以提高植物(特别是高粱和小麦)对蚜虫侵害的抵抗能力。
背景技术
高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench，2n＝2x＝20)属禾本科，起源于非洲，现分布于全球六大洲、71个国家，总产量占据了全球禾谷类总量的3.5％，每年大约提供57.9百万公吨的谷物，是全世界种植的面积仅次于玉米、小麦、水稻和大麦的第五大粮食作物，同时也是饲用、工业和能源开发的重要原料(FAO Statistics，2004；Kim et al.，2011)。高粱是热带禾本科植物的代表，具有C4光合系统，能在较高的温度下利用复杂的生物化学和形态上的特殊性来增加碳的吸收。与其它热带谷类作物相比，高粱具有较小的基因组(全基因组大约750Mb大小)，而且遗传变异丰富，杂种优势强。因此，如水稻一样成为功能基因组学研究的又一重要模式植物。高粱全基因组测序的完成为更好地研究高粱基因及其相关功能打下了基础(Paterson et al.，2009；王海莲等，2009；邵玉涛等，2016)。
已报道有150多种害虫危害高粱生产，我国至少有25种，其中蚜虫是主要害虫之一(Young and Teetes，1977；Sharma，1993；Guo et al.，2011)。危害高粱最严重的蚜虫是麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani)和甘蔗黄蚜(Melanaphis sacchari Zehntner)。麦二叉蚜既能危害小麦也能危害高粱(Blackman and Eastop，2000；Kindler et al.，2002；Punnuri et al.，2013)，主要危害高粱的幼苗，有多种生物型。甘蔗黄蚜又名高粱蚜，可以危害甘蔗和高粱，在非洲、亚洲、澳大利亚和远东的很多地区，以及中美洲和南美洲的部分地区都有分布(van den Berg，2002；Singh et al.，2004)，主要危害高粱成株期，变异小，不易产生新的生物型，是我国高粱产区经常发生的主要害虫之一(李金梅等，2006)。高粱蚜除直接从植株体内吸食营养外，还可分泌大量蜜露污染作物，影响植株光合作用，严重影响高粱产量及品质；此外，还可传播谷类红叶、甘蔗黄叶和甘蔗花叶等病毒病，如不使用杀虫剂，引起的产量损失可达46％-78％(van den Berg，2002)。
目前，防治高粱蚜虫主要采用喷洒乐果等化学药剂。采用化学药剂防治蚜虫不仅污染环境，使蚜虫产生抗药性，同时还会杀死其他一些益虫(如捕食动物，寄生动物和传粉昆虫)。因此，寻找防治蚜虫的替代方法，有效的进行蚜虫防治已经迫在眉睫。宿主植物抗性是替代杀虫剂控制蚜虫的最有效方式之一，是蚜虫综合防治中不可或缺的环节(Dedryveret al.，2010)。利用宿主植物抗性，选用抗蚜品种是防治蚜虫最为经济有效的途径。
发明内容
在本发明人的前期工作中，我们利用分子标记技术，寻找与抗蚜基因紧密连锁的分子标记，将高粱抗蚜基因RMES1定位在高粱第六号染色体一个126kb长度的区间内(Wanget al.，2013)。该126kb序列在已测序高粱品种BTx623已公开(https：// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Sbicolor；Paterson etal.，2009)，但是在我们欲进行抗蚜虫基因克隆的高粱品种河农16(HN16)还是未知。由此，我们又进一步精确定位了RMES1，并克隆了其目标基因和开发了用于检测RMES1的功能标记。利用该基因进行遗传育种，将会加快抗蚜育种进程，对提高高粱及其他广受蚜虫危害的农作物蚜虫抗性，进而增加产量，具有十分重要的理论意义和现实价值。
本发明要解决的技术问题是如何提高植物抗蚜虫特性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物抗蚜虫特性相关的基因及其编码的蛋白，以及所述基因和蛋白在植物抗蚜虫中的应用。
本发明的一个目的是提供一种高粱蚜虫抗性相关基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述蚜虫抗性基因所编码的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供含有上述抗性基因的载体。
本发明的另一个目的是提供包含上述载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供上述基因在制备转基因植物中的应用。
本发明另一个目的是提供RMES1蛋白在抑制蚜虫对植物的危害，和/或抑制蚜虫对植物的致病性，和/或抑制蚜虫发育中的应用。
本发明另一个目的是提供RMES1不同形式序列突变及其突变体在验证RMES1对抗蚜虫抗性功能中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对蚜虫具有抗性的高粱、小麦等禾本科植物中的应用。
本发明的另一个目的是提供用于检测上述抗性基因的试剂盒及其在选育对蚜虫具有抗性的高粱、小麦等禾本科植物中的应用。
在第一方面中，本发明从抗蚜虫高粱品种河农16(HN16)中分离得到RMES1基因，该基因编码含有LRR结构域的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
RMES1基因编码一个富含亮氨酸重复(1eucine rich repeat，LRR)结构域的蛋白，但是与其他抗虫基因编码蛋白不同的是，该蛋白中没有典型的核苷酸结合(nucleotidebinding，NB)结构域。
应当理解，本领域技术人员可很容易对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。
本发明技术人员应该理解，那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的RMES1的核苷酸序列80％或者更高一致性(identity)的核苷酸，只要编码RMES1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“一致性”指与天然核酸序列的序列同一性。更高“一致性”是指与本发明序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码核苷酸序列具有80％或更高的相同一致性的核苷酸序列。一致性可以用计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的一致性可以用百分比(％)表示。
因此，在一个实施方案中，本发明提供抗蚜虫基因RMES1基因，其编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或编码由SEQ ID NO.2衍生的并且具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相同的功能的氨基酸序列。
本领域技术人员应该理解，此处的术语“由SEQ ID NO.2衍生的并且具有与SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列相同的功能的氨基酸序列”可以通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加并筛选其功能而得到，条件是由SEQID NO.2衍生的氨基酸序列具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相同的功能。
在一个实施方案中，所述的抗蚜虫基因RMES1基因可以选自下述核苷酸序列：
1)SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；或
2)与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列具有80％以上一致性，且编码与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选地，本发明所述的抗蚜虫基因可以包括与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列具有90％以上，更优选地，95％以上，甚至99％的同源性，且编码与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，本发明所述的抗蚜虫基因RMES1基因可以如SEQ IDNO.1所示。
在一个实施方案中，本发明提供抗蚜虫基因RMES1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或是SEQ ID NO.2衍生的且具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相同的功能的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的蚜虫基因RMES1基因编码的蛋白可以如SEQID NO.2所示。
在第二方面，本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
含有RMES1基因的重组表达载体包括双元农杆菌载体，病毒载体，细菌表达载体及酵母表达载体等。含有RMES1基因的载体在构建过程中，可以单独或者组合使用多个诱导型、增强型、组成型、组织特异型启动子。载体可以含有抗生素或抗化学试剂的抗性筛选标记，也可以含有产生颜色变化的酶，比如GUS，或者荧光标记蛋白，例如红色或绿色荧光蛋白。构建的载体可以转化细菌，真菌及单双子叶植物，具体可以为大肠杆菌、农杆菌、酵母、烟草、拟南芥、高粱、玉米、小麦、大麦，但不限于这些。
在第三方面中，本发明提供RMES1蛋白在抑制蚜虫对植物的危害，和/或抑制蚜虫对植物的致病性，和/或抑制蚜虫发育中的应用。
植物防御蚜虫可能通过干扰蚜虫在植物上定居(即排趋性)，或者减少蚜虫在植物上存活和生产后代(即抗生性)实现。本发明通过无选择实验证明RMES1介导抗生反应，即用罩子将高粱蚜虫罩住，使其只能取食指定品种的高粱叶片。结果显示，与感蚜品种相比，含有RMES1基因的高粱叶片上成虫提前羽化，繁殖的后代也明显少很多。可见，RMES1抑制了蚜虫的存活和繁殖，具有抗生的特性。
本发明通过可选择实验证明RMES1是否介导排趋反应，即将放有蚜虫的培养皿放入花盆中间，花盆的外围随机种植着各10株感蚜品种和含有RMES1基因的高粱品种小苗，以供蚜虫选择取食。放入蚜虫后统计每个植株上成虫的数量和后代的数量。发现，在最初的6个小时内，在感蚜品种和含有RMES1基因的高粱品种的植株上分布的成虫数量没有明显区别。但经过一个较长选择时间后(24-48小时)，含有RMES1基因的高粱品种上的蚜虫迅速减少，而感蚜品种上的蚜虫迅速增多。处理6h后，蚜虫在感蚜品种和含有RMES1基因的高粱品种均开始繁殖后代，但与感蚜品种相比，含有RMES1基因的高粱品种繁殖后代的速度要慢得多。以上实验表明，RMES1不仅抑制了蚜虫的定居，具有排趋的抗性，同时还减少了蚜虫的存活和繁殖，具有抗生的功能。
在一个实施方案中，本发明提供RMES1基因在培育抗蚜虫植物品种中的应用，通过将RMES1基因转染到植物株系中而得到抗蚜虫植物品种。所适用的植物种类包括高粱、玉米、小麦、大麦和水稻，但不限于这些。
在一个实施方案中，本发明提供一种培育抗蚜虫植物品种的方法，所述方法包括转基因方法，即通过将RMES1基因转染到植物株系中而得到抗蚜虫植物品种；或者采用常规杂交方法，即将感蚜虫品种与携带RMES1基因的抗蚜虫品种杂交，从而使感蚜虫品种获得来自携带RMES1基因的抗蚜虫植物品种的蚜虫抗性。所适用的植物种类包括高粱、玉米、小麦、大麦和水稻，但不限于这些。其中所述基因转染的方法可以使用基因枪或农杆菌转化等。
在第四方面，本发明还提供RMES1基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。该启动子序列位于RMES1基因起始密码子上游-1bp至-2000bp处。
在第五方面，本发明还提供一系列HN16的RMES1基因缺失突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.4-6所示。
其中RMES1基因在第2598bp至2774bp的缺失突变体如SEQ ID No.4所示，将其命名为asml。
其中RMES1基因在第2267bp至2408bp的缺失突变体如SEQ ID No.5所示，将其命名为asm2。
其中RMES1基因在第2267bp至2408bp的缺失突变体如SEQ ID No.6所示，将其命名为asm3。
上述SEQ ID No.4-6所示的RMES1基因的缺失突变体可用于验证RMES1功能。所述验证方法为各取30粒3个RMES1基因突变体(asm1，asm2和asm3)、蚜虫敏感品种BTx623和抗蚜品种HN16种子进行种植，在植物生长至两叶一心期进行蚜虫抗性鉴定。平均每株幼苗接蚜20只，10-15天后统计植株存活和死亡情况。将植株枯死作为感蚜的标准，接虫15天后如果植株仍然存活，即使植株上存在蚜虫，仍然视为抗虫。所有实验在光照培养箱(型号RXZ-430D，购自宁波江南仪器厂)内进行，培养条件为：16h光照，8h黑暗，温度范围25-30℃，相对湿度60％。15天后asm1、asm2、asm3和BTx623植株全部死亡，HN16生长正常，表明RMES1基因突变后，asm1、asm2、asm3获得感蚜特性，从而表明抗蚜品种HN16的蚜虫抗性由RMES1基因赋予。
在第六方面，本发明还提供SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对，所述引物可用于鉴定或辅助鉴定植物是否具有抗蚜虫特性。
在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定植物是否具有抗蚜虫抗性的方法，所述方法包括无选择试验，即用罩子将蚜虫罩住，使其只能取食指定品系的叶片。若该植物品系和其他品系相比，叶片上成虫提前羽化，繁殖的后代也明显少很多，则判断该植物品系为抗蚜，且具有抗生的特性。所述方法同时包括可选择试验，即将放有蚜虫的培养皿放入花盆中间，花盆的外围随机种植着抗蚜和感蚜品系各10株小苗，以供蚜虫选择取食。放入蚜虫后每间隔一段时间(如接蚜12小时，24小时，48小时)统计每个植株上成虫的数量和后代的数量，如果抗蚜品系植株上的蚜虫迅速减少，而感蚜品系植株上的蚜虫迅速增多则判断该抗性品系具有排趋的抗性。
在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定植物是否具有抗蚜虫抗性的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对。所述SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对组成的分子标记可以在抗蚜虫材料扩增大小为464bp的PCR产物。利用所述分子标记可以快速、高效地鉴定携带RMES1基因的染色体片段。
本发明具有明显的优点和效果。将克隆的抗蚜虫基因RMES1转入感蚜虫的植物植株中，有助于产生新的抗蚜虫植物植株。
本发明能够进一步提供或应用基于上述RMES1核苷酸片段获得的抗蚜虫的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株中。
本发明提供的SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的分子标记能够快速检测RMES1基因或携带RMES1基因的染色体片段，有助于加快高粱、小麦等禾本科植物抗蚜虫育种进程。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1.蚜虫抗性品种HN16、蚜虫敏感品种BTx623及其杂交F1材料接种蚜虫后的表型比较。蚜虫敏感品种BTx623、蚜虫抗性品种HN16和二者杂交获得的F1材料苗期蚜虫抗性鉴定。接种蚜虫15天后BTx623植株全部死亡，HN16生长正常，而F1材料依然存活，只出现少量叶片干枯。
图2.高粱蚜虫抗性基因RMES1在高粱染色体上的精细定位。BTx623精细定位区间位于BT-LRRP2和BT-LRRP3的25Kb之间，而HN16在此区间相对BTx623有较大片段插入，对应BT-LRRP2和BT-LRRP3区间的长度为的169Kb之间，该区间除了BT-LRRP2和BT-LRRP3的同源基因BT-LRRP2和BT-LRRP3，还存在2个编码有LRR结构域的蛋白编码基因。
图3.三种类型高粱材料RMES1等位基因测序与其推导的氨基酸序列比对。序列比对表明类型2材料和类型3材料的RMES1等位基因相对于类型1材料RMES1基因编码的氨基酸序列在160-200aa的位置均相对于类型1材料发生了明显序列变异。类型1材料RMES1基因编码的氨基酸序列一致，其中材料1为HN16。
图4.HN16与asm1、asm2及asm3的LRRP3B核苷酸序列比对。图4只显示了3个突变体与HN16的LRRP3B核苷酸序列在突变区域的序列比对，asm1缺失了HN-LRRP3B基因3′端2598bp至2774bp的177bp，asm2缺失了HN-LRRP3B基因3′端2267bp至2408bp的142bp序列，asm3缺失了2713bp至2724bp的12bp序列，同时在2726bp至2734bp的序列区间还发生了碱基替换。
图5.HN16与asm1、asm2及asm3的LRRP3B氨基酸序列比对。图5只显示了3个突变体与HN16的LRRP3B氨基酸序列在突变区域的序列比对，asm1缺失59个氨基酸，asm2发生移码突变和编码的提前终止，asm3缺失4个氨基酸和存在3个氨基酸替换。
图6.LRRP3B缺失突变体与蚜虫抗性品种HN16接种蚜虫后的表型比较。3个突变体asm1、asm2和asm3与感蚜品种BTx623表型一致，均为接蚜15天后死亡。
图7.RMES1氨基酸序列中的保守结构域预测。
图8.HN-LRRP3B在HN16各个器官中的表达模式分析。荧光定量PCR结果显示，HN-LRRP3B在根、茎、叶、旗叶、幼穗和种子中均有表达，其中旗叶和幼叶中的表达量最高，根和茎中次之，在幼穗和种子中的表达量最低。
图9.蚜虫取食不同时间HN16和突变体中HN-LRRP3B的表达模式分析。在蚜虫取食前，HN16和突变体(以asm1为例)中HN-LRRP3B的表达量没有显著区别；在蚜虫的取食过程中，在野生型HN16和突变体中HN-LRRP3B的表达量均有所升高，但野生型的表达量要显著高于突变体。
图10.无选择实验。蚜虫取食不同时间点HN16和BTx623植株上的蚜虫数目变化情况。
图11.可选择实验。50只无翅蚜虫被放到HN16和BTx623间(A)。蚜虫取食不同时间后每个植株上的成虫数量(B)和后代数量(C)。
图12.RMES1基因标记在分子标记辅助选择育种中的应用。该分子标记可以从存在LRRP3B基因的抗蚜自然群体材料特异的扩增出464bp的条带，而HN-LRRP3B存在突变的材料没有任何扩增产物(A)。对以BTx623为母本、HN16为父本的杂交F2植株进行基因型和接蚜鉴定，发现凡是抗虫单株均能扩增出464bp条带，在感虫单株则无扩增产物(B)。
图13.pUbi-LRRP3B-GFP质粒图谱。RMES1基因由Ubiquitin启动子(pUbi)驱动表达，RMES1基因(去掉终止密码子)的3′端融合了绿色荧光蛋白(GFP)基因序列，所形成开放阅读框命名为LRRP3B-GFP，LRRP3B即为RMES1基因，该开放阅读框又可命名为RMES1-GFP。
图14.RMES1转基因小麦苗期抗蚜虫性鉴定。采用SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对进行转基因植株鉴定，凡是转基因阳性植株均可以扩增出464bp的条带，而转基因受体小麦科农199无扩增(A)，在接种蚜虫前和接种蚜虫48小时LRRP3B表达无显著差异(B)，统计分析发现蚜虫在转基因小麦株系生长与繁殖较为缓慢(C)。转基因株系叶片在处理15天还处于嫩绿状态，而转基因受体亲本科农199的叶片已经发黄，开始枯萎(D)。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明的实施例部分，我们阐述了RMES1基因的抗性特征、分离克隆、功能特征以及分子鉴定，分离的RMES1基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的蚜虫抗性。
实施例1.高粱蚜抗性鉴定及高粱蚜虫抗性基因RMES1的遗传分析
各取30粒蚜虫敏感品种BTx623(由河北农业大学提供)、蚜虫抗性品种HN16(抗蚜虫高粱品种河农16，由河北农业大学提供)和二者杂交获得的F1种子进行种植，生长至两叶一心期进行蚜虫抗性鉴定。平均每株幼苗接蚜20只，10-15天后统计植株存活和死亡情况。将植株枯死作为感蚜的标准，接虫15天后如果植株仍然存活，即使植株上存在蚜虫，仍然视为抗虫。所有实验在光照培养箱(型号RXZ-430D，购自宁波江南仪器厂)内进行，培养条件为：16h光照，8h黑暗，温度范围25-30℃，相对湿度60％。
结果表明15天后BTx623植株全部死亡，HN16生长正常，而F1材料依然存活，只出现少量叶片干枯(图1)，表明RMES1为显性抗蚜虫基因。对BTx623与HN16杂交的312份F3植株进行接蚜鉴定，发现该F3群体中抗蚜、中抗和高感植株分别为82、64、166株(表1)，符合1∶2∶1分离比。由此推断HN16所表现的对蚜虫抗性是由一对半显性基因控制的。
表1.F3家系后代分离比的卡方检验
Figure GDA0001577346820000091
χ2＝3.36＜χ2 0.05，2＝5.99
实施例2.高粱蚜虫抗性基因RMES1的精细定位和克隆
将对蚜虫敏感品种BTx623与抗蚜品种HN16杂交，部分F1植株花粉授给BTx623获得BC1F1种子，并连续回交并自交获得的5000株BC5F2群体作为精细定位RMES1的主要实验材料。
本实验室前期已经将候选基因(RMES1)定位到高粱第六号染色体Sb6m2650和Sb6rj2776两个标记之间，BTx623基因组在此区间染色体序列长度为126kb(Wang etal.2013)。该区间包含5个预测基因，其中3个编码预测的LRR抗性蛋白，将其分别命名为BT-LRRP1(基因登录号Sobic.006G017200)，BT-LRRP2(基因登录号Sobic.006G017400)和BT-LRRP3(基因登录号Sobic.006G017500)。进一步开发了6个分子标记Sb6sv2663、Sb6id2669、Sb6id2689、Sb6sv2731、Sb6id2705和Sb6id2730。其中，Sb6id2705位于LRRP2上，Sb6id2730位于LRRP3上，标记Sb6id2669和Sb6id2689位于BT-LRRP1和BT-LRRP2之间，标记Sb6sv2663位于BT-LRRP1的下游，Sb6sv2731位于BT-LRRP3的上游。
分子标记的引物采用Primer Premier 5(Lalitha，2000)软件设计，引物由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成，基因型分析中PCR扩增体系2×PCR Mix购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司(货号AS111-01)，PCR反应体系如表2所示，PCR反应在赛默飞世尔科技(中国)有限公司
Figure GDA0001577346820000101
孔快速热循环仪进行。PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃变性30s、55-60℃退火35s、72℃延伸1min，扩增35个循环。
表2.PCR反应体系
组分 加入量
2×PCR Mix 10μl
PrimerF(10μM) 1μl
Primer R(10μM) 1μl
DNA 1ul
dd H<sub>2</sub>O 32.5μl
总体积 50μl
为了对RMES1进行精细定位，首先利用标记Sb6m2650和Sb6id2776对5000个BC5F2单株进行基因型分析，用标记Sb6m2650检测出23个交换株，标记Sb6id2776检测出21个交换株。随后运用新开发的6个标记进行连锁分析时，只在这些筛选出的交换植株中进行。其中，利用标记Sb6sv2663，Sb6id2669，Sb6id2689和Sb6id2705分别检测到16，14，6和1个交换株；标记Sb6sv2731和Sb6id2730均筛选到2个交换株(图2)。至此，将RMES1定位到标记Sb6id2705和Sb6id2730之间，该区间在测序品种BTx623基因组序列长度为大约25kb，并且在参照基因组不存在任何预测基因(图2)。我们构建了HN16在该区间的BAC重叠群，发现HN16在BT-LRRP2和BT-LRRP3的同源基因HN-LRRP2和HN-LRRP3之间存在两个新的编码LRR结构域的蛋白，分别命名为HN-LRRP3A和HN-LRRP3B。通过计算编码蛋白序列一致性，发现HN-LRRP3A与HN-LRRP3B序列一致性最高(表3)。
表3.定位区间HN16和BTx623基因编码蛋白序列一致性比较
HN-LRRP3B BT-LRRP1 BT-LRRP2 BT-LRRP3 HN-LRRP2 HN-LRRP3
HN-LRRP3B
BT-LRRP1 62.30％
BT-LRRP2 82.50％ 60.70％
BT-LRRP3 70.90％ 46.70％ 60.00％
HN-LRRP2 82.30％ 60.10％ 97.10％ 59.60％
HN-LRRP3 73.40％ 46.70％ 61.20％ 93.10％ 60.70％
HN-LRRP3A 96.20％ 62.40％ 83.00％ 70.20％ 83.00％ 73.00％
实施例3.高粱自然群体材料RMES1与蚜虫抗性相关性分析
采用Primer Premier 5(Lalitha，2000)软件设计用于扩增HN-LRRP3A和HN-LRRP3B全长的引物，扩增HN-LRRP3A全长引物对由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10组成，扩增HN-LRRP3B全长引物对由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12组成。引物由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成，基因型分析中用于PCR扩增的高保真Taq酶
Figure GDA0001577346820000111
FastPfu Fly DNAPolymerase购自北京全式金生物技术有限公司(货号AP231-01)，PCR反应体系如表4所示，PCR反应在赛默飞世尔科技(中国)有限公司
Figure GDA0001577346820000112
96孔快速热循环仪进行。PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃变性30s、60℃退火35s、72℃延伸1.5min，扩增35个循环。PCR产物测序由赛默飞世尔科技(中国)有限公司完成。
表4.HN-LRRP3A和HN-LRRP3B全长PCR反应体系
Figure GDA0001577346820000113
Figure GDA0001577346820000121
通过PCR扩增对来自全世界范围内的159份高粱品种LRRP3A与LRRP3B基因型进行鉴定，同时对其蚜虫抗性进行了分析。发现该自然群体材料根据LRRP3A与LRRP3B基因型可以分为4类。类型1材料携带HN16类型LRRP3A和LRRP3B，所有33份材料均为抗蚜；类型2材料携带HN16类型LRRP3A，但是LRRP3B相对HN-LRRP3B均发生了突变，所有11份材料均为感蚜；类型3材料不携带LRRP3A，但是携带与类型2一致的突变形式LRRP3B，所有10份材料均为感蚜；类型4材料既不携带LRRP3A也不携带LRRP3B，所有105份材料均为感蚜(图3，表5)。图3表示类型2和类型3部分材料LRRP3B突变区域序列，基因突变造成的氨基酸变异主要分布在第170-200aa区间(见图3上部和中间部的序列比对)，还表示类型1代表性材料相应LRRP3B区域序列(见图3下部的序列比对)。综上，携带HN-LRRP3A类型的材料有的表现为抗虫(类型1)，有的表现为感虫(类型2)，但是凡是携带HN-LRRP3B类型的材料(类型1)均表现为抗蚜，而HN-LRRP3B发生突变或缺失的材料(类型2、3或4)均表现为感虫(表5)。因此推论HN-LRRP3B可能是RMES1候选基因，它的自然变异决定了高粱对蚜虫抗与感的差异。HN-LRRP3B基因在20.8％(159份中的33份)的高粱材料中存在，表明HN-LRRP3B基因在生产实践中已经得到了一定的利用。
表5.159份来自世界各地高粱自然群体材料基因型和表型分析
Figure GDA0001577346820000122
Figure GDA0001577346820000131
Figure GDA0001577346820000141
Figure GDA0001577346820000151
Figure GDA0001577346820000161
Figure GDA0001577346820000171
Figure GDA0001577346820000181
“+”表示携带该基因，“-”表示不携带该基因，“M”表示携带该基因的突变形式，“N/A”表示来源不清楚。
实施例4.HN-LRRP3B缺失突变体筛选和表型鉴定
为构建高粱突变体库，利用0001％、0.0015％和0.002％3个浓度的双环氧丁烷(Diepoxybutane，DEB)(货号RH105484-5ML，购自BIORuler公司)溶液共处理约9000粒HN16的种子(每个浓度处理约3000粒)。方法如下：先用清水浸泡种子4小时，控干水，双环氧丁烷溶液处理20小时，最后用流水冲洗24小时以浸出残留的DEB，防止继续作用。
采用Primer Premier 5(Lalitha，2000)软件设计了可以同时扩增HN-LRRP3、HN-LRRP3A和HN-LRRP3B序列的保守引物对，该保守引物对由引物对SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14组成。引物由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成，其中同时合成了5′末端携带FAM荧光基团的SEQ ID No.13引物。PCR扩增体系2×PCR Mix购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司(货号AS111-01)，PCR反应体系如表6所示，PCR反应在赛默飞世尔科技(中国)有限公司
Figure GDA0001577346820000182
孔快速热循环仪进行。PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃变性30s、55-60℃退火35s、72℃延伸1min，扩增35个循环。所扩增片段在ABI公司3700XL基因测序仪进行片段大小分析。如果所扩增片段长度小于HN16，则认为该材料在HN-LRRP3、HN-LRRP3A或HN-LRRP3B序列存在突变。
表6.PCR反应体系
组分 加入量
2×PCR Mix 10μl
SEQ ID No.13荧光引物(10μM) 0.16μl
普通SEQ ID No.13引物(10μM) 0.24μl
普通SEQ ID No.14引物(10μM) 0.4μl
DNA 1ul
dd H<sub>2</sub>O 8.2μl
总体积 20μl
共发现3个该类缺失突变体，分别命名为asm1、asm2和asm3。经测序鉴定，在3个突变体中，发生突变的正是HN-LRRP3B，而HN-LRRP2、HN-LRRP3和HN-LRRP3A均未发生变化。在这些突变体中，asm1缺失了HN-LRRP3B基因3′端2598bp至2774bp的177bp，asm2缺失了HN-LRRP3B基因3′端2267bp至2408bp的142bp序列，asm3缺失了2713bp至2724bp的11bp序列，同时在2726bp至2734bp的序列区间还发生了碱基替换(图4)。
将突变序列与HN-LRRP3B编码的氨基酸序列进行比对，发现asm1缺失59个氨基酸，asm2发生移码突变和编码的提前终止，asm3缺失4个氨基酸和存在3个氨基酸替换(图5)。对asm1、asm2和asm3进行苗期接蚜鉴定，发现三者均为接蚜15天后死亡，表现出感蚜表型(图6)，HN-LRRP3B缺失可能是感蚜的原因。综合对159份高粱自然群体检测结果，可以确定HN-LRRP3B就是RMES1候选基因。
实施例5.RMES1基因的结构
RMES1基因编码区全长3099bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用扩增HN-LRRP3B全长的引物编码区不内含子序列。取其起始密码子(ATG)上游2000bp序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。采用植物启动子分析工具PlantPAN(http：//PlantPAN.mbc.nctu.edu.tw)发现其启动子序列存在较多转录因子结合顺式作用元件(表7)，表明该基因容易受到外界环境诱导表达。
表7.HN-LRRP3B启动子顺式作用元件分析
Figure GDA0001577346820000201
Figure GDA0001577346820000211
Figure GDA0001577346820000221
实施例6.RMES1蛋白的结构
通过NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)及预测软件对HN-LRRP3B的蛋白结构进行了预测，同时采用其他两种预测软件InterProScan(version 4.8)和Smart(http：//smart.embl-heidelberg.de/)对预测结果进行验证。根据已知核苷酸序列推断RMES1编码1032个氨基酸(SEQ ID NO.2)，在NCBI中搜索比对Conserved Domain Database(CDD)数据库，发现从353到567氨基酸区间含有5个LRR结构域，其中405到567氨基酸区间含有4个LRR家族成员LRR_8superfamily蛋白结构域(E＝7.55e-04)(图7)。然而，与以前所分离的抗虫基因不同的是HN-LRRP3B不具有典型的NB(nucleotide binding)结构域(图7)。
实施例7.RMES1基因的表达特性分析
用于定量分析HN-LRRP3B表达的特异引物通过Beacon Designer 8软件(美国PREMIERBiosoft公司)设计，引物对由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16组成。采用Takara公司的
Figure GDA0001577346820000232
Premix ExTaqTM进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBR Green I的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。PCR反应在Realplex Mastercycler System(Eppendorf)上进行。
表8.荧光定量PCR反应体系
Figure GDA0001577346820000231
反应条件如下：95℃变性2min；95℃变性15s、60℃退火15s、68℃延伸20s，共40个循环。
对HN-LRRP3B在不同器官中的的表达模式进行分析。荧光定量PCR结果显示，HN-LRRP3B在根、茎、叶、旗叶、幼穗和种子中均有表达，其中旗叶和幼叶中的表达量最高，根和茎中次之，在幼穗和种子中的表达量最低。可见RMES1主要在营养器官中表达，而在生殖器官(幼穗和种子)中的表达量极小，几乎可以忽略不计(图8)。
对蚜虫取食前后HN-LRRP3B的表达进行分析，发现在蚜虫取食前，HN16和突变体(以asm1为例)中HN-LRRP3B的表达量没有显著区别；在蚜虫的取食过程中，在野生型HN16和突变体中HN-LRRP3B的表达量均有所升高，但野生型的表达量要显著高于突变体，特别是蚜虫取食48小时后，这一结果尤为明显(图9)，说明HN-LRRP3B的表达是受蚜虫取食诱导的。
实施例8.RMES1抗蚜虫机制分析
(1)无选择实验
植物防御蚜虫可能通过干扰蚜虫在植物上定居(即排趋性)，或者减少蚜虫在植物上存活和生产后代(即抗生性)而实现。本发明首先进行了无选择实验来验证RMES1是否介导抗生反应，即用罩子将高粱蚜罩住，使其只能取食指定品种的高粱叶片。结果显示，与感蚜品种BTx623相比，HN16叶片上的成虫提前羽化，繁殖的后代也明显少很多。接虫4天后，BTx623上的蚜虫数目达到初始的12倍，而HN16还不足初始的4倍(图10)。可见，HN16抑制了蚜虫的存活和繁殖，具有抗生的特性。
(2)可选择实验
本发明设计了可选择实验证明RMES1是否介导排趋反应，即将高粱蚜放在培养皿中，放入花盆中间，花盆的外围随机种植着10株HN16和BTx623的小苗，可供蚜虫选择取食(图11A)。放入蚜虫3，6，24和48h后统计每个植株上成虫的数量(图11B)和后代的数量(图11C)。
经观察发现，在最初的6个小时内，在HN16和BTx623的植株上分布的成虫数量没有明显区别。但经过一个较长选择时间后，HN16上的蚜虫迅速减少，BTx623上的蚜虫迅速增多，24h后BTx623上的蚜虫数目为HN16的2倍，48h后则为HN16上的10倍以上(图11B)。处理6h后，蚜虫在HN16和BTx623均开始繁殖后代，但与BTx623相比，HN16繁殖后代的速度要慢得多，6h后BTx623上的后代数目已经是HN16的5倍，48h后为HN16的10倍以上(图11C)。
通过以上实验表明，RMES1不仅抑制了蚜虫的定居，具有排趋的抗性，同时还减少了蚜虫的存活和繁殖，具有抗生的功能。
实施例9.RMES1基因标记在分子标记辅助选择育种中的应用
为方便RMES1基因在植物抗蚜虫育种中的利用，本发明开发了一种用于检测RMES1基因分子标记的试剂盒，所述试剂盒包含由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对，利用该试剂盒可以特异检测植物(主要指高粱)自然群体中是否存在RMES1基因，或检测植物双亲分离后代群体中是否存在RMES1基因。
本发明通过随机检测表2中12份存在LRRP3B基因的抗蚜品种和12份存在LRRP3B基因突变形式的感蚜品种，发现该分子标记可以从存在LRRP3B基因的抗蚜品种DNA特异的扩增出464bp的条带，而HN-LRRP3B存在突变材料没有任何扩增产物(图12A)，因此SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示的引物对可以准确地检测高粱自然群体中功能性LRRP3B基因。
对以BTx623为母本、HN16为父本的杂交F2植株进行基因型和接蚜鉴定，发现凡是抗虫单株均能扩增出464bp条带，利用该引物对在感虫单株则无扩增(图12B)，表明SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示的引物对可以准确地鉴定分离群体中抗蚜虫和感蚜虫材料。
实施例10.遗传转化RMES1基因产生的小麦抗性植株的应用
(1)RMES1基因表达载体构建
植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-GFP由中国科学院植物学研究所景海春研究员实验室提供，该载体在pCAMBIA3300(参见http：//www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)基础上在多克隆酶切位点处插入了玉米Ubiquitin基因启动子和绿色荧光蛋白基因。采用限制性内切酶BamHI(购自New England Bio1abs公司)37℃酶切2小时将pCAMBIA3300-Ubi-GFP线性化，以可以用扩增HN-LRRP3B(即RMES1基因)去掉终止密码子的基因全长引物对SEQ ID No.17和SEQ ID No.18扩增HN-LRRP3B全长。SEQ ID No.17和SEQID No.18分别携带载体pCAMBIA3300-Ubi-GFP经BamHI酶切后的15bp边界序列。利用In-Fusion HD Cloning Kit(购自大连TaKaRa公司)将SEQ ID No.11和SEQ ID No.12扩增产物(包含去掉终止密码子的RMES1基因全长)和线性化的pCAMBIA3300-Ubi-GFP进行无缝克隆。无缝克隆的反应体系如表9。
表9.无缝克隆反应体系
Figure GDA0001577346820000251
将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，酶切检查阳性克隆，送英俊公司进一步测序验证，获得HN-LRRP3B基因植物表达载体，将检验正确的重组载体命名为pUbi-LRRP3B-GFP(质粒图谱如图13所示)。
(2)小麦遗传转化RMES1基因
选择小麦品种科农199(国审麦2006017)为转化受体。取开花后15-20天的小麦种子，经70％乙醇(购自北京化工厂)表面灭菌1-2分钟后，再用1.5％的次氯酸钠(购自北京化工厂)灭菌，用无菌水冲洗3-4次。然后用小心挤出幼胚，培养于培养基中，25℃培养诱导愈伤组织。
制备DNA-金粉复合物，具体过程为称取6mg金粉(直径为1.0μm，购自Bio-Rad公司)于2ml离心管中；加入100μL无水乙醇，振荡2min；1000rpm离心10sec；弃上清，用100μL双蒸水悬浮，振荡2min；重复离心三次；充分悬浮金粉后，加入10μg的pUbi--LRRP3B-GFP质粒DNA，缓慢加入100μL 2.5M氯化钙(购自北京化工厂)溶液，40μL 0.1M亚精胺溶液，充分振荡3min，并静置3min；10000rpm离心30sec，弃上清；加入500μL无水乙醇(购自北京化工厂)振荡；10000rpm离心30sec，弃上清；加入120μL无水乙醇，重悬待用。
基因枪轰击愈伤组织：愈伤组织在高渗培养基[MS(货号M5519，购自Sigma公司)+甘露醇(90g/L，货号M9546，购自Sigma公司)+2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)(5mg/L，货号76514，购自Sigma公司)+植物凝胶(3g/L，货号P8169，购自Sigma公司)]上培养4-6h，吸取8-10μL制备的DNA-金粉复合物置于载体膜(购自BIO-RAD公司)上晾干，轰击过程如下：用70％乙醇对基因枪(型号PDS-1000/He，购自BIO-RAD公司)表面及样品室进行消毒，同时DNA-金粉复合物放在70％乙醇中浸泡15min；打开电源、真空泵及氦气开关，使气压大于200psi；将载体膜放入固定环中，将质粒DNA-金粉放置于中间，干燥；放下可裂膜(购自BIO-RAD公司)挡盖，将可裂膜放在中央，固定；将微粒发射器移出轰击室，取下盖子，放入阻挡网，把DNA-金粉复合物在片安装在固定槽中，盖上盖子，将微粒发射器放回轰击室；将样品盘放入轰击室，关上轰击门并抽真空。当其数值为26-28in Hg时，将开关打开，然后按住轰击键，当达到1100psi时，可裂膜破裂，松开轰击键开关；释放轰击室的真空；打开轰击室，取出样品盘；取下微粒发射装置，卸下微载体膜和阻挡网；关掉氦气阀门，放走气体，关闭所有电源。
轰击后将愈伤组织移入筛选培养基[MS(货号M5519，购自Sigma公司)+甘露醇(90g/L，货号M9546，购自Sigma公司)+2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)(2mg/L，货号76514，购自Sigma公司)+硫酸铜(0.6mg/L，货号PHR1477，购自Sigma公司)+水解酪蛋白(1g/L，货号22090，购自Sigma公司)+草甘膦(2mg/L，货号90007，购自Sigma公司)+植物凝胶(3g/L，货号P8169，购自Sigma公司)]筛选，2-3周为一个周期，筛选2个周期；将抗性愈伤转入分化培养基[MS(货号M5519，购自Sigma公司)+细胞分裂素(0.2mg/L，货号B3408，购自Sigma公司)]；3-4周后，将分化苗转移到生根培养基(1/2MS，货号M5519，购自Sigma公司)；在幼苗长到10cm时，洗去培养基，栽于温室。
(3)转基因小麦苗期抗蚜虫性鉴定
采用SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物进行转基因阳性植株鉴定，凡是转基因阳性植株均可以扩增出464bp的条带，而转基因受体小麦科农199无扩增(图14A)。由于转基因载体采用组成型启动子，在接种蚜虫前即检测到LRRP3B的较高表达，接种蚜虫48小时LRRP3B表达与接种0小时无显著差异(图14B)。在科农199和转基因株系生长至两叶一心期进行蚜虫接种，每种材料每盆种植3棵苗，设置3个重复，平均每株幼苗接蚜3头，统计接蚜后蚜虫在每个植株的生长和繁殖情况，并拍照记录植株的存活和死亡情况。所有实验在培养箱内进行，培养条件为：14h光照，10h黑暗，温度18℃，相对湿度60％。
统计分析发现在接种蚜虫的0-3天，蚜虫的生长和繁殖在转基因植株和转基因受体亲本科农199之间没有显著差异，从第7天开始蚜虫的生长和繁殖在转基因植株和转基因受体亲本科农199之间差异均达到显著(图14C)。观察蚜虫处理后植株生长情况，发现转基因株系叶片在处理15天还处于嫩绿状态，而转基因受体亲本科农199的叶片已经发黄，开始枯萎(图14D)。以上结果表明将RMES1导入小麦有利于提高小麦对蚜虫的抗性。
蚜虫不但可以严重影响小麦和高粱生长并造成产量损失，而且还可以危害其它如玉米、水稻和大麦等重要禾本科农作物。转RMES1基因小麦试验表明，虽然RMES1基因来源于高粱，但是RMES1整合到小麦基因组仍然能够赋予小麦蚜虫抗性。玉米、水稻和大麦与小麦和高粱具有较近的亲缘关系，将RMES1整合到玉米、水稻和大麦基因组同样有可能赋予这些作物蚜虫抗性，这就为培育多种作物抗蚜虫品种、减少农药使用提供了一种新思路。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
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Claims (11)

1.一种抗蚜虫基因RMES1基因，其编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗蚜虫基因RMES1基因，其选自SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.含有权利要求1或2所述的抗蚜虫基因RMES1基因的重组表达载体。
4.含有权利要求1或2所述的抗蚜虫基因RMES1基因或权利要求3所述的重组表达载体的宿主菌，其中所述宿主菌选自细菌或真菌。
5.根据权利要求4所述的宿主菌，其中所述宿主菌选自大肠杆菌、农杆菌或酵母菌。
6.由权利要求1或2所述的抗蚜虫基因RMES1基因编码的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的氨基酸序列，其为SEQ ID NO.2。
8.一种培育抗蚜虫植物品种的方法，所述方法包括：将权利要求1或2所述的抗蚜虫基因RMES1基因转染到植物株系中而得到抗蚜虫植物品种，或者通过杂交方法，使杂交后代获得抗蚜虫基因RMES1基因而成为抗蚜虫植物品种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物选自高粱、玉米、小麦、大麦或水稻。
10.权利要求1或2所述的RMES1基因的启动子，其核苷酸序列为SEQ ID No.3。
11.一种鉴定植物是否具有抗蚜虫抗性的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID No.7和SEQID No.8所示的引物对。
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