MX2014012167A - Composiciones y metodos para modificar la expresion de genes de interes. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una secuencia promotora específica para la expresión de genes de interés en el endosperma del fruto. La invención también describe construcciones de ADN que contienen el promotor, así como un método que utiliza estas construcciones para producir plantas, células de planta o protoplastos transgénicos. La expresión del transgén exclusivamente en el órgano de interés, permite que la transcripción exógena se acumule sólo en el fruto y es ventajoso sobre la expresión constitutiva, ya que facilita la implementación de estrategias que tengan el propósito de obtener cultivares con un mayor valor agregado, tal como: la adaptación al estrés ambiental, resistencia a patógenos, plagas y agroquímicos, incremento en el valor nutricional y terapéutico, y una nueva alternativa de sistemas de expresión en plantas, para generar cultivares más competitivos a costos más bajos. Además, la presente invención también describe una secuencia con expresión constitutiva, la cual ofrece una alternativa para implementar sistemas de expresión cuando la expresión constitutiva es requerida. El objetivo de la invención es incrementar los beneficios económico, social y ambiental, así como la bioseguridad asociados con la transformación genética.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA MODIFICAR LA EXPRESION DE GENES DE INTERES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al campo de la bioteenología. Más específicamente, la presente invención se refiere a un promotor específico para la expresión de genes de interés en el endosperma de frutos. La invención también describe construcciones de ADN que contienen el promotor de la invención ligado de manera operable a un gen heterólogo y/o endógeno. Además, la presente invención se refiere al uso de estas construcciones en forma de vectores de expresión, vectores recombinantes y en plantas, células vegetales o protoplastos transgénicos. La presente invención también describe un método que utiliza tales construcciones que contienen el promotor de la invención, para la producción de plantas, células vegetales o protoplastos transgénicos. De esta manera, la expresión del transgén solamente en la parte de interés, permite la acumulación de la transcripción exógena solamente en el fruto, lo cual favorece la implementación de estrategias con el propósito de aumentar el valor agregado, la generación de cultivares más adaptados al estrés ambiental, a patógenos y plagas, agroquímicos, además de plantas con alto valor nutricional y alto valor terapéutico. Además de estas ventajas, la presente invención es una nueva alternativa de Ref. 251611 sistemas de expresión en organismos vegetales, que se puede utilizar para la generación de nuevos cultivares y para programas de mejoramiento. La presente invención tiene como objetivo incrementar los beneficios económicos, sociales y ambientales, además de los beneficios de bioseguridad, asociados con la transformación genética.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En las últimas tres décadas, la agricultura ha sido beneficiada por la bioteenología a la cual se asocia la tecnología del ADN recombinante, el cultivo de tejidos vegetales y los métodos de mejoramiento clásicos para generar plantas resistentes a herbicidas (Aragao, F.J.L., Vianna, G. R., Albino, M.M.C. & Rech, E.L. 2002 Transgenic Dry Bean Tolerant to the Herbicide Glufosinate Ammonium. Crop Science, v. 42, n. 4, p.1298-1302), a plagas de insectos (Lillcy C. J., Wang D., Atkinson H. J & Urwin P. E.2010 Effective delivery of a nematode-repellent peptide using Plant Biotechnology Journal, pp. 1-11 doi: 10.1111/j.1467-7652.2010.00542.x, a root-cap-specific promoter) y resistentes a las sequías (Quan R, Hu S, Zhang Z, Zhang H, Zhang Z, Huang R. Overexpression of an ERF transcription factor-TSRFl improves rice drought tolerance. Plant Biotechnol J.2010 May 1; 8(4):476-88), además de plantas con alto valor nutricional (Aluru, M., Xu, Y., Guo, R., Wang, Z., Li, S., White, W., Wang, K. & Rodermel, S.2008 Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content. J. Exp. Bot., v.59, n.3, p. 3551-3562) y de alto valor terapéutico (Marcondes, J. & Hansen, E.2008 Transgenic lettuce seedlings carrying hepatitis B virus antigen HBsAg. Braz. J. Infect. Dis., v. 12, n.6, p. 469-471). Sumadas, estas características dan como resultado el aumento de la producción, ganancias económicas, mejoría de la calidad de vida de la población y conservación del medio ambiente. Por medio de la téenica de manipulación transgénica, es posible la introducción de genes de interés, independientemente de las barreras interespecíficas.

A pesar de los beneficios económicos, sociales y ambientales relacionados con la transformación genética, esta tecnología se tornó preocupante por parte de los consumidores y ambientalistas, debido a cuestiones de bioseguridad.

La información de la literatura técnica señala la evolución en la aplicación de la transformación genética, de acuerdo con el surgimiento de varias generaciones de transgénicos. La primera y segunda generación de plantas transgénicas utilizan promotores constitutivos, tales como el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H.1985 Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v.313, p.810-812), promotores de genes encontrados en el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens , como por ejemplo el promotor del gen de la enzima nopalina sintetasa (Bevan, M. W., Barnes W. M. & Chilton, M. D.1983 Structure and transcription of the nopaline syntase gene región of T-DNA. Nucleic Acids Research, v.11, no.2, p.369-385) y promotores de genes que codifican para proteínas altamente conservadas e involucradas en procesos vitales de prácticamente todos los organismos, tales como la ubiquitina (Toki S., Takamatsu S., Nojiri C., Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A.H., Quail P.H. & Uchimiya H.1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants. Plant Physiol. Nov; 100(3):1503-7) y la actina (An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinncy E.C., Chambliss S. & Meagher R.B.1996 Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Jul; 10(1):107-21). Mientras tanto, la tercera generación de plantas transgénicas se caracteriza, entre otros aspectos, por la utilización de promotores específicos de tejido, tales como promotores específicos de células epidérmicas (Hooker T.S., Millar A.A. & Kunst L. 2002. Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis . Plant Physiol. Aug; 129(4):1568-80), de floema (Okumoto S., Koch W., Tegeder M., Fischer W.N., Biehl A., Leister D., Stierhof Y.D. & Frommer W.B. 2004. Root phloem-specific expression of the plasma membrane amino acid proton co-transporter AAP3. J Exp Bot. Oct; 55(406):2155-68), de polen (Wakeley PR, Rogers HJ, Rozycka M, Greenland AJ, Husscy PJ. A maize pectin methylesterase-like gene, ZmC5, specifically expressed in pollen. Plant Mol Biol. 1998 (May; 37(1):187-92) o inducidos por estrés biótico (Himmelbach A., Liu L., Zierold U., Altschmied L., Maucher H., Beier F., Müller D., Hensel G., Heise A., Schützendübel A., Kumlehn J. & Schweizer P.2010. Promoters of the barley germin-like GER4 gene cluster enable strong transgene expression in response to pathogen attack. Plant Cell.2010. Mar; 22(3):937-52. Epub Mar 19), abióticos (Rai M., He C. & Wu R.2009. Comparative functional anaylisis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgenic Res. Oct; 18(5):787-99) y químicos (Tomsett, A. Tregova, A. Garoosi y M. Caddick, Ethanol-inducible gene expression first step towards a new green revolution?, Trends Plant Sci.9 (2004), pp.159-161), para promover la expresión del transgén de manera puntual y solamente cuando sea necesario.

La obtención y disponibilidad de promotores capaces de limitar la expresión génica temporal y/o espacialmente, puede ser una de las maneras de equilibrar los beneficios de la manipulación genética y sus restricciones.

Un promotor es un conjunto de módulos de control de transcripción, organizados en torno al sitio de inicio de la enzima ARN polimerasa II (Potenza, C.; Alemán, L. & Sengupta-Gopalan, C.2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In vitro Cellular Development Biological-Plant v. 40, p. 1-22), los cuales contienen secuencias específicas reconocidas por las proteínas involucradas en la transcripción. En la literatura téenica se han descrito diferentes clases de promotores, con base en su perfil de expresión. Entre ellas están los promotores constitutivos, los cuales son activos en todos los tejidos y en todas las fases del desarrollo del organismo, tales como por ejemplo, el promotor CaMV35S (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985. Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812). Ahora bien, los promotores específicos de tejido/órgano promueven la expresión de su gen correlacionado solamente en su tejido/órgano blanco tal como el fruto (Atkinson R.G., Bolitho K.M., Wright M.A., Iturriagagoitia-Bueno T., Reid S.J. & Ross G.S.1998 Apple ACC-oxidase and polygalacturonase: ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato. Plant Mol Biol. Oct; 38(3):449-60), la semilla-grano (Paine J.A., Shipton C.A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy M.J., Vernon G., Wright S.Y., Hinchliffe E., Adams J.L., Silverstone A.L. & Drake R.2005. Improving the nutritional valué of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat Biotechnol. Apr; 23(4):482-7), la raíz/tubérculos (Visser R.G., Stolte A. & Jacobsen E. 1991. Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants. Plant Mol Biol. Oct; 17(4):691-9), las flores (Annadana S., Beekwilder M.J., Kuipers G., Visser P.B., Outchkourov N., Pereira A., Udayakumar M., De Jong J. & Jongsma M.A.2002. Cloning of the chrysanthemum UEP1 promoter and comparative expression in florets and leaves of Dengranthema grandiflora . Transgenic Res. Aug; 11(4):437-45), y las hojas (Nomura M., Katayama K., Nishimura A., Ishida Y., Ohta S., Komari T., Miyao Tokutomi M. Tajima S. & Matsuoka M.2000. The promoter of rbcS in a C3 plant (rice) directs organ-specific, light-dependent expression in a C4 plant (maize), but does not confer bundle sheath cell-specific expression. Plant Mol Biol. Sep, 44(1):99-106). También existen los promotores de respuesta o inducibles, los cuales son activados mediante una determinada situación, en respuesta al estrés biótico, abiótico o químico. Los promotores aislados a partir de un organismo dado, se pueden utilizar para regular un gen de otro organismo por medio de construcciones genéticas quiméricas.

Existen innumerables promotores específicos de tejido descritos para las plantas, como es el caso de la expresión específica en la semilla (WO8903887), en el tubérculo (como el mencionado en la Solicitud de Patente US20030175783, Keil et al . , 1989 EMBO J.8: 1323:1330), las hojas (como el mencionado en la Solicitud de Patente US20030175783, Hudspeth et al . , 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), el tallo (como el mencionado en la Solicitud de Patente Us20030175783, Keller et al . , 1988 EMBO J.7: 3625-3633), tejidos vasculares (como el mencionado en la Solicitud de Patente US20030175783, Peleman et al . , 1989 Gene 84: 359-369 y Schmülling et al . (1989) Plant Cell 1, 665-670), la raíz (US20060143735, y como el mencionado en la Solicitud de Patente US20030175783, Keller et al . , 1989 Genes Devel.3:1639-1646), el estambre (O8910396, W09213956), promotores específicos de la zona de dehiscencia (W09713865), del meristema (Ito et al . (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878) y del fruto (Edwards y Coruzzi (1990) Annu. Rev. Genet. 24, 275 a 303 y US5753475), siendo que en este último documento, la secuencia presentada tiene acción específica en el pericarpio del fruto.

En la presente invención, se presenta un promotor aislado a partir del café ( Coffea spp), específico del endosperma del fruto. El endosperma es la parte consumida del grano, de gran interés económico, y la posibilidad de expresar una proteína de interés específicamente en el endosperma, es útil en la introducción de características relacionadas con la calidad nutricional, características organolépticas, y presenta ventajas en la etapa posterior a la cosecha. En la actualidad, los promotores utilizados en la obtención de productos transgénicos comerciales, a menudo son constitutivos y promueven la expresión del transgén en todos los tejidos de la planta y en todas las fases del desarrollo. Esta característica produce desgaste energético en la planta, ya que ocurre un desperdicio metabólico en la producción de una proteína en cantidades y lugares en que no es necesaria y esto puede causar disminución en la productividad. Además, es deseable desde el punto de vista comercial, agregarle valor a cultivos económicamente importantes tales como el caso del arroz dorado, rico en b-caroteno (Bcyer P. Golden Rice and 'Golden' crops for human nutrition.2010. May 15.N Biotechnol. {Epub ahead of print}. http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B8JG 4-5033Y3B-2&_user=7430124&_coverDate=05%2F15%2F2010&_rdoc=l%_ fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C00001 2878&_version=l&_urlVersion=0&_userid=7430124&md5=a9c6d210db8 6be4e6946fOf\f69766c0). Otro aspecto importante es la facilidad de realizar pruebas de bioseguridad una vez que la expresión del gen ha sido restringida a un solo órgano.

El uso cada vez más frecuente de la manipulación genética transgénica como recurso para resolver problemas de cultivos económicamente importantes, ocurre porque la manipulación transgénica permite la incorporación de características deseables de una manera dirigida, independientemente de las barreras entre especies.

La mayoría de las plantas transgénicas lanzadas al mercado, hasta la fecha utilizan promotores constitutivos, cuyo producto es expresado en todos los tejidos del organismo. Otro factor limitante es la dependencia teenológica, ya que el uso de los promotores actualmente disponibles está protegido por patentes. La invención aquí propuesta también se puede considerar como una alternativa a regiones promotoras ya existentes, principalmente en cultivares y programas de mejoramiento.

El campo agronómico actual tiene impacto promovido por el cambio climático, el cual causa serios desequilibrios en el medio ambiente y en la agricultura, y por el aumento de población, que es un factor que genera desequilibrio ambiental por la demanda de espacio para incrementar la producción agrícola. Para mitigar estos impactos es necesario el manejo sustentable de los recursos naturales como el agua y el espacio, y también de las adversidades como la sequías, plagas y patógenos. De esta manera, se deben desarrollar plantas más adecuadas a este escenario y la manipulación transgénica es una herramienta que acelera la obtención de estos cultivares.

El documento PI0209551-3 presenta una invención que se refiere a una secuencia nucleotídica derivada de las hojas del café, que se puede emplear como promotor para una expresión inducible de genes en plantas. Particularmente, la referida invención se refiere a una secuencia nucleotídica que abarca el promotor y la región de codificación de un gen rbcS. De modo diferente, la invención propuesta en el presente documento se refiere a un promotor específico para frutos y además constituye una alternativa a procesos transgénicos, particularmente en organismos vegetales.

Los documentos WO0151637 y W00302939 se refieren a promotores aislados de Fragaria vesca - fresa, que dirigen selectivamente la expresión de secuencias de ADN puestas bajo el control del mismo, en los frutos de plantas. Cuando se comparan con la presente invención, se nota que las secuencias de los promotores descritos en las patentes anteriormente mencionadas, fueron aisladas de Fragaria vesca - fresa. La propuesta revelada en el presente documento, tiene como ventaja su utilización para la generación de cultivares y/o en programas de mejoramiento en diversos organismos vegetales, incluyendo los que pertenecen al género Coffea ssp, una vez que se obtuvo el aislamiento de ese mismo género. Además, el promotor propuesto presenta una alternativa para la creación de organismos vegetales que expresan los transgenes.

A su vez, la Patente KR100797644, se refiere a un promotor de expresión específico en frutos, derivado de Citrus unshiu - fruto cítrico de origen japonés. El promotor se proporciona para inducir su expresión en el periodo de maduración tardío en frutos, expresar eficientemente un gen exógeno en frutos y controlar su expresión, de modo que se produzcan de manera eficiente plantas transgénicas. La ventaja al utilizar la invención propuesta por nuestro grupo, se presenta particularmente en cultivares del género Coffea ssp o también en programas de mejoramiento de este género, por tratarse de una región amortiguadora presente en el propio género. También se presenta una alternativa para la creación de organismos vegetales que expresan transgenes, como el anteriormente mencionado.

El documento de Patente W02010093175, presenta un promotor de expresión específico, del gen HR7; en cuanto al documento de Patente W02010012848, se refiere a una secuencia promotora denominada FSP1 situada en la región 5' del ADN del gen Snl, ambos derivados del Solanum lycopersicum - jitomate. De conformidad con el documento, un gen introducido a partir de una planta transformada, puede ser expresado específicamente en tejido de flores y frutos, en comparación con el uso convencional, tal como por ejemplo, el promotor del virus del mosaico de la coliflor - CaMV 35S. A pesar de ser un promotor específico que se puede usar para la expresión en frutos, presenta como desventaja en relación con el promotor de la presente, la imposibilidad de ser utilizado como promotor nativo del género Coffea spp y/o en programas de mejoramiento de este mismo género.

A su vez, las invenciones descritas en los documentos CN1298021 y W02005026366, se refieren a secuencias para dirigir la expresión de un gen de interés, al endosperma. Mientras tanto, éstas mismas se derivan de las secuencias controladoras 5' del gen waxy y del gen de la glutelina GluD-1, respectivamente, del arroz, los cuales presentan las mismas desventajas citadas en el párrafo anterior, referentes al género Coffea spp.

La invención que se describe en el documento de Patente US2007169226, se refiere a métodos y reactivos para la expresión de genes amortiguados temporalmente y/o espacialmente, en especial en semillas de plantas y tejidos reproductores femeninos relacionados. Entre tanto, las composiciones comprenden nuevas secuencias de nucleótidos para un promotor que se sabe que controla la expresión en semillas, del gen conocido como eepl y no en frutos específicamente. Además, la secuencia no es específica para Coffea spp.

De manera muy similar al documento anterior, el documento de Patente W02008040061, revela una secuencia de ácidos nucleicos aislados que comprende una secuencia nucleotídica que corresponde a una región promotora activa de una secuencia de ADN. Aún así, la secuencia de ácido nucleico aislada y derivada de un grano de cereal, tiene las mismas desventajas referentes al uso del promotor en el género Coffea spp y en los programas de mejoramiento del género referido.

Aún de manera semejante, los documentos de Patente US2009089897 y US2010037347, proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias nucleot ídicas en plantas, en donde las nuevas composiciones son secuencias nucleotídicas para promotores de tejidos que son aislados del sorgo.

El documento de Patente W02010118477, a su vez, proporciona composiciones que comprenden secuencias promotoras operables en plantas, aisladas de Triticum aestivum - trigo, y sus variantes, que confieren expresión selectiva/específica de genes específicos, en especial en el endosperma, siendo, por lo tanto, diferentes y no presentando las ventajas de las secuencias de la presente invención, en relación con el género Coffea spp.

La Patente US7071378 y la Solicitud de Patente W02005026366, revelan en su contenido secuencias nucleotídicas promotoras aisladas, respectivamente, de Zea mays - maíz y Hordeum vulgare - cebada, las cuales permiten la expresión de secuencias codificadoras que pueden estar ligadas a, o que son específicas, la región de endosperma.

Ante lo explicado, la presente invención se refiere a una nueva secuencia promotora específica del endosperma, para la expresión de un gen de interés exclusivamente en el fruto. Además de presentar ventajas como la expresión dirigida solamente el endosperma en los frutos, y al ser utilizadas en cultivares de Coffea spp y programas de mejoramiento de este mismo género, la invención proporciona una nueva alternativa para sistemas de expresión en plantas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un nuevo promotor para la expresión específica de un gen en el endosperma de frutos. De esta manera, la expresión del transgén solamente en una parte de interés, permite la acumulación de la transcripción exógena solamente en el fruto, lo cual favorece la implementación de estrategias con el propósito de aumentar el valor agregado, la generación de cultivares más adaptados al estrés ambiental, a patógenos y plagas, a agroquímicos, además de organismos vegetales con un alto valor nutricional y alto valor terapéutico. Además de estas ventajas, la presente invención proporciona una nueva alternativa de sistemas de expresión en organismos vegetales, que se pueden utilizar para la generación de nuevos cultivares y en programas de mejoramiento. La presente invención tiene como objetivo incrementar los beneficios económicos, sociales y ambientales, además de la bioseguridad, relacionados con la transformación genética.

En una primera modalidad, la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 1; la secuencia inversa de la SEQ ID NO: 1; sondas e iniciadores que corresponden a la SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, la presente invención proporciona genes quiméricos que comprenden el polinucleótido de la presente invención, por sí solo o en combinación con uno o más polinucleótidos conocidos, junto con células y organismos que comprenden estos genes quiméricos.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona vectores recombinantes que comprenden, en dirección de 5' a 3', una secuencia de promotor de polinucleótido de la presente invención, un polinucleótido por ser transcrito, y una secuencia de terminación de genes. El polinucleótido por ser transcrito puede comprender un marco de lectura abierta de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés, o puede ser una región de no codificación, o no traducida, de un polinucleótido de interés. La matriz de lectura abierta puede estar orientada en una dirección de "sentido" o en una dirección de "antisentido". De preferencia, la secuencia de terminación de genes es funcional en una planta huésped. Más preferiblemente, la secuencia de terminación de genes es la del gen de interés, pero pueden ser otras descritas en la téenica (véase Benjamín Lewin, Genes VIII, Capítulo 9) tales como el terminador de la nopalina sintetasa de A. turne fasciens . Los vectores recombinantes también pueden incluir un marcador para la identificación de las células transformadas.

En otro aspecto, se proporcionan células de plantas transgénicas que comprenden el vector recombinante de la presente invención, junto con organismos tales como plantas. que comprenden estas células transgénicas, y frutos, semillas y otros productos derivados o progenie de estas plantas. Los propágulos de las plantas transgénicas de la presente, también están incluidos en la invención.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para modificar la expresión de genes en un organismo, tal como una planta, incluyendo la incorporación estable en el genoma del organismo que contiene el vector recombinante de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un organismo transformado, tal como una planta, que tiene la expresión de un polipéptido modificada. Este método comprende transforma una célula de planta con el vector recombinante de la presente invención, para obtener una célula transgénica bajo condiciones que conduzcan a la regeneración y crecimiento de la planta madura.

Además, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para identificar un gen responsable de la función de un fenotipo deseado. El método comprende: 1) la transformación de una célula vegetal que contiene un vector recombinante que comprende una secuencia promotora de polinucleótidos de la presente invención, ligada de manera operable a un polinucleótido por ser probado, 2) cultivar la célula vegetal bajo condiciones que conduzcan a la regeneración y crecimiento de la planta madura, de modo que se obtenga una planta transgénica; y 3) comparar el fenotipo de la planta transgénica con aquél de plantas no transformadas, o de tipo silvestre.

Las modalidades anteriormente mencionadas y otras adicionales de la presente invención, y los modos de obtención, serán tornarán evidentes y la invención será entendida mejor con referencia a la "Descripción Detallada de la Invención".

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Diagrama de flujo que presenta las etapas involucradas en el desarrollo del promotor específico de endosperma.

Figura 2. Fraccionamiento electroforático de los fragmentos específicos representantes de la secuencia de CaLTPl. (+) control positivo, (R) ADNc de raíz, (Fr) ADNc del fruto y (Ho) ADNc de la hoja.

Figura 3. Gráfica representativa del perfil de expresión de LTP1 en la raíz, las hojas y el fruto, en relación con el gen de la ubiquitina.

Figura 4. Validación de la expresión preferencial del LTP1 en el fruto, por inmunoelectrotransferencia tipo Northern (Northern blot). Gel desnaturalizante 1.5% con muestras de raíces, hojas y frutos de Coffea arabica 120 días después del florecimiento. R: raíz, Ho: Hoja y Fr: Fruto.

Figuras 5A y 5B. Fraccionamiento electroforético de los fragmentos obtenidos por medio de la téenica 5'race. M = marcador - escalera de 1 Kb, 1/1M - biblioteca Dral, 2/2M -biblioteca Eco RV, 3/3M - biblioteca PvuII y 4/4M - biblioteca Stul.

Figura 6. Esquema que detalla la reconstrucción del vector binario PBI121. El vector PBI121 tiene 12,800 pb de compartimento y su número de acceso en Gen Bank es AF485783. La construcción de interés se obtuvo por medio de la sustitución del promotor CaMV 35S (835 pb) por el fragmento de 451 pb referente al promotor CaLTPl.

Figura 7. Reconstrucción del vector binario PBI121. El vector BPI121 tiene 12,800 pb de compartimento y su número de acceso en Gen Bank es AF485783. La construcción de interés se obtuvo por medio de la sustitución del promotor CaMV 35S (835 pb) por el fragmento de 451 pb referente al promotor CaLTPl.

Figuras 8A-8F. Localización de la actividad de GUS en plantas de tabaco transformadas con el promotor PBI. Las figuras 8A, 8B, 8C, 8D; e 81, 8J, 8K, 8L representan los controles negativo y positivo (PBI 121) del experimento, respectivamente. 8A, 8E y 81 representan tejidos foliares y radiculares; 8B, 8F y 8J cortes transversales de frutos; 8C, 8G y 8K semillas; 8D, 8H y 8L estambre, pétalos y gineceo. 8E, 8F, 8G y 8H representan la actividad del promotor CaLTPl. Se puede observar el diagnóstico de reacción solamente en las semillas (G) de plantas que contienen el promotor específico del endosperma.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un promotor específico de endosperma para la expresión de un gen de interés, solamente en el fruto del organismo vegetal transgénico.

En la siguiente descripción, se utiliza un número de términos exclusivamente. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de la invención.

Un "gen quimérico" es un gen comprendido de un promotor y una región codificadora de diferentes orígenes. En el caso de la presente invención, el gen quimérico comprende el polinucleótido de la presente invención ligado a regiones codificadoras de genes endógenos y/o exógenos.

Una "secuencia consensual" es una secuencia artificial en la cual la base en cada posición representa una base frecuentemente más encontrada en la secuencia actual, en comparación con los diferentes alelos, genes u organismos.

Un "promotor" es aquella porción del ADN por encima de la región codificadora, que contiene sitios de ligamiento para la ARN polimerasa II, para iniciar la transcripción del ADN.

La "expresión" es la transcripción o traducción de un gen estructural, endógeno o heterólogo.

Una "caja GC" es un elemento común en un promotor, que puede aumentar la actividad del mismo.

Una "caja TATA" es un elemento en el promotor, localizado aproximadamente 30 bases por arriba del sitio de inicio de la transcripción. La caja TATA está asociada con factores de transcripción en general, incluyendo la ARN polimerasa II.

El término "gen" significa una unidad física y funcional de herencia, representada por un segmento de ADN que codifica para una proteína funcional o una molécula de ARN.

Un "gen endógeno", es un gen propio de la célula o del organismo.

Un "gen heterólogo" es un gen aislado de un organismo donador y recombinado en un organismo receptor transformado. Es un gen que no es propio de la célula o del organismo.

Un "gen reportero" es una unidad codificadora cuyo producto es fácilmente probado, por ejemplo, genes CAT, GUS, GAL, LUC y GFP. La expresión de un gen reportero puede ser usada para probar la función de un promotor ligado a ese gen reportero.

El término "propágulo" tal como se utiliza en la presente invención, significa cualquier parte de una planta que pueda ser utilizada en la reproducción o propagación, sexual o asexual, incluyendo las mudas.

El término "sentido" significa que la secuencia de polinucleótido está en la misma orientación de 5' a 3', con respecto al promotor.

El término "antisentido" significa que la secuencia del polinucleótido está en orientación contraria en relación a la orientación de 5' a 3' del promotor.

Tal como se utiliza en la presente, el término "x-mero", como referencia a un valor específico de "x", se refiere a una secuencia que comprende por lo menos un número específico ( "x") de residuos del polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 1. De acuerdo con las modalidades preferidas, el valor de x de preferencia es de por lo menos 20, más preferiblemente de por lo menos 40, todavía más preferiblemente de por lo menos 60 y más preferiblemente por lo menos de 80. Así mismo, los polinucleótidos de la presente invención, comprenden un polinucleótido de 20 meros, 40 meros, 60 meros, 80 meros, 100 meros, 120 meros, 150 meros, 180 meros, 220 meros, 250 meros, 300 meros, 400 meros, 500 meros ó 600 meros, identificado como SEQ ID NO: 1 y variantes de los mismos.

El término "polinucleótido(s) ", tal como se utiliza en la presente, significa un polímero de un solo filamento de pares de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, e incluye las correspondientes moléculas de ARN y ADN, incluyendo moléculas de ARNHn y ARNm, de filamentos tanto en "sentido" como en "antisentido", y comprende ADNc, ADN genómico, y ADN recombinante, así como polinucleótidos completa o parcialmente sintetizados. Una molécula de ARNHn contiene intrones y corresponde a una molécula de ADN en un modo generalmente de uno a uno. Una molécula de ARNm corresponde a una molécula de ADN y ARNHn de la cual los intrones fueron escindidos. Un polinucleótido puede consistir de un gen completo, o de cualquier porción del mismo. Los polinucleótidos de "antisentido" operables, pueden comprender un fragmento del polinucleótido correspondiente, y la definición de "polinucleótido" incluye también todos esos fragmentos antisentido operables. Los polinucleótidos antisentido y téenicas para desarrollarlos, son bien conocidos en la técnica (Sambrook, J.; E.F. Fritsch y T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Los polinucleótidos descritos en la presente invención, de preferencia tienen una pureza cercana al 80%, más preferiblemente una pureza de por lo menos aproximadamente 90%, y todavía más preferiblemente, una pureza de al menos aproximadamente 99%.

El término "oligonucleótido", se refiere a un segmento relativamente corto de una secuencia de polinucleótido, que comprende generalmente entre 6 y 60 nucleótidos. Estos oligonucleótidos pueden ser utilizados como sondas o iniciadores ("cebadores"), en donde las sondas se pueden utilizar en pruebas de hibridación y los iniciadores se pueden utilizar en la amplificación de ADN mediante la reacción de polimerasa en cadena.

El término "sonda" utilizado en la presente invención, se refiere a un oligonucleótido, polinucleótido o ácido nucleico, siendo ADN o ARN, que se presenta naturalmente como en una digestión con enzimas de restricción purificadas, o producidas sintéticamente, que es capaz de aparearse con, o hibridizarse específicamente con, un ácido nucleico que contiene secuencias complementarias a la sonda. Una sonda también puede ser de cadena simple o de cadena doble. El complemento exacto de la sonda dependerá de múltiples factores, incluyendo la temperatura, el origen de la sonda y el uso del método. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, la sonda oligonucleotídica típicamente contiene de 15 a 25 ó más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos. Las sondas en la presente se seleccionan para ser complementarias para diferenciar cadenas de una secuencia de ácido nucleico particular. Esto significa que la sonda puede ser suficientemente complementaria para ser capaz de "hibridizarse específicamente" o aparearse con sus respectivas cadenas blanco, bajo una serie de condiciones previamente determinadas. En consecuencia, la secuencia de la sonda no necesita reflejar exactamente la secuencia complementaria del blanco u objetivo. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede ser ligado al final del extremo 5' ó 3' de la sonda, siendo el resto de la secuencia de la sonda complementario a la cadena blanco. Alternativamente, se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias largas no complementarias dentro de la sonda, si ésta tiene una suficiente complementariedad con la secuencia de ácido nucleico blanco, para aparearse específicamente con ella.

El término "cebador" tal como se utiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido, siendo ARN o ADN de cadena simple o doble, derivado de un sistema biológico, generado a través de la digestión con enzimas de restricción, o producido sintéticamente, el cual cuando se coloca en un ambiente apropiado, es capaz de actuar funcionalmente como iniciador de una síntesis de ácido nucleico dependiente del molde. Cuando se presenta con un molde de ácido nucleico apropiado, precursores de trifosfatos de nucleótidos adecuados de ácidos nucleicos, una enzima polimerasa, cofactores adecuados y condiciones tales como la temperatura y pH adecuados, el cebador puede ser extendido en su extremo 3' mediante la adición de nucleótidos, mediante la acción de una polimerasa o con una actividad similar, para producir una primera extensión del producto. El "cebador" puede variar de complemento, dependiendo de las condiciones particulares y requerimientos para la aplicación. Por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico, el "cebador" oligonucleotídico típicamente puede contener 15-25 ó más nucleótidos. El "cebador" debe tener una suficiente complementariedad con el molde deseado, para iniciar la síntesis de la extensión del producto deseado. Eso no significa que la secuencia del "cebador" deba representar un complemento exacto del molde deseado. Por ejemplo, una secuencia nucleotídica no complementaria puede ser ligada al final del extremo 5' de un "cebador" complementario. Alternativamente, se pueden intercalar bases no complementarias dentro de la secuencia oligonucleotídica del cebador, siempre y cuando dicho cebador tenga una suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena de molde deseada, para proporcionar funcionalmente un complejo molde-cebador, para la síntesis de la extensión del producto.

El término "hibridizado específicamente" se refiere a la asociación entre dos moléculas de ácido nucleico de cadena simple, que poseen secuencias suficientemente complementarias para permitir la hibridación bajo condiciones predeterminadas, generalmente descritas en el estado de la téenica (nota: Tecnología de ADN recombinante. Universidad de Sao Paulo, Capítulo 1, 2003).

En particular, el término se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria, que contiene una molécula de ADN o ARN de cadena simple de la presente invención. Las condiciones apropiadas necesarias para la realización de la hibridación específica entre moléculas de ácidos nucleicos de cadena simple, de complementariedad variada, han sido bien descritas en el estado de la téenica (nota: Tecnología de ADN recombinante. Universidad de Sao Paulo, Capítulo 4, 2003). Una fórmula común para calcular las condiciones de restricción requeridas para la hibridación entre moléculas de ácido nucleico, se presenta a continuación (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Coid Spring Harbor Laboratory Press): Tm = 81.5°C + 16.6 Log [Na+] + 0.41 (%G+C) - 0.63 (% formamida)-600/pb en el dúplex (sonda).

Tal como ilustra la fórmula de arriba, utilizando [Na+] = [0.368] y 50% de formamida, con un contenido de GC de 42% y un tamaño de sonda promedio de 200 bases, la Tm será de 57°C.

Se describen sondas o cebadores correspondientes al polinucleótido de la presente invención identificado como SEQ ID NO: 1 ó una variante del mismo, si la sonda del oligonucleótido o cebador, o su complemento, estuviera contenida dentro de la secuencia especificada como SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma.

El término "oligonucleótido" se refiere en la presente a "cebadores" y "sondas" de la presente invención, y se define como una molécula de ácido nucleico que comprende dos o más ribo o desoxirribonucleótidos, de preferencia más de tres. El tamaño exacto de los oligonucleótidos, dependerá de varios factores y de la aplicación particular y uso de los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden 15-50 pares de bases consecutivas, complementarias a la SEQ ID NO: 1. Las sondas pueden ser fácilmente seleccionadas utilizando procedimientos bien conocidos en el estado de la téenica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989), teniendo en cuenta las restricciones de hibridación ADN-ADN, recombinación y temperaturas de fusión, y el potencial de formar enlaces y otros factores, que son conocidos en este campo.

La definición de los términos "complemento", "complemento inverso" y "secuencia inversa", tal como se utilizan en la presente, se ilustra mediante el siguiente ejemplo. Para la secuencia 5'AGTGAAGT3', el complemento es 3'TCACTTCA5 ' , o el complemento inverso es 3'ACTTCACT5' y la secuencia inversa es 5'TGAAGTGA3'.

Tal como se utiliza en la presente, el término "variante" o "sustancialmente similar", comprende secuencias de aminoácidos o nucleótidos diferentes de secuencias específicamente identificadas, en que uno o más nucleótidos o residuos de aminoácido ha sido eliminado, sustituido o adicionado. Las variantes pueden ser variantes alélicas, de origen natural, o variantes de origen no natural. Las secuencias variantes o sustancialmente similares están relacionadas con fragmentos de ácido nucleico que pueden ser caracterizados por el porcentaje de similitud de sus secuencias nucleotídicas, con las secuencias nucleotídicas aquí descritas (SEQ ID NO: 1), por ejemplo mediante algoritmos comunes empleados en la téenica. Los fragmentos de ácido nucleico preferidos son aquéllos cuya secuencia nucleotídica tiene al menos aproximadamente 40 ó 45% de identidad de secuencia, de preferencia aproximadamente 50 ó 55% de identidad de secuencia, más preferiblemente aproximadamente 60 ó 65 de identidad de secuencia, más preferiblemente aproximadamente 70 ó 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente aproximadamente 80 u 85% de identidad de secuencia, todavía más preferiblemente aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia, en comparación con la secuencia de referencia. El porcentaje de identidad se determina mediante la alineación de dos secuencias por ser comparadas, determinando el número de residuos idénticos en la porción alineada, dividiendo ese número entre el número total de residuos en la secuencia problema y multiplicando el resultado por 100. Esta alineación se puede realizar mediante el uso de programas de software existentes en internet, en donde uno de ellos es el programa BLASTN, que está disponible en la página del Centro Nacional de Información de Biotecnología/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

El término "vector" se refiere a un replicón, tal como un plásmido, cósmido, bácmido, fago o virus, en el cual otras secuencias genéticas o elementos (ya sean ADN o ARN) pueden ser ligados para ser replicados junto con el vector. De preferencia, el vector derivado de virus se selecciona del grupo que consiste de bacteriófagos, vaccinia, retrovirus, o virus del papiloma bovino. El "vector recombinante" es el resultado de la combinación de un vector comercial con genes quiméricos, o el polinucleótido de la presente invención ligado de manera operable a un polinucleótido endógeno y/o heterólogo de interés, que a su vez está ligado de manera operable a una señal de terminación. Tales vectores se pueden obtener en el comercio, incluyendo el Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) y Promega (Madison, Wis.). Algunos ejemplos de vectores utilizados en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a los vectores pGEM-T, pCAMBIA 1391, vectores de portal (gateway), y el vector pMON.

El término "secuencia mejoradoras de la expresión" conocidas como intensificadores ( "enhancers") que pueden estar muy distantes del promotor (antes o después, "en dirección 5'" o en "dirección 3'), son capaces de potenciar la tasa de transcripción. Estos amplificadores no son específicos y potencian la transcripción de cualquier promotor que se encuentre a su alcance. La eficiencia de la expresión de un gen en un tejido específico, depende de la adecuada combinación e integración de los amplificadores, los promotores y las secuencias adyacentes.

El primer intensificador descubierto que estimulaba la transcripción de genes eucarióticos fue el SV40 (presente en el genoma del virus 40 de simios). Después de descubierto el intensificador SV40, se identificaron centenares de otros intensificadores tales como HSV-1, AMV, HPV-16, en otros genomas virales en el ADN de células eucarióticas (Lodish et al., Biología celular e molecular.4a edición, página 368).

El término "ligado de manera operable" significa que las secuencias amortiguadoras necesarias para la expresión de la secuencia codificadora, están colocadas en la molécula de ADN en posiciones apropiadas en relación con la secuencia codificadora para el efecto de expresión de dicha secuencia codificadora. Esa misma definición a veces se aplica al arreglo de secuencias codificadoras y elementos controladores de la transcripción (por ejemplo, promotores, auxiliares o "intensificadores" y elementos o secuencias de terminación), en el vector de expresión. Una región codificadora exógena típicamente está flanqueada por regiones amortiguadoras ligadas de manera operable que regulan la expresión de la región codificadora exógena en una célula transformada (que puede ser un microorganismo, una célula vegetal o animal). Una región amortiguadora típica ligada de manera operable a una región codificadora exógena, incluye un promotor; esto es, un fragmento de ácido nucleico que puede causar la transcripción de regiones codificadoras exógenas, posicionado en dirección 5' de la región codificadora exógena. En el caso de la presente invención, la región amortiguadora se refiere a las regiones sustancialmente similares a la SEQ ID NO: 1. Para ayudar a aumentar la transcripción de un determinado polinucleótido, la secuencia promotora de la presente invención podrá estar ligada a otras secuencias amortiguadoras ya descritas, tales como: ATATT (elemento de fuerte expresión en la raíz), AACAAAC y GCCACCTCAT (elementos relativos a la expresión específica en semillas), CACGTG y CCTACC (ambas secuencias pueden ser estimuladas por un factor de estrés), entre otros (Ai-Min Wu et al., Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl) promoter and its expression activity in transgenic tobáceo, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426-435).

Una "secuencia de terminación" es una secuencia de ADN que señaliza el final de la transcripción. Algunos ejemplos de secuencias de terminación incluyen, pero no se limitan a la señal de terminación del virus SV40, señal de adenilación del HSV TK, la señal de terminación del gen de la nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefasciens (NOS), la señal de terminación del gen de la octopina sintetasa, la señal de terminación de los genes 19S y 35S del CaMV, la señal de terminación del gen de la alcohol deshidrogenasa del maíz, la señal de terminación del gen de la manopina sintetasa, la señal de terminación del gen de la beta-faseolina, la señal de terminación del gen de la ssRUBISCO, la señal de terminación del gen de la sacarosa sintetasa, la señal de terminación del virus que ataca al Trifolium subterranean (SCSV), la señal de terminación del gen trpC de Aspergillus nidulans , y otras semejantes. La presente invención proporciona una región amortiguadora de polinucleótidos aislados, que pueden ser empleados en la manipulación de fenotipos de plantas, junto con polinucleótidos aislados que comprendan estas regiones amortiguadoras. Más específicamente, la presente invención se refiere al promotor o secuencia amortiguadora de conformidad con la SEQ ID NO: 1, responsable de la expresión de un representante de la familia LTP1 ("Lipid Transfer Protein"-Proteína de transferencia lipídica), siendo denominado CaLTPl en la presente invención, y que es responsable de la expresión en el endosperma del fruto.

La cantidad de un polipéptido de interés específico puede ser aumentada o reducida mediante la incorporación de copias adicionales de genes, o secuencias codificadoras, que codifican el polipéptido, ligadas de manera operable a la secuencia promotora de la presente invención (SEQ ID NO: 1), en el genoma de un organismo, tal como una planta. De manera similar, se puede obtener un aumento o una disminución de la cantidad del polipéptido, mediante la transformación de la planta con copias antisentido de estos genes.

El polinucleótido de la presente invención fue aislado de plantas de café, más específicamente de Coffea arabica, pero puede ser alternativamente sintetizado mediante el uso de las téenicas de síntesis convencionales. Específicamente, el polinucleótido aislado de la presente invención, incluye una secuencia identificada como SEQ ID NO: 1; y el complemento inverso de la secuencia identificada como SEQ ID NO: 1.

El polinucleótido de la presente invención se puede identificar en secuencias de ADN genó ico de plantas para las cuales la información de la secuencia del genoma está disponible al público, o se puede aislar de varias bibliotecas de polinucleótidos, o se puede sintetizar mediante el uso de técnicas conocidas en este campo (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989). El polinucleótido se puede sintetizar, por ejemplo, utilizando sintetizadores automáticos de oligonucleótidos (por ejemplo, el sintetizador de ADN OLIGO 1000M, Beckman), para obtener segmentos de polinucleótidos de hasta 50 ó más ácidos nucleicos. Una pluralidad de estos segmentos polinucleotídicos se pueden unir utilizando las técnicas de manipulación de ADN patrón que son conocidas en este campo (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989). Una téenica de síntesis de polinucleótidos convencional y de ejemplo, incluye la síntesis de un segmento del polinucleótido de una sola cadena, que tiene, por ejemplo, 80 ácidos nucleicos, e hibridizando este segmento a un segmento de 85 ácidos nucleicos complementarios, sintetizados para producir un "overhang" (excedente) de 5 nucleótidos. El próximo segmento puede ser sintetizado de modo similar, con un "overhang" de 5 nucleótidos en el filamento opuesto. Los extremos "pegajosos" o cohesivos, aseguran una unión apropiada cuando las dos porciones son hibridizadas. De esta manera, el polinucleótido de la presente invención puede ser sintetizado completamente in vi tro.

Tal como se observó anteriormente, la secuencia del promotor de la presente invención se puede emplear en vectores recombinantes y/o de expresión, para accionar la transcripción y/o expresión de un polinucleótido de interés. El polinucleótido de interés puede ser endógeno o heterólogo para un microorganismo, por ejemplo, para una planta por ser transformada. Los vectores recombinantes y/o de expresión de la presente invención, también pueden ser empleados para modular los niveles de transcripción y/o expresión de un polinucleótido, por ejemplo un gen que está presente en la planta de tipo silvestre, o se pueden emplear para proporcionar la transcripción y/o expresión de una secuencia de ADN que no se encuentra en la planta de tipo silvestre, incluyendo, por ejemplo, un gen que codifica para un gen reportero, tal como GUS.

En algunas modalidades de la presente invención, el polinucleótido de interés comprende una matriz de lectura abierta que codifica para un polipéptido de interés. La matriz o marco de lectura abierta se inserta en el vector en una orientación de sentido y la transformación con esa construcción genética/vector recombinante, dará generalmente como resultado una superexpresión del polipéptido seleccionado. El polipéptido de interés, que será amortiguado por el promotor de la presente invención, podrá ser insertado en el vector en una orientación de sentido, antisentido, o en ambas. La transformación con un vector recombinante y/o de expresión que contiene el promotor de la invención regulando la expresión del polinucleótido de interés en la orientación antisentido o en ambas orientaciones (sentido y antisentido), generalmente dará como resultado la expresión reducida del polipéptido seleccionado.

El polinucleótido de interés como secuencia codificadora, está ligado de manera operable a una secuencia del promotor polinucleotídico de la presente invención, de modo que una célula huésped es capaz de transcribir un ARN accionada por la secuencia del promotor ligado al polinucleótido de interés. La secuencia del promotor polinucleotídico generalmente está posicionada en el extremo 5 del polinucleótido por ser transcrito. El uso de un promotor específico de un tejido, como la secuencia del promotor de café ( Coffea arábica) , responsable de la expresión del gen LTP1 (Lipid Transfer Protein - Proteína de Transferencia Lipídica) identificada como SEQ ID NO: 1, afectará la transcripción del polinucleótido de interés únicamente en el endosperma de la planta transformada.

El vector recombinante o vector de expresión de la presente invención, también puede contener un marcador de selección que sea eficaz en células de organismos, tales como una planta, para permitir la detección de las células transformadas que contienen el vector recombinante de la invención. Estos marcadores, que son bien conocidos, típicamente confieren resistencia a una o más toxinas. Un ejemplo de este marcador es el gen nptll, cuya expresión da como resultado resistencia a la kanamicina o neomicina, que son antibióticos generalmente tóxicos para células vegetales a una concentración moderada. Las células transformadas, también pueden ser identificadas por su capacidad de crecer en un medio conteniendo el antibiótico en cuestión. Otros marcadores que se pueden utilizar para construir vectores recombinantes y/o de expresión que contengan el polinucleótido de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a: el gen hpt que confiere resistencia al antibiótico higromicina, el gen manA y el gen bar.

El sistema que utiliza el gen manA (que codifica para una enzima PMI - fosfomanosa isomerasa) de Escherichia coli (Miles e Guest, 1984. Complete nucleotide sequence of the fumarase gene fumA, of E. coli Nucleic Acids Res.1984 April 25; 12(8); 3631-3642), que tiene a la mañosa como agente selectivo, es uno de los nuevos sistemas sugeridos como alternativos a los dos primeros descritos anteriormente (Joersbo et al . , 1998 Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet, Physiologia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi: 10.1034/j.1399-3054.1999.105117.x). Las especies vegetales que no metabolizan la mañosa, sufren una grave inhibición del crecimiento cuando ésta es ofrecida como única fuente de carbono en el medio de cultivo. Los efectos adversos e inhibitorios del uso de la mañosa son consecuencias de la acumulación de manosa-6-fosfato, que es un producto de la fosforilación de la mañosa por una hexoquinasa. El PMI promueve la interconversión de manosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato, permitiendo de este modo que la primera pueda ser catabolizada en la vía glucolítica (Ferguson y Street, 1958. Análise de sistemas gene marcador/agente seletivo alternativos para seleqáo positiva de embrioes somáticos transgénicos de mamoeiro, Rev. Bras . Fisiol . Veg. , 2001, vol.13, no.3, p. 365-372. ISSN 0103-3131.: Malea et al . , 1967 Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes, Physiologia Plantarum Volume 111 Issue 3 Page 269 -March 2001 doi:10.1034/j.1399-3054.2001.1110301.x). El gen bar (que codifica para la enzima PAT - fosfinotricin-N-acetiltransferasa) de Streptomycees hygroscopicus (Murakani et al . , 1986 The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Molecular and General Genetics., 205: 42-50, 1986), que tiene al glufosinato de amonio (PPT) como agente selectivo, es, entre los sistemas de tipo genes de tolerancia al herbicida, uno de los más ampliamente empleados por la ingeniería genética para el desarrollo de OGMs vegetales. El PAT inactiva herbicidas que tienen como compuesto activo al PPT mediante la detoxificación de éste. La detoxificación, que es el resultado de la acetilación del grupo amino libre presente en el PPT, torna a éste incapaz de competir de manera inhibitoria con una glutamina sintetasa (GS), haciendo posible de este modo la remoción del amoniaco tóxico de la célula vegetal mediante la transformación del glutamato en glutamina, reacción catalizada por la GS (Lindscy, 1992 Molecular cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, constitutively expressed on resting leukocytes, Nature 360, 481 - 484 (03 December 1992); doi:10.1038/360481a0).

Alternativamente, la presencia del gen quimérico en células transformadas, se puede determinar por medio de otras téenicas conocidas en este campo (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989), tales como inmunoelectrotransferencia tipo Southern (Southern blot) y RCP (Reacción en Cadena Catalizada por Polimerasa).

Las técnicas para ligar de manera operable los componentes de los vectores recombinantes o de expresión de la presente invención, son bien conocidos en la técnica e incluyen el uso de ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de endonucleasas de restricción, tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al ("Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989). Los genes quiméricos de la presente invención pueden ser ligados a un vector que tenga por lo menos un sistema de replicación, por ejemplo E. coli, de modo que, después de cada manipulación, las construcciones resultantes puedan ser clonadas y secuenciadas.

Los vectores recombinantes y/o de expresión de la presente invención, se pueden utilizar para transformar una variedad de organismos, incluyendo, pero no limitándose a plantas. Las plantas que pueden ser transformadas utilizando los vectores recombinantes y/o de expresión de la presente invención, incluyen angiospermas monocotiledoneas (gramíneas, maíz, granos, avena, trigo y cebada, etc.), angiospermas dicotiledóneas (por ejemplo, Arabidopsis, tabaco, legumbres, alfalfa, avena, eucalipto, bordo, etc.), y gimnospermas (por ejemplo, pino, pinácea blanca, alerce, etcétera). Los protocolos de transformación de plantas ya son conocidos en la téenica (Manual de transformación genética de plantas. Brasilia: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, Capítulo 3 y 7, 1998). En una modalidad preferida, los vectores recombinantes y/o de expresión de la presente invención, se emplean para transformar plantas dicotiledóneas. Preferiblemente, la planta se selecciona del grupo que consiste de la familia de las Rubiacea , pero de preferencia de la especie Coffea arabica . Otras plantas pueden ser transformadas de manera útil con el vector recombinante y/o de expresión de la presente invención, incluyendo, pero no limitándose a: Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica , Carica, Citrus, Citrullus , Capsicum, Carthamus , Cocos, Coffea, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus , Heterocallis , Hordeum, Hyoseyamus , Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseoulus , Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, S cale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea .

La señal de terminación de la transcripción y la región de poliadenilación de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a la señal de terminación del SV40, la señal de adenilación del HSV TK, la señal de terminación del gen de la nopalina sintetasa de A. tumefasciens (nos) , la señal de terminación del gen RNA 35S del CaMV, la señal de terminación del virus que ataca a Trifolium subterranean (SCSV), la señal de terminación del gen trpC de Aspergillus nidulans, y otros similares. De preferencia, el terminador utilizado en la presente invención es el terminador del gen LTP1 (Lipid Transfer Protein - Proteína de Transferencia Lipídica).

Los vectores recombinantes y/o de expresión de la invención, se pueden introducir en gel genoma de la planta huésped deseada, a través de una variedad de téenicas convencionales. Por ejemplo, la introducción mediada por A. tumefasciens; electroporación; fisión de protoplastos; inyección en órganos reproductores; inyección en embriones inmaduros; microinyección de protoplastos de células vegetales; el uso de métodos balísticos tales como el bombardeo de partículas recubiertas con ADN, y otros. La elección de la técnica dependerá de la planta por ser transformada. Por ejemplo, las plantas dicotiledóneas y algunas monocotiledoneas y gimnospermas, pueden ser transformadas por tecnología del plásmido Ti de Agrobacterium. Los vectores recombinantes y/o de expresión pueden ser combinados con regiones flanqueadoras de T-ADN apropiadas y ser introducidos en el vector convencional del huésped A. tumefasciens . La función de virulencia del huésped A. turne fasciens dirigirá la inserción de las construcciones génicas y el marcador adyacente dentro del ADN de la célula vegetal, cuando la célula es infectada por la bacteria. Las téenicas de transformación mediadas por A. tumefasciens, incluyendo el desarmamiento y el uso de vectores binarios, han sido descritas en la literatura científica (como se menciona en la Solicitud de Patente US 20020152501, Horsch et al . Science 233:496-498, 1984; y Fralcy et al . Proc . Nati . Acad. Sci . USA 80:4803, 1983). El vector binario utilizado preferiblemente en la invención, es el vector binario de tipo PBI 121.

Las técnicas de microinyección son conocidas en este campo y se han descrito en la literatura científica y de patentes. La introducción de vectores recombinantes y/o de expresión utilizando precipitados de polietilenglicol, se describe en Paszkowski et al . Embo J.3:2717-2722, 1984 (tal como se menciona en la Solicitud de Patente US20020152501). Las técnicas de electroporación se describen en From et al . Proc. Nati . Acad. Sci . USA 82:5824, 1985 (tal como se menciona en la Solicitud de Patente US20020152501). Las técnicas balísticas de transformación se describen en Klein et al . Nature 327:70-73, 1987 (tal como se menciona en la Solicitud de Patente US20020152501). La introducción de los vectores recombinantes y/o de expresión de la presente invención, se puede realizar en tejidos tales como tejidos de hojas, células disociadas, protoplastos, semillas, embriones, regiones meristemáticas, cotiledones, hipocotiledones, y otros. De preferencia, la presente invención utiliza la transformación a través de la introducción mediada por A. turne fasciens , utilizando A. thaliana como planta modelo (Clough et al., "floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of A. thaliana" , Plant J.1998 (Dec; 16(6):735-43). Sin embargo, se pueden utilizar otros métodos de transformación para insertar vectores recombinantes y/o de expresión de la presente invención, tales como la biobalística, que consiste en una téenica de transformación directa del ADN que utiliza microproyectiles impulsados a alta velocidad, para transportar el ADN al interior de las células [Rech, E.L; Aragao, F.J.L. Biobalística. In: Manual de Transíormagao Genética de Plantas (Brasileiro, A.C.M. & Carneiro, V.T.C. eds.), EMBRAPA Servipo de Produpao de Informapoes - SPI.1998, 106pp), y mediante un tubo polínico. El método de transformación a través del tubo polínico fue descrito por primera vez por Zhou et al (Zhou, G, Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., y Liu, G. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol.101:433-448, 1983) y consiste en la aplicación de una solución de ADN a la parte superior de manzanas jóvenes después de la polinización. Con el uso de esta técnica, el ADN exógeno puede alcanzar el ovario a través del pasaje dejado por el tubo polínico e integrar las células cigóticas ya fertilizadas, pero no divididas.

Una vez que las células fueron transformadas por cualquiera de las téenicas anteriormente mencionadas, las células que tienen el vector recombinante y/o de expresión de la presente invención incorporado en su genoma, se pueden seleccionar por medio de un marcador, tal como un marcador de resistencia a la higromicina o a la kanamicina. Las células de plantas transformadas, se pueden cultivar para regenerar una planta completa que posea un genotipo transformado y, finalmente, el fenotipo deseado. Tales técnicas de regeneración cuentan con la manipulación de ciertas fitohormonas en el medio de crecimiento del cultivo de tejidos, típicamente conteniendo un marcador biocida y/o herbicida, que debe ser introducido junto con la secuencia de nucleótidos deseada. La regeneración de plantas a partir del cultivo de protoplastos, se describe en Evans et al . (Evans et al , Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp.124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985, tal como se menciona en la Solicitud de Patente Us20020152501). La regeneración también se puede obtener a través de callos de planta, explantes, órganos, o partes de los mismos. Estas técnicas de regeneración han sido bien descritas en la técnica, tales como en Leelavathi et al . [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacteri um-mediated transformation protocol for cotton (G. hirsutum L.): Enbryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep (2004) 22:465-470]. Este trabajo describe un protocolo para la transformación y regeneración del algodón, en donde el callo embriogénico con Agrobacterium es cultivado bajo estrés de deshidratación y selección con antibióticos por 3 a 6 meses, para la regeneración de diversos embriones transgénicos , en promedio 75 embriones. Habiéndose obtenido la selección de placas, estos embriones son cultivados y multiplicados en un medio de cultivo, seguido por el desarrollo de los embriones cotiledóneos en el medio de maduración de embriones. Con esto se obtiene una media de 12 plantas por caja de petri de callos cocultivados. Aproximadamente el 83% de estas plantas son transgénicas. Las plantas transformadas resultantes pueden ser reproducidas de modo sexual o asexual, utilizando los métodos conocidos en la téenica [Leelavathi et al , A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton ( Gossipium hirsutum L. ) : Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep, 2004, 22: 465-470] , para producir generaciones sucesivas de plantas transgénicas.

La producción de ARN en células se puede controlar al escoger la secuencia del promotor, mediante la selección del número de copias funcionales, o a través del sitio de integración de los polinucleótidos incorporados en el genoma huésped. Un organismo puede ser transformado utilizando un vector recombinante y/o de expresión de la presente invención, que contiene más de una matriz o marco de lectura abierta de codificación para un polipéptido de interés .

El polinucleót ido aislado de la presente invención, también tiene utilidad en el mapeo del genoma, en el mapeo físico y en la clonación posicional de genes. La secuencia identificada como SEQ ID NO: 1 y sus variantes, se pueden usar para proyectar sondas e iniciadores de oligonucleótidos . Las sondas de oligonucleót idos proyectadas utilizando el polinucleótido de la presente invención, se pueden emplear para detectar la presencia del promotor del gen LTP1 (Lipid Transfer Protein - Proteína de Transferencia Lipídica) , en cualquier organismo que tenga secuencias de ADN suficientemente similares en sus células, empleando téenicas ya conocidas en esta materia, tales como las técnicas de hibridación de ADN de electroinmunotransf erencia (Sambrook J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd edition [M]. New York: Coid Spring Harbor, NY, 1989).

Los iniciadores de oligonucleótidos proyectados utilizando el polinucleótido de la presente invención, se pueden usar para amplificaciones por RCP. El polinucleót ido de la presente invención también se puede emplear para etiquetar o identificar un organismo o material reproductivo del mismo. Esta etiqueta puede obtenerse, por ejemplo, mediante la introducción estable de un identificador del polinucleót ido heterólogo, no funcional, no interferente , en un organismo, bajo el control del polinucleótido de la presente invención.

El promotor propuesto para la presente invención, se obtuvo siguiendo de preferencia los siguientes pasos: 1. El material genético de las muestras de los posibles candidatos, se puede preparar siguiendo los procedimientos descritos por Jones (Jones JDG, Dunsmuir, P. y Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4:2411-2418), o cualquier procedimiento que permita tener acceseo al material genético íntegro, como por ejemplo, los métodos de extracción que utilizan solventes orgánicos. 2. El material aislado de los posibles candidatos, debe confirmar su integridad, por ejemplo, a través de téenicas de gel desnaturalizante, para poder servir de molde en la formación de nuevas moléculas de ADN por medio de reacciones de RCP, o también por RCP-TR en caso de que el molde sea ARN. Se recomienda el tratamiento de las muestras con DNAsa, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en ese documento. 3. El material genético obtenido puede ser utilizado en reacciones de RCP con cebadores específicos del gen seleccionado, como por ejemplo el gen LTP1, para la evaluación del tejido y la especificidad del mismo. Los referidos cebadores pueden ser diseñados con la ayuda del programa Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S y Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocole: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp .365-386), o cualquier otro programa y/o proceso que proporcione cebadores específicos para los candidatos. 4. Las reacciones de RCP se pueden realizar en un aparato especial para el procedimiento, tal como un termocielador MJ Research Modelo PTC-100, o cualquier otro termociclador capaz de desempeñar su función, bajo condiciones idénticas para la reacción, en la cual se sugiere una incubación inicial de 94°C, por 3 minutos, seguida por 35 ciclos de 94°C por 30 segundos para la desnaturalización, 50°C por 40 segundos para la hibridación de los oligonucleótidos, y 72°C durante 1 minuto para la extensión . 5. Después del procedimiento, las reacciones deben ser sometidas a un periodo adicional, en el cual se recomiendan 10 minutos a 72°C para el complemento de la polimerización. Es recomendable que cada reacción contenga 1 ml^de ADNc diluido 1:10, 2.5 U de Taq DNA polimerasa y 30 pmoles de oligonucleótidos iniciadores, en un volumen final de 50 ml. 6. La identidad del producto amplificado puede ser confirmada, por ejemplo, mediante la migración electroforét ica de los fragmentos, en la cual se recomienda utilizar como comparación el control positivo, constituido por un vector, por ejemplo un vector del banco de datos del Proyecto Genoma Café (FV2-050) conteniendo la secuencia estudiada. 7. Después del fraccionamiento del material genético, las muestras deben ser sometidas al proceso de inmunoelectrotransf erencia tipo Northern (Northern blot), el cual se recomienda para la transferencia de material genético a la membrana apropiada para el procedimiento, tal como por ejemplo una membrana de nylon, y se hibridiza con SSPE en una sonda correspondiente a la secuencia parcial de la supuesta LTP marcada, por ejemplo, con el isótopo 32 del fósforo - 32P. 8. El promotor debe ser aislado mediante cualquier téenica de aislamiento, para lo cual se recomienda utilizar la técnica 5'race, junto con la técnica de RCP "anidada" simplificada mediante el uso del Kit Genome Walker Universal (Clontech), siguiendo las especificaciones del fabricante. 9. Los fragmentos provenientes pueden ser clonados y secuenciados por el proceso destinado para este fin. Se recomienda el uso del método de didesoxinucleótido (Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A.R.1979. Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 74, 5463-5468). 10. La caracterización del perfil de expresión del promotor putativo aislado, se puede realizar a través de la expresión de esa secuencia, y variaciones truncadas provenientes de la misma, pero que conserven la función propuesta de promotor, en vectores binarios, para lo cual se sugiere el uso del vector binario de tipo PBI 121 y la clonación en los sitios HindIII y BamHI, de conformidad con las téenicas estandarizadas de biología molecular, por ejemplo la técnica propuesta por Sambrook (SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. ed. New York: Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 608p). Se recomienda el uso de controles positivos y negativos para la realización de tales procedimientos . 11. El proceso de transformación debe ser realizado en organismo de interés, para lo cual se sugiere la planta de humo - Nicotiana tabacum, empleando como vector cepas de Agrobacterium turne faciens, como por ejemplo las cepas de Agrobacterium turne faciens CV3101 (C58PMP90), empleando cualquier protocolo específico para este fin, como por ejemplo el propuesto por Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., Rogers S.G. y Fralcy R.T.1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229-1231). La eficacia de la transformación de los explantes debe ser evaluada mediante la expresión transitoria y estable en los tejidos de los propágulos regenerados de un gen de interes, para lo cual se recomienda el uso del gen GUS. 12. El análisis de la expresión del gen GUS se debe realizar mediante protocolos de ensayo histoquímico, por ejemplo, de conformidad con la adaptación del protocolo descrito por Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. y Bevan M.W. 1987. GUS fusions: b-glucoronidase as a sensitive and versatile gene fusión marker in higher plants. EMBO J.6: 3901-3907) en hojas, raíces, frutos, semillas y flores (pétalos, gineceo, estambre, polen) de las plantas transformadas .

EJEMPLOS La presente invención ahora se definirá con los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque indican parte de la invención, se presentan a manera de ilustración solamente, sin tener, por lo tanto, ningún límite para el alcance de la presente invención.

Las téenicas normales de biología molecular, tales como la transformación de bacterias y electroforesis en gel de agarosa de los ácidos nucleicos, son referidas a través de los términos comunes para describirlas. Los detalles de la práctica de estas técnicas, que son conocidos en este campo, se describen en Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Coid Spring Harbor Laboratory Press) . Varias soluciones empleadas en las manipulaciones experimentales, son referidas por sus nombres comunes, tales como "agarosa", "TBE", "miniprep", etcétera. Las composiciones de estas soluciones se pueden encontrar en la referencia Sambrook, et al . (anteriormente citada) .

Ejemplo 1 - Análisis in s co Los segmentos "contiguos" del banco de datos del genoma del café (VIEIRA, L. G. E.; ANDRADE, A. C.; COLOMBO, C. A.; MORAES, A. H. A.; MEHTA, A.; OLIVEIRA, A. C.; LABATE, C. A.; MARINO, C. L.; MONTEIRO-VITORELLO, C. B. Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource. Brazilian Journal of Plant Physiology, v. 18, p. 95-108, 2006) fueron organizados en 2 grupos contrastantes: fruto y no fruto. Estos dos grupos se compararon por medio de la prueba exacta de Fisher, y el resultado indicó 18 "contiguos" preferencialmente expresados en el fruto.

Posteriormente, los "contiguos" se analizaron en cuanto a la existencia o no de patentes.

Ejemplo 2 - Validación Experimental Para la validación experimental, se seleccionó un "contiguo" llamado gen candidato de fruto 1 - CaLTPl, por presentar un alto grado de especificidad y un alto nivel de expresión exclusiva en el fruto, y por no estar protegido por patentes, no el gen, ni su promotor. Despues de los ensayos de caracterización y validación, quedó claro que se trataba del gen de la LTP (Lipid Transfer Protein - Protelna de Transferencia Lipídica). La validación experimental del gen CaLTPl (gen candidato de fruto 1), se realizó de la manera descrita por medio de ensayos de expresión temporal y espacial, empleándose las téenicas de: RCP-TR (RCP con Transcriptasa Reversa); Inmunoelectrotransferencia tipo Northern (Northern Blot; RCPq-TR.

Ejemplo 3 - RCP-TR Para la realización de los ensayos de RCP-TR, se extrajeron muestras de ARN de la raíz, de hojas y del fruto de Coffea arabica cv IAPAR 59, cultivadas en el campo experimental de Embrapa Cerrados. El ARN fue extraído de acuerdo con la metodología descrita por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, y Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants . E BO J 4: 2411-2418). Después, los ARNs fueron evaluados en cuanto a su integridad, en gel desnaturalizante al 1.5%. Las muestras de ARN de raíces, hojas y frutos, se usaron como molde en la formación de moléculas de ADNc, por medio de reacciones de RCP-TR utilizando cebadores oligo dT. Los ADNc obtenidos se utilizaron en reacciones de RCP con cebadores específicos del gen LTP1, para la evaluación de la especificidad de tejido de los mismos. Para esto, se diseñaron los siguientes oligonucleótidos específicos, con la ayuda del programa Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S y Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW-for general users and for biologist programmers: In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp.365-386): Cebador para el fruto no.1: SEQ ID NO: 2; Cebador para el fruto no.2: SEQ ID NO: 3.

Las reacciones se llevaron a cabo en un termocielador MJ Research modelo PTC-100, con una incubación inicial a 94°C durante 3 minutos, seguida por 35 ciclos a 94°C durante 30 segundos para la desnaturalización, 50°C durante 40 segundos para la hibridación de los oligonucleótidos, y 72°C por 1 minuto para la extensión. Después de los ciclos, las reacciones fueron sometidas a un periodo adicional de 10 minutos a 72°C, para complementar la polimerización. Cada reacción contenía 1 mH de ADNc diluido 1:10, 2.5 U de Taq DNA polimerasa y 30 pmoles de oligonucleótidos iniciadores, en un volumen final de 50 m]3. La identidad del producto amplificado fue confirmada por migración electroforética de los fragmentos en comparación con el control positivo, constituido por un vector del banco de datos del Proyecto Genoma Café (FV2-050), conteniendo la secuencia estudiada (Figura 2).

Ejemplo 4 - Extracción de ARN Se extrajeron muestras de ARN total de raíces, hojas y frutos de Coffea arabica cv IAPAR 59, cultivadas en el campo experimental de Embrapa Cerrados, siguiendo el protocolo descrito por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, y Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). Después de ser extraídos, los ARNs fueron fraccionados en gel desnaturalizante al 1.5%, para analizar su.integridad.

Ejemplo 5 - Tratamiento con DNAsa Los ARNs fueron sometidos a un tratamiento con la enzima DNAsa, la cual consistió en una reacción que contenía 10 mg de uno de los ARNs, 5 U de la enzima DNasa, 2 mL de amortiguador de reacción 10X (Tris-HCl 200 mM, pH 8, AEDT 0.1 mM, DTT 1 mM) y agua DEPC para completar el volumen hasta 20 mL. La reacción se dejó a 37°C por 10 minutos y después fue transferida a un gel. Después, las muestras de reacción fueron tratadas con el objetivo de inactivar la DNAsa, o sea, agregando 180 mE de agua DEPC y 200 m!E de clorofano (24:24:1 de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, respectivamente) . Después de mezclar algunas veces, las muestras se centrifugaron a 12,000 g durante 3 minutos. La fase superior (acuosa) fue transferida a un nuevo tubo y se agregó etanol (2.5 veces el volumen de la muestra) y NaAc 3M (1/10 del volumen de la muestra), y se dejaron a -20°C durante aproximadamente 16 horas. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 12,000 g durante 40 minutos, descartándose el sobrenadante, y la pella se lavó con etanol al 70% antes de ser resuspendida en 20 mL de agua DEPC. Después del tratamiento, una alícuota de los ARNs se colocó en gel de agarosa al 1.5%, para analizar su calidad.

Ejemplo 6 - Síntesis de ADNc Se llevó a cabo la reacción de síntesis de ADNc con 300 ng de ARN de raíz, hojas o fruto (tratados con DNAsa) , 2 mE de oligo dT (50 mM), 1 mE de mezcla de dNTP (15 mM) y agua DEPC hasta completar 13 mE. La reacción se llevó a 65°C por 5 minutos y después se colocó en gel durante 3 minutos. Después, se agregaron 4 mL de amortiguador de primera cadena (5X), 1 mL de DDT (0.1M) y 1 mL de SuperScript III RT (200 U^ L). La mezcla de reacción se incubó a 50°C por 1 hora y después a 70°C por 15 minutos, para inactivar la reacción .

Ejemplo 7 - RCPq-TR Muestras de ARN total de raíces, hojas y frutos se trataron con DNAsa y se transformaron en ADNc. Las reacciones de RCP fueron preparadas utilizando el reactivo SYBR Green y los siguientes oligonucleótidos específicos: Cebador para fruto no.3: SEQ ID NO: 4; Cebador para fruto no.4: SEQ ID NO: 5.

Las reacciones se llevaron a cabo en un aparato de tipo 7500 PCR Systems (Applied Biosystems) , de conformidad con Bustin (Bustin SA, en Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems; J Mol Endocrinol (2002) v. 29 - p. 23-39). Los análisis comparativos se realizaron empleando el gen dela ubiquitina como patrón constitutivo (Figura 3).

Ejemplo 8 - Inmunoelectrotransferencia Northern (Northern blot) Se extrajeron muestras de ARN total de hojas y frutos (estado verde) de café adulto de la especie Coffea arabica variedad Catuaí Amarelo. En el caso de la raíz, se utilizaron raíces de plantas con 190 días que fueron germinadas en papel germiteste, transferidas al sustrato vegetal (vermiculita - Terral) y cultivadas en invernadero. El método de extracción de ARN fue como el descrito por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, y Bedbrook J.1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants . EMBO J 4: 2411-2418). El ARN fue fraccionado en un gel desnaturalizante al 1.5%, transferido al vacío a la membrana de nylon, e hibridizado en SSPE con la sonda correspondiente a la secuencia parcial de la supuesta LTP marcada con 32P. El resultado obtenido en la validación experimental por Northern blot, demuestra la expresión específica de fruto de gen (Fig.4).

Ejemplo 9 - Aislamiento del promotor El promotor fue aislado por medio de la téenica 5'race, junto con la técnica de RCP "anidada" simplificada por el uso del Kit Genome Walker Universal (Clontech), siguiendo las especificaciones del fabricante. Para la amplificación, se utilizaron los siguientes cebadores: Ia reacción: Cebador para la primera reacción de avance: SEQ ID NO : 6; Cebador para la Ia reacción de retroceso: SEQ ID NO: 7. 2a. reacción: Cebador para la 2a reacción de avance: SEQ ID NO: 8; Cebador para la 2a reacción de retroceso: SEQ ID NO: 9 .

Los fragmentos obtenidos (Figura 5) fueron clonados y secuenciados por el método de didesoxinucleótido (Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A.R.1979. Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 74, 5463-5468).

Ejemplo 10 - Obtención de vectores binarios Con el fin de caracterizar el perfil de expresión del promotor putativo aislado, se prepararon 4 vectores binarios conteniendo la versión completa del promotor de CaLTPl, que es un fragmento de 1.2 Kb y 3 versiones truncadas de 451 pb, 785 pb y 1.0 Kb . Para tal efecto, los fragmentos se clonaron en el vector binario de tipo PBI 121 en los sitios Hindlll y BamHI, de conformidad con las téenicas estándar de biología molecular (SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. ed. New York: Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989.608p) .

Ejemplo 11 - Transformación de plantas de humo con vectores binarios Los vectores binarios preparados conforme al punto anterior, se utilizaron en la transformación de plantas de humo. Cepas de Agrohacterium turne faciens CV3101 (C58PMP90), fueron transformadas independientemente con las 4 construcciones citadas en el ejemplo anterior, así como con el control positivo PBI 121 original, según Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., Rogers S.G. y Fralcy R.T.1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229-1231).

Después de esa etapa, secciones foliares (explantes) de Nicotiana tabacum se sumergieron en suspensión bacteriana conteniendo el vector binario, por 5 minutos. Posteriormente, los discos se colocaron en papel filtro para eliminar el exceso de bacterias y se incubaron en un medio de cocultivo durante 48 horas (Trinca, S.; De Pace C.; Caccia, R.; Mugnozza, G.S.; Dodds, J.H. Jaynes, J. Transíormat ion of potato (Solanum tuberosum L.) leaf sic using A. tumefaciens transfer DNA sequences coding for lytic peptides. Molecular methods for potato improvement. Lima: CIP, 1991.85p) . Después del cocultivo, los explantes se colocaron en medio de selección (medio de cocultivo suplementado con 50 mg/L de canamicina y 50 mg/L de cefotaxima) . La eficiencia de transformación de los explantes, se evaluó mediante la expresión transitoria y estable del gen GUS en los tejidos de los propágulos regenerados .

Ejemplo 12 - Análisis de la expresión del gen GUS El fragmento promotor de 451 pares de bases, es capaz de dirigir la expresión del gen reportero GUS solamente en semillas de plantas de humo (Figura 7). El análisis de la expresión de GUS se realizó mediante un ensayo histoquímico, de conformidad a una adaptación del protocolo descrito por Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. y Bevan M.W. 1987. GUS fusions: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusión marker in higher plants . EMBO J. 6: 3901-3907) en hojas, raíces, frutos, semillas y flores (pétalos, gineceo, estambre, polen) de plantas transformadas con el promotor de 451 pb y los controles positivos y negativos. Los cortes fueron hechos a mano con la ayuda de un bisturí y las muestras se sumergieron en solución amortiguadora de reacción, que consiste en: X-gluc 1 mM (sal ciclohexilamonio de 5-bromo-4-cloro-3-indolil^ -D-glucourónico) , AEDT 10 mM, ferricianato de potasio 0.5 mM, y ferrocianato de potasio 0.5 mM, Tritón X-100 al 0.1%, en NaH2P04.H20100 mM. El pH de la solución se ajustó a 7.0 con NaOH y se filtró bajo una campana. Después de 15 minutos de infiltración al vacío (5 mmHg), las muestras se incubaron a 37°C durante una noche .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

RE I VIND I CAC I ONE S Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polinucleótido con actividad específica de tejido, caracterizado porque comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: a) secuencias que sean sustancialmente similare a la SEQ ID NO: 1; b) complementos de la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1; c) complementos inversos de la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1; d) secuencias inversas de la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1.

2. Un gen quimérico, caracterizado porque comprende : a) un polinucleótido cuya secuencia sea sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 1, opcionalmente ligado a secuencias intensif icadoras de la expresión o promotores de interés, ligados de manera operable a b) una secuencia polinucleotídica de interés.

3. Un gen quimérico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque porque la secuencia polinucleotídica de interés puede ser una región codificadora o una región no codificadora.

4. Un gen quimérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la región codificadora se aísla de un gen endógeno o heterólogo.

5. Un gen quimérico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia polinucleotídica de interés, puede estar en orientación de sentido o de antisentido.

6. El gen quimérico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las secuencias intensif icadoras de expresión, se seleccionan del grupo que consiste de SV40, HSV-1, A V, HPV-16, entre otras. 7. 7.

Un vector recombinante caracterizado porque contiene un gen quimérico de conformidad con la reivindicación 2.

8. Un vector recombinante, caracterizado porque comprende : a) un polinucleótido cuya secuencia sea sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 1, opcionalmente ligado a secuencias intensificadoras de la expresión o promotores de interés; ligados de manera operalbe a b) una secuencia polinucleotídica de interés; y c) una secuencia de terminación.

9 . El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia polinucleotídica de interés puede ser una región codificadora o una región no codificadora.

10. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia polinucleotídica de interés se aísla de un gen endógeno o heterólogo .

11. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de terminación se selecciona del grupo que consiste de la señal de terminación de SV40, la señal de adenilacion de HSV TK, la señal de terminación del gen de la nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens (NOS), la señal de terminación del gen de la octopina sintetasa, la señal de terminación de los genes 19S y 35S de CaMV, la señal de terminación del gen de la alcohol deshidrogenasa del maíz, la señal de terminación del gen de la manopina sintetasa, la señal de terminación del gen de la beta-faseolina, la señal de terminación del gen de ssRUBISCO, la señal de terminación del gen de la sacarosa sintetasa, la señal de terminación del virus que ataca a Trifolium subterranean (SCSV), la señal de terminación del gen trpC de Aspergillus nidulans, y otros semejantes.

12. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las secuencias intensif icadoras de la expresión, se seleccionan del grupo que consiste de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16, entre otras.

13. Una célula transformada, caracterizada porque contiene un vector recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

14. Una planta, o parte o propágulo o progenie de la misma, caracterizada porque comprende un vector recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

15. Un método para modificar la expresión de genes en un organismos, caracterizado porque incorpora de manera estable en el genoma del organismo, un vector recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, ó un gen quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el organismo es una planta .

17. Un método para producir una planta que cuenta con la expresión de un gen modificado, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) transformar una célula vegetal, tejido, órgano o embrión vegetal, con un vector recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 ó un gen quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6; b) seleccionar las células transformadas, callos de células, embriones o semillas; c) regenerar plantas maduras a partir de las células transformadas, callos de células, embriones o semillas seleccionados en la etapa del inciso (b); d) seleccionar plantas maduras del paso del inciso (c) que manifiesten la expresión del gen modificado cuando se comparan con una planta no transformada. RSUMEN DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una secuencia promotora específica para la expresión de genes de interés en el endosperma del fruto. La invención también describe construcciones de ADN que contienen el promotor, así como un método que utiliza estas construcciones para producir plantas, células de planta o protoplastos transgénicos. La expresión del transgén exclusivamente en el órgano de interés, permite que la transcripción exógena se acumule sólo en el fruto y es ventajoso sobre la expresión constitutiva, ya que facilita la implementación de estrategias que tengan el propósito de obtener cultivares con un mayor valor agregado, tal como: la adaptación al estrés ambiental, resistencia a patógenos, plagas y agroquímicos, incremento en el valor nutricional y terapéutico, y una nueva alternativa de sistemas de expresión en plantas, para generar cultivares más competitivos a costos más bajos. Además, la presente invención también describe una secuencia con expresión constitutiva, la cual ofrece una alternativa para implementar sistemas de expresión cuando la expresión constitutiva es requerida. El objetivo de la invención es incrementar los beneficios económico, social y ambiental, así como la bioseguridad asociados con la transformación genética.