BR102012008162B1 - composições e métodos para modificar a expressão de genes de interesse - Google Patents

Abstract

composições e métodos para modificar a expressão de genes de interesse. a presente invenção diz respeito a uma sequência promotora específica para a expressão de genes de interesse em endosperma de frutos. a invenção ainda descreve construções de dna que contém o promotor bem como o método utilizando tais construções para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. a expressão do trasngene somente no órgão de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto e constitui vantagem em relação à expressão constitutiva, pois favorece a implementação de estratégias que visam a obtenção de cultivares com maior valor agregado como: adaptação a estresse ambiental, tolerância a patógenos, pragas e defensivos agrícolas, aumento do valor nutricional e terapêutico e uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais gerando cultivares mais competitivas a custos mais baixos. além disso, a presente invenção também apresenta uma sequência com expressão constitutiva, oferecendo uma alternativa para a implementação de sistemas de expressão onde a expressão constitutiva é requerida. a invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios econômicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES DE INTERESSE (51) Int.CI.: C12N 15/82; C12N 15/113; C12N 15/67 (73) Titular(es): EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA - EMBRAPA (72) Inventor(es): JULIANA DANTAS DE ALMEIDA; LEILA MARIA GOMES BARROS; MAURO CARNEIRO; ALAN CARVALHO ANDRADE; FELIPE RODRIGUES DA SILVA; LUIZ FILIPE PROTASIO PEREIRA; MICHELLE GUITTON COTTA; MIRIAN THEREZINHA SOUZA DA EIRA (85) Data do Início da Fase Nacional: 09/04/2012

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COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES DE INTERESSE

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada ao campo da biotecnologia. Mais 5 especificamente a invenção diz respeito a um promotor específico para a expressão de genes de interesse em endosperma de frutos. A invenção descreve ainda construções de DNA que contêm o promotor da invenção operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor da invenção para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de plantas com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizada para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios econômicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nas ultimas três décadas a agricultura tem sido beneficiada pela biotecnologia a qual associa a tecnologia do DNA recombinante, a cultura de tecidos vegetais e os métodos de melhoramento clássico para gerar plantas resistentes a herbicidas (Aragão, F.J.L., Vianna, G. R., Albino, M.M.C. & Rech, E.L. 2002 Transgenic Dry Bean Tolerant to the Herbicide Glufosinate Ammonium. Crop Science, v. 42, n. 4, p. 1298-1302), a insetos-praga (Lilley C. J., Wang D., Atkinson H. J. & Urwin P. E. 2010 Effective delivery of a nematode-repellent peptide using.Plant Biotechnology Journal, pp. 1-11 doi: 10.1111/j.1467-7652.2010.00542.x, a root-cap-specific promoter) e tolerantes a

2/35 seca (Quan R, Hu S, Zhang Z, Zhang H, Zhang Z, Huang R. Overexpression of an ERF transcription factor TSRF1 improves rice drought tolerance. Plant Biotechnol J. 2010 May 1 ;8(4):476-88), além de plantas com alto valor nutricional (Aluru, M., Xu, Y., Guo, R., Wang, Z., Li, S., White, W., Wang, K. & Rodermel, S. 2008 Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content. J. Exp. Bot., v. 59, n. 3, p. 3551— 3562) e alto valor terapêutico (Marcondes, J. & Hansen, E. 2008 Transgenic lettuce seedlings carrying hepatitis B virus antigen HBsAg. Braz. J. Infect. Dis., v.12, n. 6, p. 469-471). Somadas, essas características resultam em aumento de produção, ganhos econômicos, melhoria da qualidade de vida da população e preservação do meio ambiente. Por meio da técnica de transgenia é possível a introdução de genes de interesse independentemente de barreiras interespecíficas.

Apesar dos benefícios econômicos, sociais e ambientais associados à transformação genética, essa tecnologia se tomou alvo de preocupação por parte de consumidores e ambientalistas devido a questões de biossegurança.

Dados da literatura apontam uma evolução na aplicação da transformação genética de acordo com o surgimento de várias gerações de transgênicos. A primeira e segunda geração de plantas transgênicas utilizaram promotores constitutivos como o promotor do vírus do mosaico da couve flor (CaMV 35S) (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985 Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature, v. 313, p. 810-812), promotores de genes encontrados no T-DNA de Agrohacterium (umefaciens como por exemplo, o promotor do gene da enzima nopalina sintetase (Bevan, M. W., Bames, W. M. & Chilton, M. D. 1983 Structure and transcription of the nopaline syntase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Research, v.ll, n. 2, p. 369-385) e promotores de genes que codificam proteínas altamente conservadas e envolvidas em processos vitais de praticamente todos os organismos como a ubiquitina (Toki S., Takamatsu S., Nojiri C., Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A.H., Quail P.H. & Uchimiya H, 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants. Plant Physiol. Nov;100(3):1503-7) e a actina (An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S. & Meagher R.B. 1996 Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Jul; 10(1): 107-21). Entretanto, a terceira geração de plantas transgênicas caracteriza-se, entre outros aspectos, pela

3/35 ¹ r utilização de promotores tecido-específicos, tais como: promotores específicos de células epidérmicas (Hooker T.S., Millar A.A. & Kunst L. 2002. Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arahidopsis. Plant Physiol. Aug; 129(4): 1568-80), de floema (Okumoto S., Koch W.,

Tegeder M., Fischer W.N., Biehl A., Leister D., Stierhof Y.D. & Frommer W.B. 2004. Root phloem-specific expression of the plasma membrane amino acid proton cotransporter AAP3. J Exp Bot. Oct;55(406):2155-68), de pólen (Wakeley PR, Rogers HJ, Rozycka M, Greenland AJ, Hussey PJ. A maize pectin methylesterase-like gene, ZmC5, specifícally expressed in pollen. Plant Mol Biol. 1998 May;37( 1):187-92) ou induzidos por estresses bióticos (Himmelbach A., Liu L., Zierold U., Altschmied L., Maucher H., Beier F., Müller D., Hensel G., Heise A., Schützendübel A., Kumlehn J. & Schweizer P. 2010. Promoters of the barley germin-like GER4 gene cluster enable strong transgene expression in response to pathogen attack. Plant Cell. 2010. Mar; 22(3):937-52. Epub Mar 19), abióticos (Rai M., He C. & Wu R. 2009. Comparative functional analysis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgeníc Res. Oct; 18(5):787-99) e químicos (Tomsett, A. Tregova, A. Garoosi and M. Caddick, Ethanol-inducible gene expression: first step towards a new green revolution?, Trends Plant Sei, 9 (2004), pp. 159-161) para promover uma expressão do transgene pontual e apenas quando necessário.

A obtenção e disponibilização de promotores capazes de limitar a expressão gênica temporal e/ou espacialmente pode ser uma das maneiras de equilibrar os benefícios da transgenia e suas restrições.

Promotor é um conjunto de módulos de controle de transcrição, organizados em volta do sítio de iniciação da enzima RNA polimerase II (Potenza, C.; Aleman, L. &

Sengupta-Gopalan, C. 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular Development Biological-Plant v. 40, p.1-22) os quais contém sequências específicas reconhecidas por proteínas envolvidas na transcrição. Diferentes classes de promotores vêm sendo descritas na literatura, baseadas em seu perfil de expressão.

Entre elas está a dos promotores constitutivos, os quais são ativos em todos os tecidos e em todas as fases do desenvolvimento do organismo, como, por exemplo, o CaMV35S (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-II. 1985. Identification of DNA sequences required for

4/35 the activity of the cauliflower mosaic vírus 35S promoter, Nature, v, 313, p. 810-812). Já os promotores tecido/órgão-específicos promovem a expressão de seu gene correlato somente em seu tecido/órgão-alvo como fruto (Atkinson R.G., Bolitho K.M., Wright M.A., Iturriagagoitia-Bueno T., Reid S.J. & Ross G.S. 1998 Apple ACC-oxídase and polygalacturonase: ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato. Plant Mol Biol. Oct; 38(3):449-60), semente-grão (Paine J.A., Shipton C.A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy M.J., Vemon G., Wright S.Y., HinchlifFe E., Adams J.L., Silverstone A.L. & Drake R. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat Biotechnol. 10 Apr;23(4):482-7), raiz/tubérculos (Visser R.G., Stolte A. & Jacobsen E. 1991. Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants. Plant Mol Biol. Oct; 17(4):691-9), flores (Annadana S., Beekwilder M.J., Kuipers G,, Visser P.B., Outchkourov N., Pereira A., Udayakumar M., De Jong J. & Jongsma M.A. 2002. Cloning of the chrysanthemum UEP1 promoter and comparative 15 expression in florets and leaves of Dertdranlhema grandiflora. Transgenic Res. Aug;l 1(4):437-45) e folhas (Nomura M., Katayama K., Nishimura A., Ishida Y, Ohta S., Komari T., Miyao-Tokutomi M., Tajima S. & Matsuoka M. 2000. The promoter of rbcS in a C3 plant (rice) directs organ-specific, light-dependent expression in a C4 plant (maize), but does not confer bundle sheath cell-specific expression. Plant Mol Biol. 20 Sep;44(l ):99-106). Existem ainda os promotores responsivos ou induzíveis os quais são ativados mediante uma determinada situação, em resposta a estresses bióticos, abióticos ou químicos. Promotores isolados a partir de um dado organismo podem ser utilizados para regular um gene de outro organismo por meio de construções gênicas quiméricas.

Existem inúmeros promotores tecido-específicos descritos para plantas, como é o caso da expressão específica em semente (WO8903887), tubérculo (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359369 e Schmülling et al, (1989) Plant Cell 1, 665-670), raiz (US20060143735 e como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei.

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3:1639-1646), estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865), meristema (Ito et al. (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878) e fruto (Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 e US5753475, sendo que nesse último documento, a sequência apresentada tem ação específica no pericarpo do fruto.

Na presente invenção, apresentamos um promotor isolado a partir de cafeeiro (Coffea ssp), específico do endosperma do fruto. O endosperma é a parte consumida do grão, de grande interesse econômico, e a possibilidade de expressar uma proteína de interesse especificamente no endosperma é útil na introdução de características relacionadas à qualidade nutricional, características organolépticas, vantagens na fase pós-colheita. Atualmente, os promotores utilizados na obtenção dos transgênicos comerciais são frequentemente constitutivos e promovem a expressão do transgene em todos os tecidos da planta e em todas as fases do desenvolvimento. Essa característica acarreta desgaste energético na planta, pois ocorre desperdício metabólico na produção de uma proteína em quantidades e locais em que ela é desnecessária e pode levar a diminuição da produtividade. Além disso, é desejável do ponto de vista comercial a agregação de valor a culturas importantes economicamente como é o caso do arroz dourado, rico em β-caroteno (Beyer P. Golden Rice and 'Golden' crops for liuman nutrition. 2010. May 15. N Bíotechnol. [Epub ahead of print].

http://www.sciencedirect.com/science7_ob-ArticlcflRI.&_udi=B8JG4-5033Y3B-

2&_user=7430124&_coverDate=05%2F15%2F2010&_rdoc=l&_fmt=high&_orig=sear ch&_sort=d&_doeanchor=&view=c&_acct=G000012878&_version=l &_urlVersion=0 &_userid-7430124&md5=a9c6d210db86be4e6946f0fl f69766c0). Outro aspecto importante é a facilitação de testes de biossegurança, uma vez que a expressão do gene fica restrita a um só órgão.

O uso cada vez mais frequente da transgenia como recurso na resolução de problemas de culturas economicamente importantes ocorre porque a transgenia permite a incorporação de características desejáveis de forma direcionada, independentemente de barreiras entre espécies.

A maioria das plantas transgênicas lançadas no mercado até o presente utiliza-se de promotores constitutivos, cujo produto é expresso em todos os tecidos do organismo. Outro fator limitante é a dependência tecnológica uma vez que os usos dos promotores

6/35 disponíveis atualmente estão protegidos por patentes. A invenção aqui proposta pode ainda ser vista como uma alternativa a regiões promotoras já existentes, principalmente em cultivares e programas de melhoramento.

O cenário agronômico atual conta com impactos promovidos pelas mudanças 5 climáticas os quais causam sérios desequilíbrios no meio ambiente e na agricultura e com o aumento populacional, que é um fator gerador de desequilíbrio ambiental pela demanda de espaço para aumento da produção agrícola. Para mitigar esses impactos é necessário o manejo sustentável dos recursos naturais como água e espaço e também das adversidades como seca, pragas e patógenos. Desta forma, plantas mais adequadas a esse cenário precisam ser desenvolvidas e a transgenia é uma ferramenta que acelera a obtenção desses cultivares.

O documento PI0209551-3 apresenta uma invenção que se refere a uma sequência de nucleotídeos derivada de folhas de café que pode ser usada como um promotor para uma expressão induzível de genes em plantas. Particularmente, a referida invenção pertence a uma sequência de nucleotídeos englobando o promotor e a região de codificação de um gene rbcS. De forma diferente, a invenção proposta no presente documento trata-se de um promotor específico para frutos e além de consistir uma alternativa a processos de transgenia, particularmente em organismos vegetais.

Os documentos WO0151637 e W00302939 se referem a promotores, isolados de Fragaria vesca — morango, que dirigem seletivamente a expressão de sequências de DNA colocados sob o controle do mesmo nos frutos de plantas. Quando comparadas ao presente invento, nota-se que as sequências dos promotores descritos nas patentes supracitadas foram isoladas de Fragaria vesca - morango. A proposta revelada no presente documento possui como vantagem a sua utilização para a geração de cultivares e/ou programas de melhoramento em diversos organismos vegetais, inclusive aos pertencentes ao gênero Coffea ssp, uma vez que o isolado foi obtido desse mesmo gênero. Além disso, o promotor proposto apresenta alternativa para a criação de organismos vegetais expressando transgenes.

A patente K.R100797644 por sua vez, se refere a um promotor de expressão específico em frutos, derivado do Citrus unshiu - fruto cítrico de origem japonesa. O promotor é fornecido para induzir a expressão de período de maturação tardio em frutos, expressar eficientemente um gene exógeno em frutos e controlar sua expressão, de

7/35 modo que plantas transgênicas sejam produzidas eficientemente. A vantagem ao se utilizar a invenção proposta pelo nosso grupo se faz particularmente nas cultivares do gênero Coffea ssp ou mesmo em programas de melhoramento desse gênero por se tratar de uma região regulatória presente no próprio gênero. Apresentando também uma alternativa para a criação de organismos vegetais expressando transgenes, como supracitado.

O documento WO2010093175 apresenta um promotor de expressão específico, do gene HR7, enquanto o documento WO2010012848 refere-se a uma sequência promotora denominada FSP1 situada na região 5 'do DNA do gene Snl, ambas derivadas do Solanum lycopersicum — tomate. De acordo com o documento, um gene introduzido a partir de uma planta transformada pode ser especificamente expresso em tecido de flores e frutos, quando comparado ao utilizado convencionalmente, como, por exemplo, o promotor do Cauliflower mosaic virus - CaMV 35S. Apesar de ser um promotor específico podendo ser utilizado para a expressão em frutos, apresenta como desvantagem ao promotor aqui pleiteado a impossibilidade de ser utilizado como um promotor nativo do gênero Coffea ssp e/ou programas de melhoramento desse mesmo gênero.

Por sua vez, as invenções retratadas nos documentos CN1298021 e W02005026366 se referem a sequências para direcionar a expressão de um gene de interesse no endosperma. Entretanto, essas mesmas são derivadas das sequências controladoras 5' do gene waxy e do gene glutelin gene GluD-1 respectivamente, do arroz apresentando assim, as mesmas desvantagens citadas no parágrafo anterior referentes ao gênero Coffea ssp.

A invenção retratada no documento US2007169226 refere se a métodos e reagentes para a expressão de genes regulada temporalmente e/ou espacialmente, especialmente em sementes de plantas e tecidos reprodutivos femininos relacionados. Entretanto, as composições compreendem novas sequências de nucleotídeos para um promotor que sabidamente controla a expressão em sementes, do gene conhecido como eepl e não de frutos especificamente. Além da sequência não ser específica para Coffea ssp.

De forma bastante similar ao documento do item anterior, o documento W02008040061 revela uma sequência de ácidos nucléicos isolada compreendendo uma

8/35 sequência de nucleotídeos que corresponde a uma região promotora ativa de uma sequência de DNA. Contudo, a sequência de ácido nucléico isolada é derivada de um grão de cereal e trás as mesmas desvantagens referentes à utilização do promotor no gênero Coffea ssp e nos programas de melhoramento do referido gênero.

Ainda de forma semelhante, os documentos US2009089897 e US2010037347 fornecem composições e métodos para a regulação da expressão de sequências de nucleotídeos em planta, sendo que as novas composições são sequências de nucleotídeos para promotores de tecido, entretanto, isolado a partir de sorgo.

O documento WO2010118477 por sua vez proporciona composições 10 compreendendo sequências promotoras operáveis em plantas, isoladas de Triticum aestivum — trigo, e suas variantes, que conferem expressão seletiva/específica de genes específicos especialmente no endosperma sendo, portanto diferente e não apresentando as vantagens da sequência aqui proposta em relação ao gênero Coffea ssp.

A patente US7071378 e o pedido de patente W02005026366 revelam em seu 15 conteúdo sequências de nucleotídeos promotoras isoladas, respectivamente de Zea mays - milho e Hordeum vulgare - cevada, que permitam a expressão de sequências codificadoras onde podem estar ligadas, que são específicas para região do endosperma.

Diante do explicitado, a presente patente refere-se a uma nova sequência promotora específica de endosperma para a expressão de gene de interesse somente no 20 fruto. Além de apresentar vantagens como a expressão direcionada apenas no endosperma em frutos e ao ser utilizadas em cultivares de Coffea ssp e programas de melhoramento desse mesmo gênero, a invenção traz ainda uma nova alternativa para sistemas de expressão em vegetais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a um novo promotor para expressão específica de gene em endosperma de frutos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de organismos vegetais com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para

9/35 sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizadas para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios econômicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.

Em uma primeira concretização, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo que seja substancialmente similar à SEQ 1D NO1; sequência reversa de SEQ ID NO1; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NO1.

Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombinantes compreendendo, na direção 5’-3’, uma sequência de promotor de polinucleotídeo da presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma sequência de terminação de genes. O polinucleotídeo a ser transcrito pode compreender uma armação de leitura aberta de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou pode ser uma região de não codificação, ou não traduzida, de um polinucleotídeo de interesse. A matriz de leitura aberta pode ser orientada em uma direção “sense” ou “antisense”. Preferivelmente, a sequência de terminação de genes é funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a sequência de terminação de genes é a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado da técnica (vide Benjamin Lewin, Genes VIII , capítulo 9) como o terminador da nopalina sintase de A. tumefasciens. Os vetores recombinantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas.

Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o vetor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou progênie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção.

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Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o vetor recombinante da presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um 5 organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão de um polipeptídeo modificada. Esse método compreende transformar uma célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênica sob condições que conduzem à regeneração e crescimento da planta madura.

Ainda em outro aspecto da presente invenção é provido um método para 10 identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a transformação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma sequência de promotor de polinucleotídeos da presente invenção ligada operacionalmente a um polinucleotídeo a ser testado, 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgênica, e 3) comparar o fenótipo da planta transgênica com o fenótipo de plantas não transformadas, ou de tipo selvagem.

Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tomarão evidentes, e a invenção será melhor compreendida por referência na “Descrição Detalhada da Invenção”.

BREVE Ü^SC RICÂO DAS FIGURAS

T

Figura 1. Fluxograma-apresentando as etapas envolvidas para o desenvolvimento do promotor endosperma-específico.

Figura 2. Fracionamento eletroforético de fragmentos específicos representantes da sequência de CaLTPl. (+) controle positivo, (R) cDNA de raiz, (Fr) cDNA de fruto e (Fo) cDNA de folha.

Figura 3. Gráfico representativo do perfil de expressão da LTP1 em raiz, folha e fruto em relação ao gene da ubiquitina.

Figura 4. Validação da expressão preferencial de LTP1 em fruto por Northern blot. Gel desnaturante 1,5% com amostras de raiz, folha e fruto de Coffea arabica 120 dias após o florescimento. R: raiz; Fo: Folha e Fr: Fruto.

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Figura 5. Fracionamento eletroforético dos fragmentos obtidos por meio da técnica de 5’race. M - marcador 1Kb ladder, 1/1M - biblioteca Dral, 2/2M - biblioteca Eco RV, 3/3M - biblioteca PvuII e 4/4M - biblioteca Stul.

Figura 6. Esquema que detalha a reconstrução do vetor binário PBI121. O vetor PB1121 possui 12800 pb de comprimento e seu número de acesso no Gen Bank é AF485783. A construção de interesse foi obtida por meio da substituição do promotor CaMV 35S (835 pb) pelo fragmento de 451 pb referente ao promotor CaLTPl.

Figura 7. Reconstrução do vetor binário PBI121. O vetor PBI121 possui 12800 pb de comprimento e seu número de acesso no Gen Bank é AF485783. A construção de interesse foi obtida por meio da substituição do promotor CaMV 35S (835 pb) pelo fragmento de 451 pb referente ao promotor CaLTPl,

Figura 8, Localização da atividade de GUS em plantas de tabaco transformadas com o promotor PB1. A, B, C, D; e I, J, K, L representam os controles negativo e positivo (PBt 121) do experimento, respectivamente. A, E e I representam tecidos foliares e radiculares; B, F e J secções transversais de frutos; C, G e K sementes; D, EI e L estame, pétala e gineceu. E, F, G e H representam a atividade do promotor CaLTPl. Pode-se observar o diagnóstico de reação apenas nas sementes (G) de plantas que contêm o promotor endosperma-específico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um promotor específico de endosperma para a expressão de gene de interesse apenas no fruto do organismo vegetal transgênico.

Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

Um “gene quimérico” é um gene compreendendo um promotor e uma região codificadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, o gene quimérico compreende o polinucleotídeo da presente invenção ligado a regiões codificadoras de genes endógenos e/ou exógenos.

Uma “sequência consenso” é uma sequência artificial na qual a base em cada posição representa a base freqüentemente mais encontrada na sequência atual comparando-se diferentes alelos, genes ou organismos.

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Um “promotor” é aquela porção do DNA acima da região codificadora que contém sítios de ligação para RNA polimerase II para iniciar a transcrição do DNA.

“Expressão” é a transcrição ou tradução de um gene estrutural, endógeno ou heterólogo.

“GC box” é um elemento comum no promotor que pode aumentar a atividade do promotor.

“TATA box” é um elemento no promotor, localizado aproximadamente 30 bases acima do sítio de início da transcrição. O TATA box está associado com fatores de transcrição em geral, incluindo a RNA polimerase II.

O termo “gene” significa uma unidade física e funcional da hereditariedade, representada por um segmento de DNA que codifica uma proteína funcional ou molécula de RNA.

Um “gene endógeno” é um gene próprio da célula ou do organismo.

Um “gene heterólogo” é um gene isolado de um organismo doador e recombinado no organismo receptor transformado. E um gene que não é próprio da célula ou do organismo.

Um “gene repórter” é uma unidade codificadora cujo produto é facilmente testado, por exemplo, genes CAT, GUS, GAL, LUC e GFP. A expressão de um gene repórter pode ser usada para testar a função de um promotor ligado a esse gene repórter.

O termo “propágulo” como usado na presente invenção significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexual ou assexual, incluindo as mudas.

“Sense” significa que a sequência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5’—3’ com relação ao promotor.

“Antisense” significa que a sequência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5’-3’ do promotor.

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Como usado aqui, o termo “x-mero”, como referência a um valor específico de “x”, refere-se a uma sequência compreendendo pelo menos um número específico (“x”) de resíduos do polinucleotídeo identificado como SEQ ID NO1. De acordo com formas de realização preferidas, o valor de x é preferivelmente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente ainda pelo menos 60 e mais preferivelmente pelo menos 80. Assim, polinucleotídeos da presente invenção compreendem um polinucleotídeo de 20 meros, 40 meros, 60 meros, 80 meros, 100 meros, 120 meros, 150 meros, 180 meros, 220 meros, 250 meros, 300 meros, 400 meros 500 meros ou 600 meros identificado como SEQ ID NO1 e variantes dos mesmos.

O termo “polinucleotídeo (s)” como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mRNA, de filamentos tanto “sense” como “antisense”, e compreende cDNA, DNA genômico, e DNA recombinante, assim como polinucleotídeos completamente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém íntrons e corresponde a uma molécula de DNA em um modo geralmente um a um. Uma molécula de RNAm corresponde a uma molécula de DNA e HnRNA da qual os íntrons foram excisados. Um polinucleotídeo pode consistir de um gene completo, ou qualquer porção do mesmo. Os polinucleotídeos “antisenso” operáveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de “polinucleotídeo” inclui assim todos esses fragmentos antisense operáveis. Os polinucleotídeos antisense e técnicas envolvendo polinucleotídeos antisense são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)

Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puro.

O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um segmento relativamente curto de uma sequência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos.

Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores (“primers”),

14/35 onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase.

O termo “sonda” utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo sequências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma sequência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Conseqüentemente, a sequência da sonda não necessita refletir exatamente a sequência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, com o restante da sequência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Altemativamente, bases não complementares ou sequências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a sequência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele.

O termo “primer” como utilizado aqui se refere a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade

15/35 similar para produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o ‘primer’ oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O ‘primer’ deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a sequência do ‘primer’ deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5’ de um ‘primer’ complementar. Alternativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da sequência de oligonucleotídeo do ‘primer’, desde que o ‘primer’ tenha complementaridade suficiente com a sequência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto.

O termo “hibridizando especificamente” diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam sequências suficientemente complementares para permitir tal hibridizaçâo sob condições predeterminadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1, 2003)

Em particular, o termo se refere à hibridizaçâo de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridizaçâo específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 4, 2003). Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridizaçâo entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press):

Tm = 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida)-600/pb no duplex (sonda)

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Como ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368] e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.

Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da 5 presente invenção identificado como SEQ ID NO1 ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da sequência especificada como SEQ ID NO1, ou uma variante desta.

O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 1550 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), levando em consideração estringências de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica.

A definição dos termos “complemento”, “complemento reverso” e “sequência reversa”, como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a sequência 5’AGTGAAGT3’, o complemento é 3’TCACTTCA5’, o complemento reverso é 3’ACTTCACT5’ e a sequência reversa é 5’TGAAGTGA3’.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” compreende sequências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de sequências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As sequências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas sequências de nucleotídeos com a sequências de nucleotídeo descrita aqui (SEQ ID NO 1), como determinada por

17/35 algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nuclcicos preferidos são aqueles cujas sequências de nucíeotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de sequência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência quando comparada com a sequência de referência. A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas sequências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na sequência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

O termo “vetor” diz respeito a um replicon, tal como plasmídeo, cosmídeo, baemídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (seja DNA ou RN A) possam ser ligadas para serem replicadas juntas com o vetor. Preferencialmente o vetor derivado de vírus é selecionado entre os bacteriófagos, vaccinias, retrovírus ou vírus do papiloma bovino. O “vetor recombinante” é resultante da combinação de um vetor comercial com genes quiméricos, ou o polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacional mente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Paio Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad,

Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados a, são os vetores pGEM-T, pCAMBIA 1391, vetores gateway e o vetor pMON,

O termo “sequências acentuadoras de expressão” conhecidas como amplificadores (enhancers), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. Estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que

18/35 estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das sequências adjacentes.

O primeiro intensificador descoberto que estimulava a transcrição de genes eucariotos foi o SV40 (Presente no genoma do Vírus 40 de Símio) Após a descoberta do intensificador SV40 foram identificados centenas de outros enhancer como HSV-1, AMV, 1IPV-16 , em outros genomas virais no DNA de células eucarióticas. ( Lodish et al, Biologia celular e molecular. 4^a edição pág 368)

O termo “operacionalmente ligado” significa que as sequências regulatórias necessárias para expressão da sequência codificadora são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativa à sequência codificadora para efeito de expressão da sequência codificadora . Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de sequências codificadoras e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, auxiliadores ou “enhancers” e elementos ou sequências de terminação) no vetor de expressão. Uma região codificadora exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificadora exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificadora exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléico que pode causar transcrição de regiões codificadores exógenas, posicionado na região 5’ da região codificadora exógena. No caso da presente invenção a região regulatória diz respeito às regiões substancial mente similares à SEQ ID NO 1. Para auxiliar no aumento da transcrição de um determinado polinucleotídeo, a sequência promotora da presente invenção poderá estar ligada a outras sequências regulatórias já descritas, tais como: ATATT (elemento de forte expressão na raiz), AACAAAC e GCCACCTCAT (elementos relativos a expressão específica em sementes), CACGTG e CCTACC (ambas sequências podem ser estimuladas ao um fator de estresse), entre outros. (Αί-Min Wu et al, Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426^135)

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Uma “sequência de terminação” é uma sequência de DNA que sinaliza o final da transcrição. São exemplos de sequências de terminação, mas não estão limitados a sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes. A presente invenção provê uma região regulatória de polinucleotídeos isolados que podem ser empregadas na manipulação de fenótipos de plantas, junto com polinucleotídeos isolados compreendendo estas regiões regulatórias. Mais especificamente a presente invenção está relacionada ao promotor ou sequência regulatória de acordo com a SEQ 1D NO1, responsável pela expressão de um representante da família LTP1 (“Lipid Transfer Protein”-Proteína transferidora de lipídio), sendo denominado na presente invenção de CaLTPl, responsável pela expressão no endosperma do fruto.

A quantidade de um polipeptídeo de interesse específico pode ser aumentada ou reduzida através da incorporação de cópias adicionais de genes, ou sequências de codificação, codificando o polipeptídeo, ligado operacionalmente a sequência de promotor da presente invenção (SEQ ID NO1), no genoma de um organismo, como uma planta. Similarmente, um aumento ou uma diminuição na quantidade do polipeptídeo pode ser obtido por transformação de planta com cópias antisense destes genes.

O polinucleotídeo da presente invenção foi isolado de plantas de café, mais especificamente de Coffea arabica, mas ele pode ser altemativamente sintetizado usando técnicas de síntese convencionais. Especificamente o polinucleotídeo isolado da presente invenção inclui a sequência identificada como SEQ ID NO1; o complemento reverso da sequência identificada como SEQ ID NO1; complemento reverso da sequência identificada como SEQ ID NO1.

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O polinucleotídeo da presente invenção pode ser identificado em sequências de DNA genômico de plantas para as quais a informação da sequência de genoma é disponível ao público, ou isolado de várias bibliotecas de polinucieotídeos, ou pode ser sintetizado usando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). O polinucleotídeo pode ser sintetizado, por exemplo, usando sintetizadores automatizados de oligonucleotídeos (por exemplo, sintetizador de DNA OLIGO 1000M Beckman) para obter segmentos de polinucieotídeos de até 50 ou mais ácidos nucléicos. Uma pluralidade destes segmentos de polinucieotídeos podem ser então ligados usando técnicas de manipulação de DNA padrões que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Uma técnica de síntese de polinucleotídeo convencional e exemplar envolve a síntese de um segmento de polinucleotídeo de filamento único, tendo, por exemplo, 80 ácidos nucléicos, e hibridizando este segmento a um segmento de 85 ácidos nucléicos complementar, sintetizados, para produzir um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos. O próximo segmento pode ser então sintetizado de modo similar, como um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos no filamento oposto. As extremidades “pegajosas” ou coesivas asseguram uma ligação apropriada quando as duas porções são hibridizadas. Deste modo, o polinucleotídeo desta invenção pode ser sintetizado completamente in vilro.

Como observado acima, a sequência de promotor da presente invenção pode ser empregada em vetores recombinantes e/ou de expressão para acionar a transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo de interesse. O polinucleotídeo de interesse pode ser endógeno ou heterólogo para um organismo, por exemplo, uma planta, a ser transformada. Os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser assim empregados para modular níveis de transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo, por exemplo, um gene que está presente na planta de tipo selvagem, ou pode ser empregado para prover transcrição e/ou expressão de uma sequência de DNA que não é encontrada na planta de tipo selvagem, incluindo, por exemplo, um gene que codifica um gene repórter, como GUS.

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Em algumas formas de realização da presente invenção, o polinucleotídeo de interesse compreende uma matriz de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de interesse. A matriz de leitura aberta é inserida no vetor em uma orientação sense e a transformação com essa construção genética/vetor recombinante irá geralmente resultar em super-expressão do polipeptídeo selecionado. O polipeptídeo de interesse, que será regulado pelo promotor da presente invenção, poderá ser inserido no vetor na orientação sense, antisense ou em ambas as direções. A transformação com um vetor recombinante e/ou de expressão contendo o promotor da invenção regulando a expressão do polinucleotídeo de interesse na orientação antisense ou em ambas as orientações (sense e antisense) irá geralmente resultar na expressão reduzida do polipeptídeo selecionado,

O polinucleotídeo de interesse, como uma sequência de codificação, é ligado de modo operativo em uma sequência do promotor de polinucleotídeo da presente invenção de modo que uma célula hospedeira é capaz de transcrever um RNA acionado pela sequência do promotor ligada ao polinucleotídeo de interesse. A sequência do promotor de polinucleotídeo está geralmente posicionada na extremidade 5’ do polinucleotídeo a ser transcrito. O uso de promotor tecido-específico, como a sequência do promotor de café (Coffea arabica), responsável pela expressão do gene LTP1 (Lipid Transfer Protein- Proteína transferidora de lipidio) identificada como SEQ ID NO1, irá afetar a transcrição do polinucleotídeo de interesse apenas no endosperma da planta transformada.

O vetor recombinante ou vetor de expressão da presente invenção também pode conter um marcador de seleção que é eficaz em células do organismo, como uma planta, para permitir a detecção de células transformadas contendo o vetor recombinante inventivo, Estes marcadores, que são bem conhecidos, tipicamente conferem resistência a uma ou mais toxinas Um exemplo deste marcador é o gene nptll, cuja expressão resulta em resistência a canamicina ou neomicina, antibióticos que são geralmente tóxicos para células de plantas em uma concentração moderada. As células transformadas podem ser assim identificadas por sua capacidade de crescer em meio contendo o antibiótico em questão. Outros marcadores que podem ser utilizados para construir vetores recombinantes e/ou de expressão contendo o polinucleotídeo da

22/35 presente invenção podem ser, mas não estão limitados a: gene hpt confere resistência ao antibiótico higromicina, gene manA e o gene bar.

O sistema que usa o gene manA (que codifica a enzima PMI - phosphomannose isomerase) de Escherichia coli (Miles e Guest, 1984. Complete nucleotide sequence of the fumarase gene íumA, of E. coli. Nucleic Acids Res. 1984 April 25; 12(8): 36313642), tendo a manose como agente seletivo, é um dos novos sistemas sugeridos como alternativos aos dois primeiros descritos acima (Joersbo et al., 1998 Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet, Physiologia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi: 10.1034/j. 1399-3054.1999.105117.x). As espécies vegetais que não metabolizam manose sofrem severa inibição de crescimento quando esta é oferecida como única fonte de carbono em meio de cultura. Os efeitos adversos e inibitórios do uso da manose são consequências do acúmulo de manose-6-fosfato, produto da fosforilação da manose por uma hexoquinase. PMI promove a interconversão de manose-6-fosfato e frutose-6-fosfato, permitindo assim que a primeira possa ser catabolizada na via glicolítica (Ferguson e Street, 1958. Análise de sistemas gene marcador/ agente seletivo alternativos para seleção positiva de embriões somáticos transgênicos de mamoeiro, Rev. Bras. Fisiol. Veg, 2001, vol.13, no.3, p.365-372. ISSN 0103-3131. : Malca et al., 1967 Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes, Physiologia Plantarum Volume 111 Issue 3 Page 269 - March 2001 doi :10.1034/j. 13993054.2001.1110301.x).0 gene bar (que codifica a enzima PAT - phosphinothricin-Nacetyltransferase) de Streptomyces hygroscopicus (Murakani et al., 1986 The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Molecular and General Genetics., 205: 42-50, 1986.), tendo o glufosinato de amônio (PPT) como agente seletivo, é, dentre os sistemas tipo gene de tolerância a herbicida, um dos mais amplamente empregados pela engenharia genética no desenvolvimento de OGMs vegetais. PAT inativa herbicidas que apresentam o PPT como composto ativo mediante detoxificação deste. A detoxificação, que é resultante da acetilação do grupamento amino livre presente no PPT, torna este incapaz de competir de forma inibitória com a glutamina sintetase (GS), possibilitando assim a remoção da amônia tóxica da célula vegetal pela conversão de glutamato em glutamina, reação esta catalizada pela GS (Lindsey, 1992 Molecular

23/35 cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, constitutively expressed on resting leukocytes, Nature 360, 481 - 484 (03 December 1992); doi: 10.1038/36048laO).

Altemativamente, a presença do gene quimérico em células transformadas pode ser determinada por meio de outras técnicas conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), como Southern e PCR.

As técnicas para ligar de modo operativo os componentes dos vetores recombinantes ou de expressão inventivos são bem conhecidas no estado da técnica e incluem o uso de ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de endonuclease de restrição, como descrito, por exemplo, em Sambrook et al (“Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Genes quiméricos da presente invenção podem ser ligados a um vetor tendo, pelo menos um sistema de replicação, por exemplo, E.coli, assim após cada manipulação, as construções resultantes podem ser clonadas e seqüenciadas.

Vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser usados para transformar uma variedade de organismos incluindo, mas não limitando a plantas. As plantas que podem ser transformadas usando vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção incluem angiospermas monocotiledôneas (por exemplo, gramíneas, milho, grãos, aveia, trigo e cevada...), angiospermas dicotiledôneas (por exemplo, Arabidopsis, tabaco, legumes, alfafa, aveia, eucalipto, bordo...), e gimnospermas (por exemplo, pinheiro, espruce branco, lariço...). Os protocolos de transformação de plantas já são bem conhecidos no estado da técnica (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, Capitulo 3 e 7, 1998). Em uma forma de realização preferida, os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção são empregados para transformar plantas dicotiledôneas. Preferivelmente, a planta é selecionada da família das Rubiaceae, mais preferivelmente da espécie Coffea arabica. Outras plantas podem ser transformadas de modo útil com o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: Anacardium, Anona, Arachis, Aríocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsieum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus,

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Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pis um, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum,

Vicia, Vitis, Vigna, e Zea.

O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de A. tumefasciens (nos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium suhierranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes, Preferivelmente o terminador utilizado na presente invenção é o terminador do gene LTP1 (Lipid Transfer Protein-Proteína transferidora de lipídio).

Os vetores recombinantes e/ou de expressão da invenção podem ser introduzidos dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, introdução mediada por A. tumefasciens·, eíetroporação; fusão de protoplasto; injeção em órgãos reprodutivos; injeção em embriões imaturos; microinjeção de protoplastos de células de plantas; utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA e outros. A escolha da técnica irá depender da planta a ser transformada. Por exemplo, plantas dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas e gimnospermas podem ser transformadas por tecnologia de plasmídeo Ti de Agrobacterium. Os vetores recombinantes e/ou de expressão podem ser combinados com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro A. (umefasciens. A função de virulência do hospedeiro A.

(umefasciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por A. (umefasciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al.

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983). O vetor binário utilizado preferencialmente na invenção é o vetor binário do tipo pBI 121.

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Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária, A introdução de vetores recombinantes e/ou de expressão utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowskí et al. Embo J. 3:2717-2722, 1984 (como mencionado no pedido de patente

US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente

US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A introdução dos vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção pode ser feita em tecidos, como tecido de folha, células dissociadas, protoplastos, sementes, embriões, regiões meristemáticas, cotilédones, hipocotilédones, e outros. Preferencialmente a presente invenção utiliza a transformação através da introdução mediada por A. tumefasciens utilizando a A. thalicma com planta modelo (Clough at al, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of A. thaliana, Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43.). No entanto outros métodos de transformação podem ser utilizados para inserir vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção, tais como a biobalística, que consiste em uma técnica de transformação direta do DNA que utiliza microprojéteis impulsionados em alta velocidade para carrear o DNA para dentro das células [Rech, E.L; Aragão, F.J.L. Biobalística. In: Manual de Transformação Genética de Plantas (Brasileiro, A.C.M. & Carneiro, V.T.C. eds.), EMBRAPA Serviço de Produção de Informações -SPI. 1998, 106pp], e via tubo polínico. O método de transformação via tubo polínico foi divulgado pela primeira vez por Zhou et al (Zhou, G., Wang, J., Zeng, ¥., Huang, J., Qian, S., and Liu, G. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol. 101:433-448, 1983) e consiste na aplicação de uma solução de DNA na parte superior da maçã jovem após a polinização. Utilizando esta técnica, o DNA exógeno pode alcançar o ovário através da passagem deixada pelo tubo polínico e integrar as células zigóticas já fertilizadas, porém não divididas,

Uma vez que as células foram transformadas, por qualquer uma das técnicas mencionadas acima, as células tendo o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incorporado em seu genoma podem ser selecionadas por meio de um marcador, como o marcador de resistência a higromicina ou a canamicina. As células de

26/35 plantas transformadas podem então ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, finalmente, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al. (Evans et al, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985, como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são bem descritas no estado da técnica, tais como em Leelavathi et al. [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (G hirsuium £.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Ccll Rcp (2004) 22:465 470J. Esse trabalho descreve um protocolo para transformação e regeneração do algodão onde o calo embriogênieo com Agrobacterium, é cultivado sob estresse de desidratação e seleção de antibiótico por 3 a 6 meses para a regeneração de diversos embriões transgênicos, uma média de 75 embriões globular. Sendo observado sobre a seleção de placas esses embriões são cultivados e multiplicados no meio, seguido pelo desenvolvimento de embriões cotiledonares sobre o meio de maturação do embrião. Para se obter uma media de 12 plantas por placas de petri de calos co-cultivados. Aproximadamente 83% dessas plantas são transgênícas. As plantas transformadas resultantes podem ser reproduzidas de modo sexual ou assexual, usando métodos conhecidos no estado da técnica [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (Gossipium hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep, 2004, 22: 465^470 ], para dar gerações sucessivas de plantas transgênicas.

A produção de RNA em células pode ser controlada por escolha da sequência do promotor, por seleção do número de cópias funcionais ou através do sítio de integração de polinucleotídeos incorporados no genoma hospedeiro. Um organismo pode ser transformado utilizando um vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção

27/35 contendo mais de uma matriz de leitura aberta de codificação para um polipeptídeo de interesse.

O polinucleotídeo isolado da presente invenção também tem utilidade no mapeamento do genoma, em mapeamento físico e em clonagem posicionai de genes. A sequência identificada como SEQ ID NO1 e suas variantes podem ser usadas para projetar sondas e iniciadores de oligonucleotídeos. As sondas de oligonucleotídeos projetadas usando o polinucleotídeo da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença do promotor do gene LTP1 (Lipid Transfer Protein-Proteína transferidora de lipidio) em qualquer organismo tendo sequências de DNA suficientemente similares em suas células usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, como as técnicas de hibridização de DNA dot blot (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual. 2'^ld edition [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

Os iniciadores de oligonucleotídeos projetados usando o polinucleotídeo da presente invenção podem ser usados para amplificações de PCR. O polinucleotídeo da presente invenção também pode usado para etiquetar ou identificar um organismo ou material reprodutivo do mesmo. Esta etiqueta pode ser obtida, por exemplo, por introdução estável de um identificador de polinucleotídeo heterólogo, não funcional, não disruptivo, em um organismo, sob o controle do polinucleotídeo da presente invenção.

O promotor proposto para a presente invenção foi obtido seguindo preferencialmente as etapas:

- O material genético das amostras dos possíveis candidatos pode ser realizado segundo os procedimentos descritos por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, e Bedbrook J. 1985. High levei expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418.), ou qualquer procedimento que permita ter acesso ao material genético integro, como por exemplo, os métodos de extração que utilizam solventes orgânicos.

2-0 material isolado dos possíveis candidatos deve ter sua integridade confirmada, como por exemplo, através de técnicas de gel desnaturante, para então servir de molde na formação das novas moléculas de DNA por meio de reações de PCR, ou mesmo RT28/35

PCR caso o molde seja RNA. Recomenda-se o tratamento das amostras com DNAse, como por exemplo, via procedimento descrito nesse documento.

3-0 material genético obtido pode ser utilizado em reações de PCR com primers específicos do gene selecionado, como por exemplo, o gene LTP1, para avaliação da tecido especificidade do mesmo. Os referidos primers podem ser desenhados com auxílio do programa Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S e Skaletsky H.

J. 2000 PrimerS on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386) ou qualquer outro programa e/ processo que forneça primers específicos para os candidatos.

- As reações de PCR podem ser conduzidas em aparato especial para o procedimento, como termociclador MJ Research modelo PTC-100, ou qualquer outro termociclador capaz de desenvolver sua função, em condições idéias para a reação, na qual é sugerida a incubação inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos para desnaturação, 50°C por 40 segundos para hibridização dos oligonucleotídeos e 72°C por 1 minuto para extensão.

- Após o procedimento, as reações devem ser submetidas a um período adicional, na qual se recomenda 10 minutos a 72°C, para complemento da polimerização. E recomendável que cada reação continha lpL de cDNA diluído 1:10, 2,5 U de Taq DNA polimerase e 30 pmoles de oligonucleotídeos iniciadores em um volume final de 50 pL.

- A identidade do produto amplificado pode ser confirmada, como por exemplo, pela migração eletroforética dos fragmentos, na qual se recomenda utilizar como comparação o controle positivo, constituído por um vetor, como por exemplo, um vetor do banco de dados do Projeto Genoma Café (FV2-050) contendo a sequência estudada.

- Após o fracionamento do material genético, as amostras devem ser submetidas ao processo de Northen Blot, o qual se recomenda a transferência do material genético para membrana própria para o procedimento, como por exemplo, a membrana de nylon, e hibridizado em SSPE com sonda correspondente a sequência parcial da suposta LTP marcada, como por exemplo, a marcação com o isótopo 32 do fósforo - P.

- O promotor deve ser isolado por qualquer técnica de isolamento, a qual se recomenda utilizar a técnica de 5'race, aliada à técnica de PCR “nested” simplificada

29/35 pela utilização do Genome Walker Universal Kit (Clontech) segundo especificações do fabricante.

- Os fragmentos provenientes podem ser clonados e sequenciados por processo destinado a esse fim. Recomenda a utilização do método de dideoxinucleotídeo (Sanger, F., Nicklen,S. e Coulson,A.R. 1979. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5468.).

- A caracterização do perfil de expressão do promotor putativo isolado pode ser realizado através da expressão dessa sequência, e variações truncadas provenientes dessa, mas que conservem a função proposta de promotor, em vetores binários, o qual se sugere a utilização do vetor binário do tipo pBl 121 e clonagem nos sítios Hind III e Bam HI de acordo com técnicas padrão de biologia molecular, como por exemplo, a técnica proposta por Sambrook (SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANTATIS, T. Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 608p). Recomenda-se a utilização de controles positivos e negativos para a realização de tais processos.

11-0 processo de transformação deve ser realizado no organismo de interesse, na qual se sugere a planta de fumo - Nicotiana tahacum, utilizando-se como vetor cepas de Agrohacterium tumefaciens, como por exemplo, a cepas de Agrohacterium tumefaciens CV3101 (C58PMP90), utilizando-se qualquer protocolo específico para esse fim, como por exemplo, o proposto por Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., Rogers S.G. and Fraley R.T. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229 1231). A eficiência de transformação dos explantes deve ser avaliada através da expressão transiente e estável nos tecidos dos propágulos regenerados de um gene de interesse, o qual se recomenda a utilização do gene gus.

- A análise de expressão do gene gus deve ser realizada por protocolos de ensaio histoquímico, como por exemplo, conforme adaptação do protocolo descrito por Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. and Bevan M.W. 1987. GUS fusions: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907) em folhas, raízes, frutos, sementes e flores (pétala, gineceu, estame, pólen) das plantas transformadas.

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EXEMPLO

A presente invenção é ainda definida nos seguintes exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma de ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.

Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucléicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Várias soluções utilizadas nas manipulações experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como “agarose”, “TBE”, “miniprep”, etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook, et al. (supracitada).

EXEMPLO 1 - Análise in silico

Os “contigs” do banco de dados do genoma café (VIEIRA, L. G. E. ; ANDRADE, A. C. ; COLOMBO, C. A. ; MORAES, A. Η. A. ; MEHTA, A, ; OLIVEIRA, A. C. ; LABATE, C. A. ; MARINO, C. L. ; MONTEIRO-VITORELLO, C. B, . Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource. Brazilian Journal of Plant Physiology, v. 18, p. 95-108, 2006) foram organizados em 2 grupos contrastantes: fruto e não fruto. Esses dois grupos foram comparados por meio de teste exato de Fisher e o resultado indicou 18 “contigs” preferencialmente expressos em fruto. Em seguida os “contigs” foram analisados quanto à existência ou não de patentes.

EXEMPLO 2 - Validação Experimental

Foi selecionado para validação experimental um “contig” nomeado gene candidato de fruto 1 - CaLTPl por apresentar alto grau de especificidade e alto nível de expressão exclusiva em fruto e por não estar protegido por patente, nem o gene nem seu promotor. Após os ensaios de caracterização e validação ficou claro que se tratava do gene da LTP (Lipid Transfer Protein-Proteína transferidora de lipídio). A validação experimental do gene CaLTPl (gene candidato de fruto 1) foi realizada como descrito

31/35 por meio de ensaios de expressão temporal e espacial utilizando-se as técnicas de: RTPCR (Transcriptase Reverse-PCR); Northern Blot; RT-qPCR.

EXEMPLO 3 - RT-PCR

Para realização dos ensaios de RT-PCR foram extraídas amostras de RNA de raiz, folha e fruto de Coffea arabica cv IAPAR 59, cultivadas no campo experimental da Embrapa Cerrados. O RNA foi extraído segundo a metodologia descrita por Jones (Jones JDG Dunsmuir P, e Bedbrook J. 1985. High levei expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). Em seguida os RN As foram avaliados, quanto sua integridade, em gel desnaturante 1,5 %. As amostras de RNA de raiz, folha e fruto foram usadas como molde na formação de moléculas de cDNA por meio de reações de RT-PCR utilizando-se primers oligo dT. Os cDNAs obtidos foram usados em reações de PCR com primers específicos do gene LTP1 para avaliação da tecido especificidade do mesmo. Para tal, foram desenhados os seguintes oligonucleotídeos específicos com ajuda do programa Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S e Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386):

Primer para fruto n°l: SEQ ID NO 2;

Primer para fruto n°2: SEQ ID NO 3.

As reações foram conduzidas em termociclador MJ Research modelo PTC-100, com incubação inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos para desnaturação, 50°C por 40 segundos para hibridizaçâo dos oligonucleotídeos e 72°C por 1 minuto para extensão. Após os ciclos, as reações foram submetidas a um período adicional de 10 minutos a 72°C para complemento da polimerização. Cada reação continha lpL de cDNA diluído 1:10, 2,5 U de Taq DNA polimerase e 30 pmoles de oligonucleotídeos iniciadores em um volume final de 50 pL. A identidade do produto amplificado foi confirmada pela migração eletroforética dos fragmentos em comparação ao controle positivo, constituído por um vetor do banco de dados do Projeto Genoma Café (FV2-050) contendo a sequência estudada) (Figura 2).

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EXEMPLO 4 - Extração de RNA

Foram extraídas amostras de RNA total de raiz, folha e fruto de Coffea arabica cv IAPAR 59, cultivadas no campo experimental da Embrapa Cerrados, seguindo o protocolo descrito por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, and Bedbrook J. 1985. High levei 5 expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). Depois de extraídos, os RNAs foram fracionados em gel desnaturante 1,5% para análise de sua integridade.

EXEMPLO 5 - Tratamento com DNAse

Os RNAs foram submetidos ao tratamento com a enzima DNAse o qual 10 consistiu em uma reação contendo 10 pg de um dos RNAs, 5 U da enzima DNAse, 2 pL do tampão de reação 10X (200mM Tris-HCl pH 8, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) e água DEPC para completar o volume de 20 pL. A reação foi deixada a 37°C por 10 minutos e depois transferida para o gelo. Após a reação as amostras foram tratadas com o objetivo de inativar a DNAse, ou seja, foi adicionado 180 pL de água DEPC e 200 pL de 15 clorofane (24:24:1 de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, respectivamente). Após misturar algumas vezes, as amostras foram centrifugadas a 12.000 g por 3 minutos. A fase superior (aquosa) foi transferida para novo tubo e adicionado etanol (2,5 vezes o volume da amostra) e NaAc 3M (1/10 do volume da amostra) e deixado a -20°C durante aproximadamente 16 h. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 12.000 g por 40 20 minutos, descartou-se o sobrenadante e o pellet foi lavado com etanol 70% antes de ser ressuspendido em 20 pL de água DEPC. Após tratados, uma alíquota dos RNAs foi colocada em gel de agarose 1,5% para análise de sua qualidade.

EXEMPLO 6 - Síntese de cDNA

A reação de síntese de cDNA foi realizada com 300 ng de RNA, de raiz, folha ou 25 fruto (tratados com DNAse), 2 pL de oligo dT (50 pM), 1 pL de dNTP Mix (15 mM) e água DEPC até completar 13 pL. A reação foi aquecida à 65°C por 5 minutos e depois colocada no gelo por 3 minutos. Em seguida foi adicionado 4 pL de First-Strand Buffer (5X), 1 pL de DDT (0,1 M) e 1 pL de SuperScript III RT (200 U/pL). A reação foi incubada à 50°C por 1 hora e depois a 70°C por 15 minutos para inativar a reação.

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EXEMPLO 7 - RT-qPCR

Amostras de RN A total de raiz, folha e fruto foram tratadas com DNase e convertidas em cDNA. As reações de PCR foram preparadas utilizando-se o reagente SYBR Green e os seguintes oligonucleotídeos específicos:

Primer para fruto n°3: SEQ ID NO 4;

Primer para fruto n°4: SEQ ID NO 5.

As reações foram conduzidas em aparelho do tipo 7500 PCR Systems (Applied Biosystems) de acordo com Bustin, (Bustin SA em Quantification of mRNA using realtime reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems; J Mol Endocrinol (2002) v.29 - p23-39). As análises comparativas foram feitas usando-se o gene da ubiquitina como padrão constitutivo (figura 3).

EXEMPLO 8 - Northern blot

Amostras de RNA total de folha e fruto (estágio verde) foram extraídas de cafeeiro adulto da espécie Coffea arabica variedade Catuaí Amarelo. No caso de raiz, foram utilizadas raízes de plantas com 190 dias que foram germinadas em papel germiteste, transferidas para substrato vegetal (vermiculita - Terral) e cultivadas em casa de vegetação, O método de extração de RNA foi como descrito por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, e Bedbrook J. 1985. High levei expression of introduced chímeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). O RNA foi ífacionado em gel desnaturante 1,5%, transferido a vácuo para membrana de nylon, e hibridizado em SSPE com sonda correspondente a sequência parcial da suposta LTP marcada com P. O resultado obtido na validação experimental por Northern blotting demonstra a expressão fruto-específica do gene (Fig. 4).

EXEMPLO 9 - Isolamento do promotor

O promotor foi isolado por meio da técnica de 5'race, aliada à técnica de PCR “nested” simplificada pela utilização do Genome Walker Universal Kit (Clontech) segundo especificações do fabricante. Para amplificação foram utilizados os seguintes primers:

I^a reação:

34/35

Primer para I^a reação forward: SEQ ID NO 6;

Primer para I^a reação reverse: SEQ ID NO 7.

2a reação:

Primer para 2^a reação forward: SEQ ID NO 8;

Primer para 2^a reação reverse: SEQ ID NO 9.

Os fragmentos obtidos (figura 5) foram clonados e sequenciados pelo método de dideoxinucleotídeo (Sanger,F., Nicklen,S. and Coulson,A.R. 1979. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5468).

EXEMPLO 10 - Obtenção de vetores binários

A fim de caracterizar o perfil de expressão do promotor putativo isolado, foram confeccionados 4 vetores binários contendo a versão completa do promotor de CaLTPl, que é um fragmento de 1,2 Kb e 3 versões truncadas de 451 pb, 785 pb e 1,0 Kb. Para tal, os fragmentos foram clonados em vetor binário do tipo pBI 121 nos sítios Elind III e Bam HI de acordo com técnicas padrão de biologia molecular (SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T, Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2, ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 608p).

EXEMPLO 11 - Transformação de fumo com vetores binários

Os vetores binários confeccionados conforme o item anterior foram utilizados na transformação de plantas de fumo. Cepas de Agrobacterium tumefaciens CV3101 (C58PMP90), foram transformadas independentemente com as 4 construções citadas no item anterior, assim como com o controle positivo pBI 121 original segundo Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., Rogers S.G. and Fraley R.T. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 12291231). Após essa etapa, secções foliares (explantes) de Nicotiana tabacum foram imersas em suspensão bacteriana contendo o vetor binário por 5 minutos. Em seguida, os discos foram colocados em papel de filtro para eliminar o excesso de bactérias e incubados em meio para co-cultivo durante 48 horas (Trinca, S,; De Pace C.; Caccia, R.; Mugnozza, G.S.; Dodds, J.FL Jaynes, J. Transformation of potato (Solanum tuberosum L.) leaf disc using A. tumefaciens transfer DNA sequences coding for lytic peptides. Molecular methods for potato improvement. Lima: C1P, 1991. 85p). Após o co-cultivo,

35/35 os explantes foram colocados em meio de seleção (meio de co-cultivo suplementado com 50 mg.L-1 de canamicina e 50 mg. L-l de cefotaxima). A eficiência de transformação dos explantes foi avaliada pela expressão transiente e estável do gene gus nos tecidos dos propágulos regenerados.

EXEMPLO 12 - Análise da expressão de gus

O fragmento promotor de 451 pares de base é capaz de comandar a expressão do gene repórter gus somente na semente das plantas de fumo (figura 7). A análise da expressão de gus foi feita por ensaio histoquímico conforme adaptação do protocolo descrito por Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. and Bevan M.W. 1987. GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907) em folhas, raízes, frutos, sementes e flores (pétala, gineceu, estame, pólen) de plantas transformadas com o promotor de 451pb e os controles positivos e negativos. Os cortes foram feitos a mão com o auxílio de bisturi e as amostras foram imersas no tampão de reação que consiste em: 1 mM X-gluc (5-bromo15 4-chloro-3-indolyl-P-D-glucuronide cyclohexylammonium salt), 10 mM de EDTA, 0.5 mM de ferricianeto de potássio, e 0.5 mM de ferrocianeto de potássio, Triton X-100 0,1%, em 100 mM de NaH2PO4. H2O. Ajustou-se o pH da solução para 7,0 com NaOH e filtrou-se em capela. Depois do passo de 15 minutos de infiltração à vácuo (5 mmHg) as amostras foram incubadas a 37°C overnight.

1/2

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um gene quimérico caracterizado por compreender:

   a) um polinucleotídeo cuja seqüência seja SEQ ID NO 1, opcionalmente ligado a seqüências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a

   b) uma seqüência de polinucleotídeo heteróloga de interesse.
2. 2. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da seqüência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.
3. 3. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da seqüência de polinucleotídeo de interesse poder estar na orientação sense ou antisense.
4. 4. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato das seqüências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16 , entre outros.
5. 5. Um vetor recombinante caracterizado por conter um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1.
6. 6. Um vetor recombinante caracterizado por compreender:

   a) um polinucleotídeo cuja seqüência seja SEQ ID NO 1, opcionalmente ligado a seqüências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a

   b) uma seqüência de polinucleotídeo heteróloga de interesse; e

   c) uma seqüência de terminação.
7. 7. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato da seqüência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.
8. 8. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato da seqüência de terminação ser selecionada do grupo consistindo de sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da

   Petição 870180034371, de 27/04/2018, pág. 4/11

   2/2 beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.
9. 9. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato das seqüências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16 , entre outros.
10. 10. Método para modificar a expressão de genes em um organismo caracterizado por incorporar estavelmente no genoma do organismo um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
11. 11. Método de acordo com reivindicação 10 caracterizado pelo fato do organismo ser uma planta.
12. 12. Método para produzir uma planta tendo a expressão de um gene modificada caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas:

    a) transformar uma célula de planta, tecido, órgão ou embrião um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4;

    b) selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;

    c) regenerar plantas maduras de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);

    d) selecionar plantas maduras da etapa (c) tendo a expressão do gene modificada quando comparada com uma planta não transformada.

    Petição 870180034371, de 27/04/2018, pág. 5/11

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    ANÁLISES IN SILICO

    Banco de dados do Genoma Café

    GENES CANDIDATOS FRUTOESPECÍFICOS PUTATIVOS

    VALIDAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO EXPERIMENTAL

    RT-PCR, Northern Blote RT-qPCR

    GENE CANDIDATO

    ISOLAMENTO DO PROMOTOR E OBTENÇÃO DE FRAGMENTOS

    TRUNCADOS

    Método Genome Walker

    ANÁLISE INSILICO DAS SEQUÊNCIAS PROMOTORAS

    Banco de dados Plant Care e PLACE^^

    O

    CLONAGEM EM VETOR BINÁRIO pBH21

    TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA MODELO via Agrobacteríum tumefacíens em Nicotiano tabacum

    ENSAIO DE EXPRESSÃO DO GENE REPÓRTER uidA

    Ensaio histoquímico

    AVALIAR A FUNCIONALIDADE DOS PROMOTORES

    Ensaios fluorimétricos

    FIGURA 1

    FIGURA 2

    2/5

    203,01 109,86 29497,49

    FIGURA 3

    Fo

    Fr

    3/5

    FIGURA 4

    FIGURA 5 i

    I i

    FIGURA 6

    4/5

    FIGURA 7

    5/5

    FIGURA 8