KR101079041B1 - 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 형질전환 식물 - Google Patents

오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 형질전환 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오이 유래의 카이네이스 유전자의 프로모터 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스 유전자의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저온 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 오이 유래 카이네이스 유전자의 프로모터와 이를 이용한 저온 스트레스 저항성 형질전환 식물의 품종개발 기술은 다양한 경제작물의 수확량 증대에 크게 기여할 수 있을 것이다.
오이, 카이네이스, 프로모터, 벡터, 저온 스트레스

Description

오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 형질전환 식물{Novel cold stress resistance kinase promoter from Cucumis sativas and method for enhancing the cold stress resistance of plants using the same}
본 발명은 오이 유래의 카이네이스 유전자의 프로모터 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스 유전자의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저온 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체에 관한 것이다.
최근에 유전자 변형 기술을 이용하여 식물의 형질을 개량하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있다. 이러한 과정에서 외래의 유용 유전자를 대상 식물체에서 발현시키기 위해, 유전자 발현에 필요한 프로모터가 요구된다. 특히, 특정 식물체에서 분리한 유전자를 그 식물체에서 발현시키고자할 때, 해당 식물체로부터 분리한 프로모터를 이용하는 것이 중요하다.
상기 프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유 전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화 된다.
유전자 전이(transformation)를 통한 형질전환 식물체를 개발함에 있어 상시적이면서 강한 발현을 하는 프로모터들, 예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(CaMV35S) 프로모터(Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985)가 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 프로모터에 연결된 특정 유전자의 상시적이고 과다한 발현(over-expression)은 생체대사에 불필요한 대량의 단백질이 주는 유독효과로 인하여 형질전환 식물체가 발아가 되지 않거나 왜소하게 되는 등의 부작용이 나타나는 경우가 많다. 대표적인 예로서, CaMV35S 프로모터를 사용하여 환경스트레스 전사인자 유전자 DREB1A를 과발현시킨 애기장대가 저온 및 저수분 조건에 대하여 저항성을 증진되는 것은 관찰되었으나, 성장이 저해되어 왜소증(dwarfed phenotype) 을 보이면서 아미노산 프롤린 및 수용성 당류의 생산이 함께 증가하는 것이 확인되었다(Lie et al., Plant Cell 10: 1391-1406, 1998; Gilmour et al., Plant Physiol. 124: 1854-1865, 2000). 이러한 부작용은 CaMV35S 프로모터 대신 환경스트레스 관련 유전자인 rd29A의 유도성 프로모터를 사용함으로써 최소화할 수 있다(Kasuga et al, Nat. Biotechnol. 17: 287-291, 1999).
그러므로, 식물체 조직에서 모든 시간대에 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 대신 특정 조건 또는 특정 시기에 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 유도성 프로모터를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어왔다. 학술적으로는, 미생물이나 동물에서 분리된 프로모터를 식물에 도입하고 화학물질을 유도체로 사용하여 목적단백질의 생합성을 촉발하는 유도성 프로모터 시스템이 많이 개발되었다. 지금까지 화학물질에 의한 발현유도 시스템으로서 식물에 적용된 예로서, 스테로이드 덱사메타손(dexamethasone), 항생제 테트라사이클린(tetracycline), 구리이온, IPTG 등 화학물질을 유도물질로 처리해 주는 방법이 소개된 바 있다(Gatz et al., Plant J. 2: 397-404, 1992; Weimann et al., Plant J. 5: 559-569, 1994; Aoyama T. and Chua N-H, Plant J. 11: 605-612, 1997). 그러나 이들 시스템에 사용하는 유도물질 화합물들의 가격이 극히 고가이고 그 화학물질자체가 주는 유독한 효과를 발생하기도 하며 모든 식물에 적용되지 못하는 등의 문제점이 있다.
최근에는 식물이 저수분(가뭄), 고염(염해), 저온(냉해), 등의 환경스트레스에 대하여 자체적 저항성을 보이게 되는 메카니즘이 식물분자생물학의 큰 분야로서 매우 많은 연구(Xiong et al., Plant Cell S165-S183, 2002) 뿐만 아니라 학술적 연구를 통하여 밝혀진 세포 신호전달 과정 및 유전자 발현 조절 메카니즘을 인위적으로 조절하여 가뭄 등 환경스트레스에 대하여 저항성을 갖는 식물체를 개발하고자 하는 연구가 오래 전부터 진행되어 왔다(Valliyodan and Nguyen, Curr. Opin. Plant Biol. 9: 189-195, 2006).
본 발명에서는 저온 등 환경 스트레스 하에서 유전자 발현을 유도시키는 프로모터로 아직 프로모터가 거의 알려져 있지 않는 오이로부터 저온에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 분리하였고, 형질전환 식물체에서 외래 도입 유전자의 발현을 유도하고, 환경 스트레스 하에서 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 오이 유래의 내성 유도 카이네이즈(kinase) 유전자의 프로모터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 목적 단백질을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저온 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 저온에서 식물이 목적 유전자의 발현을 유도하여 목적단백질을 생산토록 하는 프로모터를 제공한다. 구체적으로 서열번호 1로 기재된 염기서열로 이루어지는 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터를 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 오이 카이네이스 유전자(kinase)의 프로모터를 분리하기 위하여, 오이 카이네이스 유전자 DNA를 프로브로 사용하여 오이 BAC 라이브러리를 스크리닝 하여 ATG 개시코돈으로부터 유전자의 상류부분(upstream region)으로 약 2.3 kb에 해당하는 염기서열을 분석하여 서열번호 1로 기재하였다. 도 1을 참조한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에는 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에 포함된, 예를 들어 항생제 저항성 유전자 발현을 위한, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상류 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서 구성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 노팔린 신타아제(NOS) 또는 벼α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로 터미네 이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
구체적으로 상기 오이 카이네이스 유전자(kinase) 프로모터의 활성과 형질전환 식물체에서 외래 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 서열번호 1로 기재된 염기서열을 근거하여 중합효소연쇄반응으로 ATG 개시코돈으로부터 약 1.1 kb 크기의 프로모터 부위를 확보하였다. 상기 확보된 오이 카이네이스 유전자 프로모터를 제한 효소를 이용하여 베타 글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS) 유전자를 함유하는 pBI121 벡터에 삽입하여 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 상기 GUS 단백질은 무색의 글루쿠로닌산/염색물질(dye)복합체를 분해하여 파란색을 내는 유리 염색물질을 내게하므로, 식물체 조직을 이 복합체 용액에 침지하면 이 단백질이 생산되는 조직만이 특이하게 염색된다. 도 2를 참조한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환 미생물을 제공한다. 상기 형질전환 미생물에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli) 또는 아그로박테리움(Agrobacterium)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 미생물로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적단백질을 저온에서 특이적으로 발현시키는 형질전환식물체의 제조방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러 한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜방법(Krens et al., Nature 296: 72-74, 1982; Negrutiu et al., Plant Mol. Biol. 8: 363-373, 1987), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., Bio/Technol. 3: 1099-1102, 1985), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179-185, 1986), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., Nature 327, 70-73, 1987), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 미생물로 형질전환된, 저온 스트레스에 대한 내성을 갖는 형질전환 애기장대를 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 저온 스트레스는 2 내지 8℃ 이며, 바람직하게는 4 내지 6℃이다.
구체적으로 상기 제조된 재조합 발현 벡터를 동결-해동(freeze-thaw) 방법을 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV1301에 형질전환하였다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV1301을 진탕 배양한 후, 진공-인필트레이션(vacuum-infiltration) 방법을 이용하여 애기장대에 형질전환 후 애기장대 T1 형질전환체를 선별하였다.
상기 선별된 T1 형질전환체에서 카이네이스 유전자(kinase) 프로모터의 삽입을 유전자 특이 프라이머와 벡터-유전자 특이 프라이머를 이용하여 확인하여 오이 가이네이스 유전자가 애기장대 게놈에 삽입되었음을 확인하였다. 도 3을 참조한다.
상기 선별된 애기장대 형질전환체를 3주간 배양한 후, 형질전환 식물체의 각 조직으로부터 정상적인 배양온도 조건(23℃)과 저온(4℃) 조건에 따른 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법을 이용하여 조사하였다. 그 결과, 정상적인 배양온도 조건(23℃)에서 보다 저온(4℃)에서 1일간 처리한 식물체 뿐만 아니라 모든 조직에서 정상적인 배양온도 조건(23℃)에서 보다 저온(4℃)에서 1일간 저온 처리한 경우 GUS가 강하게 발현됨을 알 수 있었다. 도 4를 참조한다.
본 발명에 따른 오이 유래 카이네이스 유전자의 프로모터를 목적유전자에 연결하고 식물형질전환용 발현벡터에 조합하여 전이함으로써, 저온 스트레스 하에서 목적단백질을 특이적으로 발현시키는 형질전환식물체를 얻을 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 오이 유래 카이네이스 유전자의 프로모터와 이를 이용한 저온 스트레스 저항성 형질전환 식물의 품종개발 기술은 다양한 경제작물의 수확량 증대에 크게 기여할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.
이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
[ 실시예 1] 오이 유래 카이네이스 유전자의 프로모터 확보 및 염기서열 분석
오이 카이네이스 유전자(Cu-kinase)의 프로모터를 분리하기 위하여, 오이 카이네이스 유전자 DNA를 프로브로 사용하여 오이 EcoRI BAC 라이브러리를 스크리닝 하였다. 그 결과, 8개의 클론을 찾아 중합효소연쇄반응을 통해 확인하였고 그 크기를 결정하였다. 그 중 크기가 약 105kb인 클론을 선택하여 cDNA 염기서열로부터 프라이머(5‘GGAATAAAAACCATTACCAGAACC3’)를 제작한 다음, BAC 클론을 직접 주형으로 사용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, ATG 개시코돈으로부터 유전자의 상류부분(upstream region)으로 약 2.3 kb에 해당하는 염기서열을 분석하여 서열번호 1로 기재하였다(도 1).
[ 실시예 2] 오이 유래 카이네이스 유전자 프로모터를 이용한 벡터 제조
오이 카이네이스 유전자(Cu-kinase) 프로모터의 활성과 형질전환 식물체에서 외래 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 오이 프로모터가 삽입된 식물 발현 벡터를 제작하였다. 상기 실시예 1의 서열번호 1의 염기서열에 근거하여 ATG 개시코돈으로부터 약 1.1 kb 크기의 DNA를 클로닝할 수 있도록 정방향 프라이머(서열번호 2: GAGAGTGTTTGGTGTAC)와 역방향 프라이머(서열번호 3: GTCGCGAGTGAAGAG)를 제작한 다음, 오이의 게놈 DNA를 주형으로 이용하여 프로모터 부위를 중합효소연쇄반응으로 확보하였다. 중합효소연쇄반응 결과 생성된 DNA 절편을 HindIII와 BamHI 제한효소를 이용하여 베타 글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS) 유전자를 함유하는 pBI121 벡터에 삽입하였다(도 2). 제조된 벡터의 프로모터 염기서열을 염기서열 분석을 통하여 확인하였다.
[ 실시예 3] 제조된 벡터를 이용한 애기장대 식물체의 형질전환
상기 실시예 2에서 제조된 벡터를 동결-해동(freeze-thaw) 방법을 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV1301에 형질전환 하였다. 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV1301을 2일 동안 28℃에서 진탕 배양한 후, 진공-인필트레이션(vacuum-infiltration) 방법을 이용하여 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. Columbia)에 형질전환 시켰다. 애기장대 형질전환 후 카나마이신(30 mg/L)을 함유하는 MS 선택배지에서의 생육 여부를 바탕으로 애기장대 T1 형질전환체를 선별하였다.
상기 선별된 T1 형질전환체에서 카이네이스 유전자(kinase) 프로모터의 삽입 을 유전자 특이 프라이머(서열번호 4: GATTGGAGAGATGAATGTTAG, 서열번호 5: AGGTACGGACAAAGTACTAAACC)와 벡터-유전자 특이 프라이머(정방향: 5'CAGATGGCAACCGCATTCAC3', 역방향; 5'GCCAGTTCAGTTCGTTGTTC3')를 이용하여 확인하였다.
그 결과 도 3의 전기영동 결과에서 확인 할 수 있듯이, 형질전환체 3, 4, 6 번 라인 중 가장 확실한 4번 라인을 이용하여 유전자 발현양상을 조사하였다.
[ 실시예 4] 형질전환된 애기장대의 조직 화학적 염색 양상 분석
상기 실시예 3에서 선별된 애기장대 형질전환체를 3주간 배양한 후, 형질전환 식물체의 각 조직으로부터 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법을 이용하여 조사하였다. 식물체를 1 mM X-glu(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴β-D-글루쿠로니드), 100 mM 소듐 포스테이트(sodium phosphate) pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.5 mM 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 0.5 mM 포타슘 페로시아나이드(Potassium Ferrocyanide), 0.1% 트립톤 X-100(Triton X-100)을 함유하는 용액에 침지하여 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 100% 에탄올을 이용하여 세척함으로써 조직에 존재하는 클로로필을 제거하였다. 정상적인 배양온도 조건(23℃)과 저온(4℃) 조건에서 배양한 식물체에서의 GUS의 발현 정도를 각각 조사하였다.
14일 동안 키운 형질전환체를 정상적인 배양온도 조건(23℃)과 저온(4℃) 조건에서 1일간 저온 처리한 후 GUS의 발현 정도를 비교 분석한 결과 도 4에서 확인 할 수 있듯이, 정상적인 배양온도 조건(23℃)에서 보다 저온(4℃)에서 1일간 처리 한 식물체에서의 GUS가 강하게 발현됨을 알 수 있었다(도 4A). 또한, 성숙한 형질전환체(도 4B), 꽃(도 4C), 성숙한 잎(도 4D) 등에서도 GUS의 발현을 확인하였으며, 모든 조직에서 정상적인 배양온도 조건(23℃)에서 보다 저온(4℃)에서 1일간 저온 처리한 경우 GUS가 강하게 발현됨을 알 수 있었다.
도 1은 본 발명에 따른 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터의 염기서열을 보여주는 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터의 모식도를 보여주는 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 저온 스트레스에 대한 내성을 갖는 형질전환 애기장대의 형질전환여부를 확인한 중합효소연쇄반응 결과를 나타낸 것이며,
도 4는 본 발명에 따른 저온 스트레스에 대한 내성을 갖는 형질전환 애기장대의 온도에 따른(좌: 23℃/우: 4℃) GUS의 발현 정도를 확인한 결과이다.
(A: 발아 14일, B: 성숙한 식물체, C: 꽃, D: 잎)
<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Novel cold stress resistance kinase promoter from Cucumis sativas and method for enhancing the cold stress resistance of plants using the same <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1499 <212> DNA <213> Cucumis sativus <220> <221> promoter <222> (1)..(1449) <223> Cu-kinase promoter region <400> 1 aaaaattaaa accatatact attaagagtg gctttcttat ttgatagtcc tagttattca 60 tatatagaaa agtcacatgt gattctagta aagttaaccg aatattttaa ctacaaaaga 120 ctaaaatata cttattttaa aagtttaaag actaaaacaa atacttttta aataaaagtt 180 taatatcata gaacatataa atgaatgcaa acttataata ataaaaaaca tagtacaaac 240 ggaaaatgtt tgtaataaat gattgtgatt gaattttatt gtaaactaat aggtgtaaat 300 aaaaatgttg agattattac tattaaatat tattatgaat tgaaaaaaag agagagtgtt 360 tggtgtacca aattaattta aaaagattag ggaaagaaaa taaaatgatt ggagagatga 420 atgttagaga atattaaatg tccaatttct atagaaaaat attatgtaaa attacggtat 480 ttaaatttaa cttctaatcc aatatttatt tataataaag tatgataaat gatagataga 540 atagaaagag tagtgtatga ggatcacgat tgattgtaaa tgagatagaa tacaaatagt 600 agtgtatgac gatcagaagg atttgtataa acgtatttat gttgatttag aaagaaaaga 660 aagggaagaa ttgatagtca gaaaacaaaa aataaaagtt ggattatgaa agaagacatt 720 atgaactttg tctctatctc tctctctctc acacacacac acactataaa caaaaacaaa 780 gggattgttt agtgttttct taaatagcaa ttttgggcta tgcccaactt tgtccttatc 840 catgcatttg gatttcccat tctaaacccc atcgtctctt ctctctctct ctctctttgt 900 ttttattctc tctatttttc ttttttttgg cattcaaagt caaatcacga gacgatgtac 960 agtgacaata aactcacaaa gaaaggggaa aaaaataaag ggaaaaaaaa ctctcttttg 1020 cagctttaaa ttgcagatgg caaccgcatt cacttccata cgcggagaag catcaatttc 1080 acacctcaat tttgtccctt cactttcatt ttcattgctt tcctcccatt caattcttta 1140 tttgcctccc ctgcttctga cactaactct ttttctgatt tctattgttt tttcttttaa 1200 tattctgggg ctgctggatt tgcgttttcc tacatgtgga gaggcactat attcttttcc 1260 caccaagcac aagaatccgt tcgatttctg gatcggttac cgggatttta gggatgggtc 1320 tgttcagtat caaacatggg ttttttttag tttttttgtc tttggtttag tactttgtcc 1380 gtacctcttt gaatctctga tgggttcttt ttgggaaagg ttttcgtgtg tgaattgaga 1440 gaagaaggaa gtgaggaagt gcactgaagg tgtttgataa aagtcggcac gaggaagag 1499 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 gagagtgttt ggtgtac 17 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 gtcgcgagtg aagag 15 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 gattggagag atgaatgtta g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 aggtacggac aaagtactaa acc 23

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 기재된 염기서열로 이루어지는 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터.
  2. 제 1항에 따른 오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스(Kinase) 유전자의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환 미생물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 미생물이 대장균(E. coli) 또는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)인, 형질전환 미생물.
  6. 제 4항에 따른 형질전환 미생물로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는, 목 적단백질을 저온에서 특이적으로 발현시키는 형질전환식물체의 제조방법.
  7. 제 4항에 따른 형질전환 미생물로 형질전환된, 저온 스트레스에 대한 내성을 갖는 형질전환 애기장대 식물체.
  8. 삭제
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In Vitro Cellular and Developmental Biology—Plant, Vol. 36, pp. 108–114 (2000)
The Plant Cell, Vol. 21, pp. 944-953 (2009.03.)

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