BR102013007201B1 - Composições e métodos contendo promotor específico de folhas para modificar a expressão de genes de interesse em plantas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS CONTENDO PROMOTOR ESPECÍFICO DE FOLHAS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES DE INTERESSE EM PLANTAS. A presente invenção se refere a uma sequência de polinuceotídeos capaz de modificar a expressão de forma eficiente de um ou mais genes de interesse em folhas de plantas, particularmente do gênero Glycine, bem como as ferramentas para obtenção de plantas geneticamente modificadas utilizando tal sequência e uso da mesma. As possibilidades de uso da invenção são amplas, destacando a criação de novas cultivares resistentes a doenças e pragas que atacam folhas, expressão de transgenes que aumentem a eficiência fotossintética da planta, guiar a expressão de proteínas de interesse como anticorpos e fármacos que podem ser facilmente isolados a partir de folhas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a uma sequência de polinucleotídeos capaz de modificar a expressão de um ou mais genes de interesse em folhas, particularmente do gênero Glycine. A invenção também está relacionada com composições contendo tal sequência, métodos para obtenção de plantas geneticamente, planta e/ou parte das mesmas contendo tal sequência e uso da sequência da invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

No Brasil, a soja possui grande importância econômica, pois a exportação do complexo da planta, constituído por grão, farelo e óleo, tem o maior peso na balança comercial, tomando-se o produto agrícola que mais gera divisas cambiais atualmente (Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior, Balança comercial - dados 15 consolidados, 2011. Disponível em: <http://www.desenvolvimento.gov.br/arquivos/dwnl_1331125742.pdf>. Acesso em 13 de março de 2013). No cenário mundial, o país é o segundo maior produtor dessa commodity, segundo os dados econômicos da safra 2010/ 2011 (Conab, Companhia Nacional de Abastecimento, 2013. Disponível em http://www.conab.gov.br/01alaCMS/uploads/arquivos/12_09_06_09_l 8_33_boletim_graos _-_setembro_2012.pdf. Acesso em 13 de março de 2013).

Estima-se que a produção e consumo da soja aumentem à medida que a população mundial cresce, devido à sua importância tanto na alimentação humana e animal quanto industrial e aplicações farmacêuticas (Hartman et al., Crops that feed the World 2. Soybean- 25 worldwide production, use, and constraints caused by pathogens and pests. Food Security, v. 3, n. 1, p. 5-17, 2011.). No entanto, para o aumento ser eficiente e sustentável, é necessário contornar diversos fatores que afetam a produção negativamente. Seca, alagamento, congelamento, disponibilidade de nutrientes no solo, salinidade e fotoperíodo são alguns dos fatores abióticos que afetam o cultivo de soja. Entre os fatores bióticos estão 30 pragas como insetos e microrganismos que causam doenças como a ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizí) e infecção da raiz por nematóides (Heterodera glycines} (Hartman et al., Crops that feed the World 2. Soybean-worldwide production, use, and constraints caused by pathogens and pests. Food Security, v. 3, n. 1, p. 5-17, 2011.).

As estratégias que podem ser utilizadas para contornar as perdas por doenças, pragas e estresses abióticos são o uso de pesticidas, fertilizantes, irrigação ou o 5 desenvolvimento de variedades de plantas resistentes (Hartman et al., Crops that feed the World 2. Soybean-worldwide production, use, and constraints caused by pathogens and pests. Food Security, v. 3, n. 1, p. 5-17, 2011.). Porém, os insumos agrícolas podem ameaçar a saúde humana e o meio ambiente ao contaminar lençóis de água, o solo e se acumularem no produto final de consumo, ou seja, nos grãos (Matson et al., Agricultural TO Intensification and Ecosystem Properties. Science, v. 277, n. 5325, p. 504-509, July 25, 1997.). Além disso, a disponibilidade de água e os altos custos podem limitar o sistema de irrigação da cultura, tomando-o em alguns casos inviável (Hartman et al., Crops that feed the World 2. Soybean-worldwide production, use, and constraints caused by pathogens and pests. Food Security, v. 3, n. 1, p. 5-17, 2011.).

A engenharia genética é uma ferramenta importante para a produção de novos cultivares de soja que possam superar as limitações da cultura. Adicionalmente, essa técnica contribui com o aumento da produtividade auxiliando o melhoramento, pois amplia a base genética de culturas por meio da introdução de características encontradas em organismos filogeneticamente distantes ao transpor barreiras genéticas (Singh e Hymowitz, Soybean 20 genetic resources and crop improvement. Genome, v. 42, n. 4, p. 605-616,1999.). A transgenia permite a inserção de características que podem beneficiar as plantas e seus produtos proporcionando o melhoramento de plantas pouco adaptadas (Singh et al., Genetically modified crops: Success, safety assessment, and public concern. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 71, n. 5, p. 598-607, 2006). Em diversos países essa 25 tecnologia já está sendo utilizada para aumentar a produção agrícola, sendo o Brasil o país que detém a segunda maior área plantada de culturas geneticamente modificadas contando com quase 27 milhões de hectares plantados de soja transgênica (Conab, Companhia Nacional de Abastecimento, 2013. Disponível em http://www.conab.gov.br/01alaCMS/uploads/arquivos/12_09_06_09_18_33_boletim_graos 30 _-_setembro_2012.pdf. Acesso em 13 de março de 2013). Dos cultivares de soja aprovados para plantio no Brasil, o Roundup Ready, o Cultivance e o Liberty Link™ possuem tolerância a herbicidas enquanto o cultivar Intacta RR2 PRO, além de ser tolerante a herbicida, produz a proteína inseticida CrylA (CTNBIO, Comissão Nacional de Biossegurança, 2013. Disponível em http://www.ctnbio.gov.br/upd_blob/0001/1736.pdf. Acesso em 13 de março de 2013).

O desenvolvimento da pesquisa na área genômica e o recente sequenciamento do genoma da soja (Schmutz et al., Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature, v. 463, n. 7278, p. 178-183, 2010.) tomaram mais rápida e direcionada a criação de novas variedades, uma vez que o genoma provê informações sobre a expressão gênica, as vias metabólicas, a estrutura do material genético, o desenvolvimento e a evolução dos organismos. Desta forma, é possível por meio da engenharia genética vislumbrar o aumento da produção da soja sem expansão da área plantada, manipulando-se rotas metabólicas para aumentar a eficiência fotossintética, a fixação de nitrogênio nos seus tecidos de reserva, e influenciar na fase reprodutiva da espécie (Ainsworth et al., Accelerating yield potential-in soybean: potential targets for biotechnological improvement. Plant, Cell & Environment, v. 35, n. l,p. 38-52, 2012).

A transgenia consiste na inserção de um ou mais genes capazes de conferir ao organismo uma característica desejável. Denomina-se transgene a sequência de nucleotídeos contendo uma região promotora, uma região codificadora e uma região terminadora inserida em um genoma hospedeiro (Visarada et al., Transgenic breeding: Perspectives and prospects. Crop Science, v. 49, n. 5, p. 1555-1563, 2009). Os transgenes podem ser oriundos de organismos semelhantes ou filogeneticamente distantes do hospedeiro (Singh et al., Genetically modified crops: Success, safety assessment, and public concern. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 71, n. 5, p. 598-607, 2006). Os dois métodos mais utilizados para inserir genes em plantas são a biobalística, no qual a planta é bombardeada por partículas de ouro ou de tungsténio cobertas pelo DNA de interesse; e via Agrobacterium sp., uma bactéria de solo que é capaz de transferir um segmento de seu DNA para plantas por meio do plasmídio Ti (tumor inducing) (Singh et al., Genetically modified crops: Success, safety assessment, and public concern. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 71, n. 5, p. 598-607, 2006).

A regulação da expressão do transgene será feita, em maior parte, pelo promotor, parte integrante do gene a qual controla a etapa de transcrição, a primeira a sofrer o controle da expressão gênica. A expressão do transgene, porém, não é uniforme em todas as plantas geradas sob as mesmas condições, pois ela está sujeita a outros mecanismos de regulação endógenos da planta. A escolha de um promotor adequado para regular o transgene pode diminuir essa variabilidade de expressão e aumentar a eficiência da técnica (Cammue et al., Approaches to minimize variation of transgene expression in plants. Molecular Breeding, v. 16, n. l,p. 79-91,2005).

Apesar de proporcionar diversos benefícios para a agricultura ao aumentar a produtividade, diminuir o uso de agrotóxicos e os custos, a cultura de organismos geneticamente modificados ainda levanta questões quanto à segurança ecológica e toxicológica (Singh et al., Genetically modified crops: Success, safety assessment, and 5 public concern. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 71, n. 5, p. 598-607, 2006).

Uma medida que pode ser utilizada para diminuir preocupações com a biossegurança de plantas GM é o uso de promotores, sequências regulatórias a montante (upstream) da região codificadora, responsáveis pelo controle preciso dos transgenes, ou seja, promotores que limitam a expressão desses a determinado órgão e/ou período (Potenza et al., Targeting 10 transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: P-romoters- used in plant transformation. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, v. 40, n. 1, p. 1-22, 2004).

Atualmente, existem diversos promotores isolados utilizados para regular transgenes em plantas transformadas: promotores constitutivos, órgão/tecido/célula-específicos, 15 induzíveis e promotores sintéticos. A escolha do promotor a ser utilizado depende do objetivo final da transformação, seja ela para estudo de expressão gênica e desenvolvimento da planta, ou uso comercial (Potenza et al. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, v. 40, n. 1, p. 1-22, 2004). 20 Existem dois tipos básicos de promotores, os induzíveis e os constitutivos. Um promotor induzível é um promotor capaz de ativar (direta ou indiretamente) a transcrição de uma ou mais seqüências de DNA ou genes em resposta a um determinado indutor. Na falta deste indutor, as seqüências de DNA ou genes não serão transcritos. O indutor pode ser um componente químico (descrito, por exemplo, no documento de 25 patente WO9519443), um estresse de origem fisiológica (como no caso de ferimentos, que é descrito, por exemplo, no documento de patente US6677505), ou um composto endógeno gerado em resposta a mudanças no desenvolvimento da planta.

Existem inúmeros promotores tecido-específicos descritos para plantas, como é o caso da expressão específica em semente (WO8903887), tubérculo (como 30 mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), fruto (Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 e US5753475), caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369 e Schmülling et al. (1989) Plant Cell 1, 665-670), raiz (US20060143735 e como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3:1639-1646), estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da 5 zona de deiscência (WO9713865) e meristema (Ito et al. (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878).

Os promotores constitutivos, por sua vez, são capazes de promover a expressão de seqüências de DNA durante todo o desenvolvimento da planta sem restrições espaciais. Sendo assim, essa expressão ocorre em uma grande variedade de células e TO tecidos da planta. Apesar disso, o termo “constitutivo” não significa que a sequência é expressa nos mesmos níveis em todas as células vegetais.

A presente invenção diz respeito a um promotor específico de folha isolado de planta de soja que pode ser utilizado no controle de pragas que atacam esse órgão sem que o produto da expressão do transgene afete o desenvolvimento da planta e a 15 qualidade da semente, produto a ser consumido. Adicionalmente, o promotor pode regular a expressão de transgenes que aumentem a eficiência fotossintética da planta, aumentando, assim, a produção de culturas de valor agronômico. Ainda, esse promotor pode guiar a expressão de proteínas de interesse como anticorpos e fármacos que podem ser facilmente isolados a partir de folhas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a uma sequência de polinuceotídeos capaz de modificar a expressão de forma eficiente de um ou mais genes de interesse em folhas de plantas, particularmente do gênero Glycine, bem como as ferramentas para obtenção de plantas geneticamente modificadas utilizando tal sequência e uso da mesma. As possibilidades 25 de uso da invenção são amplas, destacando a criação de novas cultivares resistentes a doenças e pragas que atacam folhas, expressão de transgenes que aumentem a eficiência fotossintética da planta, guiar a expressão de proteínas de interesse como anticorpos e fármacos que podem ser facilmente isolados a partir de folhas.

O polinucleotídeo de acordo com a presente invenção apresenta homologia com 30 a sequência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO1, tendo 50% de identidade, preferencialmente 60%, preferencialmente 70%, preferencialmente 80%, preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95% ou superior.

Em uma primeira concretização, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo que seja substancialmente similar à SEQ ID NO1; sequência reversa de SEQ ID NO1; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NO1.

Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo 5 o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombinantes compreendendo, na direção 5 ’-3’, uma sequência de promotor de polinucleotídeo da 10 presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma sequência de terminação de genes. O polinucleotídeo a ser transcrito pode compreender uma armação de leitura aberta de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou pode ser uma região de não codificação, ou não traduzida, de um polinucleotídeo de interesse. A matriz de leitura aberta pode ser orientada em uma direção “sense” ou “antisense”.

Preferivelmente, a sequência de terminação de genes é funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a sequência de terminação de genes é a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado da técnica como o terminador da nopalina sintetase de A. tumefaciens. Os vetores recombinantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas.

Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o vetor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou progénie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o vetor recombinante da presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão modificada de um 30 polipeptídeo. Esse método compreende transformar uma célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênica sob condições que conduzem à regeneração e crescimento da planta madura.

Ainda em outro aspecto da presente invenção é provido um método para identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a transformação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma sequência de promotor de polinucleotídeos da presente invenção ligada operacionalmente a um polinucleotídeo a ser testado, 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgênica, e 3) comparar o fenótipo da planta transgênica com o fenótipo de plantas não transformadas, ou de tipo selvagem.

Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tomarão evidentes, e a invenção será mais bem compreendida por referência na “Descrição Detalhada da Invenção”.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Fluxograma indicando as etapas de pesquisa envolvidas no isolamento de um promotor preferencialmente expresso em folha.

Figura 2. Perfil de expressão do contig 18151 baseado na frequência relativa de ESTs (expressed sequence tags) (ESTs do contig / total de ESTs da biblioteca). (A) frequência das ESTs que compõem o contig 18151 de bibliotecas de folha e não folha (raiz, flor, semente e vagem) de soja no banco da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (https://alanine.cenargen.embrapa.br/Soja001/); (B) frequência de ESTs do gene Gma 12822 (idêntico ao 18151) no UniGene do banco de sequências do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ESTProfileViewer.cgi?uglist=Gma. 12822), indicando o nome das bibliotecas, o número de transcritos por milhão (TPM); a intensidade estimada da mancha baseada em TPM e a frequência relativa; (C) frequência relativa de ESTs que formam o contig 24764 (idêntico ao 18151) no banco de sequências do projeto GenoSoja (http://bioinfo03.ibi.unicamp.br/soja/) das bibliotecas: H03 de hipocótilo e plúmula de sementes germinantes; L05 de folhas não expandidas e ápices caulinares de plântulas com duas semanas; L06 de tecido foliar submetido a estresse hídrico; SH2 de brotos germinativos; L03 de folhas totalmente expandidas; UK1 de origem desconhecida; S10 de plântulas; L01 de tecido foliar senescente de plantas maduras e L08 de folha.

Figura 3. Análise comparativa da sequência do contig 18151, 802 pb, com o genoma da soja no Phytozome (http://www.phytozome.net/). (A) transcrito Glyma20g01120.1 no cromossomo Gm20 que alinhou com o contig 18151 com 100% de identidade; (B) transcrito Glyma07g21150.1 com 91,1% de identidade de sequência com o contig 18151 do cromossomo Gm07. O contig 18151 está representado em preto e os transcritos ao qual foi alinhado em cinza. Anexo 1. Análise comparativa da sequência do contig 18151, 802 pb, com o genoma da soja no Phytozome (http://www.phytozome.net/). (A) transcrito ... _ 1Q Glyma20g01120.1 no cromossomo Gm20 que alinhou com o contig 18151 com 100% de identidade; (B) transcrito Glyma07g21150.1 com 91,1% de identidade de sequência com o contig 18151 do cromossomo Gm07. O contig 18151 está representado em azul e os transcritos ao qual foi alinhado em amarelo.

Figura 4. Anotação funcional dos loci que alinharam com o contig 18151 no 15 banco de dados do Phytozome (http://www.phytozome.net/). (A) Glyma20g01120 no cromossomo Gm20 e (B) Glyma07g21150 no cromossomo Gm07.

Figura 5. Perfil de expressão do gene GmCitl. (A) Eletroforese em gel de agarose 1,5% dos produtos das reações de RT-PCR semiquantitativa, indicando os fragmentos amplificados do gene de actina (~ 500 pb) e GmCitl (419 pb).

Figura 6. Ensaio de Northern blot do GmCitl com RNA total de órgãos de soja, apresentando fragmento de 0,8 Kb correspondente ao tamanho estimado do transcrito GmCitl. No painel inferior, eletroforese em gel de agarose 1,5% mostrando concentrações de RNA ribossomal 25S equivalentes nas amostras correspondentes, após coloração com brometo de etídio. Raiz (R); folha (F); vagem (V) ou semente (S). M: 25 1Kb plus DNA LADDER.

Figura 7. Sequência genômica da região promotora e codificadora de GmCitl de G. max. cv. Williams 82 obtida pelo Phytozome (http://www.phytozome.net/). O sítio de iniciação da tradução (ATG) está destacado em negrito, as regiões em cinza são, respectivamente a região 5’ UTR, um intron, a seqüência codificadora e a região 30 3’UTR. As regiões onde se anelam os iniciadores para amplificação dos diversos fragmentos do promotor estão sublinhadas. Anexo 2. Sequência genômica da região promotora e codificadora de GmCitl de G. max. cv. Williams 82 obtida pelo Phytozome (http://www.phytozome.net/). O sítio de iniciação da tradução (ATG) está destacado em vermelho, verde-corresponde à região 5’ UTR, azul à seqüência codificadora, rosa à região 3’UTR e a região em amarelo corresponde a um intron. As regiões onde se anelam os iniciadores para amplificação dos diversos fragmentos do promotor estão sublinhadas.

Figura 8. Representação esquemática do vetor pENTR™. O sítio em que o 5 fragmento de DNA é ligado, de modo que seja flanqueado pelos sítios de recombinação attLl e attL2, está em destaque no esquema. Fonte: Invitrogen™ (2006).

Figura 9. Representação esquemática do vetor pMDC162. A figura mostra as regiões codificadoras que compõem o vetor, seu mapa de restrição e os sítios de recombinação attRl e attR2. A recombinação entre os sítios attLl e attL2 do vetor de TO entrada còm os sítios attRl e attR2 (indicados por setas) do vetor destino resultará-na- inserção do fragmento de DNA de interesse e na excisão do gene mortal ccdB. Fonte: Curtis e Grossniklaus (2003).

Figura 10. Migração eletroforética em gel de agarose 1% dos vetores de entrada pENTR™ (VE) e dos vetores binários pMDC162 (VB) contendo os fragmentos 15 PCitO,4, PCitO,8 pMCitl,9. As enzimas utilizadas foram EcoRV e Notl no caso dos vetores de entrada e Xbal no caso dos vetores binários. M: 1Kb plus DNA LADDER.

Figura 11/ Anexo 3. Análise in silico e funcional da região promotora do GmCitl. (A) representação dos motivos putativos dos elementos cis encontrados na região promotora (fita senso) com 2,3 kb do GmCitl. Na barra superior estão indicados 20 o TATA Box e um motivo putativo do elemento iniciador (Inr). Os elementos destacados necessários para expressão órgão-específica são: OSE1ROOTNODULE, OSE2ROOTNODULE e ROOTMOTIFTAPOX1 responsáveis pela expressão gênica em raiz, CACTFTPPCA1 necessário para expressão em folha e GT1 CONSENSUS, GATABOX, INRNTPSADB, IBOXCORE, CIACADIANLELHC, -10PEHVPSBD, 25 GT1CORE, IBOX, IBOXCORENT, SORLIP2AT, TBOXATGAPB, SORLIP1AT, SORLIP4AT e SORLREP4AT responsivos à luz. Na parte inferior b representa o gene gus sem promotor, c, d, e e representam o gene gus com os promotores PCitO,4, PCitO,8 e PCitl,9 respectivamente e (B) ensaio histoquímico em folha (a esquerda) e raiz (a direita) das plantas de fumo onde: (a) planta não transformada, (b) planta transformada 30 com o vetor binário sem promotor e (c) planta com o vetor binário contendo o promotor PCitO,4, (d) planta com o vetor binário contendo o promotor PCitO,8, (e) planta com o vetor binário contendo o promotor PCitl,9. A barra na parte inferior das fotos corresponde a 1 mm.

Figura 12: Cassete de expressão contendo o promotor Pcit0,4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção tem como finalidade o fornecimento de método para modificar a expressão, bem como uma sequência promotora eficaz para plantas, 5 preferencialmente do gênero Glycine, de forma a tomar possível a produção de variedades geneticamente modificadas expressando genes de interesse em folhas.

Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente.

As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

No contexto dessa descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso 10 serão melhor detalhados a seguir:

Um “gene quimérico” é um gene compreendendo um promotor e uma região codificadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, o gene quimérico compreende os polinucleotídeos da presente invenção ligados a regiões codificadoras de genes endógenos e/ou exógenos.

Uma “seqüência consenso” é uma seqüência artificial na qual a base em cada posição representa a base freqüentemente mais encontrada na seqüência atual comparando- se diferentes alelos, genes ou organismos.

Os termos “promotor”, “região promotora” ou “sequência promotora” podem ser usados intercambiavelmente e entende-se significarem, de acordo com a presente 20 invenção, aquela porção do DNA anterior à região codificadora que contém sítios de ligação para RNA polimerase II para iniciar a transcrição do DNA, conferindo assim, um ponto de controle para a transcrição do gene. Em eucariotos, o início da transcrição depende da ligação ao promotor de um conjunto de proteínas designadas fatores de transcrição. Estes fatores se ligam às sequências promotoras, recrutando a RNA polimerase, a enzima que 25 sintetiza o RNA a partir da região codificadora do gene.

O promotor-alvo da RNA polimerase II (Pol II) é uma região chave que regula a transcrição diferencial das proteínas que codificam os genes. A arquitetura gene- específica das sequências promotoras toma extremamente difícil planejar a estratégia geral para predizer promotores. As regiões flanqueando o promotor são particularmente 30 pouco descritas e pouco compreendidas (Shahmuradov et al., (2005) Nucleic Acids Research, 33(3): 1069-1076). Estas regiões podem conter dúzias de motivos curtos (5- 10 bases) que servem como sítios de reconhecimento para as proteínas envolvidas no início da transcrição, e na regulação específica da expressão gênica. Cada promotor tem seleção e arranjo únicos de tais elementos gerando um padrão original da expressão gênica.

O sítio de ligação dos fatores gerais de transcrição pode ser dividido em 3 partes. O Promotor Proximal, que é a sequência proximal upstream ao gene que tende a conter os elementos regulatórios primários. Esta região de 200-300 pb está upstream do promotor núcleo e contém sítios múltiplos de ligação dos fatores de transcrição, os quais são responsáveis pela regulação da transcrição específica. O Promotor Distai, que é a sequência distal a montante do gene que pode conter os elementos regulatórios adicionais, geralmente com uma influencia mais fraca do que a do promotor proximal.

A posição não esta muito clara, sabe-se apenas que está à montante (mas não -como-um enhancer (potencializador) ou outra região reguladora cuja influência é independente da posição/orientação). O promotor distai também possui sítios de ligação para os fatores de transcrição específicos (Smale, (2001) Genes Dev., 15:2503-2508). E por fim, o promotor núcleo.

Como os promotores tipicamente são imediatamente adjacentes ao gene em questão, a posição dos promotores é designada relativamente ao sítio de inicio da transcrição, onde a transcrição do RNA começa por um gene em particular, ou seja, posições à montante são números negativos iniciando a contagem pelo -1, por exemplo, -100 é a posição 100 pares de bases a montante.

O promotor núcleo é a região mínima do promotor capaz de iniciar a transcrição basal. Ela contém o sítio de início da transcrição (TSS) e extensões típicas que vão de -60 a +40 relativos aos TSS. Entre 30-50% de todos os promotores conhecidos contêm um TATA-box situado de 45 a 25 pb upstream ao TSS. O TATA-box é aparentemente o sinal funcional mais conservado nos promotores de eucariotos e em alguns casos pode dirigir o início preciso da transcrição pela Pol II, mesmo na ausência de outros elementos controladores. Muitos genes altamente expressos contêm um forte TATA-box em seu promotor núcleo. Entretanto, em alguns grupos grandes de genes, como genes “housekeeping" e da fotossíntese, a região TATA-box está frequentemente ausente, e os promotores correspondentes são citados como promotores sem TATA-box.

Nestes promotores, a localização exata do ponto de início da transcrição pode ser controlada pela sequência de nucleotídeos da região de início da transcrição (Inr) ou pelo elemento promotor a jusante “downstream" (DPE), o qual é observado geralmente 30 pb a jusante do TSS (Burke e Kadonaga, (1997) Genes Dev., 11:3020—3031; Smale, (1997) Biochim. Biophys. Acta, 1351:73—88).

A região onde se liga a RNA polimerase II chamada TATA Box é uma sequência consenso TATAAA, localizada 25 a 30 nucleotídeos acima do ponto de início da transcrição (-25 a -30). A região TATA-box tipicamente aparece muito próximo ao sítio de início de transcrição (geralmente a menos de 50 bases). Muitos promotores 5 contêm outras sequências, como a região CAT box (-70 a -80), que possui a sequência consenso CAAT ou CCAAT e a região GC box (-110), que possui a sequência consenso GGGCGG. As regiões do promotor CAT box e GC box parecem funcionar como enhancers e locais de ligação de fatores de transcrição (Smale e Kadonaga, (2003) Annu. Ver. Biochem. 72:449-479).

Uma grande variedade de algoritmos vem sendo desenvolvidos para facilitar a detecção de promotores em sequências genômicas, e a predição de promotores é um elemento comum de muitos métodos de predição de genes. A primeira revisão detalhada do desempenho de muitos programas com a função de predizer promotores foi apresentada por Fickett e Hatzigeorgiou, (1997) (Genome Res., 7:861- 15 878). Embora o pequeno número de sequências testadas (18 sequências) tenha apresentado diversos problemas (Ohler et al., (1999) Bioinformatics, 15:362-369), os resultados demonstraram que os programas testados podem reconhecer cerca de 50% dos promotores com uma taxa de falsos positivos de 1 a cada 700-1000 pb (Pedersen et al., (1999) Phytopathology, 87(l):96-100; Ohler e Niemann, (2001) Trends Genet, 20 17:56-60). Entretanto, é importante melhorar a eficiência da predição de promotores em sequências únicas (devido à falta frequente de informação sobre as sequências de genes ortólogos).

“Expressão” é a transcrição ou tradução de um gene estrutural, endógeno ou heterólogo.

O termo “gene” significa uma unidade física e funcional da hereditariedade, representada por um segmento de DNA que codifica uma proteína funcional ou molécula de RNA.

Um “gene endógeno” é um gene próprio da célula ou do organismo.

Um “gene heterólogo” é um gene isolado de um organismo doador e 30 recombinado no organismo receptor transformado. É um gene que não é próprio da célula ou do organismo.

Um “gene repórter” é uma unidade codificadora cujo produto é facilmente testado, por exemplo, genes CAT, GUS, GAL, LUC e GFP. A expressão de um gene repórter pode ser usada para testar a fúnção de um promotor ligado a esse gene repórter.

O termo “propágulo” como usado na presente invenção significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexual ou assexual, incluindo as mudas.

“Sense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na mesma 5 orientação 5’-3’ com relação ao promotor.

“Antisense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5’-3’ do promotor.

Como usado aqui, o termo “x-mero”, como referência a um valor específico de “x”, refere-se a uma seqüência compreendendo pelo menos um número específico (“x”) -10- - -de resíduos do polinucleotídeoidentificadocomoSEQIDNO 1. De acordo- com-formas de realização preferidas, o valor de x é preferivelmente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente ainda pelo menos 60 e mais preferivelmente pelo menos 80. Assim, polinucleotídeos da presente invenção compreendem um polinucleotídeo de 20 meros, 40 meros, 60 meros, 80 meros, 100 meros, 120 meros, 150 meros, 180 meros, 15 220 meros, 250 meros, 300 meros, 400 meros, 500 meros ou 600 meros identificado como SEQ ID NO1 e variantes da mesma.

O termo “polinucleotídeo (s)”, como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mRNA, de 20 filamentos tanto “sense” como “antisense”, e compreende cDNA, DNA genômico, e DNA recombinante, assim como polinucleotídeos completamente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém introns e corresponde a uma molécula de DNA em um modo geralmente um a um. Uma molécula de RNAm corresponde a uma molécula de DNA e HnRNA da qual os introns foram excisados. Um polinucleotídeo pode consistir de um 25 gene completo, ou qualquer porção do mesmo. Os polinucleotídeos “antisenso” operáveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de “polinucleotídeo” inclui assim todos esses fragmentos antisense operáveis. Os polinucleotídeos antisense e técnicas envolvendo polinucleotídeos antisense são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular 30 cloning. A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)

Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puro.

O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um segmento relativamente curto de uma seqüência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores (“primers”), onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase.

O termo “sonda”, utilizado na presente invenção, refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo seqüências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de 10 cadeia simples ou cadeia-dupla. O comprimento- exato da sonda -dependerá -de-muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da seqüência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma seqüência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Conseqüentemente, a seqüência da sonda não necessita refletir exatamente a seqüência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, 20 com o restante da seqüência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Altemativamente, bases não complementares ou seqüências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele.

O termo “primer” como utilizado aqui refere-se a um oligonucleotídeo, sendo 25 RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos 30 nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o ‘primer’ oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O ‘primer’ deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a seqüência do ‘primer’ deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma 5 seqüência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5’ de um ‘primer’ complementar. Altemativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da seqüência de oligonucleotídeo do ‘primer’, desde que o ‘primer’ tenha complementaridade suficiente com a seqüência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto.

Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao -polinucleotídeo da presente invenção identificado como SEQ ID NO1 ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da seqüência especificada como SEQ ID NO 1, ou uma variante desta.

O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 15-50 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), levando em consideração estringências de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica.

A definição dos termos “complemento”, “complemento reverso” e “seqüência reversa”, como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo:

Para a seqüência 5’AGTGAAGT3’, o complemento é 3’TCACTTCA5’, o complemento reverso é 3’ACTTCACT5’ e a seqüência reversa é 5’TGAAGTGA3’.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” compreende seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de seqüências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As seqüências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas seqüências de nucleotídeos com a seqüências de nucleotídeo descrita aqui (SEQ ID NO 1), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucléicos preferidos são aqueles cujas seqüências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de seqüência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de seqüência, mais cerca de 60% ou 65% de identidade de seqüência, mais cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, mais cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferencialmente preferencialmente preferencialmente preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 10 ou 99% de identidade de seqüência quando comparada com a seqüência de referência? A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na 15 internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). “Variantes” ou “sequências homólogas” de polinucleotídeos ou polipeptídeos, para os propósitos da presente invenção, envolvem sequências que tenham uma identidade percentual com a sequência de polinucleotídeos ou 20 polipeptídeos descritos pela invenção, de pelo menos (ou pelo menos cerca de) 20,00% a 99,99% (inclusive). A faixa anteriormente mencionada de identidade deve ser tomada como incluindo, e fornecida descrição escrita e suporte para, qualquer fração percentual em intervalos de 0,01%, entre 20,00% e, até, incluindo 99,99%. Estas percentagens são puramente estatísticas e diferenças entre duas sequências de ácidos nucléicos podem ser 25 distribuídas aleatoriamente e por todo o comprimento da sequência. Sequências homólogas podem, por exemplo, exibir identidades percentuais de 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 30 95, 96 97, 98, ou 99 por cento com as sequências da presente invenção. Tipicamente, a identidade percentual é calculada com referência ao comprimento completo, nativo, e/ou polinucleotídeo de ocorrência natural. Os termos "idêntico" ou "identidade" percentual, no contexto de dois ou mais sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, refere-se a dois ou mais sequências ou subsequências que sejam a mesma ou tenham a percentagem especificada de resíduos de aminoácidos que sejam as mesmas, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação, como medido usando um algoritmo de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Em certos aspectos da invenção, sequências 5 homólogas a SEQ ID NO1 tem ao menos 70% de identidade de sequência ao longo do comprimento completo (ou ao longo do comprimento completo de um dados fragmento da SEQ ID NO1). Homologias tanto de sequências de proteínas como de ácidos nucléicos podem ser avaliadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos de comparação de sequências e programas conhecidos da técnica. Tais algoritmos e 10 programas incluem, mas não estão de nenhuma forma_limitadps_à,jrBLSTN,^LASP, FASTA, TFASTA, e CLUSTALW (Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448; Altschul et al., 1990, J Mol. Biol. 251 (3):403-410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680; Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Altschul et al., 1993, 15 Nature Genetics 3:266-272). Comparações de sequências são tipicamente conduzidas utilizando os parâmetros padrão fornecidos pelo vendedor, ou usando os parâmetros apresentados nas referências identificadas acima, que estão segundo os quais, incorporados por referencia em sua integralidade.

Homologia de sequência e identidade de sequência também podem ser 20 determinadas por estudos de hibridização sob alto rigor de hibridização, rigor intermediário e/ou baixo rigor de hibridização. Vários graus de rigor de hibridização podem ser empregados. Quanto mais severas as condições, maior a complementaridade necessária para a formação de fitas duplex. O rigor das condições pode ser controlado pela temperatura, concentração da sonda, comprimento da sonda, força iônica, tempo e 25 semelhantes. Preferencialmente, a hibridização é conduzida sob baixo, médio e alto rigor por técnicas conhecidas como descrito, por exemplo, em Keller, G.H., M.M. Manak [1987] DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170.

O termo “hibridizando especificamente” diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam seqüências suficientemente 30 complementares para permitir tal hibridização sob condições pré-determinadas geralmente descritas no estado da técnica. Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica.

Hibridização de DNA imobilizado em Southern blots, por exemplo, com sondas gene específicas marcadas com P pode ser conduzida por métodos padrões (Maniatis et al. [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Em geral, hibridização e subsequentes lavagens podem ser feitas sob médio a alto rigor que permitam a detecção de sequências alvo com homologia à sequência de polinucleotídeos exemplificada. Para sondas genéticas de DNA dupla-fita, a hibridização pode ser realizada durante a durante a noite a 20-25° C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do DNA híbrido em SSPE 6X, solução de Denhardt 5X, SDS 0,1%, DNA denaturado 0,1-mg/ml. A temperatura de fusão é descrita pela seguinte fórmula (Betlz et al. [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman e K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285). Tm=81,5°C+16,6Log[Na+]+0,41 (%G+C)-0,61 (%formamida)- 600/comprimento do duplex em pares de bases.

Lavagens são tipicamente realizadas da seguinte maneira: (1) duas vezes à temperatura ambiente por 15 minutos em SSPE IX, SDS 0,1% (lavagem de rigor intermediário); (2) uma vez à Tm - 20°C por 15 minutos em SSPE 0,2X, SDS 0,1% (lavagem de rigor intermediário) 20 Para sondas de oligonucleotídeos a hibridização pode ser realizada durante a noite a 10-20 °C abaixo da temperatura de desnaturação (Tm) do hibrido em SSPE 6x, solução de Denhardt 5X, 0,1% SDS e 0,1 mg/ml de DNA denaturado. Tm para a sonda de oligonucleotídeos pode ser determinada pela seguinte fórmula: Tm(°C)=2(número de pares de bases T/A)+4(número de pares de bases 25 G/C) (Suggs et al. [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).

As lavagens podem ser realizadas da seguinte maneira: (1) duas vezes à temperatura ambiente por 15 minutos SSPE IX, 0,1% SDS (lavagem de baixo rigor) (2) uma vez à temperatura de hibridização por 15 minutos em SSPE IX, SDS 0,1% (lavagem de rigor intermediário) Em geral sais e temperatura podem ser alterados para modificar o rigor. Com um fragmento de DNA marcado com >70 bases em comprimento, as seguintes condições podem ser usadas. Baixo: SSPE 1 ou 2X, temperatura ambiente Baixo: SPPE 1 ou 2X, 42 °C Intermediário: SSPE 0,2 ou IX, 65 °C Alto: SSPE O,1X, 65 °C.

Por meio de outro elemento não limitador, procedimentos utilizando condições de alto rigor podem ser realizados das seguintes maneiras: Pré-hibridização de filtros contendo DNA é realizada de 8h a durante a noite a 65°C em tampão composto de SSC 6X, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP 0,02%, Ficoll 0,02%, BSA 0,02% e 500 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Filtros são - 10 hibridizados por 48 h a 65 °C, a-temperatura de hibridização preferencial, em mistura de pré-hibridização contendo 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e 5-20 x 106 cpm de sonda marcada com 32P. Altemativamente a etapa de hibridização pode ser realizada a 65 °C na presença de tampão SSC, SSC IX correspondendo a 0,15M NaCl e citrato de sódio 0,05 M. Subsequentemente, lavagens de filtro podem ser feitas a 15 37 °C por lh em solução contendo 2X SSC, PVP 0,01%, Ficoll 0,01% e BSA 0,01%, seguida de uma lavagem em SSC 0,lX a 50 °C por 45 minutos. Altemativamente, lavagem de filtros pode ser feita com uma solução contendo SSC 2X e SDS 0,1%, ou SSC 0,5X e SDS 0,1%, ou SSC 0,lX e SDS a 68 °C por intervalos de 15 minutos. Seguindo as etapas de lavagem as sondas hibridizadas são detectáveis por auto- 20 radiografia. Outras condições de alto rigor que podem ser utilizadas são bem conhecidas da técnica e como citado em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57; e Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. são incorporados neste em sua integralidade.

Outro exemplo não-limitante de procedimentos utilizando condições de rigor intermediário são como segue: Filtros contendo DNA são pré-hibridizados e então hibridizados em uma temperatura de 60 °C na presença de tampão SSC 5X e sonda marcada. Subsequentemente lavagens de filtros são feitas em uma solução contendo SSC 2X a 50 °C e as sondas hibridizadas são detectáveis por auto-radiografia. Outras 30 condições de rigor intermediário que podem ser utilizadas são bem conhecidas dos técnicos no assunto como citados em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., PP 9.47-9.57; e Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Insterscience, N.Y. são incorporados neste em sua integralidade.

Outra concretização da invenção compreende métodos para a expressão de sequências heterólogas em plantas controlada por novas sequências promotoras. O termo "sequência de nucleotídeos heteróloga" significa uma sequência que não é encontrada naturalmente operacionalmente ligada à sequência promotora. Enquanto esta 5 sequência de nucleotídeos é heteróloga à sequência promotora, ela pode ser homóloga ou heteróloga à planta. "Operacionalmente ligado" significa a junção de duas sequências de nucleotídeos de forma que a sequência codificante de cada fragmento de DNA esteja no quadro de leitura correto.

Para que o gene de interesse seja expresso em uma planta, no entanto, o 10 polinucleotídeo contendo a sequência do gene deve ser operacionalmente ligado _ao polinucleotídeo contendo a sequência promotora fornecida pela invenção, configurando o cassete de expressão. As técnicas utilizadas para a construção de um cassete de expressão são de rotina e conhecidas por técnicos no assunto (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, 15 N.Y.).

Outra concretização da invenção compreende, portanto cassetes de expressão contendo os polinucleotídeos, promotores de expressão gênica em plantas, fornecidos pela invenção.

Os cassetes de expressão podem ser montados, ou posteriormente 20 inseridos, em vetores que permitam a produção de cópias do cassete através da propagação de células transformadas com os referidos vetores, como E. coli, em meio de cultura. Tais vetores devem conter uma origem de replicação funcional para o tipo de célula a ser utilizado e um gene marcador, preferencialmente de resistência a um antibiótico. Os vetores propagados podem então ser removidos das células de E. coli e 25 inseridos em células de Agrobacterium contendo um pequeno plasmídeo Ti modificado, em um sistema binário, para transformação de células vegetais. Altemativamente os vetores propagados também podem ser utilizados para a transformação vegetal por outras técnicas.

O termo “vetor” diz respeito a um replicon, tal como plasmídeo, cosmídeo, 30 bacmídeo, fago ou vírus, no qual outras seqüências genéticas ou elementos (seja DNA ou RNA) possam ser ligados para serem replicadas juntas com o vetor. Preferencialmente o vetor derivado de vírus é selecionado entre os bacteriófagos, vaccinias, retrovirus ou vírus do papiloma bovino. O “vetor recombinante” é resultante da combinação de um vetor comercial com genes quiméricos, ou o polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif), New England Biolabs (Beverly, 5 Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados a, são os vetores pAC 321 e pMDC162 (Curtis e Grossniklaus, A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis of Genes in Planta. Plant Physiology, v. 133, n. 2, p. 462-469, 2003) .

O termo “seqüências acentuadoras de expressão” conhecidas como TO amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream” ou “downstream”) e que potencializam a taxa de transcrição. Estes amplificadores não são específicos e potencializam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das 15 seqüências adjacentes.

O primeiro intensificador descoberto que estimulava a transcrição de genes eucariotos foi o SV40 (Presente no genoma do Vírus 40 de Símio) Após a descoberta do intensificador SV40 foram identificados centenas de outros enhancer como HSV-1, AMV, HPV-16, em outros genomas virais no DNA de células eucarióticas. (Lodish et al, Biologia 20 celular e molecular. 4a edição pág 368). Os acentuadores de expressão da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a SV40, HSV-1, ÁMV, HPV-16.

O termo “operacionalmente ligado” significa que as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência codificadora são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativa à seqüência codificadora para efeito de expressão da 25 seqüência codificadora. Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de seqüências codificadoras e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, auxiliadores ou “enhancers” e elementos ou seqüências de terminação) no vetor de expressão. Uma região codificadora exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificadora 30 exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificadora exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléico que pode causar transcrição de regiões codificadores exógenas, posicionado na região 5’ da região codificadora exógena. No caso da presente invenção a região regulatória diz respeito às regiões substancialmente similares à SEQ ID NO 1. Para auxiliar no aumento da transcrição de um determinado polinucleotídeo, a seqüência promotora da presente invenção poderá estar ligada a outras seqüências regulatórias já descritas, tais como: AT ATT (elemento de forte expressão na raiz), AACAAAC e GCCACCTCAT (elementos relativos a expressão específica em sementes), CACGTG e CCTACC (ambas seqüências podem ser estimuladas ao um fator de estresse), entre outros. (Ai-Min Wu et al, Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426—435). As seqüências regulatórias da presente invenção dirigem a expressão preferencialmente para as folhas da planta. Mais -prefereneialmente a expressão é dirigida-para asTolhas das plantas de soja.

Uma “seqüência de terminação” é uma seqüência de DNA que sinaliza o final da transcrição. São exemplos de seqüências de terminação, mas não estão limitados a sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes. A presente invenção provê regiões regulatória de polinucleotídeos isolados que podem ser empregadas na manipulação de fenótipos de plantas, junto com polinucleotídeos isolados compreendendo estas regiões regulatórias. Mais especificamente a presente invenção está relacionada a promotores ou seqüências regulatórias que ocorrem em plantas de soja (Glycine max), responsáveis pela expressão de uma proteína não descrita, provavelmente integrante do sistema citocromo bóf, a qual é preferencialmente expressa em folhas dessa espécie vegetal. Os promotores de soja isolados foram denominados na presente invenção de PCitO,4 (SEQ ID NO1).

A quantidade de um polipeptídeo de interesse específico pode ser aumentada ou reduzida através da incorporação de cópias adicionais de genes, ou seqüências de codificação, codificando o polipeptídeo, ligado operacionalmente a seqüência de promotor da presente invenção (SEQ ID NO 1), no genoma de um organismo, como uma planta. Similarmente, um aumento ou uma diminuição na quantidade do polipeptídeo pode ser obtido por transformação de planta com cópias antisense destes genes.

Os polinucleotídeos da presente invenção foram isolados de plantas de soja, mais especificamente de Glycine max, mas ele pode ser altemativamente sintetizado usando técnicas de síntese convencionais. Especificamente o polinucleotídeo isolado da presente invenção inclui a seqüência identificada como SEQ ID NO1; o complemento reverso da seqüência identificada como SEQ ID NO1; e o complemento reverso da seqüência 5 identificada como SEQ ID NO1.

Estudos da atividade dos promotores da presente invenção são detalhados nos exemplos deste relatório. Dados experimentais feitos em plantas de Nicotiana tabacum quantificando a atividade de GUS demonstraram que o vetor recombinante contendo o promotor PCitO,4 possui maior atividade GUS em folhas, comprovando a especificidade ~ 10 dos promotores da presente-invenção.

O polinucleotídeo da presente invenção pode ser sintetizado usando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) O polinucleotídeo pode ser sintetizado, por exemplo, usando-se sintetizadores automatizados de oligonucleotídeos 15 (p°r exemplo, sintetizador de DNA OLIGO 1000M Beckman) para obter segmentos de polinucleotídeos de até 50 ou mais ácidos nucléicos. Uma pluraridade destes segmentos de polinucleotídeos podem ser então ligados usando técnicas padrão de manipulação de DNA que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Uma técnica de síntese 20 de polinucleotídeo convencional e exemplar envolve a síntese de um segmento de polinucleotídeo de filamento único, tendo, por exemplo, 80 ácidos nucléicos, e hibridizando este segmento a um segmento de 85 ácidos nucléicos complementar, sintetizados, para produzir um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos. O próximo segmento pode ser então sintetizado de modo similar, como um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos no filamento oposto. As 25 extremidades “pegajosas” ou coesivas asseguram uma ligação apropriada quando as duas porções são hibridizadas. Deste modo, os polinucleotídeos desta invenção podem ser sintetizados completamente in vitro.

Como observado acima, a seqüência de promotor da presente invenção pode ser empregada em vetores recombinantes e/ou de expressão para acionar a transcrição e/ou 30 expressão de um polinucleotídeo de interesse em folhas ou então em cassetes lineares, adequados para transformação por biolística. O polinucleotídeo de interesse pode ser endógeno ou heterólogo para um organismo, por exemplo, uma planta, a ser transformada. Os cassetes de expressão da presente invenção podem ser assim empregados para modular níveis de transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo, por exemplo, um gene que está presente na planta de tipo selvagem, ou pode ser empregado para prover transcrição e/ou expressão de uma seqüência de DNA que não é encontrada na planta de tipo selvagem, incluindo, por exemplo, um gene que codifica um gene repórter, como GUS.

Em algumas formas de realização da presente invenção, os polinucleotídeos 5 de interesse compreendem uma matriz de leitura aberta que codificam um polipeptídeo de interesse. A matriz de leitura aberta é inserida no vetor em uma orientação sense e a transformação com essa construção genética/vetor recombinante irá geralmente resultar em super-expressão do polipeptídeo selecionado principalmente nas folhas. O polipeptídeo de interesse, que será regulado pelo promotor da presente invenção, poderá ser inserido no 10 vetor na orientação sense, antisense ou em ambas as direções. A transformação com um vetor recombinante e/ou de expressão contendo o promotor da invenção regulando a expressão do polinucleotídeo de interesse na orientação antisense ou em ambas as orientações (sense e antisense) irá geralmente resultar na expressão reduzida do polipeptídeo selecionado.

O polinucleotídeo de interesse, como uma seqüência de codificação, é ligado de modo operativo em uma seqüência do promotor de polinucleotídeo da presente invenção de modo que uma célula hospedeira é capaz de transcrever um RNA acionado pela seqüência do promotor ligada ao polinucleotídeo de interesse. A seqüência do promotor de polinucleotídeo está geralmente posicionada na extremidade 5’ do polinucleotídeo a ser 20 transcrito. O uso de promotores específicos, como a seqüência do promotor da presente invenção identificadas como SEQ ID NO1, irá afetar a transcrição do polinucleotídeo de interesse principalmente nas folhas da planta transformada por isso a importância na escolha do polinucleotídeo de interesse.

O cassete de expressão da presente invenção também pode conter um 25 marcador de seleção que é eficaz em células do organismo, como uma planta, para permitir a detecção de células transformadas contendo o vetor recombinante inventivo. Estes marcadores, que são bem conhecidos, tipicamente conferem resistência a uma ou mais toxinas. Um exemplo deste marcador é o gene nptll, cuja expressão resulta em resistência a canamicina ou neomicina, antibióticos que são geralmente tóxicos para células de plantas 30 em uma concentração moderada. As células transformadas podem ser assim identificadas por sua capacidade de crescer em meio contendo o antibiótico em questão. Outros marcadores que podem ser utilizados para construir vetores recombinantes e/ou de expressão contendo o polinucleotídeo da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a: gene hpt confere resistência ao antibiótico higromicina, gene manA e o gene bar.

O sistema que usa o gene manA (que codifica a enzima PMI - phosphomannose isomerase) de Escherichia coli (Miles e Guest, 1984. Complete nucleotide sequence of the fumarase gene fumA, of E. coli. Nucleic Acids Res. 1984 April 25; 12(8): 3631-3642), tendo a manose como agente seletivo, é um dos sistemas sugeridos como alternativos aos dois primeiros descritos acima (Joersbo et al., 1998 Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet, Physiologia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi:10.1034/j. 1399- 3054.1999.105117.x). As espécies vegetais que não metabolizam manose sofrem severa inibição de crescimento quando esta é oferecida como única fonte de carbono em meio de cultura. Os efeitos adversos e inibitórios do uso da manose são conseqüências do acúmulo de manose-6-fosfato, produto da fosforilação da manose por uma hexoquinase. PMI promove a interconversão de manose-6-fosfato e frutose-6-fosfato, permitindo assim que a primeira possa ser catabolizada na via glicolítica (Ferguson e Street, 1958. Análise de sistemas gene marcador/ agente seletivo alternativos para seleção positiva de embriões somáticos transgênicos de mamoeiro, Rev. Bras. Fisiol. Veg., 2001, vol.13, no.3, p.365- 372. ISSN 0103-3131. : Malca et al., 1967 Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes, Physiologia Plantarum Volume 111 Issue 3 Page 269 - March 2001 doi: 10.1034/j. 1399- 3054.2001.1110301.x).0 gene bar (que codifica a enzima PAT - phosphinothricin-N-acetyltransferase) de Streptomyces hygroscopicus (Murakani et al., 1986 The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Molecular and General Genetics., 205: 42- 50, 1986.), tendo o glufosinato de amónio (PPT) como agente seletivo, é, dentre os sistemas tipo gene de tolerância a herbicida, um dos mais amplamente empregados pela engenharia genética no desenvolvimento de OGMs vegetais. PAT inativa herbicidas que apresentam o PPT como composto ativo mediante detoxificação deste. A detoxificação, que é resultante da acetilação do grupamento amino livre presente no PPT, toma este incapaz de competir de forma inibitória com a glutamina sintetase (GS), possibilitando assim a remoção da amónia tóxica da célula vegetal pela conversão de glutamato em glutamina, reação esta catalizada pela GS (Lindsey, 1992 Molecular cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, constitutively expressed on resting leukocytes, Nature 360, 481 - 484 (03 December 1992); doi: 10.1038/36048 laO).

Altemativamente, a presença do gene quimérico em células transformadas pode ser determinada por meio de outras técnicas conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), como Southern e PCR.

As técnicas para ligar de modo operativo os componentes dos vetores recombinantes ou de expressão inventivos são bem conhecidas no estado da técnica e 5 incluem o uso de ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de endonuclease de restrição, como descrito, por exemplo, em Sambrook et al (“Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Genes quiméricos da presente invenção podem ser ligados a um vetor tendo, pelo menos um sistema de replicação, por exemplo, E.coli, assim após cada manipulação, as construções resultantes 10 podem ser cionadas e sequenciadas. _ Cassetes de expressão da presente invenção podem ser usados para transformar uma variedade de organismos incluindo, mas não limitando a plantas. Desta forma, são também concretizações da invenção, células, tecidos vegetais ou plantas geneticamente modificadas, expressando genes de interesse regulados pelos promotores 15 previamente descritos. As plantas que podem ser transformadas usando vetores recombinantes e/ou de expressão contendo a presente invenção incluem angiospermas monocotiledôneas (p°r exemplo gramíneas, milho, grãos, aveia, trigo e cevada...), angiospermas dicotiledôneas (p°r exemplo soja, arabidopsis, tabaco, legumes, alfafa, aveia, eucalipto, bordo...), e gimnospermas (por exemplo pinheiro, espruce branco, lariço...). Os 20 protocolos de transformação de plantas já são bem conhecidos no estado da técnica (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEN, Capitulo 3 e 7, 1998). Em uma forma de realização preferida, os cassetes de expressão da presente invenção são empregados para transformar plantas dicotiledôneas. Preferivelmente, a planta é selecionada da família das Fabaceae, mais preferivelmente da 25 espécie Glycine max. Outras plantas podem ser transformadas de modo útil com o cassete de expressão da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, 30 Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea.

O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de A. tumefaciens (nos), sinal de terminação do gene RN A 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. Preferivelmente o terminador utilizado na presente invenção é o terminador do gene que codifica para a proteína nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens.

Os cassetes de expressão da invenção podem ser introduzidos dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais sendo a mais indicada a bibalística. Por exemplo, introdução mediada por A. tumefaciens', eletroporação; fusão de protoplasto; injeção em órgãos reprodutivos; injeção em embriões imaturos; microinjeção de protoplastos de células de plantas; utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA e outros. A escolha da técnica irá depender da planta a ser transformada. Por exemplo, plantas dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas e gimnospermas podem ser transformadas por tecnologia de plasmídeo Ti de Agrobacterium. Os vetores recombinantes e/ou de expressão podem ser combinados com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro A. tumefaciens. A função de virulência do hospedeiro A. tumefaciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por A. tumefaciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica e patentária (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983).

Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária. A introdução de cassetes e/ou vetores recombinantes e/ou de expressão utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722, 1984 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A introdução dos vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção pode ser feita em tecidos, como tecido de folha, células dissociadas, protoplastos, sementes, embriões, regiões meristemáticas, cotilédones, hipocotilédones, e outros. Preferencialmente a presente invenção utiliza a transformação através da introdução mediada por A. tumefaciens utilizando a Nicotiana tabacum com planta modelo (modificado de BARROS, L. M. G. Transformação genética de Nicotiana tabacum cv Xanthi utilizando Agrobacterium e 5 eletroporação. Dissertação de mestrado. Universidade de Brasília, DF, Brasil, 117p, 1989).

No entanto outros métodos de transformação podem ser utilizados para inserir cassetes de expressão da presente invenção, tais como a biobalística, que consiste em uma técnica de transformação direta do DNA que utiliza microprojéteis impulsionados em alta velocidade para carrear o DNA para dentro das células [Rech, E.L; Aragão, F.J.L. Biobalística. In: 10 Manual de Transformação Genética de Plantas (Brasileiro, A.C.M. & Carneiro, V.T.C. eds.), EMBRAPA Serviço de Produção de Informações -SPI. 1998, 106pp], e via tubo polínico. O método de transformação via tubo polínico foi divulgado pela primeira vez por Zhou et al (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., and Liu, G. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth, in Enzymol. 101:433-448, 1983) e consiste na 15 aplicação de uma solução de DNA na parte superior da maçã jovem após a polinização.

Utilizando esta técnica, o DNA exógeno pode alcançar o ovário através da passagem deixada pelo tubo polínico e integrar as células zigóticas já fertilizadas, porém não divididas.

Uma vez que as células foram transformadas, por qualquer uma das técnicas 20 mencionadas acima, as células tendo o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incorporado em seu genoma podem ser selecionadas por meio de um marcador, como o marcador de resistência a higromicina ou a canamicina. As células de plantas transformadas podem então ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, finalmente, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração 25 contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a seqüência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al. (Evans et al, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing 30 Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21- 73, CRC Press, Boca Raton, 1985, como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são bem descritas no estado da técnica, tais como em Leelavathi et al. Leelavathi et al, A simple and rapid

Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (G. hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep (2004) 22:465-470], Esse trabalho descreve um protocolo para transformação e regeneração do algodão onde o calo embriogênico com Agrobacterium, é cultivado sob estresse de 5 desidratação e seleção de antibiótico por 3 a 6 meses para a regeneração de diversos embriões transgênicos, uma média de 75 embriões globular. Sendo observado sobre a seleção de placas esses embriões são cultivados e multiplicados no meio, seguido pelo desenvolvimento de embriões cotiledonares sobre o meio de maturação do embrião. Para se obter uma media de 12 plantas por placas de petri de calos co-cultivados. 10 Aproximadamente 83% dessas plantas são transgênicas. As plantas transformadas resultantes podem ser reproduzidas de modo sexual ou assexual, usando métodos conhecidos no estado da técnica [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacterium- mediated transformation protocol for cotton (Gossipium hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep, 2004, 22: 465^170 15 ], para dar gerações sucessivas de plantas transgênicas.

A produção de RNA em células pode ser controlada por escolha da seqüência do promotor, por seleção do número de cópias funcionais ou através do sítio de integração de polinucleotídeos incorporados no genoma hospedeiro. Um organismo pode ser transformado utilizando um vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção 20 contendo mais de uma matriz de leitura aberta de codificação para um polipeptídeo de interesse.

O polinucleotídeo isolado da presente invenção também tem utilidade no mapeamento do genoma, em mapeamento físico e em clonagem posicionai de genes. A seqüência identificada como SEQ ID NO1 e suas variantes podem ser usadas para projetar 25 sondas e iniciadores de oligonucleotídeos. As sondas de oligonucleotídeos projetadas usando os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença dos promotores em qualquer organismo tendo seqüências de DNA suficientemente similares em suas células usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, como as técnicas de hibridização de DNA dot blot (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 30 Molecular cloning a laboratory manual. 2nd edition [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

A obtenção de plantas transgênicas com níveis adequados de proteínas heterólogas, necessita de sequências nucleotídicas regulatórias (promotores) que direcionem altos níveis de expressão em tecidos específicos ou alvo. A busca por estes promotores é baseada na identificação de genes que são expressos em um determinado tecido ou condição fisiológica.

As regiões regulatórias são utilizadas como um importante instrumento para direcionar a expressão de genes de interesse, como os que codificam proteínas tóxicas do 5 tipo Cry para a geração de novas linhagens de plantas geneticamente modificado (GM) resistente ao ataque de pragas.

A vantagem de se ter uma sequência promotora obtida a partir do genoma de uma planta e portanto, de origem vegetal, é que esta pode ser usada em outras espécies vegetais diminuindo os riscos ambientais e para a saúde, além de melhorar a _ 10 aceitação pelo mercado- consumidor,-A rapidez na-obtenção- da sequência promotora e de sua disponibilização para uso, além de sua eficiência na regulação da expressão gênica, favorece o emprego deste promotor em comparação a outros obtidos de vírus, bactérias, dentre outros.

Os exemplos ilustrativos apresentados a seguir servirão para melhor 15 descrever a presente invenção. Entretanto, os dados e procedimentos ilustrados referem- se meramente a algumas modalidades de concretização da presente invenção e não devem ser tomados como limitativos do escopo da mesma. Ao se ter promotores de expressão gênica comprovadamente regulando sequências gênicas em plantas transformadas, esta construção (promotor e/ou gene de resistência, por exemplo) obtida 20 do genoma da mesma espécie que será inserida, aumenta a probabilidade de sucesso do evento de transformação. Além disso, a obtenção de genes e promotores da própria soja indica um caminho de menor risco ao ambiente e a saúde ao se trabalhar com promotores ou genes de vírus, bactérias por exemplo.

A estratégia de obtenção do promotor da presente invenção pode ser verificada 25 através da Figura 1 e será melhor detalhada nos exemplos.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Identificação de contigs órgãos específicos

Os contrastes virtuais (Northern eletrônico) para identificação de sequências específicas e abundantes de folha foram realizados no banco de ESTs (expressed 30 sequence tags) de soja (https://alanine.cenargen.embrapa.br/Soja001) da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. O banco reúne contigs formados a partir de ESTs disponíveis em domínio público (Shoemaker et al., A compilation of soybean ESTs: generation and analysis. Genome, v. 45, n. 2, p. 329-338, 2002) e possui uma ferramenta para realização de Northern virtual que utiliza o Teste Exato de Fisher para determinar a significância estatística (P < 0,05) dos resultados. Por meio dessa ferramenta é possível obter a frequência de ESTs que formam um contig (sequência de um transcrito putativo). As bibliotecas com sequências de cDNA provenientes de folha 5 foram agrupadas e contrastadas com as sequências das bibliotecas de cDNA dos demais órgãos. Assim, foram realizados contrastes entre os grupos folha versus (vs.) não folha. Bibliotecas de cDNA de tecidos não diferenciados e de plântulas não foram inseridas em nenhum grupo.

Exemplo 2 — Análises virtuais dos contigs órgão-específicos

Os sete (7) contigs resultantes do Northern eletrônico, aqui considerados genes candidatos putativos, foram comparados por meio de BLASTn (Altschul et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, n. 17, p. 3389-402, 1997.) com as seqüências presentes no banco de dados do genoma estrutural da soja, constituído por seqüências obtidas durante a execução do projeto Genoma da Soja (GenoSoja) (http://bioinfo03.ibi.unicamp.br/soja/). Tal banco utiliza o teste de significância Audic- Claverie (Audic e Claverie, The significance of digital gene expression profiles. Genome Res, v. 7, n. 10, p. 986-95, Oct 1997) para determinar a frequência dos ESTs dentro das diversas bibliotecas. Dessa maneira, os contigs obtidos pelo Northern eletrônico realizado no banco de dados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia que possuíam sequências correspondentes no banco GenoSoja foram novamente analisados quanto ao seu perfil de expressão.

Os contigs selecionados foram comparados ao banco de sequências não redundantes do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando o BLASTn (Altschul et 25 al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, n. 17, p. 3389-402, 1997.). Desta forma, foram encontrados os transcritos (CDS) correspondentes (100% de identidade de sequência) aos contigs nesse banco. Os transcritos idênticos aos contigs foram também analisados no Unigene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) quanto ao perfil de 30 expressão.

De acordo com o Northern eletrônico realizado no banco da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, o contig mais promissor foi o 18151, cujas ESTs são originárias exclusivamente de bibliotecas de folha (Figura 2-A). O gene Gma 12822, correspondente a esse contig no NCBI, também apresentou no Uni Gene o perfil 5 de expressão baseado em EST preferencial em folha e em menor grau em cotilédone (Figura 2-B), bem como o contig 24764 (idêntico ao 18151) do banco do projeto GenoSoja apresentou maior expressão em folhas não expandidas e ápices caulinares de plântulas com duas semanas, seguida de tecido foliar senescente de plantas maduras e folhas totalmente expandidas (Figura 2-C).

As bibliotecas de cDNA de tecidos não diferenciados foram desconsideradas nas análises.

Exemplo 3 - Anotação funcional e mapeamento

Os contigs que apresentaram expressão preferencial em folha em pelo menos dois dos três bancos utilizados (https://alanine.cenargen.embrapa.br/Soja001; http://bioinfo03.ibi.unicamp.br/soja e http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) foram alinhados por meio do BLASTn (Altschul et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, n. 17, p. 3389-402, 1997.) ao genoma da soja cv. Williams 82 (Schmutz et al., Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature, v. 463, n. 7278, p. 178-183, 2010) disponível no banco genômico Phytozome (http://www.phytozome.net/). O banco fornece informações quanto ao mapeamento dos transcritos no genoma por meio do Gbrowse e anotação funcional destes com dados obtidos nas plataformas de anotação: Pfam, Panther, KOG, GO. Assim, a sequência do gene correspondente ao contig (identidade >90 % no alinhamento) foi localizada no genoma e sua anotação funcional 25 obtida (Figura 3/Anexol e 4).

Exemplo 4 - Validação Experimental: RT-PCR

Para validação experimental foi selecionado o gene candidato putativo nomeado GmCitl (Glycine max Citocromol) por apresentar alto grau de especificidade e alto nível de expressão em folha. Esse gene corresponde ao contig 18151. A validação 30 experimental do gene GmCitl foi realizada por meio de ensaios de expressão temporal e espacial utilizando-se as técnicas de: a) RT-PCR (Transcriptase Reverse-PCR); b) Northern Blot; c) RT-qPCR.

Para realização dos ensaios de RT-PCR (Transcriptase Reverse-Polimerase Chain Reaction) foram extraídas amostras de RNA total de raiz, folha jovem, folha madura, vagem nos estágios R4, R5 e R6 e semente nos estágios R5, R6 e R7 foi extraído individualmente a partir de plantas Glycine max cv. Conquista. O RNA foi extraído segundo a metodologia descrita por Jones et al. (Jones et al., High levels of expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO Journal 4: 2411-2414, 1985). As vagens foram coletadas de plantas nos estágios reprodutivos R4, R5 e R6 e as sementes nos estágios R5, R6 e R7 (Fehr e Caviness, Stages of Soybean Development. Ames: Iowa State University of Science and Technology, v. 80, p. 1-1'2, 1977). Tais estágios foram determinados baseados-no florescimento, desenvolvimento das vagens e semente e maturação da planta, segundo Fehr e Caviness (Stages of Soybean Development. Ames: Iowa State University of Science and Technology, v. 80, p. 1-12, 1977). No estágio R4, a vagem possui 2 cm. Nos demais, as vagens são identificadas de acordo com o desenvolvimento das sementes. No estágio R5 a semente possui 3 mm, no R6 a semente verde completa a cavidade da vagem e no R7 é o início da maturidade, no qual a vagem possui a cor amarronzada e a semente já atingiu seu tamanho final, porém não a cor. Foram pesados dois gramas de cada órgão, congelados imediatamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C. As sementes e vagens foram separadas antes do congelamento.

Em seguida os RNAs foram avaliados, quanto sua integridade, em gel desnaturante 1,5 %. As amostras de RNA de raiz, folha, vagem e semente foram usadas como molde na formação de moléculas de cDNA por meio de reações de RT-PCR utilizando-se primers oligo dT. Os cDNAs obtidos foram usados em reações de PCR com primers específicos para o gene GmCitl com o objetivo de avaliar a tecido- especificidade do mesmo. Para tal, foram desenhados os seguintes oligonucleotídeos específicos com ajuda do programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen & Skaletsky, Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology, v. 132, p. 365-86, 2000). Tabela 1. Sequências dos iniciadores específicos utilizados nas reações de RT- 30 PCR semiquantitativa.

O RNA total extraído foi tratado com a DNAse I Amplification Grade (InvitrogenTM). Amostras de 5 μg de RNA foram tratadas em reação contendo 10X Dnasel Reaction Buffer, 5 unidades de DNAse I Amplification Grade (1U/ μL) e água tratada com DEPC em volume final de 10 μL. A reação foi incubada a 25 °C por 15 5 minutos. A enzima foi inativada pela adição de EDTA para uma concentração de 12.5 mM seguido de aquecimento a 65 °C por dez minutos.

A primeira fita do cDNA foi sintetizada por transcrição reversa a partir do RNA de raiz, folha, vagem e semente de planta de soja utilizando a enzima SuperScript III Reverse Transcriptase (InvitrogenTM) conforme protocolo do fabricante. Em tubos de 10 microcentrífuga foram adicionados inicialmente 300 ng de Oligo(dT), 2 μg de RNA de um dos órgãos tratados com DNAse e 0.8 mM de cada dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfatado). A reação foi mantida a 65 °C durante cinco minutos. Em seguida, adicionou-se First-strand buffer IX, DTT 5 mM e 200 unidades da transcriptase reversa. A síntese ocorreu a 50 °C por uma hora. Esse procedimento foi realizado para a síntese 15 de cDNA a partir do RNA total extraído de cada órgão. Os produtos das reações foram diluídos 20 vezes e 5 μL foram utilizados nas reações de PCR.

Para reação de RT-PCR semiquantitativa, utilizou-se, além do par de iniciador específico (Tabela 1) para o transcrito alvo, outro par de iniciador para amplificar um fragmento do gene de actina, gene expresso constitutivamente. Todas as PCRs foram 20 montadas em duplicatas de reação para cada cDNA de raiz, folha, vagem ou semente contendo os seguintes reagentes: IX do tampão para PCR, 0.4 mM de cada dNTP (Invitrogen™), 0.4 μM de cada iniciador citado acima, 1.5 unidades de Taq polymerase (Invitrogen™), 5 μL de cDNA diluído, 3 mM de MgC12 e água estéril (Milli-Q), no volume final de 25 μL. As condições da PCR foram: 94 °C por um minuto seguido 25 pelos ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55-57°C por 30 segundos e 68 °C por dois minutos. Os produtos de PCR (15 μL) foram separados em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta (UV). O número de ciclos de

PCR foi otimizado para assegurar que as reações de amplificação fossem paradas na fase exponencial de amplificação do produto. A identidade do produto amplificado foi confirmada pela migração eletroforética dos fragmentos em comparação com a do marcador de peso molecular (Figura 5).

Exemplo 5 - Validação Experimental: Northern

Amostras de RN A total de raiz, folha jovem, folha madura e vagem, extraídas conforme descrito no item “RT-PCR” foram fracionadas em gel de agarose 1,5% em condições desnaturantes (formaldeído) e tampão MOPS (MOPS 0,2 M, AcNa 50 mM, -EDTA lOmM). Em cada poço dogel foram aplicados 20 μg de RN A total dissolvido 10 em tampão de amostra (ficol 30%, EDTA 0,5M pH 8,0, azul de bromo fenol 0,025%, formamida 30,1%, glicerol 2% e brometo de etídio 0,1%). Após a eletroforese o RNA total de soja foi transferido a vácuo para membrana de náilon (Hybond - N, Amersham Bioscience). O tampão de transferência utilizado foi o SSPE 10X (NaCl 1,5M; NaH2PO4 0,lM; Na2-EDTA-2H2O lOmM). A transferência foi realizada durante 15 quatro horas à pressão de 5 mm Hg. Ao final, a membrana foi incubada por cinco minutos em SSPE 2X e o RNA foi fixado à membrana por exposição à luz UV (UV Stratalinker 1800 - Stratagene) durante 30 segundos.

As sondas dos Northern blots foram feitas com os mesmos fragmentos obtidos na RT-PCR, cujos produtos possuíam aproximadamente 400 pb (Tabelai). Os 20 fragmentos foram purificados utilizando o kit Wizard ® SV Gel and Clean Up System (Promega). Cinquenta ng de cada fragmento foram desnaturados por cinco minutos a 95-100 °C e incubados no gelo por mais cinco minutos. Em seguida, o fragmento desnaturado foi adicionado no kit de marcação Ready to Go (Amersham Bioscience) juntamente com 5 μL de dCTP a-P32 (50 μCi), conforme especificações do fabricante. 25 A reação foi incubada a 37 °C por 40 minutos. Após o período, a sonda foi desnaturada por cinco minutos a 95-100 °C e imediatamente colocada no gelo por dez minutos. Em seguida, a sonda foi adicionada à membrana contendo o RNA previamente pré- hibridizada com o tampão de hibridização ULTRAHyb Ultrasensitive (Applied Biosystems) a 42 °C por quatro horas. A hibridização ocorreu durante a noite à mesma 30 temperatura.

A membrana foi lavada a 42 °C duas vezes por 15 minutos com a solução de lavagem 2X (SSC 2X; SDS 0,1%) e duas vezes com a solução de lavagem 0,1 X (SSC O,1X; SDS 0,1%). Em seguida, foi exposta ao Imaging Plate (IP BAS - SR 2040) por aproximadamente quatro horas, momento em que a radioatividade presente na membrana foi capturada e fotodocumentada pelo equipamento FLA 3000 (Fujifilm). O resultado pode ser observado na Figura 6.

De acordo com as análises de validação por RT-PCR e Northern blot o gene GmCitl é preferencialmente expresso em folha. A partir dessas análises ele passa a ser considerado um gene candidato para o isolamento do seu promotor.

Exemplo 6 - Isolamento do promotor

Por meio do banco de dados phytozome (http://www.phytozome.net) foi 10 possível obter a seqüência da região a montante (upstream) da seqüência codificadora (CDS) do gene GmCitl para isolamento da sua região promotora. Assim, o promotor foi identificado por meio do mapeamento dos genes selecionados no Gbrowse (http://www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/soybean) do genoma da soja cv. Williams 82 (Schmutz et al., Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature, v. 463, n. 15 7278, p. 178-183, 2010.). Assim, os 3000 pb a montante da extremidade 5’ da CDS do GmCitl foram utilizados para o desenho de iniciadores. Foram amplificados fragmentos com iniciadores desenhados especificamente para gerar fragmentos de tamanhos distintos, mas sempre contendo a região 5’ UTR do transcrito e o início da região promotora (Tabela 2). O tamanho dos fragmentos dependeu das sequências favoráveis 20 ao desenho dos iniciadores. Na Figura 7/Anexo 2 são mostradas as regiões onde os iniciadores anelam-se (sublinhados) para amplificar fragmentos promotores do gene GmCitl. Dessa maneira, para amplificar os fragmentos foi utilizado o mesmo iniciador anti-senso e diferentes iniciadores senso. Tabela 2. Sequências de iniciadores utilizados na clonagem dos promotores e 25 deleções 5'do gene GmCitl.

R: iniciadores anti-senso.

Exemplo 7 - Clonagem dos promotores

Os fragmentos da região promotora foram clonados em vetor binário por meio do sistema Gateway®, baseado na recombinação sítio-específica do bacteriófago X. Esse sistema consiste em transferir um fragmento de DNA inserido em um vetor de entrada para um vetor destino por meio de recombinação sítio-específica. Assim, os sítios attLl e attL2 que flanqueiam a região do DNA a ser transferido no vetor de entrada recombinam-se, respectivamente, com os sítios attRl e attR2 presentes no vetor destino e que flanqueiam o gene letal ccdB. Após a reação, o vetor de entrada irá conter o gene letal e o vetor destino conterá o fragmento de DNA de interesse. Foi utilizado como vetor de entrada o plasmídeo pENTR™ (Figura 8) e como vetor de destino o plasmídeo binário pMDC162 (Figura 9) específico para uso em Agrobacterium, somente para fins de validação.

Os iniciadores desenhados a partir da sequência genômica (Tabela 2) foram utilizados para amplificar os diversos fragmentos da região promotora. A enzima Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen™) foi utilizada para catalisar a reação, de acordo com o protocolo seguinte: tampão da enzima IX, 0.3 mM de cada dNTP, MgSO4 2 mM, 0.2 μM de cada iniciador, 500 ng de DNA genômico e 0,5 U de Pfx no volume final de 25 μL. O mesmo iniciador anti-senso foi combinado com todos os iniciadores senso do respectivo promotor para gerar diferentes fragmentos a partir da região 5’ (Tabela 2). A PCR ocorreu nos seguintes parâmetros: 94 °C por três minutos, 94 °C por 30 segundos, 53°C por 30 segundos e 68 °C por dois minutos.

Os amplicons foram ligados ao vetor pENTR™ /D-TOPO® (Invitrogen™) em reação com volume final de 6 μL contendo de 0.5 a 4μL de produto de PCR, 1 μL de solução salina e 1 μL do vetor TOPO®. A reação foi incubada por dez minutos à temperatura ambiente e subsequentemente utilizada na transformação por choque térmico de células competentes de Escherichia coli One Shot® TOP 10 (Invitrogen™), conforme as especificações do fabricante. Inicialmente, foram adicionados 2 μL da reação de ligação ao tubo de microcentrífuga contendo as células em estoque. Incubou- se o sistema no gelo por cinco minutos e, em seguida, a 42 °C por 30 segundos.

Imediatamente após o choque térmico, adicionou-se ao tubo de microcentrífiiga 250 μL de meio SOC (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) e a cultura foi incubada a 37 °C por uma hora. As células foram espalhadas em placas de Petri com meio LB-ágar (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) sólido e canamicina [50 μg/mL] e incubadas a 37 °C por 14 horas.

A construção primária de fragmento da região promotora ligada ao vetor pENTR™ constitui o vetor de entrada e as células transformadas com ela são os clones de entrada.

Exemplo 8 - Extração de DNA plasmidial

As colônias contendo os vetores pENTR™, onde foram clonadas as sequências promotoras putativas, foram inoculadas em tubos de ensaio com 3 mL de meio LB (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) líquido seletivo (50 μg/mL de canamicina) e mantidas em incubadora por 16 horas, com agitação de 200 rpm e temperatura de 37 °C. Alíquotas de 1,5 mL foram transferidas para tubo de microcentrífuga e centrifugadas por três minutos a 13792 g (ref). O sobrenadante foi descartado e adicionado o restante da cultura, ou seja, 1,5 mL. Após a centrifugação e a remoção do sobrenadante, o precipitado foi ressuspendido em 100 μL de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA ImM). Em seguida, adicionou-se 200 μL de solução NaSE (NaOH 0,2 M; SDS 1%; EDTA 10 mM) e os tubos foram levemente agitados. Após cinco minutos à temperatura ambiente, foram adicionados 30 μL de KAc 5 M pH 4,8. As amostras foram incubadas por cinco minutos no gelo e então centrifugadas por cinco minutos a 13 400 g, 4 °C. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos contendo 2 μL de RNase A [10 mg/mL] e deixados por 20 minutos a 37 °C em banho-maria. As soluções foram, então, lentamente homogeneizadas com 450 μL de LiCl 5M, incubadas por duas horas a -20 °C e centrifugadas por dez minutos a 13 400 g, 4 °C. Novamente, os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos contendo meio volume de isopropanol, deixados por cinco minutos à temperatura ambiente e submetidos à centrifugação por 15 minutos a 13792 g (rcf). Os precipitados foram lavados com 400 μL de etanol 70% em centrifugação a 13 400g a 4 °C por três minutos. Após a secagem do material, o DNA foi ressuspendido em 40 μL de água deionizada.

Para confirmação da clonagem dos fragmentos de DNA, os plasmideos foram digeridos com as enzimas Notl e EcoRV (GIBCO BRL™) em reação de 20 μL 5 contendo o tampão de reação IX, três unidades de cada enzima e 5 μL do DNA extraído dos clones de entrada. As digestões ocorreram durante uma hora a 37 °C em banho- maria e foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1 % corado com brometo de etídio (Figura 10).

Os vetores pENTR™ contendo os promotores PCitO,4, PCitO,8 e PCitl;9 10 liberaram os fragmentos de aproximadamente 0,4 kb; 0,8 kb; e 1,9 kb (Figura 8), como previsto para a digestão dos vetores com Notl e EcoRV. A restrição dos vetores binários, resultantes da reação de recombinação LR, com a enzima Xbal gerou fragmentos correspondentes aos promotores putativos PCitO,4, PCitO,8, (Figura 8). O promotor PCitl,9 possui um sítio de reconhecimento de Xba I na posição de 1134 pb. 15 Dessa forma, além do fragmento com aproximados 1,9 kb foram liberados ainda dois fragmentos com aproximadamente 0,9 kb cada (Figurai 0) da digestão do vetor binário contendo PCitl,9.

Exemplo 9 - Recombinação sítio específica

Uma reação de recombinação sítio específica foi montada para que o fragmento 20 da região promotora do vetor de entrada fosse transferido para o vetor binário, ou vetor destino.

O vetor destino utilizado foi o pMDC 162 (Curtis e Grossniklaus A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis of Genes in Planta. Plant Physiology, v. 133, n. 2, p. 462-469, 2003.) (Figura 9), doado pela Universidade de 25 Zurique -Suíça.

A reação foi montada em um volume final de 8 μL com aproximadamente 150 ng do vetor de entrada linearizado com a enzima EcoRV ou pvul (GIBCO BRL™) (no caso de a região promotora conter o sítio de reconhecimento da EcoRV), 150 ng do vetor destino pMDC162 e se necessário completada com tampão TE, pH8. Os 30 componentes foram brevemente agitados e centrifugados e, então foram adicionados 2 μL de Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix (Invitrogen™) conforme protocolo do fabricante. Novamente as amostras foram brevemente agitadas e centrifugadas. Em seguida, as reações foram incubadas por cinco horas a 25 °C. Para finalizar a reação adicionou-se ao tubo 1 μL de proteinase K e a reação foi incubada por dez minutos a 37 °C. O produto de interesse dessa reação de recombinação é o vetor binário pMDC162 contendo a região promotora a montante do gene gus.

Para gerar os clones de expressão (células transformadas com o vetor de expressão), foi feita a transformação por choque térmico das células quimicamente competentes OmniMAX ™ (Invitrogen ™) com o produto da reação LR. Em um tubo de microcentrífuga contendo 100 μL de células competentes foram adicionados 5 μL da reação LR e a mistura foi incubada por 30 minutos em gelo. Após esse período, foi dado o choque térmico por 90 segundos a 42 °C e adicionados 500 μL de meio SOC (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). A cultura foi incubada por uma hora a 37 °C. As células foram, então, precipitadas por centrifugação a 13792 g por 1 minuto, uma parte do meio sobrenadante foi descartada e as células foram ressuspendidas no restante de meio (~ 100 μL). As células foram espalhadas em placas de Petri com meio LB (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) sólido e canamicina [50 μg/mL] e incubadas a 37 °C por 14 horas. As colônias resistentes foram inoculadas em 3 mL de meio LB para isolamento do plasmídeo conforme protocolo descrito acima. O vetor de expressão (vetor destino pMDC162 contendo os diferentes fragmentos da região promotora), por sua vez, foi digerido com a enzima Xbal em 30 μL de reação com tampão de reação IX, 20 unidades de enzima e 20 μL dos vetores pMDC162. Igualmente ao vetor de entrada as digestões do pMDC162 ocorreram durante uma hora a 37 °C e foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio (Figura 10).

Exemplo 10 - Transformação áe Agrobacterium tumefaciens

Os plasmídeos extraídos dos clones positivos foram inseridos em células competentes de Agrobacterium da estirpe GV3101 por meio de eletroporação. Em um tubo para microcentrífuga contendo 40 μL de células foi adicionado 1 μL (50-300 ng/μL) de plasmídeo e a mistura transferida para uma cuveta de 0,2 cm. Em seguida as células foram submetidas a pulso elétrico de 25 μF, 2,5 kV, 200 Q, 5,5 segundos e logo em seguida foi adicionado 1 mL de meio SOC (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) à cubeta de eletroporação. A cultura foi transferida para novo tubo de microcentrifuga e incubada por 60 minutos a 28 °C para que as células pudessem recompor sua 5 membrana. Após esse período, 30 e 100 μL da cultura foram espalhadas em duas placas de Petri contendo meio LB-ágar (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) com canamicina [100 μg/mL], gentamicina [50 μg/mL] e rifampicina [100 μg/mL] e incubadas por aproximadamente 48 horas a 28 °C.

Exemplo 11 - Validação in vivo: Transformação de plantas de Nicotiana tabacum

A transformação de Nicotiana tabacum foi feita segundo Barros, 1989 (BARROS, L. M. G. Transformação genética de Nicotiana tabacum cv Xanthi utilizando Agrobacterium tumefaciens e eletroporação. Dissertação de mestrado.

Universidade de Brasília, DF, Brasil, 117p, 1989), com modificações.

As colônias contendo os vetores binário pMDC 162 que contêm as regiões promotoras putativas a montante do gene gus foram inoculadas em 5 mL de meio LB (Sambrook e Russell, Molecular cloning - A laboratory manual. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), canamicina [100 μg/mL], gentamicina [50 20 μg/mL] e rifampicina [100 μg/mL] e incubadas a 180 rpm por aproximadamente 24 horas a 28 °C. Cinquenta microlitros desse pré-inóculo foram colocados em 50 mL de meio LB e novamente incubados a 180 rpm por aproximadas 15 horas a 28 °C.

Folhas jovens (terceira a partir do ápice) de plantas de Nicotiana tabacum foram coletadas de plantas com 55 e 80 dias cultivadas em casa de vegetação e imediatamente 25 colocadas em água. Em capela de fluxo laminar vertical, as folhas foram lavadas com 1 litro de álcool 50% e em seguida desinfestadas em solução de hipoclorito de sódio 2% por 20 minutos. Após esse período as folhas foram lavadas três vezes em água Milli-Q estéril e mantidas em um béquer com água esterilizada enquanto não eram manipuladas.

Paralelamente, as culturas bacterianas contendo os vetores binários pMDC162 + 30 PCitO,4, pMDC162 +PCitO,8 e pMDC162 + pMCitl,9 foram distribuídas em seis placas de Petri, uma para cada tipo de vetor e deixadas na capela. Em placa de Petri de 130 mm x 15 mm contendo papéis-filtro estéreis, a folha foi dividida ao meio, retirou-se a nervura central e as bordas com auxílio de lâmina de bisturi e então, o restante foi cortado em quadrados de 0,6 x 0,6 cm aproximadamente. À medida que eram cortados, os explantes eram mergulhados na cultura de A. tumefaciens até que as duas placas de 5 Petri de 90 mm x 15 mm contendo a cultura bacteriana ficassem com toda a superfície coberta com os explantes foliares. Os controles negativos foram mergulhados em meio LB sem bactérias. Em seguida, os explantes foram transferidos para papel filtro a fim de retirar o excesso da cultura bacteriana e colocados em placas de Petri de 90 mm x 15 mm contendo o meio MS (SIGMA) (Murashige e Skoog, A revised medium for rapid 10 growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physologia Plantarum, v. 15, p. 473- 497, 1962) pH 5,6-5,8 com sacarose 3%, 6-benzilaminopurina (SIGMA) (1 mg/mL) e ágar (purificado para cultura de tecidos - SIGMA) 0,3%, com a superfície adaxial voltada para o meio. As placas foram fechadas com filme de PVC e colocadas em sala de cultura climatizada (28 °C), no escuro por dois dias. 15 O vetor de expressão utilizado para a transformação de tabaco possui o gene hpt, cujo produto, a proteína higromicina fosfotransferase, confere à planta resistência à higromicina. Assim, após a co-cultura de dois dias, para selecionar os explantes transformados e eliminar as agrobactérias, os explantes foram transferidos para placas de Petri contendo meio MS (SIGMA) (Murashige e Skoog, A revised medium for rapid 20 growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physologia Plantarum, v. 15, p. 473- 497, 1962) pH 5,6-5,8 com sacarose 3%, 6-benzilaminopurina (SIGMA) (1 mg/mL) e ágar 0,3%, adicionado de cefotaxima [500 μg/mL] e higromicina [200 μg/mL]. As placas foram fechadas com filme de PVC e incubadas em sala de cultura climatizada (28 °C), sob fotoperíodo controlado de 16 horas de luz e oito horas de escuro. Nas 25 placas com os controles negativos não foi adicionado higromicina. A cada duas semanas, período que os antibióticos começam a perder o efeito, os explantes eram transferidos para placas novas.

Após um mês da transferência para o meio seletivo os brotos regenerados e transformados foram transferidos para tubos de ensaio com meio MS (SIGMA) 30 (Murashige e Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physologia Plantarum, v. 15, p. 473-497, 1962) pH 5,6-5,8; sacarose 2%; ágar 0,3%, contendo cefotaxima [300 μg/mL] e higromicina [200 μg/mL], Os tubos com os brotos foram selados e incubados em sala de cultura nas mesmas condições anteriores. Os brotos não transformados (controle negativo) foram transferidos para os tubos contendo o mesmo meio de cultura usado para os brotos transformados, porém, sem a adição dos antibióticos.

As plantas que enraizaram nos tubos de ensaio foram transferidas para sacos 5 pequenos com terra adubada quimicamente e úmida. Após a lavagem da raiz com água para retirar o meio de cultura, a planta foi colocada na terra e coberta com saco de plástico transparente. Durante esta etapa foram coletados segmentos de raiz e folha para a realização do teste histoquímico para detecção da atividade da enzima repórter Gus. As plantas foram mantidas em casa de vegetação com temperatura e fotoperíodo 10 naturais. Os sacos plásticos transparentes foram abertos nas extremidades de modo progressivo a partir da primeira semana para permitir a aclimatação gradativa das plantas às condições da casa de vegetação e ao final de duas semanas os sacos foram completamente retirados.

Para caracterizar a atividade dos fragmentos dos promotores por meio da 15 regulação da expressão do gene repórter gus foi realizado ensaio histoquímico segundo McCabe, 1988 (Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Biotechnology, v. 6, p. 923-926, 1988). Os segmentos dos ápices radiculares e de folha, coletados durante a transferência das plantas do tubo de ensaio para a terra, foram incubados em solução contendo o substrato X-Gluc (5- bromo- 4- cloro- 3- indolil- β- 20 D- glucoronídeo) na concentração de 2 mM, ou seja: 100 mg X-Gluc foram dissolvidos em 2 mL de DMSO e adicionados em uma solução contendo EDTA 10 mM, NaH2PO4 100 mM, K4Fe(CN)6- 3H2O 0,5mM, Triton X-100 0,1%, ácido ascórbico 1% e água para completar o volume de 200 mL. O pH final da solução foi ajustado para pH 7,0 com NaOH 10 M e a solução finalmente filtrada em filtro estéril Millex® (membrana 25 Millipore com poro de 45 μM) e armazenada a -20 °C. Os segmentos das raízes e folhas foram colocados em placas de ELISA de poços contendo 200 μL da solução e incubados em estufa a 37 °C por 18 horas. Após esse período a solução foi retirada com ajuda de pipeta automática e adicionado etanol 70% para retirada da clorofila e melhor visualização do produto final da reação, o índigo blue. O etanol foi trocado várias vezes 30 até a completa retirada da clorofila. O resultado do ensaio foi visualizado na lupa SteREO Discovery.V8 (Zeiss) e as imagens capturadas (Figura 11/Anexo 3).

Os promotores gerados a partir de deleções 5’ da região promotora do GmCitl estão representados com os respectivos motivos putativos de elementos cis na Figura 11 -AJAnexo 3 A. A Figura 11-B/Anexo 3B mostra o ensaio histoquímico de folha e raiz de plantas de fumo: não transformada, transformada com o vetor binário sem promotor, 5 transformada com o promotor PCitO,4, transformada com o promotor PCitO,8 e transformada com o promotor PCitl,9. Nota-se que o PCitO,4, promotor da presente invenção (SEQ ID NO 1), foi capaz de ativar fortemente a expressão em folhas enquanto que os promotores PCitO,8 e PCitl,9 foram igualmente ativos em folha e raiz.

A Figura 12 mostra o cassete de expressão utilizado na presente invenção.

Claims (16)

1. Um gene quimérico caracterizado por compreender: a) um polinucleotídeo cuja sequência seja a sequência SEQ ID NO 1, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a b) uma sequência de polinucleotídeo de interesse que seja heteróloga à sequência de (a).

2. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de a sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.

3. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato de a região de codificação ser isolada de um gene endógeno diferente do gene GmCit1 ou heterólogo.

4. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de a sequência de polinucleotídeo de interesse de (b) poder estar na orientação sense ou antisense.

5. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de as sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16, entre outros.

6. Um vetor recombinante caracterizado por conter um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1.

7. Um vetor recombinante caracterizado por compreender: a) um polinucleotídeo cuja sequência seja a sequência SEQ ID NO 1, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a b) uma sequência de polinucleotídeo de interesse; e c) uma sequência de terminação.

8. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.

9. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse ser isolada de um gene endógeno diferente do gene GmCit1 ou heterólogo.

10. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato da sequência de terminação ser selecionada do grupo consistindo de sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.

11. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato das sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16, entre outros.

12. Uma célula de microrganismo transformada caracterizada pelo fato de conter um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11.

13. Método para modificar a expressão de genes em um organismo caracterizado por incorporar estavelmente no genoma do organismo um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

14. Método de acordo com reivindicação 13 caracterizado pelo fato de o organismo ser uma planta.

15. Método para produzir uma planta tendo a expressão de um gene modificada caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula de planta, tecido, órgão ou embrião com um vetor recombinante caracterizado por compreender um polinucleotídeo cuja sequência seja a sequência SEQ ID NO1, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a uma sequência de polinucleotídeo de interesse; e uma sequência de terminação; ou com um gene quimérico caracterizado por compreender um polinucleotídeo cuja sequência seja a sequência SEQ ID NO 1, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a uma sequência de polinucleotídeo de interesse; b) selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c) regenerar plantas maduras de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b); d) selecionar plantas maduras da etapa (c) tendo a expressão do gene modificada quando comparada com uma planta não transformada.

16. Método para produzir uma planta tendo a expressão de um gene modificada caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula de planta, tecido, órgão ou embrião um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5; b) selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c) regenerar plantas maduras de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b); d) selecionar plantas maduras da etapa (c) tendo a expressão do gene modificada quando comparada com uma planta não transformada.

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