CN115976020A - 调控植物蛋白活性的5′utr序列及在植物表达载体中的应用 - Google Patents

调控植物蛋白活性的5′utr序列及在植物表达载体中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115976020A
CN115976020A CN202211119466.4A CN202211119466A CN115976020A CN 115976020 A CN115976020 A CN 115976020A CN 202211119466 A CN202211119466 A CN 202211119466A CN 115976020 A CN115976020 A CN 115976020A
Authority
CN
China
Prior art keywords
disease
plant
sequence
utr sequence
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202211119466.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115976020B (zh
Inventor
康保珊
古勤生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Original Assignee
Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS filed Critical Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority to CN202211119466.4A priority Critical patent/CN115976020B/zh
Publication of CN115976020A publication Critical patent/CN115976020A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115976020B publication Critical patent/CN115976020B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本申请提供了一种调控植物蛋白活性的5′UTR序列,所述5′UTR序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3,包括序列为SEQ ID NO.4、5、6的uORF1、uORF2和uORF3以及序列为SEQ ID NO.7的非翻译序列。本申请还提供了包含该5′UTR序列的载体。本申请的5′UTR序列和载体适用于抗病基因的,通过喷施茉莉酸调控抗病基因所编码蛋白的翻译水平,以在防御病害的同时避免没有病害侵染时植物防御反应过度。

Description

调控植物蛋白活性的5′UTR序列及在植物表达载体中的应用
技术领域
本发明属于植物学和基因工程领域,涉及调控植物蛋白活性的5′UTR序列及其在植物表达载体中的应用。
背景技术
植物病害是严重影响农作物生产的因素之一,利用基因工程技术赋予植株抗病性,对于农业生产有着深远的影响。在此过程中,精准控制外源抗病基因表达、克服适合度代价(fitness cost)是提高植物抗病性的关键。早期人们尝试采用组成型表达抗病基因提高植物抗病性,但这常会导致植物品质变差。这是因为防御反应在未感染细胞中被激活后,防御相关的广泛细胞重编程将导致植物产量降低。植物通常通过严格控制转录、mRNA核输出和防御蛋白的降解来避免自身免疫。然而,到目前为止,只有转录水平控制被普遍用于基因工程抗病性。研究发现翻译水平的调控是植物免疫诱导过程中主要的调控方式,因此开发探索更严谨的翻译调控以表达病原体诱导的防御蛋白,可以在很大程度上避免植物防御反应引起的适合度代价,提高植株品质。从酵母(占所有mRNA的13%)到人类(占所有mRNA的49%),生物体的mRNAs中普遍存在uORFs,这表明这些mRNA特征对于精确控制转基因表达具有潜在的广泛用途。
发明内容
本发明公开一段可以调控植物蛋白活性的5′UTR序列,该序列所属基因为西瓜双功能核酸酶基因ClsBBD,其表达调控途径与生物胁迫密切相关。该序列(暂命名为ClsBBD-5′UTR)包含三个uORF,其中uORF1,uORF2分别编码3个氨基酸(AA),uORF3编码58个AA,uORF3下游有76nt的非翻译序列。在35S组成型启动子下将该序列与绿色荧光蛋白(GFP)的5'端连接构建植物表达载体,瞬时转化本氏烟,36hpi(hour post-infiltration)对照植株在紫外下可见明显绿色荧光,而该UTR序列连接的GFP在紫外下只观察到微弱的荧光,但GFP在转录水平与对照无明显差异,表明GFP在翻译水平的活性受到强烈的抑制;外源激素茉莉酸(JA)处理植株后抑制作用减弱,蛋白活性增强。利用该段序列构建外源基因特异性表达系统,正常条件下可使外源蛋白的保持低水平,喷施JA后外源蛋白含量迅速升高,适用于抗病基因的表达载体构建,降低植物防御反应过度引起的品质下降。
一方面,本申请提供了一种调控植物蛋白活性的5′UTR序列,所述5′UTR序列包括序列为SEQ ID NO.4、5、6的uORF1、uORF2和uORF3以及序列为SEQ ID NO.7的非翻译序列。
进一步地,所述5′UTR序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
另一方面,本申请提供了植物表达载体,其包含上述5′UTR序列。
进一步地,所述载体为PBI121系列或pCAMBIA1300系列载体。
另一方面,本申请提供了上述5′UTR序列或者载体在制备抗病植物中的应用。
进一步地,所述植物中使用上述5′UTR序列或者载体表达抗病基因。
进一步地,所述抗病基因的翻译水平受茉莉酸的刺激,通过在病害侵染时喷施茉莉酸调控所述抗病植物中抗病基因所编码蛋白的翻译水平,以在防御病害的同时避免没有病害侵染时植物防御反应过度。
另一方面,本申请提供了在植物中表达外源基因的方法,其中使用上述5′UTR序列或者载体表达外源蛋白;优选地,所述外源基因为抗病基因。
另一方面,本申请提供了防御植物病害的方法,包括在植物中使用上述5′UTR序列或者载体表达抗病基因,并在病害侵染时喷施茉莉酸调控所述植物中抗病基因所编码蛋白的翻译水平,以在防御病害的同时避免没有病害侵染时植物防御反应过度。
本申请中的表达的外源基因不局限于抗病基因,其他基因如报告基因、调控生理过程的基因等均可以表达,表达的目的包括但不限于基因工程操作、检测和科学研究等。
附图说明
图1:实施例2中的人工合成基因示意图;
图2:实施例2中引物设计示意图;
图3:构建植物重组表达载体pCAMBIA1300-UTR;
图4:三个携带GFP的重组载体在本氏烟中瞬时表达36h后的观察结果。A,35S:ClsBBD-5′UTR-GFP;B,35S:对照序列-GFP;C,35S:GFP;JA:JA处理植株;SA:SA处理植株,对照:清水对照;
图5:目标序列构建pGreenⅡ0800-LUC载体后报告基因Luciferase的表达活性。A,35S:ClsBBD-5′UTR-LUC;B,35S:对照序列-LUC;C,35S:LUC;JA:JA处理植株;SA:SA处理植株,对照:清水对照;
图6:实施例中所用对照序列的结构。
具体实施方式
下面结合具体实施例详述本发明,但本发明的保护范围不局限于以下实施例。
实施例1制备线性化载体
选择合适的植物表达载体,如PBI121系列或pCAMBIA1300系列载体,通过酶切将载体线性化;以下实施例中使用pCAMBIA1300。
实施例2制备ClsBBD-5′UTR序列
方法1:PCR扩增
提取西瓜叶片RNA,反转录生成cDNA第一链;根据载体插入位点附近序列,设计带接头的特异性引物pF/pR(图2),利用PCR扩增ClsBBD-5′UTR序列,扩增产物经1%琼脂糖电泳后回收纯化。引物序列为,CTGCAGGGGCCCGGGGTCGACCGAGGGCCGAATGGTAATTTAGG,SEQ IDNO.1;和GCCCTTGCTCACCATGGTACCATCGCGTCCTTTTATAGATACG,SEQ ID NO.2。
方法2:按照图1序列人工合成基因
基因合成后按照方法1设计引物,PCR扩增,电泳,回收。
ClsBBD-5′UTR序列为(5’-3’方向)CGAGGGCCGAATGGTAATTTAGGGTACCTATGAGTGAATGAATAATTAAGCAATGGCGTGTGCTATGAGCAAAAGTCTTCATTCACACTCCTTTGCAGAGTCCATTTATCTTCTCGCCCGTCTACCGTTTCTCCTTATCCGTTCATCTTATTTTGCATTCTGGAATTCCGGGATCGAGAATCTGGCGGGAATTGTTTTACCAGATCGAGCTGTGATCGCCGATTTTTAGCGTACTATTTGGAGACCCCTGTTACGAGTTTTGGTCGTGATACGGCCTAATTTTCGTATCTATAAAAGGACGCGAT,SEQ ID NO.3;
其中uORF1序列为ATGGTAATTTAG,SEQ ID NO.4;
uORF2序列为ATGAGTGAATGA,SEQ ID NO.5;
uORF3序列为ATGGCGTGTGCTATGAGCAAAAGTCTTCATTCACACTCCTTTGCAGAGTCCATTTATCTTCTCGCCCGTCTACCGTTTCTCCTTATCCGTTCATCTTATTTTGCATTCTGGAATTCCGGGATCGAGAATCTGGCGGGAATTGTTTTACCAGATCGAGCTGTGATCGCCGATTTTTAG,SEQ ID NO.6;
非翻译序列为CGTACTATTTGGAGACCCCTGTTACGAGTTTTGGTCGTGATACGGCCTAATTTTCGTATCTATAAAAGGACGCGAT,SEQ ID NO.7。
后续实施例中使用了对照序列SEQ ID NO.8,其具体结构如图6所示,为ClsBBD-5′UTR选择性剪接的一个转录本,灰色标注的序列是发生选择性剪接的内含子:CGAGGGCCGAA TGGTAATTTAGGGTACCTATGAGTGAATGAATAATTAAGCAATGGCGTGTGCTATGAGCAAAAGTCTTCATTCACA CTCCTTTGCAGAGTCCATTTATCTTCTCGCCCGTCTACCGTTTCTCCTTATCCGTTCATCTTGTCGGTCTTTTCCT TCCGAGTTCTTTCTTTTAATTTTCCGTCAATTTCTTCTTTGATCTGTGTCGTTGATAATTTGTGAACTTAAATTTAGCCATCGATTCCGCTATTGAAATTCAGATTTTGCATTCTGGAATTCCGGGATCGAGAATCTGGCGGGAATTGTTTTACCAGATCGAGCTGTGATCGCCGATTTTTAGCGTACTATTTGGAGACCCCTGTTACGAGTTTTGGTCGTGATACGGCCTAATTTTCGTATCTATAAAAGGACGCGAT(5’-3’方向)。
实施例3 ClsBBD-5′UTR序列与载体连接
利用同源重组酶将制备好的ClsBBD-5′UTR序列与线性化载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态,涂布于含相应抗生素的LB固体平板上37℃培养10-14h,挑取阳性克隆,测序验证。
实施例4报告基因GFP的表达
按照上述方法将此段序列插入pCAMBIA1300载体中,与报告基因GFP的接连(图3,对照序列为:,SEQ ID NO.8),在烟草中瞬时表达;同时采用外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)分别于0hpi,24hpi喷施处理瞬时表达后的烟草植株,并设置清水对照,36hpi后观察GFP蛋白表达(图4),结果显示,喷施清水和SA后,连接ClsBBD-5′UTR的GFP(A)表达都非常弱,而喷施JA后,GFP表达明显增强,说明ClsBBD-5′UTR受JA正向调控。
实施例5报告基因Luciferase的表达
按照上述方法将此段序列插入双荧光素酶表达载体pGreenⅡ0800LUC载体中,与荧光素酶(Luciferase)报告基因Luc接连(对照序列为:SEQ ID NO.8),在烟草中瞬时表达;同时采用外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)分别于0hpi,24hpi喷施处理瞬时表达后的烟草植株,并设置清水对照,36hpi后观察荧光素酶表达活性(图5),结果显示,喷施清水和SA后,连接ClsBBD-5′UTR的Luc(A)荧光强度都较弱,而喷施JA后,Luc荧光增强,说明ClsBBD-5′UTR受JA正向调控。

Claims (10)

1.一种调控植物蛋白活性的5′UTR序列,其特征在于,所述5′UTR序列包括序列为SEQID NO.4、5、6的uORF1、uORF2和uORF3以及序列为SEQ ID N0.7的非翻译序列。
2.根据权利要求1所述的5′UTR序列,其中所述5′UTR序列的核苷酸序列为SEQ IDNO.3。
3.植物表达载体,其特征在于,其包含根据权利要求1或2所述的5′UTR序列。
4.根据权利要求3所述的载体,其中所述载体为PBI 121系列或pCAMBIA1300系列载体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的5′UTR序列或者载体在制备抗病植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其中所述抗病植物中使用上述5′UTR序列或者载体表达抗病基因。
7.根据权利要求6所述的应用,所述抗病基因的翻译水平受茉莉酸的刺激,通过在病害侵染时喷施茉莉酸调控所述抗病植物中抗病基因所编码蛋白的翻译水平,以在防御病害的同时避免没有病害侵染时植物防御反应过度。
8.在植物中表达外源基因的方法,其特征在于,所述方法使用根据权利要求1-4任一项所述的5′UTR序列或者载体表达外源基因。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述外源基因为抗病基因。
10.防御植物病害的方法,其特征在于,所述方法包括在植物中使用根据权利要求1-4任一项所述的5′UTR序列或者载体表达抗病基因,并在病害侵染时喷施茉莉酸调控所述植物中抗病基因所编码蛋白的翻译水平,以在防御病害的同时避免没有病害侵染时植物防御反应过度。
CN202211119466.4A 2022-09-14 2022-09-14 调控植物蛋白活性的5′utr序列及在植物表达载体中的应用 Active CN115976020B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211119466.4A CN115976020B (zh) 2022-09-14 2022-09-14 调控植物蛋白活性的5′utr序列及在植物表达载体中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211119466.4A CN115976020B (zh) 2022-09-14 2022-09-14 调控植物蛋白活性的5′utr序列及在植物表达载体中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115976020A true CN115976020A (zh) 2023-04-18
CN115976020B CN115976020B (zh) 2024-04-05

Family

ID=85971007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211119466.4A Active CN115976020B (zh) 2022-09-14 2022-09-14 调控植物蛋白活性的5′utr序列及在植物表达载体中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115976020B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418040A (zh) * 2008-12-04 2009-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用
CN102242134A (zh) * 2010-05-11 2011-11-16 中国农业科学院生物技术研究所 大豆GmSGT基因和其5"UTR的克隆及其应用
WO2022023389A1 (en) * 2020-07-27 2022-02-03 Universidad Politecnica De Madrid Methods and compositions to improve plant health and protection

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418040A (zh) * 2008-12-04 2009-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用
CN102242134A (zh) * 2010-05-11 2011-11-16 中国农业科学院生物技术研究所 大豆GmSGT基因和其5"UTR的克隆及其应用
WO2022023389A1 (en) * 2020-07-27 2022-02-03 Universidad Politecnica De Madrid Methods and compositions to improve plant health and protection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A K M MAHMUDUL HUQUE等: "Phylogenetic Analysis and In Vitro Bifunctional Nuclease Assay of Arabidopsis BBD1 and BBD2", 《MOLECULES》, vol. 25, no. 9, pages 2169 *
ACCESSION: XM_039043025.1: "PREDICTED: Benincasa hispida bifunctional nuclease 1 (LOC120086396), transcript variant X2, mRNA", 《GENBANK》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115976020B (zh) 2024-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5735927B2 (ja) タンパク質生産の増強のためのmRNAの一次構造の再操作
CN110343157B (zh) 棉花黄萎病相关基因GhBONI及其编码蛋白与应用
CN111118005B (zh) 一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用
CN110713526A (zh) 小麦抗逆蛋白TaBZR2D及其编码基因与应用
CN114989268B (zh) 一种植物病毒移动蛋白及其应用
CN106674338B (zh) 抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用
CN111621504B (zh) 一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用
CN115976020B (zh) 调控植物蛋白活性的5′utr序列及在植物表达载体中的应用
CN108929917B (zh) 用于控制拟南芥叶片衰老的引物、试剂盒及其应用
KR101746106B1 (ko) 식물체의 뿌리 생장 및 발달을 조절하는 osa-miR444a.4 유전자 및 이의 용도
CN115820666A (zh) 一种菊叶薯蓣DcW5基因及其在耐干旱胁迫和耐盐胁迫中的应用
CN111574604B (zh) 小麦抗病蛋白TaAFRK及其相关生物材料与应用
CN106674339B (zh) 蛋白质在调控植物抗逆性中的应用
CN113025632B (zh) 黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE及其应用
CN110387377B (zh) 油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用
Köhler et al. Intron-specific stimulation of anaerobic gene expression and splicing efficiency in maize cells
CN114107321A (zh) 一种利用拟南芥abi5蛋白过量表达抑制双生病毒侵染的方法
CN103397048B (zh) 培育抗全蚀病和纹枯病转基因小麦的方法及其相关生物材料
CN109207510B (zh) 一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法
KR101079041B1 (ko) 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 형질전환 식물
CN108165552B (zh) 一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro及其应用
CN107058375B (zh) ZmPGK基因在玉米矮花叶病防治中的应用
CN107083396B (zh) ZmPDIL基因在玉米矮花叶病防治中的应用
KR20130015711A (ko) 식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 CaHSTF1 및 이를 이용한 형질전환 식물체
CN113061606B (zh) 植物叶片高表达双向启动子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant