CN113024645A - 小麦转录因子wrky70基因在调控植物生长发育中的应用 - Google Patents

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Abstract

小麦转录因子WRKY70基因在调控植物生长发育中的应用，通过将小麦WRKY70转录因子基因的CDS序列通过酶切连接技术构建到带有FLAG蛋白标签的过表达载体上游，并转化小麦植物，筛选并鉴定，最终获得转基因植物。对筛选到的植物进行分析发现其具有增加小麦穗粒数，降低株高，减少有效分蘖的表型，即该基因影响植物的产量。农作物中同源基因可能具有同样或相似的功能，因此在生产中具有重要的意义。

Description

小麦转录因子WRKY70基因在调控植物生长发育中的应用
技术领域
本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及小麦转录因子WRKY70基因在培育高产植物方面的应用。
背景技术
小麦是世界上最重要的三大主粮作物之一,其17％的种植面积比例提供的粮食超过了30％的全球人口供给及20％的能量消耗。在我国小麦不仅是人们最重要的碳水化合物来源之一,而且在粮食安全中占有举足轻重的作用。随着全球人口数量增加,小麦需求日益增长,供需矛盾也越来越突出。同时,作为小麦最复杂性状的产量因素的遗传也越来越成为限制小麦产量提升的主要瓶颈而未得到有效解决。因此,通过提高小麦单产水平促进粮食生产稳定,已经成为大家的共识。
发明内容
发明人针对前期已经克隆得到的小麦转录因子WRKY70基因进行了转基因植物构建及初步的产量增长分析，发现该基因有改善小麦株型和增产的功能，该基因在不同物种中具有一定的保守性，后期或可进行农作物的产量改良。
本发明提供了小麦转录因子WRKY70基因在调控植物生长发育中的应用。
进一步的，所述植物是小麦。
进一步的，所述调控是降低小麦株高、减少有效分蘖、增加穗粒数中的至少一种
本发明还提供了上述基因相关的生物材料在调控植物生长发育中的应用。
进一步的，所述生物材料是含有所述基因的表达盒.
进一步的，所述生物材料是含有所述基因的重组载体。
进一步的，所述生物材料是含有所述基因的重组微生物。
一种培育增产性转基因植物的方法，包括：提供受体植物中的权利要求4-7任一所述生物材料的含量。
本发明的有益效果：本发明对小麦转录因子WRKY70基因进行过表达载体的构建，并转化到小麦中进行研究，对筛选到的阳性植株进行分析发现其可降低株高，减少分蘖数，增加穗粒数，对增加小麦产量，并且抗倒伏可能具有重要作用，因此在生产中具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中pWMB006的载体图谱；
图2为本发明实施例1中pCAMBIA3301的载体图谱；
图3农杆菌侵染小麦幼胚后在P5培养基上做的初筛(筛选标记是bar)
图4农杆菌侵染幼胚后在P10培养基上做的复筛(筛选标记是bar)
图5农杆菌侵染幼胚后在P12培养基上做的复筛(筛选标记是bar)
图6转基因植株移栽成苗
图7 T2代TaWRKY70转基因植株抽穗表型；WT:野生型；OE-1/2/3:TaWRKY70转基因小麦，OE:TaWRKY70转基因小麦。
具体实施方式：
本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。
实施例1小麦转录因子WRKY70基因序列的获得以及植物表达载体的构建。
登录NCBI信息资源数据库网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY784578.1，找到转录因子WRKY70基因的序列(GenBank No:KY784578.1，核酸序列如SEQID NO.
1所示)，根据WRKY70基因的CDS设计PCR扩增引物：
WRKY70-F:5'-ATGGCGGCACTTGTCACTCC-3'(SEQ ID NO.2)
WRKY70-R:5'-CTACTTATCGTCGTCATCCTTGT-3'(SEQ ID NO.3)
培养小偃6号小麦品种，在发芽后的14天，在第一叶接菌条锈菌32号生理小种的叶片为材料，TRIzol法提取植物总RNA，经反转录PCR获得cDNA，随后以cDNA为模板扩增目的序列。
提取RNA具体步骤如下：参照
Figure BDA0002853211740000021
Plant RNA Reagent说明书，提取接种条锈菌转高温24h样点的小麦叶片组织总的RNA：
(1)将液氮加入研钵中，短暂预冷5～10秒，然后将保存在-80℃冰箱的植物叶片放入液氮中，快速研磨成粉末，用提前预冷药匙将粉末刮入到提前加入500μL冷的(4℃)RNAReagent的1.5mL离心管中，短暂涡旋(1min)直到样品完全悬浮；
(2)室温放置5min(20℃)，离心管水平放置，增大表面积；
(3)室温离心12000g 1min；
(4)吸取上清到另一无RNase的1.5mL离心管中，加100μL(5M)NaCl，
轻拍，轻敲管壁；
(5)加0.3ml(300μL)氯仿，翻转管子混匀；
(6)4℃12000g离心10min，吸取上清水相于另一干净离心管；
(7)加等体积异丙醇，混匀，室温竖直放置30min；
(8)4℃12000g离心10min；
(9)吸掉上清，加1000μL 75％乙醇；
(10)4℃12000g离心10min，仔细吸掉上清，仔细一些，不要丢掉RNA，短暂离心，再次吸掉上清；
(11)加10-30μL RNase-free water，上下轻轻吸打，使RNA悬浮，然后-80℃保存。
RNA提取完成后，按照表2-1进行纯化，反应条件为37℃,30min.
表1 RNA纯化体系
Figure BDA0002853211740000031
cDNA合成体系按照RNA反转录试剂盒
Figure BDA0002853211740000032
RT reagent Kit(TaKaRa,Tokyo,Japan)操作步骤进行，然后具体步骤按照说明书进行添加，最终利用PCR仪进行反应程序：37℃5min，85℃5s，终止程序。
获得小麦转录因子WRKY70基因的CDS序列：按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。热启动98℃10s，60℃5s，72℃15s，35个循环后，72℃延伸5min。
实施例2转基因小麦植株的获得
通过上下两个多克隆位点处的酶切位点切下pWMB006(氨苄抗性，见图1)质粒的内含子Osintron，连入WRKY70基因的全长编码序列。连接成功，测序无误之后(测序引物见附1)，通过HindIII、EcoRI双切回收大片段，然后连接到同样酶切(HindIII、EcoRI双切)的pCAMBIA3301(卡那霉素抗性，见图2)载体上，构建成功后，利用农杆菌EHA105转入小麦幼胚。
农杆菌EHA105侵染：在试验前一天将农杆菌置于160rpm 28℃条件摇培。取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。取授粉15天左右的小麦(Fielder，购自中基高科(北京)生物技术有限公司)穗子，取粒剥胚，加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培养培养基上，23℃培养3天。然后25℃暗培养5天(图3)。
继代筛选：将愈伤转移至W425G筛选培养基，用封口膜封好培养皿，在25.5℃培养箱中暗培养2周(图4，图5)。
再生：愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤组织转移到再生培养基上。抗性愈伤组织一般有绿芽或者绿点，或者有米黄色球状结构。封好培养皿，放到25℃培养箱中光照16h培养2周。随后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里，待苗长到一定大小可以取样检测。将健康小麦苗转入人工温室，通过T0-T2代的连续种植，到T2代，基因就完全纯合，最终获得纯合小麦转基因植株(图6)。
实施例3转基因小麦的验证
以转基因植物的叶片为材料提取基因组DNA，并进行PCR验证，确认WRKY70DNA片段插入小麦基因组。
基因组DNA的提取：
取50mg待检测的正常生长的小麦叶片研磨后加入400μL植物基因组DNA提取液(200mM Tris-Cl pH7.4，250mM NaCl，25mM EDTA，1％SDS)，涡旋混匀后高速离心5min，吸取上清并加入等体积异丙醇，室温沉淀30min，高速离心5min后弃上清，用70％乙醇清洗沉淀两次，将沉淀溶解于20μL无核酸酶的ddH2O。
利用pWMB006载体的特异引物进行PCR扩增：
以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR，体系包括5*缓冲液4μL、上游引物及下游引物各1μL、10mM dNTP 0.5μL、基因组DNA 1μL、Taq聚合酶0.5μL和无核酸酶的ddH2O12μL。PCR程序为热启动95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环后，72℃延伸5min，结束反应。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，转化子基因组DNA中可以扩增得到目标条带，而未转化的不能得到目标条带。
pWMB006特异引物为：
PubinosF:TCGATGCTCACCCTGTTGTTTG(SEQ ID NO.4)
70-R:CCTGAAGTAGAGCCTCGGGTG(SEQ ID NO.5)
实施例4转基因小麦植株的增产表型分析
将筛选出来的阳性植株在温室种植，白天(16h)/黑夜(8h)温度为25/22℃，待到小麦结种时，观察株型,分蘖和穗粒数(图7)。
以上提供的实例是将小麦WRKY70基因的CDS序列通过酶切链接的方式构建到pCAMBIA3301的载体上，并成功转化到小麦上，该基因的表达可降低小麦株高，减少有效分蘖，增加穗粒数。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽描述，但在本发明基础上，可以对之稍作修改或改进，这对本领域技术人员是显而易见的。同样的，将小麦WRKY70转录因子的CDS序列构建到其他过表达载体上也能达到相应效果。因此，在不偏离本发明的精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 小麦转录因子WRKY70基因在调控植物生长发育中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcggcac ttgtcactcc cgcgggttgt cccaccgtgt ccgagctggt cgtgcagggc 60
cgggactcgg ccgccgtcct cgaggccctg ctccggggcg cgtcgtcccc cgacaacgcc 120
gggatccggg agctcgccgc ggagattctc cgctgctgcg accgcgcgct cgccgcgctc 180
cacgccgtcg aaggcgccgc ggtcgatgtc tccggcggca ggaagcgaaa gtcggggccc 240
ggcggcgctg acaacctgac gaggccgaaa agaaggatgc gcgcgagcag cggagagaag 300
gcggcgaggg tcgagaggag gcggacggcg gaggacgggt tcatatggag gaagtacggg 360
cagaaggaga tccacaacaa caagcacccg aggctctact tcaggtgcac ctacaagcac 420
gacatcggct gcccggcgac gaggcaggtc cagcaggcgg aggacgaccc ctccctctac 480
gtcatcacct acttcggcga ccacacctgc tgccagggcg acgccgctgg cgccgtcctg 540
gaggccgagg acgtcaagat gcagccgttc gtcatcaact tcgggtcggc caccgcgagc 600
agcggctcgc cgtggctctc ctcgcccagc gacaccgacg acgtccggag gagcgacagc 660
ggggcctcag gctcgtcgca ggccgtgtgt tcgccggagg aattcgaagt gaaagaggcc 720
aaagttgagt caacgtcgga ggactcacag acggtggatc cggcggcggc ggagctgagt 780
tcgtcggccg acttctcatg tgcatcgccg gcatgggacc ctctgtccgg ctgcttggac 840
tgggaccact tcggcgacag cccgttcgat tgcgagttcc tggattttga cgccattcct 900
ctgttccaat ag 912
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcggcac ttgtcactcc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctattggaac agaggaatgg cgtc 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgatgctca ccctgttgtt tg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctgaagtag agcctcgggt g 21

Claims (8)

1.小麦转录因子WRKY70基因在调控植物生长发育中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物是小麦。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调控是降低小麦株高、减少有效分蘖、增加穗粒数中的至少一种。
4.与权利要求1中所述基因相关的生物材料在调控植物生长发育中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物材料是含有所述基因的表达盒。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物材料是含有所述基因的重组载体。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物材料是含有所述基因的重组微生物。
8.一种培育高产性转基因植物的方法，其特征在于，包括：提供受体植物中权利要求4-7任一所述生物材料的含量。
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