BR112012024153B1 - Seqüência de dna contendo a região promotora e elementos regulatórios do gene mec1, com expressão na raiz da mandioca, para uso em programas de melhoramento - Google Patents

Abstract

SEQÜÊNCIA DE DNA CONTENDO A REGIÃO PROMOTORA E ELEMENTOS REGULATÓRIOS DO GENE MECI, COM EXPRESSÃO NA RAIZ DA MANDIOCA, PARA USO EM PROGRAMAS DE MELHORAMENTO A presente invenção diz respeito a um promotor e/ou regiões regulatórias específicas para a expressão de genes de interesse em raízes. A invenção descreve ainda construções de DNA que contém o polinucleotídeo da invenção operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o polinucleotídeo da invenção para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente na raiz, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de plantas com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizadas para a geração de (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada ao campo da biotecnologia. Mais especificamente a invenção diz respeito a um promotor e regiões reguiatórias para expressão de moléculas de interesse em raízes de planta. Mais especificamente a presente invenção diz respeito a um promotor e regiões reguiatórias do gene Meei de mandioca (Manihot esculenta Crantz). A invenção descreve ainda construções de DNA que contém o promotor da invenção operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor e as regiões reguiatórias da invenção para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente na raiz, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de plantas com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizadas para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios econômicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) pertence à família Euphorbiaceae, é nativa da América do Sul, e é uma das mais importantes culturas de alimentos tropicais para mais de 600 milhões de pessoas em todo o mundo. Basicamente, cada parte da planta pode ser utilizada, mas as raízes são o produto mais comumente usado. Nos países em desenvolvimento, raízes de mandioca são muitas vezes a única fonte de calorias.

Raízes de armazenamento se desenvolvem a partir de raízes primárias por meio de divisão celular e diferenciação das células do parênquima do xilema secundário (Rateaver B (1951). Anatomy and Regeneration in the Stem and Root of Manihot utilíssima Pohl. Doctoral thesis, University of Michigan, Ann Arbor, 1-100; Castilloa JJ, Castilloa A and Pino LT (1997). Notas sobre histologia foliar y radical en yuca (Manihot esculenta Crantz). In: La Yuca Frente al Hambre del Mundo Tropical, Universidad Central de Venezuela, Caracas, 77-100). Um modelo anatômico com três sistemas de compartimentação de tecidos tem sido utilizado em estudos de expressão genica (De Souza CR, Carvalho LJ, De Almeida ER and Gander ES (2002). Towards the identification of cassava root protein genes. Plant Foods Hum. Nutr. 57: 353-363; De Souza CR, Carvalho LJ, De Almeida ER and Gander ES (2006). A cDNA sequence coding for a glutamic acid-rich protein is differentially expressed in cassava storage roots. Protein Pept. Lett. 13: 653-657). Segundo este modelo, o sistema de tecido I é composto por felogênio e feloderme, tecido do sistema II do floema e câmbio vascular, tecido e sistema III do xilema secundário com suas células do parênquima rica em amido altamente especializadas.

Pt2L4 é uma proteína solúvel em álcool predominantemente expressa no tecido do sistema III, que contém xilema e células do parênquima, com grânulos de amido (De Souza CR, Carvalho LJ, De Almeida ER and Gander ES (2002). Towards the identification of cassava root protein genes. Plant Foods Hum. Nutr. 57: 353-363). A composição de aminoácidos da proteína Pt2L4 revelou que os aminoácidos mais abundantes são o ácido glutâmico (31,6%), alanina (16,94%), valina (13,55%) e prolina (I 1,29%) (De Souza CR, Carvalho LJ, De Almeida ER and Gander ES (2006). Proteínas Pt2L4 e C54 são 60% idênticos com pesos moleculares semelhantes (16,7 e 18,0 kDa, respectivamente) e pontos isoelétricos (3,70 e 3,97) (Zhang P, Bohl-Zenger S, Puonti-Kaerlas J, Potrykus I, et al. (2003). Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation. Planta 218: 192-203). Existem dois ou mais genes homólogos que codificam para proteínas ricas em ácido glutâmico no genoma da mandioca de acordo com análises de Southern blot (Zhang P, Bohl-Zenger S, Puonti-Kaerlas J, Potrykus I, et al. (2003). Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation. Planta 218: 192-203; De Souza CR, Carvalho LJ, De Almeida ER and Gander ES (2006). A cDNA sequence coding for a glutamic acid-rich protein is differentially expressed in cassava storage roots. Protein Pept. Lett. 13: 653-657). Estudos têm revelado que as suas transcrições são mais fortemente expressas nos tecidos vasculares e em células do parênquima de raízes de armazenamento, indicando um papel importante na formação de raízes de armazenamento (Zhang P, Bohl-Zenger S, Puonti-Kaerlas J, Potrykus I, et al. (2003). Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation. Planta 218: 192-203; De Souza CR, Carvalho LJ and de Mattos Cascardo JC (2004). Comparative gene expression study to identify genes possibly related to storage root formation in cassava. Protein Pept. Lett. 11: 577-582; De Souza CR, Carvalho LJ, De Almeida ER and Gander ES (2006). A cDNA sequence coding for a glutamic acid-rich protein is differentially expressed in cassava storage roots. Protein Pept. Lett. 13: 653-657). Além disso, Zhang et al. (Zhang P, Bohl-Zenger S, Puonti-Kaerlas J, Potrykus I, et al. (2003). Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation. Planta 218: 192-203) relataram maior atividade do promotor C54 no câmbio vascular e células do parênquima ricas em amido de raízes tuberosas de plantas de mandioca transgênicas contendo este promotor fundida ao gene repórter β- glucuronidase (GUS).

Apesar dos avanços recentes no isolamento e caracterização de promotores endógenos a partir da mandioca, apenas alguns promotores de tecidos e órgãos específicos foram identificados. A identificação de promotores tecido-específicos é essencial para a engenharia genética da mandioca, que tem sido usada para aumentar o valor nutricional das raízes, bem como para produzir plantas com maior resistência a doenças virais e insetos pragas e com conteúdo cianogênicos reduzida (Taylor N, Chavarriaga P, Raemakers K, Siritunga D, et al. (2004). Development and application of transgenic technologies in cassava. Plant Mol. Biol. 56: 671-688).

Dados da literatura apontam uma evolução na aplicação da transformação genética de acordo com o surgimento de várias gerações de transgênicos. A primeira e segunda geração de plantas transgênicas utilizaram promotores constitutivos como o promotor do vírus do mosaico da couve flor (CaMV 35S) (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985 Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812), promotores de genes encontrados no T-DNA de Agrobacterium tumefaciens como por exemplo, o promotor do gene da enzima nopalina sintetase (Bevan, M. W., Barnes, W. M. & Chilton, M. D. 1983 Structure and transcription of the nopaline syntase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Research, v.ll, n. 2, p. 369-385) e promotores de genes que codificam proteínas altamente conservadas e envolvidas em processos vitais de praticamente todos os organismos como a ubiquitina (Toki S., Takamatsu S., Nojiri C., Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A.H., Quail P.H. & Uchimiya H. 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants. Plant Physiol. Nov;l00(3): 1503-7) e a actina (An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S. & Meagher R.B. 1996 Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Jul; 10(1): 107-21). Entretanto, a terceira geração de plantas transgênicas caracteriza-se, entre outros aspectos, pela utilização de promotores tecido-específicos, tais como: promotores específicos de células epidérmicas (Hooker T.S., Millar A.A. & Kunst L. 2002. Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis. Plant Physiol. Aug; 129(4): 1568-80), de floema (Okumoto S., Koch W., Tegeder M., Fischer W.N., Biehl A., Leister D., Stierhof Y.D. & Frommer W.B. 2004. Root phloem-specific expression of the plasma membrane amino acid proton co-transporter AAP3, J Exp Bot. Oct;55(406):2155-68), de pólen (Wakeley PR, Rogers HJ, Rozycka M, Greenland AJ, Hussey PJ. A maize pectin methylesterase-like gene, ZmC5, specifically expressed in pollen. Plant Mol Biol. 1998 May;37(l):l 87-92) ou induzidos por estresses bióticos (Himmelbach A., Liu L., Zierold U., Altschmied L., Maucher H., Beier F., Müller D., Hensel G., Heise A., Schützendübel A., Kumlehn J. & Schweizer P. 2010. Promoters of the barley germin-like GER4 gene cluster enable strong transgene expression in response to pathogen attack. Plant Cell. 2010. Mar; 22(3):937-52. Epub Mar 19), abióticos (Rai M., He C. & Wu R. 2009. Comparative functional analysis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgenic Res. Oct;18(5):787-99) e químicos (Tomsett, A. Tregova, A. Garoosi and M. Caddick, Ethanol-inducible gene expression: first step towards a new green revolution?, Trends Plant Sei. 9 (2004), pp. 159—161) para promover uma expressão do transgene pontual e apenas quando necessário.

A obtenção e disponibilização de promotores capazes de limitar a expressão gênica temporal e/ou espacialmente pode ser uma das maneiras de equilibrar os benefícios da transgenia e suas restrições.

Promotor é um conjunto de módulos de controle de transcrição, organizados em volta do sítio de iniciação da enzima RNA polimerase II (Potenza, C.; Aleman, L. & Sengupta-Gopalan, C. 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular Development Biological-Plant v. 40, p.1-22) os quais contém sequências específicas reconhecidas por proteínas envolvidas na transcrição. Diferentes classes de promotores vêm sendo descritas na literatura, baseadas em seu perfil de expressão. Entre elas está a dos promotores constitutivos, os quais são ativos em todos os tecidos e em todas as fases do desenvolvimento do organismo, como, por exemplo, o CaMV35S (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-FI. 1985. Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812). Já os promotores tecido/órgão-específicos promovem a expressão de seu gene correlato somente em seu tecido/órgão-alvo como fruto (Atkinson R.G., Bolitho K.M., Wright M.A., Iturriagagoitia-Bueno T., Reid S.J. & Ross G.S. 1998 Apple ACC-oxidase and polygalacturonase: ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato. Plant Mol Biol. Oct; 38(3):449-60), semente-grão (Paine J.A., Shipton C.A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy M.J., Vernon G., Wright S.Y., Hinchliffe E., Adams J.L., Silverstone A.L. & Drake R. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat Biotechnol. Apr;23(4):482-7), raiz/tubérculos (Visser R.G., Stolte A. & Jacobsen E. 1991. Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants. Plant Mol Biol. Oct;17(4):691-9), flores (Annadana S., Beekwilder M.J., Kuipers G., Visser P.B., Outchkourov N., Pereira A., Udayakumar M., De Jong J. & Jongsma M.A. 2002. Cloning of the chrysanthemum UEP1 promoter and comparative expression in florets and leaves of Dendranthema grandiflora. Transgenic Res. Aug;l 1 (4):437-45) e folhas (Nomura M., Katayama K., Nishimura A., Ishida Y., Ohta S., Komari T., Miyao-Tokutomi M., Tajima S. & Matsuoka M. 2000. The promoter of rbcS in a C3 plant (rice) directs organ-specific, light-dependent expression in a C4 plant (maize), but does not confer bundle sheath cell-specific expression. Plant Mol Biol. Sep;44(l):99-106). Existem ainda os promotores responsivos ou induzíveis os quais são ativados mediante uma determinada situação, em resposta a estresses bióticos, abióticos ou químicos. Promotores isolados a partir de um dado organismo podem ser utilizados para regular um gene de outro organismo por meio de construções gênicas quiméricas.

Existem inúmeros promotores tecido-específícos descritos para plantas, como é o caso da expressão específica em semente (WO8903887), tubérculo (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), fruta (Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 e US5753475), caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369 e Schmülling et al. (1989) Plant Cell 1, 665-670), raiz (US20060143735 e como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3:1639-1646), estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865) e meristema (Ito et al. (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878).

Na presente invenção, apresentamos um promotor isolado a partir de mandioca (Manihot esculenta Crantz), específico da raiz gerando a possibilidade de expressar uma proteína de interesse especificamente na raiz. Atualmente, os promotores utilizados na obtenção dos transgênicos comerciais são frequentemente constitutivos e promovem a expressão do transgene em todos os tecidos da planta e em todas as fases do desenvolvimento. Essa característica acarreta desgaste energético na planta, pois ocorre desperdício metabólico na produção de uma proteína em quantidades e locais em que ela é desnecessária e pode levar a diminuição da produtividade. Além disso, é desejável do ponto de vista comercial a agregação de valor a culturas importantes economicamente como é o caso do arroz dourado, rico em β-caroteno (Beyer P. Golden Rice and 'Golden' crops for human nutrition. 2010. May 15. N Biotechnol. [Epub ahead of print]. http://www.sciencedirect.corn/science? ob=ArticleURL& udi=B8JG4- 5033Y3B-2&user=7430124&coverDate=05%2F 15%2F2010&rdoc= 1 &fmt=hi gh&ori g=sear ch&sort=d&docanchor=&view=c& acct=C000012878&version=l&urlVersion=0 &userid=7430124&md5=a9c6d21 Qdb86be4e6946f0fl f69766cθ). Outro aspecto importante é a facilitação de testes de biossegurança, uma vez que a expressão do gene fica restrita a um só órgão.

O uso cada vez mais frequente da transgenia como recurso na resolução de problemas de culturas economicamente importantes ocorre porque a transgenia permite a incorporação de características desejáveis de forma direcionada, independentemente de barreiras entre espécies.

A maioria das plantas transgênicas lançadas no mercado até o presente utiliza-se de promotores constitutivos, os quais ativam a expressão de seu transgene em todos os tecidos do vegetal. Outro fator limitante é a dependência tecnológica uma vez que os usos dos promotores disponíveis atualmente estão protegidos por patentes. A invenção aqui proposta pode ainda ser vista como uma alternativa de regiões promotoras já existentes, principalmente em cultivares e programas de melhoramento que envolvam a cultivar do gênero Manihot uma vez que a sequência promotora proposta foi isolada dessa, não sendo considerada portanto, como uma sequência transgene propriamente dita.

O cenário agronômico atual conta com impactos promovidos pelas mudanças climáticas os quais causam sérios desequilíbrios no meio ambiente e na agricultura e com o aumento populacional, que é um fator gerador de desequilíbrio ambiental pela demanda de espaço para aumento da produção agrícola. Para mitigar esses impactos é necessário o manejo sustentável dos recursos naturais como água e espaço e também das adversidades como seca, pragas e patógenos. Desta forma, plantas mais adequadas a esse cenário precisam ser desenvolvidas e a transgenia é uma ferramenta que acelera a obtenção desses cultivares.

Até o presente momento, apenas duas seqüências promotoras de raiz de mandioca foram isoladas e estão em processo de patenteamento na Alemanha (European Patent Office, 80298 Munich, Germany) Essas seqüências são promotoras dos genes Cl5 e C54 que codificam as proteínas Citocromo p450 e C54, respectivamente.

Tendo em vista a escassez de promotores disponíveis para o melhoramento genético da mandioca, foi isolada e caracterizada uma sequência de DNA (SEQ ID NO1) contendo a região promotora do gene Meei, que codifica a proteína Pt2L4 rica em ácido glutâmico com expressão diferencial na raiz de reserva da mandioca.

Diante do explicitado, a presente patente refere-se a uma nova sequência promotora e regiões reguiatórias específicas de raiz para a expressão de gene de interesse somente nesta região. Além de apresentar vantagens como a expressão direcionada apenas na raiz e ao ser utilizadas em cultivares de Manihot e programas de melhoramento desse mesmo gênero, a invenção traz ainda uma nova alternativa para sistemas de expressão em vegetais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a um novo promotor e regiões reguiatórias para expressão específica de gene em raiz de plantas. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente na raiz, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de organismos vegetais com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizadas para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios econômicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.

Em uma primeira concretização, a presente invenção provê uma seqüência de polinudeotídeo que seja substancialmente similar à SEQ ID NO1; seqüência reversa de SEQ ID NO1; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NO1.

Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombinantes compreendendo, na direção 5’-3’, uma seqüência de promotor e/ou regiões regulatórias de polinucleotídeo da presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma seqüência de terminação de genes. O polinucleotídeo a ser transcrito pode compreender uma armação de leitura aberta de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou pode ser uma região de não codificação, ou não traduzida, de um polinucleotídeo de interesse. A matriz de leitura aberta pode ser orientada em uma direção “sense” ou “antisense”. Preferivelmente, a seqüência de terminação de genes é funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a seqüência de terminação de genes é a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado da técnica (vide Benjamin Lewin, Genes VIII , capítulo 9) como o terminador da nopalina sintase de A. tumefasciens. Os vetores recombinantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas.

Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o vetor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou progénie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o vetor recombinante da presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão de um polipeptídeo modificada. Esse método compreende transformar uma célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênica sob condições que conduzem à regeneração e crescimento da planta madura.

Ainda em outro aspecto da presente invenção é provido um método para identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a transformação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma seqüência de promotor e/ou regiões regulatórias de polinucleotídeos da presente invenção ligada operacionalmente a um polinucleotídeo a ser testado, 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgênica, e 3) comparar o fenótipo da planta transgênica com o fenótipo de plantas não transformadas, ou de tipo selvagem.

Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tornarão evidentes, e a invenção será melhor compreendida por referência na “Descrição Detalhada da Invenção”.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Níveis de transcrição de Mecl na raiz de reserva e tecidos. O RNA total (10μg) de: Ll - L5: cinco camadas de tecido de armazenamento de raiz; (Ct): cotilédones; (YS): jovem radical; (SP): tronco de casca; (Pt): pecíolo e (Lf.): folha foi separado em gel de agarose-formaldeído, transferido para um Hybond-N + membrana e sondado com cDNA Mecl marcado com [32PJ dCTP. Hibridização com RNA ribossomal 28S é incluído como padrão

Figura 2 - Construção gênica pMecl-GUS.

Figura 3 - Detecção da atividade GUS em eixos embrionários de feijão bombardeados com pCAMBIA-Mecl (b, e, f), pCAMBIA 3201 (c) e pCAMBIA 3201 com o promotor 35S deletado. Bars = 0,5mm

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um promotor e regiões regulatórias específicos de raiz para a expressão de gene de interesse apenas nesta região do organismo vegetal transgênico.

Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

Um “gene quimérico” é um gene compreendendo um promotor e uma região codificadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, o gene quimérico compreende o polinucleotídeo da presente invenção ligado a regiões codificadoras de genes endógenos e/ou exógenos.

Uma “seqüência consenso” é uma seqüência artificial na qual a base em cada posição representa a base freqüentemente mais encontrada na seqüência atual comparando-se diferentes alelos, genes ou organismos.

Um “promotor” é aquela porção do DNA acima da região codificadora que contém sítios de ligação para RNA polimerase II para iniciar a transcrição do DNA.

“Expressão” é a transcrição ou tradução de um gene estrutural, endógeno ou heterólogo.

“GC box” é um elemento comum no promotor que pode aumentar a atividade do promotor.

“TATA box” é um elemento no promotor, localizado aproximadamente 30 bases acima do sítio de início da transcrição. O TATA box está associado com fatores de transcrição em geral, incluindo a RNA polimerase II.

O termo “gene” significa uma unidade física e funcional da hereditariedade, representada por um segmento de DNA que codifica uma proteína funcional ou molécula de RNA.

Um “gene endógeno” é um gene próprio da célula ou do organismo.

Um “gene heterólogo” é um gene isolado de um organismo doador e recombinado no organismo receptor transformado. É um gene que não é próprio da célula ou do organismo.

Um “gene repórter” é uma unidade codificadora cujo produto é facilmente testado, por exemplo, genes CAT, GUS, GAL, LUC e GFP. A expressão de um gene repórter pode ser usada para testar a função de um promotor ligado a esse gene repórter.

O termo “propágulo” como usado na presente invenção significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexual ou assexual, incluindo as mudas.

“Sense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5’-3’ com relação ao promotor.

“Antisense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5’-3’ do promotor.

Como usado aqui, o termo “x-mero”, como referência a um valor específico de “x”, refere-se a uma seqüência compreendendo pelo menos um número específico (“x”) de resíduos do polinucleotídeo identificado como SEQ ID NO1. De acordo com formas de realização preferidas, o valor de x é preferivelmente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente ainda pelo menos 60 e mais preferivelmente pelo menos 80. Assim, polinucleotídeos da presente invenção compreendem um polinucleotídeo de 20 meros, 40 meros, 60 meros, 80 meros, 100 meros, 120 meros, 150 meros, 180 meros, 220 meros, 250 meros, 300 meros, 400 meros, 500 meros ou 600 meros identificado como SEQ ID NO1 e variantes dos mesmos.

O termo “polinucleotídeo (s)” como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mRNA, de filamentos tanto “sense” como “antisense”, e compreende cDNA, DNA genômico, e DNA recombinante, assim como polinucleotídeos completamente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém introns e corresponde a uma molécula de DNA em um modo geralmente um a um. Uma molécula de RNAm corresponde a uma molécula de DNA e HnRNA da qual os introns foram excisados. Um polinucleotídeo pode consistir de um gene completo, ou qualquer porção do mesmo. Os polinucleotídeos “antisenso” operáveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de “polinucleotídeo” inclui assim todos esses fragmentos antisense operáveis. Os polinucleotídeos antisense e técnicas envolvendo polinucleotídeos antisense são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)

Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puro.

O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um segmento relativamente curto de uma seqüência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores (“primers”), onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase.

O termo “sonda” utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo seqüências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da seqüência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma seqüência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Conseqüentemente, a seqüência da sonda não necessita refletir exatamente a seqüência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, com o restante da seqüência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou seqüências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele.

O termo “primer” como utilizado aqui refere-se a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o ‘primer’ oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O ‘primer’ deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a seqüência do ‘primer’ deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5’ de um ‘primer’ complementar. Alternativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da seqüência de oligonucleotídeo do ‘primer’, desde que o ‘primer’ tenha complementaridade suficiente com a seqüência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto.

O termo “hibridizando especificamente” diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam seqüências suficientemente complementares para permitir tal hibridização sob condições predeterminadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1, 2003).

Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 4, 2003). Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridização entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press):Tm = 81,5°C + 16,6 Log Na+ + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida)-600/pb no duplex (sonda)

Como ilustração da formula acima, usando Na+ = 0,368 e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.

Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da presente invenção identificados como SEQ ID NO1 ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da seqüência especificada como SEQ ID NO1, ou uma variante desta.

O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 1550 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), levando em consideração estringências de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica.

A definição dos termos “complemento”, “complemento reverso” e “seqüência reversa”, como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a seqüência 5’AGTGAAGT3’, o complemento é 3’TCACTTCA5’, o complemento reverso é 3’ACTTCACT5’ e a seqüência reversa é 5'TGAAGTGA3’.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” compreende seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de seqüências especifícamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As seqüências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas seqüências de nucleotídeos com a seqüências de nucleotídeo descrita aqui (SEQ ID NO 1), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucléicos preferidos são aqueles cujas seqüências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de seqüência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência quando comparada com a seqüência de referência. A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

O termo “vetor” diz respeito a um replicon, tal como plasmídeo, cosmídeo, bacmídeo, fago ou vírus, no qual outras seqüências genéticas ou elementos (seja DNA ou RNA) possam ser ligadas para serem replicadas juntas com o vetor. Preferencialmente o vetor derivado de vírus é selecionado entre os bacteriófagos, vaccinias, retrovirus ou vírus do papiloma bovino. O “vetor recombinante” é resultante da combinação de um vetor comercial com genes quiméricos, ou o polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores que podem ser utilizados na presente invenção, mas não limitados a, são os vetores pGEM-T, pGEMTeasy , pCAMBIA 3201.

O termo “seqüências acentuadoras de expressão” conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. Estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das seqüências adjacentes.

O primeiro intensificador descoberto que estimulava a transcrição de genes eucariotos foi o SV40 (Presente no genoma do Vírus 40 de Símio) Após a descoberta do intensificador SV40 foram identificados centenas de outros enhancer como HSV-1, AMV, HPV-16 , em outros genomas virais no DNA de células eucarióticas. ( Lodish et al, Biologia celular e molecular. 4a edição pág 368)

O termo “operacionalmente ligado” significa que as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência codificadora são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativa à seqüência codificadora para efeito de expressão da seqüência codificadora . Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de seqüências codificadoras e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, auxiliadores ou “enhancers” e elementos ou seqüências de terminação) no vetor de expressão. Uma região codificadora exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificadora exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificadora exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléico que pode causar transcrição de regiões codificadores exógenas, posicionado na região 5’ da região codificadora exógena. No caso da presente invenção a região regulatória diz respeito às regiões substancialmente similares à SEQ ID NO 1. Para auxiliar no aumento da transcrição de um determinado polinucleotídeo, a seqüência promotora da presente invenção poderá estar ligada a outras seqüências regulatórias já descritas, tais como: ATATT (elemento de forte expressão na raiz), AACAAAC e GCCACCTCAT (elementos relativos a expressão específica em sementes), CACGTG e CCTACC (ambas seqüências podem ser estimuladas ao um fator de estresse), entre outros. (Ai-Min Wu et al, Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl ) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426-^35)

Uma “seqüência de terminação” é uma seqüência de DNA que sinaliza o final da transcrição. São exemplos de seqüências de terminação, mas não estão limitados a sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.A presente invenção provê uma região regulatória de polinucleotídeos isolados que podem ser empregadas na manipulação de fenótipos de plantas, junto com polinucleotídeos isolados compreendendo estas regiões regulatórias. Mais especificamente a presente invenção está relacionada ao promotor ou seqüência regulatória que ocorre naturalmente em plantas de mandioca (Manihot esculenta Crantz), responsável pela expressão do gene Mecl em raízes dessa espécie vegetal. O promotor e regiões regulatórias de mandioca foram isolados do gene Mecl responsável pela expressão da proteína Pt2L4 nas raízes de mandioca e foram denominados na presente invenção de Mecl (SEQ ID NO1).

A quantidade de um polipeptídeo de interesse específico pode ser aumentada ou reduzida através da incorporação de cópias adicionais de genes, ou seqüências de codificação, codificando o polipeptídeo, ligado operacionalmente a seqüência de promotor da presente invenção (SEQ ID NO 1), no genoma de um organismo, como uma planta. Similarmente, um aumento ou uma diminuição na quantidade do polipeptídeo pode ser obtido por transformação de planta com cópias antisense destes genes.

O polinucleotídeo da presente invenção foi isolado de plantas de mandica, mais especificamente de Manihot esculenta Crantz, mas ele pode ser altemativamente sintetizado usando técnicas de síntese convencionais. Especificamente o polinucleotídeo isolado da presente invenção inclui a seqüência identificada como SEQ ID NO1; o complemento reverso da seqüência identificada como SEQ ID NO1; complemento reverso da seqüência identificada como SEQ ID NO1.

O polinucleotídeo da presente invenção pode ser identificado em seqüências de DNA genômico de plantas para as quais a informação da seqüência de genoma é disponível ao público, ou isolado de várias bibliotecas de polinucleotídeos, ou pode ser sintetizado usando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) O polinucleotídeo pode ser sintetizado, por exemplo, usando sintetizadores automatizados de oligonucleotídeos (por exemplo, sintetizador de DNA OLIGO 1000M Beckman) para obter segmentos de polinucleotídeos de até 50 ou mais ácidos nucléicos. Uma pluraridade pluralidade destes segmentos de polinucleotídeos podem ser então ligados usando técnicas de manipulação de DNA padrões que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Uma técnica de síntese de polinucleotídeo convencional e exemplar envolve a síntese de um segmento de polinucleotídeo de filamento único, tendo, por exemplo, 80 ácidos nucléicos, e hibridizando este segmento a um segmento de 85 ácidos nucléicos complementar, sintetizados, para produzir um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos. O próximo segmento pode ser então sintetizado de modo similar, como um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos no filamento oposto. As extremidades “pegajosas” ou coesivas asseguram uma ligação apropriada quando as duas porções são hibridizadas. Deste modo, o polinucleotídeo desta invenção pode ser sintetizado completamente in vitro.

Como observado acima, a seqüência de promotor da presente invenção pode ser empregada em vetores recombinantes e/ou de expressão para acionar a transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo de interesse. O polinucleotídeo de interesse pode ser endógeno ou heterólogo para um organismo, por exemplo, uma planta, a ser transformada. Os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser assim empregados para modular níveis de transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo, por exemplo, um gene que está presente na planta de tipo selvagem, ou pode ser empregado para prover transcrição e/ou expressão de uma seqüência de DNA que não é encontrada na planta de tipo selvagem, incluindo, por exemplo, um gene que codifica um gene repórter, como GUS.

Em algumas formas de realização da presente invenção, o polinucleotídeo de interesse compreende uma matriz de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de interesse. A matriz de leitura aberta é inserida no vetor em uma orientação sense e a transformação com essa construção genética/vetor recombinante irá geralmente resultar em super-expressão do polipeptídeo selecionado. O polipeptídeo de interesse, que será regulado pelo promotor da presente invenção, poderá ser inserido no vetor na orientação sense, antisense ou em ambas as direções. A transformação com um vetor recombinante e/ou de expressão contendo o promotor da invenção regulando a expressão do polinucleotídeo de interesse na orientação antisense ou em ambas as orientações (sense e antisense) irá geralmente resultar na expressão reduzida do polipeptídeo selecionado.

O polinucleotídeo de interesse, como uma seqüência de codificação, é ligado de modo operativo em uma seqüência do promotor de polinucleotídeo da presente invenção de modo que uma célula hospedeira é capaz de transcrever um RNA acionado pela seqüência do promotor ligada ao polinucleotídeo de interesse. A seqüência do promotor de polinucleotídeo está geralmente posicionada na extremidade 5’ do polinucleotídeo a ser transcrito. O uso de promotor tecido-específico, como a seqüência do polinucleotídeo de mandioca (Manihot esculenta Crantz), responsável pela expressão do gene Mecl identificada como SEQ ID NO1, irá afetar a transcrição do polinucleotídeo de interesse apenas no endosperma da planta transformada.

O vetor recombinante ou vetor de expressão da presente invenção também pode conter um marcador de seleção que é eficaz em células do organismo, como uma planta, para permitir a detecção de células transformadas contendo o vetor recombinante inventivo. Estes marcadores, que são bem conhecidos, tipicamente conferem resistência a uma ou mais toxinas Um exemplo deste marcador é o gene nptll, cuja expressão resulta em resistência a canamicina ou neomicina, antibióticos que são geralmente tóxicos para células de plantas em uma concentração moderada. As células transformadas podem ser assim identificadas por sua capacidade de crescer em meio contendo o antibiótico em questão. Outros marcadores que podem ser utilizados para construir vetores recombinantes e/ou de expressão contendo o polinucleotídeo da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a: gene hpt confere resistência ao antibiótico higromicina, gene manA e o gene bar.

O sistema que usa o gene manA (que codifica a enzima PMI - phospho manno se isomerase) de Escherichia coli (Miles e Guest, 1984. Complete nucleotide sequence of the fumarase gene fumA, of E. coli. Nucleic Acids Res. 1984 April 25; 12(8): 36313642), tendo a manose como agente seletivo, é um dos novos sistemas sugeridos como alternativos aos dois primeiros descritos acima (Joersbo et al., 1998 Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet, Physiolouia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi:10.1034/j, 1399-3 054.1999.105117.x). As espécies vegetais que não metabolizam manose sofrem severa inibição de crescimento quando esta é oferecida como única fonte de carbono em meio de cultura. Os efeitos adversos e inibitórios do uso da manose são conseqüências do acúmulo de manose-6-fosfato, produto da fosforilação da manose por uma hexoquinase. PMI promove a interconversão de manose-6-fosfato e fruto se-6-fosfato, permitindo assim que a primeira possa ser catabolizada na via glicolítica (Ferguson e Street, 1958. Análise de sistemas gene marcador/ agente seletivo alternativos para seleção positiva de embriões somáticos transgênicos de mamoeiro, Rev. Bras. Fisiol. Veg., 2001, vol.13, no.3, p.365-372, ISSN 0103-3131. : Malca et al., 1967 Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes, Physiologia Plantarum Volume 111 Issue 3 Page 269 - March 2001 doi: 10.1034/j. 1399- 3054,2001,1110301.x),0 gene bar (que codifica a enzima PAT - phosphinothricin-N- acetyltransferase) de Streptomyces hygroscopicus (Murakani et al., 1986 The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus'. molecular cloning and characterization of the gene cluster. Molecular and General Genetics., 205: 42-50, 1986.), tendo o glufosinato de amónio (PPT) como agente seletivo, é, dentre os sistemas tipo gene de tolerância a herbicida, um dos mais amplamente empregados pela engenharia genética no desenvolvimento de OGMs vegetais. PAT inativa herbicidas que apresentam o PPT como composto ativo mediante detoxificação deste. A detoxifícação, que é resultante da acetilação do grupamento amino livre presente no PPT, torna este incapaz de competir de forma inibitória com a glutamina sintetase (GS), possibilitando assim a remoção da amónia tóxica da célula vegetal pela conversão de glutamato em glutamina, reação esta catalizada pela GS (Lindsey, 1992 Molecular cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, constitutively expressed on resting leukocytes, Nature 360, 481 - 484 (03 December 1992); doi:10.1038/360481a0).

Altemativamente, a presença do gene quimérico em células transformadas pode ser determinada por meio de outras técnicas conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), como Southern e PCR.

As técnicas para ligar de modo operativo os componentes dos vetores recombinantes ou de expressão inventivos são bem conhecidas no estado da técnica e incluem o uso de ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de endonuclease de restrição, como descrito, por exemplo, em Sambrook et al (“Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Genes quiméricos da presente invenção podem ser ligados a um vetor tendo, pelo menos um sistema de replicação, por exemplo, E.coli, assim após cada manipulação, as construções resultantes podem ser clonadas e seqüenciadas.

Vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser usados para transformar uma variedade de organismos incluindo, mas não limitando a plantas. As plantas que podem ser transformadas usando vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção incluem angiospermas monocotiledôneas (por exemplo gramíneas, milho, grãos, aveia, trigo e cevada...), angiospermas dicotiledôneas (por exemplo Arabidopsis, tabaco, legumes, alfafa, aveia, eucalipto, bordo...), e gimnospermas (por exemplo pinheiro, espruce branco, lariço...). Os protocolos de transformação de plantas já são bem conhecidos no estado da técnica (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA- CENARGEM, Capitulo 3 e 7, 1998). Em uma forma de realização preferida, os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção são empregados para transformar plantas dicotiledôneas. Preferivelmente, a planta é selecionada da família das Euphorbiaceae, mais preferivelmente da espécie Manihot esculenta. Outras plantas podem ser transformadas de modo útil com o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachio, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea.

O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de A. tumefasciens (nos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. Preferivelmente o terminador utilizado na presente invenção é o terminador do gene Mec 1.

Os vetores recombinantes e/ou de expressão da invenção podem ser introduzidos dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, introdução mediada por A. tumefasciens', eletroporação; fusão de protoplasto; injeção em órgãos reprodutivos; injeção em embriões imaturos; microinjeção de protoplastos de células de plantas; utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA e outros. A escolha da técnica irá depender da planta a ser transformada. Por exemplo, plantas dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas e gimnospermas podem ser transformadas por tecnologia de plasmídeo Ti de Agrobacterium. Os vetores recombinantes e/ou de expressão podem ser combinados com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro A. tumefasciens. A função de virulência do hospedeiro A. tumefasciens direcionará a inserção das construções genicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por A. tumefasciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983). A presente invenção pode utilizar vários vetores binários, dentre eles o vetor binário do tipo pBI 121.

Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária. A introdução de vetores recombinantes e/ou de expressão utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722, 1984 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A introdução dos vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção pode ser feita em tecidos, como tecido de folha, células dissociadas, protoplastos, sementes, embriões, regiões meristemáticas, cotilédones, hipocotilédones, e outros. Preferencialmente a presente invenção utiliza a transformação através da introdução mediada por A. tumefasciens utilizando a A. thaliana com planta modelo (Clough at al, "Floral dip: a simplified method for TgroòacfôrzM/H-mediated transformation of A. thaliana", Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43.). No entanto outros métodos de transformação podem ser utilizados para inserir vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção, tais como a biobalística, que consiste em uma técnica de transformação direta do DNA que utiliza microprojéteis impulsionados em alta velocidade para carrear o DNA para dentro das células [Rech, E.L; Aragão, F.J.L. Biobalística. In: Manual de Transformação Genética de Plantas (Brasileiro, A.C.M. & Carneiro, V.T.C. eds.), EMBRAPA Serviço de Produção de Informações -SPI. 1998, 106pp], e via tubo polínico. O método de transformação via tubo polínico foi divulgado pela primeira vez por Zhou et al (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., and Liu, G. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth, in Enzymol. 101:433-448, 1983) e consiste na aplicação de uma solução de DNA na parte superior da maçã jovem após a polinização. Utilizando esta técnica, o DNA exógeno pode alcançar o ovário através da passagem deixada pelo tubo polínico e integrar as células zigóticas já fertilizadas, porém não divididas.

Uma vez que as células foram transformadas, por qualquer uma das técnicas mencionadas acima, as células tendo o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incorporado em seu genoma podem ser selecionadas por meio de um marcador, como o marcador de resistência a higromicina ou a canamicina. As células de plantas transformadas podem então ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, fmalmente, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fítohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a seqüência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al. (Evans et al, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985, como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são bem descritas no estado da técnica, tais como em Leelavathi et al. [Leelavathi et al, A simple and rapid dgruòacfórÍMW-mediated transformation protocol for cotton (G. hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants. Plant Cell Rep (2004) 22:465^170]. Esse trabalho descreve um protocolo para transformação e regeneração do algodão onde o calo embriogênico com Agrobacterium, é cultivado sob estresse de desidratação e seleção de antibiótico por 3 a 6 meses para a regeneração de diversos embriões transgênicos, uma média de 75 embriões globular. Sendo observado sobre a seleção de placas esses embriões são cultivados e multiplicados no meio, seguido pelo desenvolvimento de embriões cotiledonares sobre o meio de maturação do embrião. Para se obter uma media de 12 plantas por placas de petri de calos co-cultivados. Aproximadamente 83% dessas plantas são transgênicas. As plantas transformadas resultantes podem ser reproduzidas de modo sexual ou assexual, usando métodos conhecidos no estado da técnica [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobaclerium-mcdiated transformation protocol for cotton (Gossipium hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep, 2004. 22: 465-470 ], para dar gerações sucessivas de plantas transgênicas.

A produção de RNA em células pode ser controlada por escolha da seqüência do promotor, por seleção do número de cópias funcionais ou através do sítio de integração de polinucleotídeos incorporados no genoma hospedeiro. Um organismo pode ser transformado utilizando um vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção contendo mais de uma matriz de leitura aberta de codificação para um polipeptídeo de interesse.

O polinucleotídeo isolado da presente invenção também tem utilidade no mapeamento do genoma, em mapeamento físico e em clonagem posicionai de genes. A seqüência identificada como SEQ ID NO1 e suas variantes podem ser usadas para projetar sondas e iniciadores de oligonucleotídeos. As sondas de oligonucleotídeos projetadas usando o polinucleotídeo da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença do promotor e regiões reguiatórias do gene Mecl em qualquer organismo tendo seqüências de DNA suficientemente similares em suas células usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, como as técnicas de hibridização de DNA dot blot (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual. 2nd edition [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

Os iniciadores de oligonucleotídeos projetados usando o polinucleotídeo da presente invenção podem ser usados para amplificações de PCR. O polinucleotídeo da presente invenção também pode usado para etiquetar ou identificar um organismo ou material reprodutivo do mesmo. Esta etiqueta pode ser obtida, por exemplo, por introdução estável de um identificador de polinucleotídeo heterólogo, não funcional, não disruptive, em um organismo, sob o controle do polinucleotídeo da presente invenção.

O polinucleotídeo proposto para a presente invenção foi obtido seguindo preferencialmente as etapas: 1 - O material genético das amostras dos possíveis candidatos pode ser isolado segundo qualquer procedimento que permita ter acesso ao material genético integro, como por exemplo, os métodos de extração que utilizam solventes orgânicos. 2 - A partir do material isolado é realizada uma reação de PCR para obtenção dos fragmentos. Nessas reações são utilizados primers específicos do gene selecionado, como por exemplo, o gene Mecl. Os referidos primers podem ser desenhados com auxílio do programa Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S e Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386) ou qualquer outro programa e/ processo que forneça primers específicos para os candidatos. 3 - As reações de PCR podem ser conduzidas em aparato especial para o procedimento, como termociclador MJ Research modelo PTC-100, ou qualquer outro termociclador capaz de desenvolver sua função, em condições idéias para a reação, na qual é sugerida a incubação inicial de 92-96°C por 3-5 minutos, seguida de 25-35 ciclos (92-96°C por 30 segundos a 2 minutos para desnaturação, 60-65°C por 30segundos a 2 minutos para hibridização dos oligonucleotídeos e 70-75°C por 30 segundos e 2 minutos para extensão) e 70-75°C de 15 a 25 minutos para uma extensão final. 4 - A identidade do produto amplificado pode ser confirmada, como por exemplo, pela migração eletroforética dos fragmentos, na qual se recomenda utilizar como comparação o controle positivo, constituído por um vetor, como por exemplo, um vetor contendo a sequência estudada.

Após a obtenção do polinucleotídeo, irá ocorrer o processo de transformação para incorporação do polinucleotídeo da invenção. O processo de transformação deve ser realizado no organismo de interesse através dos procedimentos descritos anteriormente neste relatório. A eficiência de transformação dos explantes deve ser avaliada através da expressão transiente e estável nos tecidos dos propágulos regenerados de um gene de interesse, o qual se recomenda a utilização do gene gus. A análise de expressão do gene gus deve ser realizada por protocolos de ensaio histoquímico, como por exemplo, conforme adaptação do protocolo descrito por Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. and Bevan M.W. 1987. GUS fusions: β- glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907) em folhas, raízes, frutos, sementes e flores (pétala, gineceu, estame, pólen) das plantas transformadas.

EXEMPLO

A presente invenção é ainda definida nos seguintes exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma de ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.

Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Várias soluções utilizadas nas manipulações experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como “agarose”, “TBE”, “miniprep”, etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook, et al. (supracitada).

EXEMPLO 1: Análise da expressão do gene Mec 1

A expressão do gene Mecl foi avaliada em todas as partes da planta da mandioca, o que constatou uma expressão alta e direcionada para a raiz de reserva. Na Figura 1 são mostrados os resultados da análise de expressão na raiz, representada por cinco camadas diferentes de tecidos (LI a L5), sendo que a expressão do gene Mecl foi maior em L5, constituída por xilema secundário e parênquima de reserva. Na Figura 1 também são mostrados sinais de expressão de Mec 1 no cotilédone (Ct.), no caule jovem (YS) e no peciolo (Pt.), porém em niveis muito mais baixos do que na raiz, enquanto na folha (Lf.) e na casca do caule (SP) não foi detectada expressão. Estes resultados constataram uma alta expressão do gene Mecl na raiz em comparação com as demais partes da planta, sendo que neste órgão a expressão foi maior em sua parte central (camada L5), a qual é constituída principalmente por vasos (xilema secundário).

EXEMPLO 2: Obtenção do material vegetal

Folhas de mandioca (Manihot esculenta Crantz) foram gentilmente cedidas pela Df1. Eloisa Cardoso da Embrapa Amazônia Oriental (EMBRAPA-CPATU, Belém, PA, Brasil).

EXEMPLO 3: Isolamento da seqüência do promotor através da reação em cadeia da polimerase inversa

O DNA genômico foi isolado de folhas de mandioca através de kit de purificação da DNA total de planta Purelink e quantificado utilizando um fluorímetro Qubit, ambos fornecidos pela Invitrogen Life Technologies, seguindo as instruções do fabricante.

As amostras contendo aproximadamente 10μg de DNA genômico foram digeridas totalmente e separadamente com HaelII, Dral e enzimas de restrição Hphl. Depois da extração com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (24:24:1), e precipitação do etanol, fragmentos de DNA foram auto-circularizados pela T4 DNA ligase e utilizados na reação de cadeia da polimerase inversa (PCR). Dois primers reversos (Mec2-R: 5' actggctctgcttccttgggctcttc 3’ e MEC3-R: 5' tcctcaggaagtgcagtctgtgctgt 3') e um primer “forward” (Mec4 F: 5' gctgatgatgctccggctgaagtagc 3') foram projetados de acordo com a seqüência do cDNA Mecl previamente isoladas e registrados no NCB1 GenBank (acesso AY101376).Fragmentos de DNA foram amplificados utilizando os primers Mec2-R/Mec4-F na PCR inversa primária e primers Mec3-R/Mec4-F primers na PCR inversa secundária. As condições utilizadas nos ensaios primários e secundários de PCR inversa foram: 5 min a 94 0 C, 30 ciclos de amplificação (1 min a 94 0 C, 1 min a 63 0 C e 1,5 minutos a 72 0 C) e 20 min a 72 ° C para uma extensão final. Os testes de PCR foram realizados usando o mix polimerase Advantage 2 kit fornecidos por Clontech (Paio Alto, EUA). Os produtos amplificados foram purificados a partir de um gel de agarose usando o kit QIAquick Spin (Qiagen) e clonados no vector pGEMTeasy (Promega Corporation).

Ensaios de PCR utilizando os primers Mec9-F (5' ggtgatgagaagagagactatttcgttgaca 3') e Mecll-R (5' tacctcagcagtagccatagtcagcca 3’) foram realizados para obter uma seqüência promotora contígua, que foi amplificada a partir de um DNA genômico não-digerido e clonada no vector pGEMTeasy gerando o plasmídeo pMecl. Todos os clones foram seqüenciados usando um seqüenciador MegaBACE 1000 (GE Healthcare Life Sciences).

A sequência de DNA isolada (SEQ ID NO1), objeto do presente documento de patente é constituída por 1.135 nucleotídeos. A seqüência de DNA (SEQ ID NO1) é constituída por: (1) região promotora apresentando 875 nucleotídeos (1-875), (2) seqüência 5’ não traduzida apresentando 77 nucleotídeos (876-952), (3) primeiro exon apresentando 15 nucleotídeos (953-967), (4) primeiro intron apresentando 136 nucleotídeos (968-1103), (5) seqüência parcial do segundo exon apresentando 32 nucleotídeos (1104-1135).

A região promotora do gene Mecl apresenta 875 nucleotídeos e contém alguns elementos conservados. Entre eles, (1) o TATA Box envolvido na formação do aparelho basal da transcrição, localizado 103 nucleotídeos em posição a montante ao ATG de iniciação da tradução; (2) elementos ATATT que conferem expressão na raiz.

EXEMPLO 4: Análise da seqüência

Seqüências nucleotídicas foram alinhadas utilizando o algoritmo BLAST (Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, et al. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) e o programa ClustalW (Thompson et al., 1994). O programa TFSearch foi utilizado para pesquisar putativos sítios de ligação de fatores de transcrição (Heinemeyer T, Wingender E, Reuter I, Hermjakob H, et al. (1998). Databases on transcriptional regulation: TRANSFAC, TRRD and COMPEL. Nucleic Acids Res. 26: 362-367). Bancos de dados PlantCare e PLACE foram utilizados para determinar elementos regulatórios agindo em cis (Prestridge DS (1991). SIGNAL SCAN: a computer program that scans DNA sequences for eukaryotic transcriptional elements. Comput. Appl. Biosci. 7: 203-206; Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M and Korenaga T (1999). Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999. Nucleic Acids Res. 27: 297-300; Lescot M, Dehais P, Thijs G, Marchai K, et al. (2002). PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucleic Acids Res. 30: 325-327).

EXEMPLO 5: Constructos usados em experimentos para expressão transiente

O fragmento de 800 pb contendo o promotor 35S foi liberado a partir do plasmídeo pCAMBIA 3201 (CAMBIA, Canberra, Austrália) através da digestão com BamHl e Ncol. Os primers F-Mecl2 (agggatççggtgatgagaagagagactatttcg) e Mecl3-R (cagtagççatggtcagcca) contendo os sítios BamHl e Ncol (sublinhados) foram utilizados para amplificar o promotor Mecl de 970-bp a partir do plasmídeo pMecl. Após digestão com estas duas enzimas, o fragmento de 952 pb foi clonado entre os sítios BamHl e Ncol pCAMBIA 3201, substituindo o promotor CaMV 35S, que gerou o plasmídeo pCAMBlA-Mecl. Como controle negativo, o fragmento de 800 pb contendo o promotor 35S foi liberado do plasmídeo pCAMBIA 3201 por digestão com BamHl e Ncol, e o fragmento de DNA do vetor foi, então, auto-circularizado pela T4 DNA ligase. Como controle positivo foi utilizado o pCAMBIA 3201.

EXEMPLO 6: Bombardeio de eixos de feijão embrionários

A preparação do explante e bombardeamento de partículas foram realizados de acordo com métodos previamente descritos (Aragão FJL, Barros LMG, Brasileiro ACM, Ribeiro SG, et al. (1996). Inheritance of foreign genes in transgenic bean (Phaseolus vulgaris L.) co-transformed via particle bombardment. Theor. A ppi. Genet. 93: 142-150). Eixos embrionários de feijão foram superficiais e transversalmente bombardeados separadamente com três plasmídeos: pCAMBIA-Mecl, pCAMBIA 3201 e pCAMBIA 3201 sem o promotor CaMV 35S. Após o bombardeio (50 mmol • m-2 ■ s-1), os explantes foram cultivados por 24 horas a 28 ° C com fotoperíodo de 16 h em meio MS. Os tecidos foram analisados por localização in situ da atividade de GUS de acordo com métodos descritos na anterioridade (Jefferson RA, Kavanagh TA and Bevan MW (1987). GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907).

EXEMPLO 7: Análise da função da região promotora do gene Mec 1

A funcionalidade da região promotora do gene Mecl foi avaliada através de experimentos de transformação genética. Para isto, inicialmente foi feita a construção gênica pMecl-GUS, mostrada na Figura 2, na qual a região promotora do gene Mecl (1) foi colocada na posição adjacente ao gene repórter da enzima glucoronidase (GUS)(2) . Em seguida, a construção pMecl-GUS foi introduzida em embriões de feijão através de bombardeamento, nos quais a atividade de GUS foi detectada através da observação de coloração azulada (Figura 3: b, e, f), comprovando, desta forma, a funcionalidade da seqüência promotora isolada. Na Figura 3 também são mostrados embriões bombardeados com o vetor pCAMBIA 3201 sem o promotor 35S do virus do mosaico da couve-flor (controle negativo) (a, d) , nos quais não foram observados 5 atividade de GUS, e embrião bombardeado com o vetor pCAMBIA 3201 contendo o promotor 35S (controle positivo) (c), no qual observou-se atividade de GUS. Comparando-se o padrão de expressão de GUS direcionada pelos dois promotores, pôde-se observar que o 35S direcionou a expressão para as células epidérmicas enquanto o Mecl direcionou para a parte central do embrião, que corresponde ao 10 sistema vascular que está sendo formado.

Sendo assim, a seqüência nucleotídica isolada (SEQ ID NO1), objeto da presente patente, apresenta funcionalidade comprovada, podendo ser utilizada em programas de melhoramento genético vegetal.

Claims (13)

1. Um gene quimérico caracterizado por compreender: a) o polinucleotídeo descrito em SEQ ID NO:1, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a; b) uma sequência de polinucleotídeo de interesse heteróloga a SEQ ID NO:1;

2. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de a sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.

3. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de a sequência de polinucleotídeo de interesse poder estar na orientação sense ou antisense.

4. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de as sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1 , AMV, HPV-16 , entre outros.

5. Um vetor recombinante caracterizado por conter um gene quimérico de acordo com a reivindicação 2.

6. Um vetor recombinante caracterizado por compreender: a) o polinucleotídeo descrito em SEQ ID NO:1, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a; b) uma sequência de polinucleotídeo de interesse heteróloga a SEQ ID NO:1; e c) uma sequência de terminação

7. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de a sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.

8. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de a sequência de terminação ser selecionada do grupo consistindo de sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes

9. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de as sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1 , A V, HPV-16 , entre outros.

10. Uma célula de microrganismo transformada caracterizada pelo fato de conter um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9.

11. Método para modificar a expressão de genes em um organismo caracterizado por incorporar estavelmente no genoma do organismo um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 .

12. Método de acordo com reivindicação 11 caracterizado pelo fato de o organismo ser uma planta.

13. Método para produzir uma planta tendo a expressão de um gene modificada caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula de planta, tecido, órgão ou embrião com um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4; b) selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c) regenerar plantas maduras de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b); d) selecionar plantas maduras da etapa (c) tendo a expressão do gene modificada quando comparada com uma planta não transformada.

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