JPH11509733A - 植物における遺伝子発現調節のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子であって、前記核酸分子は、植物において遺伝子の発現を調節する。ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子をコードする核酸を含むトランスジェニック植物であって、前記核酸分子は前記植物において遺伝子の発現を調節する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物における遺伝子発現調節のための組成物および方法関連出願 本出願は１）”デンプン顆粒結合グルコースデンプングリコシルトランスフェ ラーゼ活性欠乏トランスジェニック植物製造法”と題し、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８ ／３００，７２６として１９９４年９月２日に出願されたＥｄｉｎｇｔｏｎによ る仮ではない出願；および２）”植物における脂肪酸飽和プロファイル改変のた めの組成物および方法”と題し、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／００１，１３５として １９９５年７月１３日に出願されたＺｗｉｃｋらによる仮出願の一部継続出願で ある。これらの出願の両方とも、図を含む全文のまま本明細書において援用され る。技術分野 本発明は植物における遺伝子発現調節のための、特に酵素的核酸分子を用いる 組成物および方法に関する。背景技術 以下の説明は植物における遺伝子発現制御の簡単な説明である。議論は完全な ものではなく、以下の発明の理解のために提供されているだけである。この要約 は、以下に記載された研究は請求された発明の先行技術であることを承認するも のではない。 植物において遺伝子発現を調節する種々の方法が存在する。伝統的には、アン チセンスＲＮＡ（Ｂｏｕｒｑｕｅ，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ １０５，１ ２５−１４９に概説されている）および共抑制（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９５Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，６８６−６９１に概説されている）法が遺伝子発現を 調節するために使用されてきた。遺伝子の挿入突然変異誘発は遺伝子発現を沈黙 させるためにも使用されてきた。しかしながら、この方法は問題とする遺伝子を 特異的に不活性化するようには設計できない。出願者はリボザイム技術は植物に おける遺伝子発現を変える魅力的な手段を提供することを信じている。 天然に存在するアンチセンスＲＮＡは１０年以上も前に細菌において最初に発 見された（Ｓｉｍｏｎｓ ａｎｄ Ｋｌｅｃｋｎｅｒ，１９８３ Ｃｅｌｌ ３ ４，６８３−６９１）。それは細菌がそれらの遺伝子発現を調節できるただ一つ の方法と考えられている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ａｎｎ．Ｒｅ ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．５５：５６７−５９７；Ｓｉｍｏｎｓ １９８８ Ｇｅｎ ｅ ７２：３５−４４）。遺伝子発現のアンチセンス媒介阻害の最初の例は哺乳 類細胞において報告されている（Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ １ ９８４ Ｃｅｌｌ ３６：１００７−１０１５）。文献には植物における遺伝子 発現を調節するためにアンチセンスＲＮＡを使用した多くの例がある。以下はそ の２，３の例である： Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，１０７，０６５および５ ，４５３，５６６号はアンチセンスＲＮＡを用いた植物における遺伝子発現を制 御するための方法を開示している。 植物において発現されたアンチセンス遺伝子は優性抑制遺伝子として働くこと が示されている。ジャガイモまたはカッサバ顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳ Ｓ）に対してアンチセンスであるＲＮＡを発現するトランスジェニックジャガイ モが産生されている。。これら両方の場合において、ＧＢＳＳ活性またはタンパ ク質が減少したまたはないトランスジェニック植物が構築されている。これらの トランスジェニック植物は、劇的に減少したアミローゼレベルを持つデンプンを 含むジャガイモのもととなる（Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ １９９１，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ ．２２５：２８８９−２９６；Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：９４７−９６２ ）。 Ｋｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．＆ Ｂｒｅｅｄ ４９ ，６９−７５は顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）遺伝子のアンチセンス配 列の発現により仲介されるトランスジェニックジャガイモ株からの塊茎中のアミ ローゼ生合成の阻害を報告している。しかしながら、筆者はＧＢＳＳ ＲＮＡを 標的としたリボザイムのインビボ活性の観察には失敗したことが示されている。 キャノーラのΔ−９デサチュラーゼ酵素に対して標的化されたアンチセンスＲ ＮＡ構築物はステアリン酸（Ｃ１８：０）のレベルを２％から４０％増加させる ことが示されている（Ｋｎｕｔｚｏｎ ｅｔ． ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．８９，２６２４）。一つの高ステアリン酸株にお いて、総油含量または発芽効率の減少はなかった。改良された油組成を持つ植物 の有用性を示したいくつかの最近の総説が入手可能である（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ， Ｊ．Ｂ．１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４，８２１；Ｋｉｎｎｅ ｙ，Ａ．Ｊ．１９９４ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５，１４４ ；Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒ． １７，６２７）。 相同的導入遺伝子不活性化は、導入遺伝子をセンス配向で挿入すると遺伝子お よび導入遺伝子の両方がダウンレギュレートされることが見いだされたという予 期されなかった結果として植物において最初に示されている（Ｎａｐｏｌｉ ｅ ｔ ａｌ．，１９９０ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９）。相同的 遺伝子配列の不活性化には少なくとも二つの機構が存在するようである。一つは メチル化を経る転写不活性化であるようであり、複製されたＤＮＡ領域が遺伝子 沈黙のための内在性機構に信号を送る。遺伝子活性調節のこの方法には、導入遺 伝子の多数のコピーの導入または問題とする遺伝子に相同的である導入遺伝子を 持つ植物の形質転換が含まれる（Ｒｏｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ，１９９５ ＥＭＢ Ｏ Ｊ ．１４：５３１８−５３２８）。共抑制の他の機構は転写後であり、遺伝 子および導入遺伝子両方からの発現を合わせたレベルにより転写体が高レベルで 産生すると考えられ、それが両方のメッセージの閾値誘導分解の引き金になる( ｖａｎ Ｂｏｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：８６１ −８７７)。共抑制の正確な分子論的基礎は知られていない。 あいにく、アンチセンスおよび共抑制技術の両方とも所望特性の遺伝力におい て困った問題を起こしやすい（Ｆｉｎｎｅｇａｎ ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ １ ９９４ Ｂｉｏ／Ｔｃｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８８３−８８８）。現在、植物 においてＤＮＡレベルで問題とする遺伝子を特異的に不活性化する簡単な方法は 存在しない（Ｐａｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，１９８８ ＥＭＢＯ Ｊ．７： ４０２１−４０２６）。トランスポゾン突然変異誘発は不十分であり安定な事柄 ではなく、一方化学的突然変異誘発は特異的ではない。 リボザイムは魅力的な代替物であり、それらの作用の触媒機構のため、競合す る技術よりも利点を持っていると信じられる。しかしながら、植物系における遺 伝子発現の調節においてリボザイムの有効性を示すのは困難である（Ｍａｚｚｏ ｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７ １５−７３１；Ｋｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．＆ Ｂｒ ｅｅｄ ４９：６９−７６）。植物細胞でのリボザイム活性の文献が報告されて いるが、これらのほとんどは一過性アッセイでのレポーター遺伝子のような、内 因的に導入された遺伝子のダウンレギュレーションである（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１５２５−１５３０； Ｐｅ ｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ ．３：２５３−２６３；Ｐｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，９２，６１６５）。 ウイルス複製、ウイルス遺伝子および／またはレポーター遺伝子の発現を調節 するためにハンマーヘッドリボザイムを用いることを提案しているいくつかの論 文もある［例えば、Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｈａｙ，１９９０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ ｏｌ ．７１，２２５７−２２６４；Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ 出願番号ＷＯ９１／１３９９４；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ（Ｓｅｒ．Ｂ） ３５，１４３４−１４４３；Ｅｄｉｎｇｔ ｏｎ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ，１９９２，Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ： Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ，Ｒ．Ｐ ．ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＪ．Ｇ．Ｉｚａｎｔ編，ｐｐ２０９−２２１，Ｒａｖ ｃｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．；Ａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ出願番号 ＷＯ９４／０００１２；Ｌｅｎｅｅ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９ ４／１９４７６およびＷＯ／９５０３４０４，Ａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，１９ ９５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６，１７８１−１７９０；Ｇｒｕｂｅｒ ｅ ｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１８Ａ， １１０（Ｘ１−４０６）およびＦｅｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ ．２５０，３２９−３３８］。これらの報告のいずれも植 物遺伝 子の発現を調節するためのリボザイムの使用については報告していない。 Ｍａｚｚｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ．２０，７１５−７３１；Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＥＭ ＢＯ．Ｊ ．１１，１５２５−１５３０；Ｐｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９ ９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２，６１７５−６ １７９；Ｗｅｇｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ ｔ ．２４５，４６５−４７０；およびＳｔｅｉｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９ ９４，Ｇｅｎｅ，１４９，４７−５４は植物細胞におけるレポーター遺伝子の発 現を阻害するためのハンマーヘッドリボザイムの使用を記載している。 Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｍｏｒｅ，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２０，８３１−８３７はファセオラス ブルガリスのグル タミン合成酵素をコードしているｇｌｎａ、ｇｌｎｂ、ｇｌｎｇ、およびｇｌｎ ｇ ＲＮＡのハンマーヘッドリボザイム媒介インビトロ切断を示している。 Ｈｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（ＷＯ ９１／１８９８５）は植物油組成を改変す るため、ダイズΔ−９デサチュラーゼ酵素を用いる方法を記載している。その明 細書は他の種からΔ−９デサチュラーゼを分離するためのダイズΔ−９デサチュ ラーゼ配列の使用を記載している。 上に引用した参照文献はトウモロコシ中のリボザイムの使用を開示および／ま たは意図していないことによりここに請求される発明とは全く異なっている。さ らに、参照文献は植物細胞、いうまでもなく植物中の遺伝子をダウンレギュレー トためのリボザイムの使用を開示および／または可能にしていないと信じられる 。発明の要約 本発明は植物における遺伝子発現調節（特に酵素的核酸分子を用いる）を特色 としている。好適には、遺伝子は内在性遺伝子である。ＲＮＡ切断活性を持つ酵 素的核酸分子はハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、グループＩイ ントロン、グループIIイントロン、ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ、ニューロスポラＶＳ ＲＮＡなどの形であるであろうが、それらに制限されるわけではない。ＲＮＡ 切断活性を持つ酵素的核酸分子はモノマーまたはマルチマーとしてコードされて いる であろうが、好適にはマルチマーである。ＲＮＡ切断活性を持つ酵素的核酸分子 をコードしている核酸は読み取り枠に機能するように連結されているであろう。 任意の植物種における遺伝子発現は、植物をＲＮＡ切断活性を持つ酵素的核酸分 子をコードしている核酸での形質転換により改変されるであろう。植物を形質転 換するための多くの技術が存在する：そのような技術にはアグロバクテリウムに よる形質転換、マイクロプロジェクタイル被覆ＤＮＡによるボンバーディング、 ウィスカーまたはエレクトロポレーションが含まれるが、それらに制限されるわ けではない。任意の標的遺伝子がＲＮＡ切断活性を持つ酵素的核酸分子をコード している核酸で修飾される。ここに例示されている二つの標的はデルタ９デサチ ュラーゼおよび顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）である。 本発明の発見までは、酵素的核酸（リボザイム）のような核酸に基づく試薬は 単子葉植物のような（例えば、トウモロコシ）植物における遺伝子発現を調節お よび／または阻害することは示されていない。リボザイムは例えば、生化学的経 路に含まれている酵素の活性を調節することにより、植物細胞の特異的特性の調 節に使用できる。いくつかの例においては、特定に遺伝子の発現を完全になくす よりも発現のレベルを減少させることが望ましいであろう：リボザイムはこのこ とを達成するために使用できる。酵素的核酸に基づく技術は改変された表現型を 持つ植物細胞、植物組織または植物を発生させるための遺伝子発現の直接調節を 可能にするためにここに開発された。 リボザイム（すなわち、酵素的核酸）はヌクレオチド塩基配列特異的様式で他 の独立したＲＮＡ分子を繰り返して切断できる酵素活性を持った核酸分子である 。そのような酵素的ＲＮＡ分子は実質的に任意のＲＮＡ転写体を標的とすること ができ、インビトロおよびインビボで効率的な切断が達成されている(Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２４，４２９；Ｋｉｍ ｅｔ ａ ｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，８７ ８８；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｊ ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ ．６，９２；Ｈａｓｃｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１ ９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３４，５８５；Ｃｅｃｈ，１９８８，ＪＡＭＡ ２６ ０，３０３０；Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ．，８６，９２１８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ． ，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，１３７１ )。 それらの配列特異性のため、トランス切断リボザイムは植物、動物およびヒト を含む種々の生物体での遺伝子発現を調節するための有効な道具として使用され る（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，上記文献；Ｅｄｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ ．，上記文献；Ｕｓｍａｎ ＆ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅ ｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０ ３７）。リボザイムは細胞ＲＮＡの背景の中で特異的ＲＮＡ標的を切断するよう に設計できる。そのような切断はｍＲＮＡを非機能性とし、そのＲＮＡからのタ ンパク質発現を無効にする。このようにして、特定の表現型および／または疾患 状態に付随するタンパク質の合成が選択的に阻害される。 本発明の他の特色および利点は、以下のその好適な態様の説明および請求の範 囲から明らかになるであろう。図の簡単な説明 図１は本分野で知られているハンマーヘッドリボザイムドメインの図的表現で ある。ステムIIは≧２塩基対長であろう。各々のＮは任意のヌクレオチドであり 、各々の・は塩基対を表している。 図２は本分野で知られているハンマーヘッドリボザイムドメインの図的表現で ある；図２ｂはＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，５９６ −６００）により基質および酵素部分に分割されたハンマーヘッドリボザイムの 図的表現であり；図２ｃはＧｅｒｌａｃｈ（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４， ５８５−５９１）により二つの部分へ分割されたハンマーヘッドを示している同 様の図であり；および図２ｄはＪｅｆｆｒｉｅｓおよびＳｙｍｏｎｓ（１９８９ ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，１３７１−１３７１）により二つの 部分へ分割されたハンマーヘッドを示している同様の図である。 図３はヘアピンリボザイムの一般構造の図的表現である。ヘリックス２（Ｈ２ ）は最小の４塩基対（すなわち、ｎは１、２、３または４である）で提供され、 ヘ リックス５は随意に２またはそれ以上の塩基長（好適には３−２０塩基、すなわ ちｍは１−２０またはそれ以上である）で提供されるかもしれない。ヘリックス ２およびヘリックス５は一つまたはそれ以上の塩基（すなわち、ｒ≧１塩基）に より共有結合で連結されているであろう。ヘリックス１、４または５はリボザイ ム構造を安定化させるために二つまたはそれ以上の塩基対により伸長させてもよ く、好適にはタンパク質結合部位である。各々の例において、各々のＮおよびＮ ’は独立して任意の正常または修飾塩基であり、各々のダッシュは可能性のある 塩基対形成相互作用を表している。これらのヌクレオチドは糖、塩基またはリン 酸が修飾されていてもよい。ヘリックスにおいては完全な塩基対形成は必要とは されないが、望ましくはある。ヘリックス１および４は、いくつかの塩基対形成 が維持される限りはどのようなサイズでもよい（すなわち、ｏおよびｐは各々独 立して０から任意の数である、例えば、２０）。必須塩基は構造中で特別の塩基 として示されているが、当業者は有意な影響を与えること無く一つまたはそれ以 上が化学的に修飾（非核酸、塩基、糖および／またはリン酸修飾）または別の塩 基で置換されることを認識するであろう。ヘリックス４は二つの別々の分子から 形成できる（すなわち結合ループなしで）。結合ループは、もしあるならば、塩 基、糖またはリン酸への修飾を持つまたは持たないリボヌクレオチドであろう。 ”ｑ”は≧２塩基である。結合ループは非ヌクレオチド連結分子で置き換えるこ ともできる。Ｈは塩基Ａ、ＵまたはＣを意味する。Ｙはピリミジン塩基を意味し ている。”−”は共有結合を意味している。 図４は本分野で知られている肝炎Δウイルスリボザイムドメインの一般構造を 表している。 図５は自己切断ＶＳ ＲＮＡリボザイムドメインの一般構造を表している。 図６はＲＮａｓｅＨ到達度アッセイの模式的表現である。特に、図６の左側は 標的ＲＮＡ上の到達部位へ結合する相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの図である 。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＡ、ＢおよびＣとラベルされた太線で示さ れている。標的ＲＮＡは細い、ねじれた線で示されている。図６の右側は切断を 行った標的ＲＮＡからの非切断標的ＲＮＡのゲル分離の図である。標的ＲＮＡの 検出は本体標識Ｔ７転写体のオートラジオグラフィーにより行った。各々のレー ン に共通のバンドは非切断標的ＲＮＡを示している；各々のレーンに独特なバンド は切断生成物を示している。 図７はＧＢＳＳ ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ到達度のグラフ表現である。 図８は異なった温度でのリボザイムによるＧＢＳＳ ＲＮＡ切断のグラフ表現 である。 図９は多リボザイムによるＧＢＳＳ ＲＮＡ切断のグラフ表現である。 図１０はゼア マイスから単離されたΔ−９デサチュラーゼｃＤＮＡのヌクレ オチド配列を掲げている。 図１１および１２は植物における脂肪酸生合成の図による表現である。図１１ はＧｉｂｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒ ．１７，６２７を修正したものである。 図１３および１４はΔ−９デサチュラーゼＲＮＡのＲＮａｓｅＨ到達度のグラ フ表現である。 図１５はインビトロでのリボザイムによるΔ−９デサチュラーゼの切断を示し ている。１０／１０はハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの結合アームの長さを 示している。１０／１０はヘリックス１およびヘリックス３が各々標的ＲＮＡ( 図１)と１０塩基対を形成している。４／６および６／６はヘアピンリボザイム およびその標的間のヘリックス２／ヘリックス１相互作用を示している。４／６ はヘアピン（ＨＰ）リボザイムが標的と４塩基対形成ヘリックス２および６塩基 対形成ヘリックス１複合体を形成することを意味している（図３参照）。６／６ はヘアピンリボザイムが標的と６塩基対形成ヘリックス２および６塩基対形成ヘ リックス１複合体を形成することを意味している。切断反応は２６℃で１２０分 実施された。 図１６はインビトロでのＨＨおよびＨＰリボザイムの活性に対するアーム長変 化の影響を示している。７／７、１０／１０および１２／１２は本質的にＨＨリ ボザイムで説明した通りである。６／６、６／８、６／１２はヘアピンリボザイ ムに対してヘリックス長を変化させ、ヘリックス２では一定（６ｂｐ）であるこ とを示している。切断反応は本質的に前に説明したように実施された。 図１７、１８、１９および２３はΔ−９デサチュラーゼＲＮＡ内の種々の部位 を標的とする多リボザイムモチーフ（同じでも異なっていてもよい）を含む転写 体を構築するための非制限的方法の図的表現である。 図２０および２１はバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ酵素を用いて ＤＮＡ鋳型から転写されたリボザイムによるΔ−９デサチュラーゼＲＮＡのイン ビトロ切断を示している。 図２２はＧＢＳＳ ＲＮＡ内の種々の部位を標的とする多リボザイムモチーフ （同じでも異なっていてもよい）を含む転写体を構築するための非制限的方法の 図的表現である。 図２４はリボザイムによるΔ−９デサチュラーゼＲＮＡの切断を示している。 ４５３マルチマーはハンマーヘッドリボザイム部位４５３、４６４、４７５およ び４８４に対して標的化された多リボザイム構築物を表している。２５２マルチ マーはハンマーヘッドリボザイム部位２５２、２７１、３１３および３２６に対 して標的化された多リボザイム構築物を表している。２３８マルチマーは三つの ハンマーヘッドリボザイム部位２５２、２５９および３２６および一つのヘアピ ンリボザイム部位２３８（ＨＰ）に対して標的化された多リボザイム構築物を表 している。２５９マルチマーは二つのハンマーヘッドリボザイム部位２７１およ び３１３および一つのヘアピンリボザイム部位２５９（ＨＰ）に対して標的化さ れた多リボザイム構築物を表している。 図２５はリボザイムを持たない対照（Ｃ、Ｆ，Ｉ、Ｊ，Ｎ、Ｐ，Ｑ）および活 性リボザイムＲＰＡ６３形質転換体（ＡＡ、ＤＤ、ＥＥ、ＦＦ、ＧＧ、ＨＨ、Ｊ Ｊ，ＫＫ）のＧＢＳＳ ｍＲＮＡレベルを示している。 図２６は非形質転換植物（ＮＴ）、８５−０６高ステアリン酸植物（１、３、 ５、８、１２、１４）および形質転換（不適切リボザイム）対照植物（ＲＰＡ６ ３−３３、ＲＰＡ６３−５１，ＲＰＡ６３−６５）におけるΔ−９デサチュラー ゼｍＲＮＡレベルを示している。 図２７は非形質転換植物（ＮＴＯ）、８５−１５高ステアリン酸植物（０１、 ０６、０７、１０、１１、１２）および８５−１５正常ステアリン酸植物（０２ 、０５、０９、１４）におけるΔ−９デサチュラーゼｍＲＮＡレベルを示してい る。 図２８は非形質転換植物（ＮＴＹ）、１１３−０６不活性リボザイム植物（０ ２、０４、０７、１０、１１）におけるΔ−９デサチュラーゼｍＲＮＡレベルを 示している。 図２９ａおよび２９ｂはトウモロコシ葉（Ｒ０）におけるΔ−９デサチュラー ゼタンパク質レベルを示している。（ａ）株ＨｉII、非形質転換植物ａ−ｅおよ びリボザイム不活性株ＲＰＡ１１３−１７（植物１−６）。（ｂ）リボザイム活 性株ＲＰＡ−８５−１５、植物１−１５。 図３０はＲＰＡ−８５−０６植物の葉中のステアリン酸を示している。 図３１は３回のアッセイの結果であるＲＰＡ−８５−１５植物の葉中のステア リン酸を示している。 図３２はＲＰＡ１１３−０６植物の葉中のステアリン酸を示している。 図３３はＲＰＡ１１３−１７植物の葉中のステアリン酸を示している。 図３４は対照植物の葉中のステアリン酸を示している。 図３５は高ステアリン酸植物交雑（ＲＰＡ８５−１５．０７自己）からのＲ１ 植物の葉ステアリン酸を示している。 図３６は次世代トウモロコシ葉中のΔ−９デサチュラーゼレベルを示している 。＊はこれらの植物が高ステアリン酸含量を示したことを表している。 図３７はアンチセンスΔ−９デサチュラーゼで形質転換された培養物（３０８ ／４３０−０１２）の個々の体細胞胚中のステアリン酸を示している。 図３８はアンチセンスΔ−９デサチュラーゼで形質転換された培養物（３０８ ／４３０−０１５）の個々の体細胞胚中のステアリン酸を示している。 図３９はアンチセンスΔ−９デサチュラーゼで形質転換された培養物（３０８ ／４３０−０１２）から再生された植物の個々の葉中のステアリン酸を示してい る。 図４０は非形質転換対照株（Ｑ８０６およびアンチセンス株３０８／４２５− １２．２．１）の単一殻粒中のアミロース含量を示している。 図４１はサザン陰性株（ＲＰＡ６３−０３０６）およびサザン陽性株（ＲＰＡ ６３−０２１８）の単一仁中のＧＢＳＳ活性を示している。 図４２は本発明の酵素的核酸を発現するための使用できる形質転換ベクターを 示している。発明の詳細な説明 本発明は、特に酵素的核酸分子を用いる植物の遺伝子発現を調節するための組 成物および方法に関している。 以下の句および用語は下記のように定義される： ”阻害する”または”調節する”とはＧＢＳＳおよびΔ−９デサチュラーゼの ような酵素の活性またはこれらの遺伝子によりコードされているｍＲＮＡのレベ ルが、酵素的核酸の不在で観察されるよりも低く、および好適にはｍＲＮＡの同 一部位へ結合できるがそのＲＮＡを切断できない不活性ＲＮＡ分子の存在下で観 察されるレベルよりも低く減少させられることを意味している。 ”酵素的核酸分子”とは特定された遺伝子標的への基質結合領域と相補的であ り、その標的を特異的に切断する活性を示す酵素活性も持っている核酸分子を意 味している。すなわち、酵素的核酸分子は分子内部的にＲＮＡ（またはＤＮＡ） を切断でき、それにより標的ＲＮＡ分子を不活性化する。この相補性が標的ＲＮ Ａへの酵素的核酸分子の十分なハイブリダイゼーションを可能にするように機能 し、切断を可能にする。１００パーセント相補性が望ましいが、５０−７５％程 度の低い相補性でも本発明においては有用であろう。核酸は塩基、糖および／ま たはリン酸基が修飾されていてもよい。用語酵素的核酸はリボザイム、触媒的Ｒ ＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、ヌクレオザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＮＡ 酵素、ＲＮＡｚｙｍｅ、ポリリボザイム、分子ハサミ、自己スプライシングＲＮ Ａ、自己切断ＲＮＡ、シスー切断ＲＮＡ、自己分解ＲＮＡ、エンドリボヌクレア ーゼ、ミニザイム、リードザイムまたはＤＮＡ酵素と相互交換可能的に使用され る。本用語は一つまたはそれ以上のリボヌクレオチドを含むおよび以下に記載さ れるような多数の他の型のヌクレオチドまたは偽塩基残基を含むであろう酵素的 ＲＮＡ分子を包含している。 ”相補性”とは古典的ワトソンークリックまたは非古典的型（例えば、フーグ スティーン型）の塩基対相互作用により他のＲＮＡ配列と水素結合を形成できる 核酸を意味している。 ”ベクター”とは所望の核酸を送達および／または発現するために使用される 核酸および／またはウイルスに基づいた技術を意味している。 ”遺伝子”とはＲＮＡをコードしている核酸を意味している。 ”植物遺伝子”とは植物によりコードされている遺伝子を意味している。 ”内在性”遺伝子とは植物細胞においてゲノム内の天然の位置に通常観察され る遺伝子を意味している。 ”外来”または”非相同”遺伝子とは宿主植物細胞には通常観察されず、標準 遺伝子導入技術により導入された遺伝子を意味している。 ”核酸”とは一本鎖または二本鎖で、糖、リン酸およびプリンまたはピリミジ ン塩基（同じでも異なっていてもよく、および修飾されていても修飾されていな くてもよい）を含むヌクレオチドから成る分子を意味している。 ”ゲノム”とは生物体の細胞および／またはウイルスに含まれている遺伝物質 を意味している。 ”ｍＲＮＡ”とは細胞によりタンパク質に翻訳されるであろうＲＮＡを意味し ている。 ”ｃＤＮＡ”とはｍＲＮＡと相補的であり、ｍＲＮＡから誘導されるＤＮＡを 意味している。 ”ｄｓＤＮＡ”とは二本鎖ｃＤＮＡを意味している。 ”センス”ＲＮＡとはｍＲＮＡ配列を含むＲＮＡ転写体を意味している。 ”アンチセンス”ＲＮＡとは標的ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡの全部または 一部と相補的な配列を含み、一次転写体および／またはｍＲＮＡの加工、輸送お よび／または翻訳を妨害することにより標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ転写 体を意味している。相補性は標的ＲＮＡの任意の部分、すなわち、５’非コード 配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列に存在してもよい。アン チセンスＲＮＡは通常センスＲＮＡの鏡像体である。 本明細書で使用される場合、”発現”とは植物細胞内部での酵素的核酸分子、 ｍＲＮＡおよび／またはアンチセンスＲＮＡ、の転写および安定な蓄積を意味し ている。遺伝子の発現には遺伝子の転写およびｍＲＮＡの前駆または成熟タンパ ク質への翻訳が含まれる。 ”共抑制”とは遺伝子と実質的に相同的である外来遺伝子の発現を意味し、植 物細胞中では外来および／または内在性タンパク質生成物の活性の減少が起きる 。 ”改変されたレベル”とはトランスジェニック生物体の遺伝子産物の製造レベ ルが非トランスジェニック生物体のレベルと異なっていることを意味している。 ”プロモーター”とは遺伝子の発現を制御する遺伝子内のヌクレオチド配列要 素を意味している。プロモーター配列は効率のよい転写に必要とされるＲＮＡポ リメラーゼおよび他の転写因子を認識する。種々の起源のプロモーターが、リボ ザイムを発現するために植物細胞中で効率よく使用できる。例えば、オクトピン 合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マノピン合成酵素プロ モーターのような細菌起源のプロモーター；カリフラワーモザイクウイルス（３ ５Ｓ）のようなウイルス起源のプロモーター；リブロース−１，６−ビホスフェ ート（ＲＵＢＰ）、カルボキシラーゼスモールサブユニット（ｓｓｕ）のような 植物プロモーター、ベーターコングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモ ーター、ＡＤＨプロモーター、熱ショックプロモーターおよび組織特異性プロモ ーター。プロモーターは転写効率を改良するある種のエンハンサー要素も含んで いるであろう。 ”エンハンサー”とはプロモーター活性を刺激できるヌクレオチド配列要素を 意味している（Ａｄｈ）。 ”構成的プロモーター”とはすべての細胞型においておよびすべての時に連続 的遺伝子発現を起こさせるプロモーター要素を意味している（アクチン、ユビキ チン、ＣａＭＶ ３５Ｓ）。 ”組織特異的”プロモーターとは葉または種のような特定の細胞または組織型 において遺伝子発現に関与するプロモーター要素を意味している（ゼイン、オレ オシン、ナピン、ＡＣＰ）。 ”分化特異的”プロモーターとは初期または後期胚発生のような特定の植物分 化段階で遺伝子発現に関与するプロモーター要素を意味している。 ”誘導可能プロモーター”とは物理的刺激（熱ショック遺伝子）；光（ＲＵＢ Ｐカルボキシラーゼ）；ホルモン（Ｅｍ）；代謝物およびストレスのような特異 的信号に応答した遺伝子発現に関与するプロモーター要素を意味している。 ”植物”とは真核生物および原核生物両方の光合成生物体を意味している。 ”被子植物”とは子房で包まれた種を持つ植物を意味している（例えば、コー ヒー、タバコ、ソラマメ、エンドウ）。 ”裸子植物”とは子房で包まれていずにさらされた種を持つ植物を意味してい る（例えば、マツ、トウヒ）。 ”単子葉植物”とはただ一つの子葉（胚の最初の葉）の存在により特徴付けら れる植物を意味している。例えば、トウモロコシ、小麦、米その他。 ”双子葉植物”とは二つの子葉（胚の最初の葉）を持つ種を産生する植物を意 味している。例えば、コーヒー、キャノーラ、エンドウその他。 ”トランスジェニック植物”とは外来遺伝子を発現している植物を意味してい る。 ”読み取り枠”とは定義された翻訳開始および終止領域を持ち、アミノ酸配列 をコードしているイントロンなしのヌクレオチド配列を意味している。 本発明は所望の標的のＲＮＡに高い特異性を示す一群の酵素的切断剤を製造す る方法を提供する。酵素的核酸分子は特異的遺伝子阻害が達成できるように標的 の特異的配列領域へ標的化されているであろう。もしくは、酵素的核酸は関連す る酵素ファミリーの遺伝子発現を阻害するために遺伝子ファミリーの高度に保存 されている領域へ標的化されているかもしれない。リボザイムは本発明の核酸を 発現するベクターで形質転換されている植物において発現されるであろう。 治療的処置に影響を及ぼすのに必要なリボザイムの濃度はより低いので、リボ ザイムの酵素的性質は他の技術よりも優れている。この利点は酵素的に働くリボ ザイムの能力を反映している。従って、一つのリボザイム分子は多くの標的ＲＮ Ａ分子を切断することができる。さらに、リボザイムは高度に特異的な阻害剤で あり、阻害の特異性は標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成機構のみでなく、標的Ｒ ＮＡ切断の機構にも依存する。切断部位近くの一つの不適当な組み合わせまたは 塩基置換はリボザイムの触媒活性を完全に除去することができる。 現在、天然に存在する酵素的ＲＮＡの六つの基本的な種類が知られている。各 々が生理学的条件下、トランスのＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒 できる。表Ｉはこれらのリボザイムのいくつかの特性を要約したものである。一 般に、酵素的核酸は最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのよう な 結合は酵素的核酸の標的結合部分を通して起こり、標的ＲＮＡを切断するために 作用する分子の酵素的部分をきわめて接近して保つ。従って、酵素的核酸は相補 的塩基対形成を通して最初に標的ＲＮＡを認識した後に結合し、一度正しい部位 へ結合されたら酵素的に働いて標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの 戦略的切断は、コードされているタンパク質の合成を指示する能力を破壊するで あろう。酵素的核酸が結合してそのＲＮＡを切断した後は、別の標的を探すため にＲＮＡから放出され、新しい標的を繰り返し結合して切断できる。 本発明の一つの好適な態様では、酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘア ピンモチーフに形成されているが、肝炎Δウイルス、グループＩイントロン、グ ループIIイントロン、ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と共同して）ま たはニューロスポラＶＳ ＲＮＡのモチーフに形成されてもよい。そのようなハ ンマーヘッドモチーフはＤｒｅｙｆｕｓ，上記文献，Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ， １９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉ ｒｕｓｅｓ ８，１８３により記載されており；ヘアピンモチーフはＨａｍｐｅ ｌ ｅｔ ａｌ，ＥＰ０３６Ｏ２５７，Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，１ ９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８,４９２９,Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８９ Ｇｅｎｅ ８２，５３，Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒ ｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３，およびＨａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，２９９により記載 されており；肝炎ΔウイルスはＰｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１６により記載されており；ＲＮａｓｅＰ モチーフはＧｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ.,１９８３ Ｃｅｌｌ ３５，８４９，Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２４９,７８３,Ｌｉ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ,１９９６,Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２４,８３５により記載されており；ニューロスポラＶ Ｓ ＲＮＡリボザイムはＣｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉ ｎｓ，１９９０ Ｃｅｌｌ ６１，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３Ｂ ｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，２７９５−２７９９；Ｇｕｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎ ｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６３）により記載されており；グループ IIイントロンはＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ ．２，７６１，Ｍｉｃｈｅｌｓ ａｎｄ Ｐｙｌｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ３４，２９６５により記載されており；およびグループＩイントロ ンはＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９８７，０７１号に記載されてい る。これらの特異的モチーフは本発明を制限するものではなく、当業者は標的遺 伝子ＲＮＡ領域の一つまたはそれ以上と相補的である特異的基質結合部位を持ち 、基質結合部位内またはその周囲に分子にＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド 配列を持っていることが本発明の酵素的核酸分子に重要であることを認識するで あろう。 本発明の酵素的核酸は真核生物プロモーターから細胞内で発現されるであろう ［Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ．ａｌ．，国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／１３９９４； Ｅｄｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ，１９９２，Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａ ｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮ Ａ ，Ｒ．Ｐ．ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＪ．Ｇ．Ｉｚａｎｔ編，ｐｐ ２０９−２ ２１，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．；Ａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，国際Ｐ ＣＴ出願番号ＷＯ９４／０００１２；Ｌｅｎｅｅ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ出 願番号ＷＯ９４／１９４７６およびＷＯ９５０３４０４，Ａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６，１７８１−１７９０；Ｍｃ Ｅｌｒｏｙ ａｎｄ Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，６ ２；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｕｐｐｌ．１８Ａ ，１１０（Ｘ１−４０６）およびＦｅｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５０，３２９−３３８；これら のすべては本明細書において援用される］。当業者は本明細書の教えからリボザ イムは適当なプロモーターから真核生物植物細胞で発現できることを認識するで あろう。リボザイム発現は構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは 誘導可能プロモーターの制御下にある。 リボザイム仲介調節を得るため、リボザイムＲＮＡは植物内へ導入される。本 明細書に例示した形質転換実験で使用されたプラスミドの構築のために以下に実 施例が提供されるが、植物の形質転換で使用できる多数の異なった型のプラスミ ドを設計するのは当業者にはよく知られたことである。Ｂｅｖａｎ，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１２，８７１１−８７２１（本明細書において 援用される）を参照されたい。また植物を形質転換させる多くの方法がある。以 下の実施例において、胚発生トウモロコシ培養物はヘリウムが吹き付けられた。 遺伝子銃（Ｃｏｒｎｅｌｌの米国特許第４，９４５，０５０号およびＤｏｗＥｌ ａｎｃｏの第５，１４１，１３１号）を用いることに加えて、植物はアグロバク テリウム技術を用いて形質転換されるであろう、トレド大学の米国特許第５，１ ７７，０１０号、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍの５，１０４，３１０号、欧州特許出願第 ０１３１６２４Ｂ１号、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの欧州特許出願第１２０５１６ ，１５９４１８Ｂ１および１７６，１１２号、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの米国特 許出願第５，１４９，６４５、５，４６９，９７６、５，４６４，７６３および ４，９４０，８３８および４，６９３，９７６、ＭａｘＰｌａｎｃｋの欧州特許 出願第１１６７１８、２９０７９９、３２０５００号、日本タバコの欧州特許出 願第６０４６６２および６２７７５２号、Ｃｉｂａ Ｇｅｉｇｙの欧州特許出願 第０２６７１５９および０２９２４３５号および米国特許出願第５，２３１，０ １９号、Ｃａｌｇｅｎｅの米国特許出願第５，４６３，１７４および４，７６２ ，７８５、およびＡｇｒａｃｅｔｕｓの米国特許出願第５，００４，８６３およ び５，１５９，１３５号を参照されたい；ウィスカー技術、Ｚｅｎｅｃａの米国 特許出願第５，３０２，５２３および５，４６４，７６５を参照されたい；エレ クトロポレーション技術、Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ研究所のＷＯ８７／０ ６６１４、Ｄｅｋａｌｂの第５，４７２，８６９および５，３８４，２５３号、 ＰＧＳのＷＯ９２０９６９６およびＷＯ９３２１３３５を参照されたい；これら のすべては全文のまま本明細書において援用される。植物を形質転換するための 多くの技術に加え、外来物質（典型的にはＲＮＡまたはＤＮＡを含んでいるプラ スミド）と接触させる組織の型も同様に変化するであろう。そのような組織には 胚発生組織、組織型ＩおよびII、形質転換および続いてのトランスジェニック植 物内への再生に受容的な任意の組織が含まれるであろうが、それらに制限される わけでは ない。別の変化しうるものは選択可能マーカーの選択である。特定のマーカーの 選択は当業者の判断であるが、以下の選択可能マーカーが、選択可能マーカーと して機能することができるであろう本明細書に掲げられていない他の遺伝子とと もに使用される。そのような選択可能マーカーにはクロロスルフロン、ヒグロマ イシン、ＰＡＴおよび／またはｂａｒ、ブロモキシニル、カナマイシンなどが含 まれるが、これらに制限されるわけではない。ｂａｒ遺伝子はストルプトムセス （特にヒグロスコピカスまたはビリドクロモゲネス種）から単離されるであろう 。ｂａｒ遺伝子はホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ） をコードしており、除草剤ビアラホス ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）中の活性 成分を不活性化する。従って技術の多数の組み合わせが、リボザイム仲介調節を 用いると使用されるであろう。 リボザイムは個々に単量体として発現され、すなわち、一つの部位が標的化さ れた一つのリボザイムが転写体当たりで発現される。もしくは、一つ以上の標的 部位が標的化された二つまたはそれ以上のリボザイムが一つのＲＮＡ転写体の一 部として発現される。一つ以上の切断部位が標的化された一つ以上のリボザイム を含む一つのＲＮＡ転写体が遺伝子発現の効率的な調節を達成するために容易に 発生される。これらのマルチマー構築物内のリボザイムは同じかまたは異なって いる。例えば、マルチマー構築物は複数のハンマーヘッドリボザイムまたはヘア ピンリボザイムまたは他のリボザイムモチーフを含んでいてもよい。もしくは、 マルチマー構築物は、ハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムのような複数の 異なったリボザイムモチーフを含むように設計してもよい。特に、マルチマーリ ボザイム構築物は、一連のリボザイムモチーフが一つのＲＮＡ転写体に縦に一列 に並んでお互いに連結されるように設計される。リボザイムはヌクレオチドリン カー配列によりお互いに連結され、ここでリンカー配列は標的ＲＮＡに相補的で も相補的でなくてもよい。マルチマーリボザイム構築物（ポリリボザイム）は遺 伝子発現のリボザイム仲介調節の効率を改良しているようである。 リボザイムの活性はまた第二のリボザイムによる一次転写体からのそれらの放 出により増加できる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５ ６９、およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５ （両方とも本明細書において全文が援用される）；Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ．，２７， １５−６；Ｔａｉｒａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１ ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｔｓ Ｒｅｓ ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａ ｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５ ５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６９，２５８５６）。 遺伝子発現のリボザイム仲介調節は被子植物、裸子植物、単子葉植物および双 子葉植物を含む広い範囲の植物で実施できる。問題とする植物には：米、小麦、 大麦、トウモロコシのような穀類；ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、綿、トウモ ロコシ、ココア、サフラワー、ギネアアブラヤシ、ココヤシ、アマ、ヒマ、ピー ナッツのような油をとる作物；コーヒーおよび紅茶のようなプランテーション作 物；パイナップル、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ブドウ、オレンジ、リンゴのよ うな果実；カリフラワー、キャベツ、メロン、ピーマン、トマト、ニンジン、レ タス、セロリ、ジャガイモ、ブロッコリのような野菜；ダイズ、ソラマメ、エン ドウのような豆科植物；カーネーション、キク、デージー、チューリップ、カス ミソウ、アルストロメリア、マリーゴールド、ペチュニア、バラのような花；オ リーブ、コルク、ポプラ、マツのような木；ウォルナッツ、ピスタチオのような 堅果などが含まれるがそれらに制限されるわけではない。以下は遺伝子発現の調 節におけるリボザイムの一般的悠揚性を説明する非制限的実施例である。 カフェイン合成に含まれる遺伝子発現のリボザイム仲介ダウンレギュレーショ ンはコーヒー豆におけるカフェイン濃度を著しく変化させるのに使用できる。コ ーヒー植物における７−メチルキサントシンおよび／または３−メチルトランス フェラーゼのような遺伝子の発現は、カフェイン合成を減少させるためにリボザ イムを用いて容易に調節できる（ＡｄａｍｓおよびＺａｒｏｗｉｔｚ、米国特許 出願第５，３３４，５２９号；本明細書において援用される）。 Ｎ−メチルプトレシン酸化酵素またはＮ−メチルトランスフェラーゼのような ニコチン産生に含まれている遺伝子を標的としたリボザイムを発現しているトラ ンスジェニックタバコ植物（Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．，上記文献）は 改変されたニコチン濃度を持つ葉を産生するであろう。 エチレン形成酵素、ペクチン メチルトランスフェラーゼ、ペクチン エステ ラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣ Ｃ）合成酵素のような果実の熟成に含まれる遺伝子を標的とするリボザイムを発 現しているトランスジェニック植物（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎ ａｔｕｒｅ ，３３４，７２４；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌ．Ｍｏ ｌ．Ｂｉｏｌ ．，１９，６９；Ｔｉｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａ ｎｔ Ｃｅｌｌ ,４,６６７；Ｐｉｃｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，１９９３,Ｔｈｅ Ｐ ｌａｎｔ Ｊ ．３，４６９；Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記文献；Ｊ ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，５６ ）はトマトおよびリンゴのような果実の熟成を遅延させるであろう。 カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、カルコンフラバノン異性化酵素（ＣＨＩ）、フ ェニルアラニン アンモニア脱離酵素またはデヒドロフラボノール（ＤＦ）ヒド ロキシラーゼ、ＤＦ還元酵素のような花色素形成に含まれる遺伝子を標的とする リボザイムを発現しているトランスジェニック植物（Ｋｒｏｌ ｖａｎ ｄｅｒ ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３３，８６６；Ｋｒｏｌ ｖａｎ ｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，４５７ ；Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記文献；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９ ６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，６８６）は異なった色を持つバラ、ペチュニアの ような花をつけるであろう。 リグニンは植物の細胞壁の機械的強度を維持するために必要な有機化合物であ る。必須であるにもかかわらず、リグニンはいくつかの欠点を持っている。シラ ージ作物の不消化性を起こし、木材パルプからの紙生産には望ましくないなどで ある。Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シンナモイル−ＣｏＡ：ＮＡＤＰＨ還元 酵素またはシンナモイルアルコール脱水素酵素のようなリグニン産生に含まれる 遺伝子を標的とするリボザイムを発現しているトランスジェニック植物（Ｄｏｏ ｒｓｓｃｌａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ．８， ８５５;Ａｔａｎａｓｓｏｖａ ｅｔ ａｌ.,１９９５,Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ．８，４６５；Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記文献；Ｄｗｉｖｅｄｉ ｅ ｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６，６１）はリグニンの 改変されたレベルを持っているであろう。 有用なリボザイムの他の有用な標的はＤｒａｐｅｒら、国際ＰＣＴ出願番号Ｗ Ｏ９３／２３５６９、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０２ ５９５、ならびにＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３１ ５４１（全文のまま本明細書において援用される）に開示されている。植物における顆粒結合デンプン合成酵素遺伝子発現の調節 植物において、デンプン生合成は葉緑体（短期デンプン貯蔵）およびアミロプ ラスト（長期デンプン貯蔵）の両方で起こる。デンプン顆粒はα（１−４）結合 α−Ｄ−グルコース単位の直鎖（アミロース）およびα（１−６）結合により架 橋結合されたアミロースの分岐鎖形（アミロペクチン）から成っている。植物に おいてデンプンの合成に含まれている酵素はデンプン合成酵素であり、それはＡ ＤＰ−グルコースを用いてα（１−４）−グルコースの直鎖を産生する。二つの 主たるデンプン合成酵素の型が植物中で観察されている：顆粒結合デンプン合成 酵素（ＧＢＳＳ）および葉緑体の細胞間質およびアミロプラストに位置している 可溶性形（可溶性デンプン合成酵素）。この酵素の両方の型ともＡＤＰ−Ｄ−グ ルコースを利用するが、顆粒結合形はまた優先してＵＤＰ−Ｄ−グルコースを利 用する。ろう質タンパク質として知られているＧＢＳＳはそれが特性付けられた 種々の植物で５５から７０ｋＤａの分子量を持っている。いくつかの植物種にお いて、ＧＢＳＳ遺伝子に影響を及ぼす突然変異はアミロースの損失を生じたが、 デンプンの総量は比較的変化せずに残っていた。ＧＢＳＳ活性の損失に加え、こ れらの突然変異体ではＧＢＳＳタンパク質レベルが減少していたかまたはなくな っていた（Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ ａｎｄ Ｐｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ ｓｉｏｌ ．７８：８４９−８Ｓ２（１９８５），Ｓａｎｏ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐ ｌ．Ｇｅｎｅｔ ．６８：４６７−４７３（１９８４），Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈ ｅｒｍｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：２ １７−２２１（１９８７），Ｓｈｕｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ３５，２２５ −２３３（１９８３），Ｅｃｈｔ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ ９９：２７５−２８４（１９８１））。ＧＢＳＳ突然変異体および野生型植 物の両方における分岐酵素並びに可溶性ＡＤＰ−グルコースデンプングリコシル トランスフェラーゼの存在は、分岐鎖ポリマーアミロペクチンおよび直鎖ポリマ ーアミロース形成のための独立した経路の存在を示している。 Ｗｘ（ろう質）座位はデンプン生合成に含まれている顆粒結合グルコシルトラ ンスフェラーゼをコードしている。この酵素の発現はトウモロコシの内胚乳、花 粉および胚嚢に制限されている。この座位の突然変異は突然変異体殻粒の外観( 殻粒中のアミロース組成が減少した結果としての表現型)からろう質と称されて きた。トウモロコシにおいてこの酵素は発育している内胚乳のアミロプラスト内 へ輸送され、そこでアミロースの産生を触媒する。トウモロコシ殻粒は約７０％ がデンプンであり、その２７％が直鎖アミロースであり、７３％がアミロペクチ ンである。ろう質は顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）をコードしている遺 伝子の劣性突然変異である。この劣性突然変異のホモ接合性の植物はアミロペク チンの形のデンプンを１００％含む殼粒を産生する。 触媒活性および促進された部位特異性を持つ（以下に説明するように）リボザ イムはアンチセンスオリゴヌクレオチドよりもより強力でおよび多分より特異的 な阻害分子であろう。さらに、これらのリボザイムはＧＢＳＳ活性を阻害でき、 およびリボザイムの触媒活性はそれらの阻害効果に対して必要とされる。当業者 にとっては、トウモロコシ以外の植物種のＧＢＳＳ活性に必要とされる標的ｍＲ ＮＡを切断する他のリボザイムが設計されるであろうことは実施例から明かであ ろう。 従って、好適な態様において、本発明はアミロース産生に含まれる酵素を阻害 する（例えば、ＧＢＳＳ活性を減少させることにより）リボザイムを特色とする 。これらの内在的に発現されたＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの到達可能領域に結 合する基質結合ドメインを含んでいる。本ＲＮＡ分子はまたＲＮＡの切断を触媒 するドメインも含んでいる。本ＲＮＡは好適にはハンマーヘッドまたはヘアピン モチーフのリボザイムである。結合により、リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断し 、翻訳およびタンパク質蓄積を妨げる。標的遺伝子の発現がないと、アミロース 産生は減少または阻害される。特異的実施例が下に提供される。 好適な態様は表IIIＡ、ＶＡおよびＶＢの結合配列と相補的である結合アーム を持っているリボザイムを含んでいる。そのようなリボザイムの例は表IIIＢ− Ｖに示されている。当業者は、そのような例は一つの植物（例えばトウモロコシ ）ｍＲＮＡに対して設計されてはいるが、他の植物種のｍＲＮＡと相補的な類似 のリボザイムが作製できることを認識するであろう。相補性により、結合アーム は配列特異的様式で標的ＲＮＡとのリボザイムの相互作用を可能にし、植物ｍＲ ＮＡ標的の切断を起こす。そのようなリボザイムの例は本質的に表IIIＢ−Ｖに 示されている配列からなっている。 好適な態様はデンプン顆粒結合ＡＤＰ（ＵＤＰ）−グルコースの阻害に使用す るためのリボザイムおよび方法である：α（１−４）−Ｄ−グルカン ４−α− グルコシル トランスフェラーゼ、すなわち、植物の顆粒結合デンプン合成酵素 （ＧＢＳＳ）活性。このことはリボザイムによる遺伝子発現の阻害を通して達成 され、植物でのＧＢＳＳ活性の減少または除去を生じる。 本発明の別の態様では、標的分子を切断してアミロース産生を阻害するリボザ イムは植物ゲノム内へ挿入された転写ユニットから発現される。好適には、植物 ゲノム内へ安定に組み込むことができ、およびリボザイムを発現している形質転 換体植物株の選択ができる組換え体ベクターは植物細胞中の構成的または誘導可 能プロモーターにより発現される。発現された後は、リボザイムは標的ｍＲＮＡ を切断し、宿主細胞のアミロース産生を減少させる。植物細胞で発現されたリボ ザイムは構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは誘導可能プロモー ターの制御下にある。 トウモロコシデンプンの改変は特異的遺伝子発現の減少ができるリボザイム技 術の重要な応用である。高レベルのアミロペクチンはトウモロコシの湿式製粉工 程に望まれており、高アミロペクチントウモロコシは消化性を促進し、それによ り食品のエネルギー利用可能性を増加させるといういくつかの証拠もある。ほと んど１０％の湿式製粉トウモロコシはろう質表現型を持ち、その劣った性質のた め伝統的なろう質種は取扱が非常に困難である。ＧＢＳＳ ｍＲＮＡを切断する ように標的化されたリボザイムは植物のＤＢＳＳ活性を減少させ、および特に、 トウモロコシ内胚乳は優勢な特性として働き、取扱がより容易であろうろう質表 現型を持つトウモロコシを産生するであろう。植物における脂肪酸飽和プロファイルの改変 植物における脂肪酸の生合成は葉緑体で開始される。脂肪酸は脂肪酸合成酵素 複合体（ＦＡＳ）によりアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）のチオエステルと して合成される。１６炭素の鎖長を持つ脂肪酸は以下の三つの経路の一つに従う ：１）合成後直ちに放出され、葉緑体内でさらに修飾を受けるため葉緑体アシル トランスフェラーゼによりグリセロール ３−リン酸（Ｇ３Ｐ）に移される；２ ）チオエステラーゼによるプラスチドからの排出により放出され、補酵素Ａ(Ｃ ｏＡ)へ移される；または３）Ｃ１８鎖長へさらに伸長される。Ｃ１８鎖は迅速 にステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼによりＣ９位が不飽和化される。葉緑体 内でのＧ３Ｐへのオレイン酸（１８：１）基の即時の輸送または葉緑体からの排 出およびチオエステラーゼによるオレイル−ＣｏＡへの変換が続く（Ｓｏｍｅｒ ｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｂｒｏｗｓｅ，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：８０ −８７）。Ｃ１６脂肪酸の大多数は第三の経路に従う。 トウモロコシ種子油において主たるトリグリセリドは小胞体で製造される。ほ とんどのオレイン酸（１８：１）およびいくらかのパルミチン酸（１６：０）は ホスファチジン酸からＧ３Ｐ移され、次にジアシルグリセリドおよびホスファチ ジルコリンへ変換される。小胞体において膜結合デサチュラーゼによるホスファ チジルコリン上のアシル鎖のさらなる不飽和化が起こる。ジーおよびトリ−不飽 和化鎖は次にアセチル−ＣｏＡプールの中へ放出され、トリグリセリドの製造に おいてジアシルグリセロールのグリセロール主鎖のＣ３位へ移される（Ｆｒｅｎ ｔｚｅｎ，１９９３ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ ，ｐ．１９５−２３０，（ｅｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｔ．Ｓ．）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＡ．）。植物脂肪酸生合成経路のスキームが図１１お よび１２に示されている。トウモロコシ種子油における三つの主たる脂肪酸はリ ノール酸（１８：２、約５９％）、オレイン酸（１８：１、約２６％）およびパ ルミチン酸（１６：０、約１１％）である。これらは平均値であり、遺伝子型に 依存して幾分異なっているであろう；しかしながら、過去１０年以上に渡って分 析 された米国コーンベルト産の油の複合試料はこの組成に一致していた（Ｇｌｏｖ ｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｔｚ，１９８７：Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｑｕａｌｉｔ ｙ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｇｒａｉｎｓ：ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ａｇｒｏｎ ｏｍｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ．，ｐ．１８３−３３６，（ｅｄｓ．Ｏｌｓ ｏｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｊ．）Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｇｒｏｎｏｍｙ ．Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．；Ｆｉｔｃｈ−Ｈａｕｍａｎｎ，１９８５ Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．６２：１５２４−１５３１；Ｓｔｒｅｃ ｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｅｄｉｂｌｅ ｆａｔｓ ａｎｄ ｏｉｌｓ ｐｒｏｃｅｓｓｉんｇ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｄ ｅｒｎ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ （ｅｄ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．）Ａｍ．Ｏｉ ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃ．Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＬ）。このＣ１８鎖長 の優位性は、Ｃ１８炭素鎖の産生に関与する脂肪酸合成酵素（１８：１の産生に 対してはステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Δ−９デサチュラーゼ）および １８：１から１８：２への変換にはミクロソームΔ−１２デサチュラーゼ）のよ うないくつかの鍵となる酵素の多さおよび活性を反映しているであろう。 植物のΔ−９デサチュラーゼ（ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼとも称さ れる）は基質としてアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）に結合されたＣ１８お よび時々Ｃ１６アシル鎖を用いる可溶性葉緑体酵素である（ＭｃＫｅｏｎ，Ｔ． Ａ． ａｎｄ Ｓｔｕｍｐｆ，Ｐ．Ｋ．，１９８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５７：１２１４１−１２１４７）。これは哺乳類、低級真核生物およびラン藻 類Δ−９デサチュラーゼとは対照的である。ラットおよび酵母Δ−９デサチュラ ーゼは基質としてアシル−ＣｏＡ鎖を用いる膜結合ミクロソーム酵素であり、ラ ン藻類Δ−９デサチュラーゼは基質としてジアシルグリセロール上のアシル鎖を 使用する。現在まで、双子葉植物からのいくつかのΔ−９デサチュラーゼｃＤＮ Ａクローンが単離され特性付けられている（Ｓｈａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｓｏｍ ｅｒｖｉｌｌｅ，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２５１０−２５１４；Ｋｎｕｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｌａ ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ．９６：３４４−３４５；Ｓａｔｏ ｅｔ．ａｌ．，１９ ９２ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：３６２−３６３；Ｓｈａｎｋｌｉｎ ｅ ｔ．ａｌ．，１９９１ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：４６７−４６８； Ｓｌｏｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２０：１５１−１５５；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ．１００：５３３−５３４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８： ２５７８− ２５８２）。異なった植物のΔ−９デサチュラーゼ配列の比較は、これが高度に 保存された酵素であることを示唆しており、アミノ酸レベル（約９０％）および ヌクレオチドレベル（約８０％）の両方において高度のレベルで同一である。し かしながら、非常に異なった生理学的および酵素学的性質から予期されるように 、植物およびその他のΔ−９デサチュラーゼ間には配列類似性は存在していない （ＳｈａｎｋｌｉｎおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、上記文献）。 ヒマの実デサチュラーゼ（およびその他の）精製および特性付けは、Δ−９デ サチュラーゼはホモ二量体として活性であることを示している；サブユニット分 子量は約４１ｋＤａ。本酵素は酸素、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰＨフェレドキシン酸 化還元酵素およびフェレドキシンをインビトロでの活性に必要としている。Ｆｏ ｘ ｅｔ ａｌ．，１９９３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２４８６−２４９０）は大腸菌での発現でヒマの実酵素はホモ二量体当た り４つの触媒的に活性な第一鉄原子を含んでいることを示している。酸化された 酵素は二つの同一のジ第二鉄クラスターを含んでおり、それはジチオナイト存在 下でジ第一鉄状態に還元される。ステアロイル−ＣｏＡおよびＯ₂存在下、クラ スターはジ第一鉄状態へ戻る。このことはデサチュラーゼはジ鉄−オキソクラス ターを含んでいるＯ₂活性化タンパク質に属していることを示唆している。この 群の他のメンバーはリボヌクレオチド還元酵素およびメタンモノオキシゲナーゼ ヒドロキシラーゼである。これらの触媒的に異なったタンパク質の予想された一 次構造の比較すると、すべてが約８０−１００アミノ酸により分離されたアミノ 酸配列の保存的対、（Ａｓｐ／Ｇｌｕ）−Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓを含 んでいることが示された。 伝統的植物繁殖計画は植物に有害な結果を与えることなく増加したステアリン 酸が達成できることを示している。サフラワー（Ｌａｄｄ ａｎｄ Ｋｎｏｗｌ ｅｓ，１９７０ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．１０：５２５−５２７）およびダイズ（Ｈ ａｍｍｏｎｄ ａｎｄ Ｆｅｈｒ，１９８４ Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ .Ｓｏｃ ．６１：１７１３−１７１６；Ｇｒａｅｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ ．２５：１０７６−１０７９）においてステアリン酸レベルが 著しく増加されている。このことは種子油の脂肪酸組成における融通性を示して いる。 Δ−９デサチュラーゼ活性の増加は酵母（Ｐｏｌａｓｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ． ，１９９２ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，８９４）またはラット（Ｇ ｒａｙｂｕｒｎ ｅｔ．ａｌ．，１９９２ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０ ，６７５）からのΔ−９デサチュラーゼ遺伝子でのタバコの形質転換により達成 されている。トランスジェニック植物の両方の組とも脂肪酸組成は著しく変化し ていたが、表現型的には対照植物と同一であった。 コーン（トウモロコシ）はマーガリン産物の製造にはほとんど使用されてこな かったのは、それが伝統的に油作物としては利用されてこなかったことおよびダ イズおよびキャノーラと比較すると種子油含量が比較的低いためである。しかし ながら、コーン油は低レベルのリノレン酸（１８：３）および比較的高レベルの パルミチン酸（１６：０）を含んでいる（マーガリンには望ましい）。Δ−９デ サチュラーゼ活性のダウンレギュレーションによるオレイン酸およびリノール酸 レベルの減少は、コーンを飽和油市場でのダイズおよびキャノーラの実行可能な 代替物にするであろうことを出願者は信じている。 マーガリンおよび菓子類の脂肪はダイズの様な植物からの油を化学的に水素添 加することにより製造されている。この過程はマーガリンの製造の費用を高め、 脂肪酸のシスおよびトランス異性体を発生させる。トランス異性体は植物由来の 油には天然に観察されておらず、潜在的な健康の危険性に対する関心が高まって いる。出願者は、不飽和化酵素がダウンレギュレートされるように植物を遺伝子 工学処理することが化学的水素添加の必要性を除去する一つの方法であることを 信じている。Δ−９デサチュラーゼは１８炭素脂肪酸内へ最初の二重結合を導入 し、それは脂肪酸の不飽和化の程度に影響する鍵となる工程である。 従って、好適な態様において、本発明は植物における脂肪酸組成を改変するた めの組成物（およびそれらの使用のための方法）に関している。このことは、植 物おけるある種の酵素活性（Δ−９デサチュラーゼのような）の減少または除去 を生じる、リボザイム、アンチセンス核酸、共抑制またはトリプレックスＤＮＡ による遺伝子発現の阻害を通して達成される。そのような活性はトウモロコシ、 小麦、米、ヤシ、ココナッツなどの単子葉植物で減少させられた。Δ−９デサチ ュラーゼ活性もまたヒマワリ、サフラワー、綿、ピーナッツ、オリーブ、ゴマ、 キュフェア、アマ、ホウホウバ、ブドウなどの双子葉植物で減少されるであろう 。 従って、一つの態様において、本発明は脂肪酸不飽和化に含まれる酵素を阻害 する（例えば、Δ−９デサチュラーゼ活性を減少させることにより）リボザイム を特色とする。これらの内在的に発現されたＲＮＡ分子は標的ｍＲＮＡの到達可 能領域に結合する基質結合ドメインを含んでいる。本ＲＮＡ分子はまたＲＮＡの 切断を触媒するドメインも含んでいる。本ＲＮＡは好適にはハンマーヘッドまた はヘアピンモチーフのリボザイムである。結合により、リボザイムは標的ｍＲＮ Ａを切断し、翻訳およびタンパク質蓄積を妨げる。標的遺伝子の発現がないと、 ステアリン酸レベルが増加し、不飽和脂肪酸産生は減少または阻害される。すぐ 下に掲げられた表の次に特異的実施例が提供される。 好適な態様において、リボザイムは表VIおよびVIIIの結合配列と相補的である 結合アームを持っている。当業者は、そのような例は一つの植物（例えばコーン ）ｍＲＮＡに対して設計されてはいるが、他の植物種のｍＲＮＡと相補的な類似 のリボザイムが作製できることを認識するであろう。相補性により、結合アーム は配列特異的様式で標的ＲＮＡとのリボザイムの相互作用を可能にし、リボザイ ムが植物ｍＲＮＡ標的の切断を起こすことを可能にする。そのようなリボザイム の例は典型的には表VIIおよびVIIIに定義されている配列である。活性リボザイ ムは典型的には実施例のものと等価な酵素中心、および標的部位で切断が起こる ように植物ｍＲＮＡを結合できる結合アームを含んでいる。そのような結合およ び／または切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。 本研究で特に有用であるリボザイムの配列は表VIIおよびVIIIに示されている 。 当業者は表に掲げられているリボザイム配列は活性に影響を及ぼすためにリボ ザイムの酵素部分が改変された（結合アームを除いて）多くのそのような配列の 代表であることを認識するであろう。例えば、表IVに掲げたハンマーヘッドリボ ザイムのステムループII配列（５’−ＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣ−３’）は任意の配 列を含むように(好適には最少２塩基対ステム構造が形成できるように)改変(置 換、欠損および／または挿入)できる。同様に、表ＶおよびVIIIに掲げたヘアピ ンリボザイムのステムループIV配列（５’−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−３’）は任意 の配列を含むように（好適には最少２塩基対ステム構造が形成できるように）改 変（置換、欠損および／または挿入）できる。そのようなリボザイムは表に特別 に記載したリボザイムと等価である。 本発明の別の態様において、標的分子を切断し、植物の不飽和脂肪酸含量を減 少させるリボザイムは植物ゲノム内へ挿入された転写ユニットから発現される。 好適には、植物ゲノム内へ安定に組み込むことができ、およびリボザイムを発現 している形質転換体植物株の選択ができる組換え体ベクターは植物細胞中の構成 的または誘導可能プロモーターにより発現される。発現された後は、リボザイム は標的ｍＲＮＡを切断し、宿主細胞の不飽和脂肪酸産生を減少させる。植物細胞 で発現されたリボザイムは構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは 誘導可能プロモーターの制御下にある。 不飽和脂肪酸プロフィールの改変は、特異的遺伝子発現ができる核酸に基づく 技術の重要な応用である。商業的に重要な油を産生する植物において、高レベル の飽和脂肪酸が望まれている。 関連する態様において、本発明はトウモロコシのΔ−９デサチュラーゼをコー ドしているｃＤＮＡの単離を特色としている。 好適な態様において、Δ−９デサチュラーゼｍＲＮＡを切断するヘアピンおよ びハンマーヘッドリボザイムも記載されている。当業者は以下に記載した実施例 からΔ−９デサチュラーゼ活性に必要とされる標的ＲＮＡを切断する他のリボザ イムが容易に設計され、それは本発明の範囲内であることを理解するであろう。 コーンＲＮＡの特異的実施例が提供されるが、当業者はこの教えはコーンに制 限されないことを認識するであろう。さらに、他の植物種においても同一の標的 が使用されるであろう。特異的植物ＲＮＡ配列を標的とするのに適した相補的ア ームが特異的ＲＮＡを標的とするリボザイムで利用される。本明細書の実施例お よび教えは制限を与えるものではなく、当業者は、本明細書の教えを用いて、種々 の異なった遺伝子の発現を調節するために、種々の異なった植物中に同様の具体 化が容易に行え、それは本発明の範囲に含まれることを認識するであろう。 本明細書の実施例においては標準分子生物学技術に従った。追加の情報はＳａ ｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｂｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、本明 細書において援用される）にみることができる。実施例 実施例１：ゼア マイスからのΔ−９デサチュラーゼｃＤＮＡの単離 縮重したＰＣＲプライマーが植物Δ−９デサチュラーゼのジ鉄−オキソ基結合 に含まれている二つの保存的ペプチドのために設計および合成された。トウモロ コシ胚ｃＤＮＡから２７６ｂｐ ＤＮＡ断片がＰＣＲ増幅され、ベクター内へク ローン化された。この断片の予想されたアミノ酸配列は双子葉植物Δ−９デサチ ュラーゼタンパク質の二つの保存的ペプチドにより分離された領域の配列と同じ であった。総計で１６のクローンが単離され；さらなる制限地図作製およびハイ ブリダイゼーションで一つのクローンが同定され、それは配列決定された。ｃＤ ＮＡ挿入物の特色は：１６２１ ｎｔ ｃＤＮＡ；１４５ ｎｔ ５’および２ ９４ ｎｔ ３’非翻訳領域（１８ ｎｔ ポリＡテイルを含む）；４４．７ｋ Ｄａポリペプチドをコードしている３９４アミノ酸読み取り枠；および予想され る成熟タンパク質はヒマの実Δ−９デサチュラーゼ遺伝子と８５％のアミノ酸同 一性。完全配列は図１０に示されている。実施例２：Δ−９デサチュラーゼに対する可能性のあるリボザイム切断部位の同 定 約２５０ＨＨリボザイム部位および約４３ＨＰ部位がコーンΔ−９デサチュラ ーゼｍＲＮＡで同定された。ＨＨ部位はウリジンおよびグアノシンを除くヌクレ オチドから成っている（ＵＨ）。表VIおよびVIIIはＨＨおよびＨＰリボザイム切 断部位のリストである。番号付けは、図１０に示された配列を持っているΔ−９ デサチュラーゼｃＤＮＡクローンの５’末端の１から始まっている。 そのような切断部位に対する表VIIおよびVIIIに掲げたようなリボザイムは、 基質結合アームとして５から１００またはそれ以上の塩基を持たせて容易に設計 および合成できる（図１−５参照）。リボザイム内のこれらの基質結合アームは リボザイムがそれらの標的と配列特異的様式で相互作用するのを可能にする。実施例３：Δ−９デサチュラーゼに対するリボザイム切断部位の選択 Δ−９デサチュラーゼｍＲＮＡの二次構造はＭ．Ｚｕｋｅｒ（Ｚｕｋｅｒ Ｍ .，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，４８−５２）により開発されたような アルゴリズムを用いるコンピューター分析により評価された。８つ以上のヌクレ オチドのＲＮＡ／ＲＮＡステムと二次折り畳み構造を形成せずおよび可能性のあ るハンマーヘッドリボザイム切断部位を含むｍＲＮＡの領域が同定された。 これらの部位はＲＮａｓｅＨアッセイによるオリゴヌクレオチド到達度が評価 された（下記実施例４を参照されたい）。実施例４：Δ−９デサチュラーゼに対するＲＮａｓｅＨアッセイ 各々２１ヌクレオチド長の４９のＤＮＡオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈ アッセイで使用された。これらのオリゴヌクレオチドはΔ−９デサチュラーゼＲ ＮＡ内の１０８部位をカバーしている。ＲＮａｓｅ ＨアッセイはΔ−９デサチ ュラーゼｃＤＮＡの完全長転写体を用いて実施された。Ｄｒａｐｅｒら、上記文 献、に一般的に記載されている方法により切断部位への到達性でＲＮＡがスクリ ーニングされた。簡単に記すと、リボザイム切断部位を示すＤＮＡオリゴヌクレ オチドが合成された。コーンｃＤＮＡクローンからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転 写のための基質を発生させるため、ポリメラーゼ連鎖反応が使用された。標識さ れたＲＮＡ転写体はこれらの鋳型からインビトロで合成された。オリゴヌクレオ チドおよび標識転写体はアニール化され、ＲＮＡｓｅＨが加えられ、混合物は３ ７℃で１０分間インキュベートされた。反応が停止され、ＲＮＡはシークエンシ ングポリアクリルアミドゲルで分離された。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ ｃｓホスホロイメージングシステムを用いたオートラジオグラフィーの定量によ り切断された基質のパーセントが決定された（図１３および１４）。実施例５：Δ−９デサチュラーゼのためのハンマーヘッドおよびヘアピンリボザ イム ＲＮａｓｅ Ｈアッセイで最もよく切断したオリゴにより覆われた部位へのハ ンマーヘッド（ＨＨ）およびヘアピン（ＨＰ）リボザイムが設計された。これら のリボザイムは次にコンピューター折り畳みによる分析にかけられ、著しい二次 構造を持っていたリボザイムは捨てられた。 リボザイムは化学的に合成された。ＲＮＡ合成のための一般法は前に記載され ている。（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ，１０９，７８４５−７８Ｓ４およびＳｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９ ０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.,１８，５４３３−５３４１;Ｗｉｎｃｏｔ ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２ ６７７）。小規模合成はアルキルシリル保護ヌクレオチドのための５分のカップ リング工程および２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのための２．５分のカップリ ング工程を持つ修飾２．５μｍｏｌ規模のプロトコールを用いた３９４Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で実施された。表IIは合成サイ クルで使用された試薬の量および接触時間が概説されている。各々のカップリン グサイクルにおいてポリマー結合５’−ヒドロキシルに比べて６．５倍過剰のホ スホロアミダイト（０．１Ｍを１６３μＬ＝１６．３μｍｏｌ）および２４倍過 剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍを２３８μＬ＝５９．５μｍｏｌ）が 使用された。トリチル分画の比色定量により決定された３９４上の平均カップリ ング収率は９７．５−９９％であった。３９４のための他のオリゴヌクレオチド 合成試薬：脱トリチル化溶液は２％ＴＣＡを含むメチレンクロリド（ＡＢＩ）で あった；キャッピングは１６％Ｎ−メチルイミダゾールを含むＴＨＦ（ＡＢＩ） および１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジンを含むＴＨＦ（ＡＢＩ）で実施 された；酸化溶液は１６．９ｍＭＩ₂、４９ｍＭピリジン、９％水を含むＴＨＦ （Ｍｉｌｌｉ ｐｏｒｅ）であった。Ｂ ＆ Ｊ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇｒａｄｅのアセトニ トリルは試薬瓶から直接使用された。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍ アセトニトリル）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手された固形物から調製された。 ＲＮＡの脱保護は以下のように実施された。ポリマー結合オリゴヌクレオチド （トリチル−オフ）は合成カラムから４ｍＬガラスねじ栓付きバイアルに移し、 ６５℃で１０分間メチルアミン（ＭＡ）の溶液中で懸濁させた。−２０℃に冷却 後、ポリマー支持体から上清液を除去した。支持体は１．０ｍｌのＥｔＯＨ：Ｍ ｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ／３：１：１で３回ボルテックスして洗浄し、上清液は最初の上 清液に加えた。オリゴヌクレオチドを含んでいる合併した上清液を乾燥させると 白色粉末が得られた。 塩基脱保護オリゴヌクレオチドは無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン、７５０μＬ ＴＥＡおよび１．４ Ｍ ＨＦ濃度にす るための１．０ ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦの溶液を２５０μＬ）６５℃に１．５時 間加熱した。得られた（完全に脱保護された）オリゴマーはアニオン交換脱塩に 先だって５０ｍＭ ＴＥＡＢ（９ｍＬ）で反応停止させた。 脱保護されたオリゴマーのアニオン交換脱塩のためＴＥＡＢ溶液をＱｉａｇｅ ｎ ５００^Rアニオン交換カートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に加え、５ ０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で前洗浄した。５０ ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ ）でカートリッジを洗浄した後、ＲＮＡは２Ｍ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で溶出さ せ、白色粉末になるまで乾燥させた。 不活性ハンマーヘッドリボザイムはＵをＧ₅におよびＵをＡ₁₄(番号付けは(Ｈ ｅｒｔｅｌ，Ｋ.Ｊ.，ｅｔ ａｌ.，１９９２,Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ ．，２０，３２５２）から）に置換することにより合成された。 ヘアピンリボザイムはハンマーヘッドＲＮＡで説明したように合成された。 リボザイムはまたバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるＤＮ Ａ鋳型からも合成された（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１ ９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムは一般 的方法を用いるゲル電気泳動により精製されるか、または高速液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ．ａｌ．，１９９６、上記文献、それ は全文本明細書において援用される）により精製され、水に再懸濁された。本研 究で使用された化学的合成リボザイムの配列は表VIIおよびVIIIに示されている 。実施例６：Δ−９デサチュラーゼリボザイムに対する長い基質試験 本研究で使用された標的ＲＮＡは１６２１ｎｔ長であり、Δ−９デサチュラー ゼＲＮＡを標的とするすべてのＨＨおよびＨＰリボザイムのための切断部位を含 んでいる。Δ−９デサチュラーゼ標的配列の上流のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプ ロモーターを含む鋳型はｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅された。標的ＲＮＡは このＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ増幅鋳型から転写された。転写体 は転写の間に四つのリボヌクレオチド三リン酸の一つとして［α−³²Ｐ］ＣＴＰ を含ませることにより内部的に標識した。転写混合物は転写後にＤＮａｓｅ−Ｉ を用いて３７℃にて２時間処理し、転写で使用したＤＮＡ鋳型を消化して除く。 転写混合物は変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。完全長ＲＮＡに相当す るバンドをゲルスライスから単離し、ＲＮＡはイソプロパノールで沈澱させ、ペ レットは４℃で貯蔵した。 リボザイム切断反応はリボザイム過剰（ｋ_cat／Ｋ_M）条件で実施された（Ｈｅ ｒｓｃｈｌａｇ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２ ９，１０１５９−１０１７１）。簡単に記すと、１ｍＭのリボザイムおよび＜１ ０ｎＭ内部標識標的ＲＮＡは５０ｍＭトリス．ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１０ｍ ＭＭｇＣｌ₂存在下６５℃で２分間加熱することにより別々に変性させた。ＲＮ Ａは反応温度（３７℃、２６℃または２０℃）を１０−２０分間冷却させること により復元させた。切断反応は適当な温度でリボザイムおよび標的ＲＮＡを混合 させることにより開始させた。一定の時間間隔で一部を採り、反応は等量の停止 緩衝液を加えることにより停止させた。試料は４％シ−クエンシングゲルで分離 させた。 ２６℃および２０℃でのリボザイム切断反応の結果は表IXおよび図１５および １６に要約されている。試験されたリボザイムの内、七つのハンマーヘッドおよ び二つのヘアピンがΔ−９デサチュラーゼＲＮＡの著しい切断を示した（図１５ および１６）。他の部位へのリボザイムは種々のレベルの活性を示した。実施例７：Δ−９デサチュラーゼに対する多リボザイム組み合わせを用いた標的 ＲＮＡの切断 相補的ＲＮＡ配列の隣接する範囲に埋め込まれた二つまたはそれ以上のリボザ イムを含む多リボザイム構築物内へいくつかの上記リボザイムが取り込まれた。 多リボザイムの非制限的例が図１７、１８、１９および２３に示されている。リ ボザイムは相補的オリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製され、カリフラ ワーモザイクウイルス３５Ｓ促進プロモーター（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｃｅｌｌ ２１，２８５）、トウモロコシＡｄｈ Ｉイントロン（Ｄ ｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １２， ３９８３）およびＮｏｓポリアデニル化シグナル（ＤｅＰｉｃｋｅｒ ｅｔ ａ ｌ．，１９８２ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，５６１）を含む 発現ベクター内へクローニングされた。これらのマルチマー含有転写ユニットか ら作製されたＴ７転写体による切断アッセイは図２０および２１に示されている 。これらは非制限的例である；当業者は他のリボザイム組み合わせ、イントロン およびプロモーター要素から成る類似の具体例が本分野では既知の技術を用いて 容易に作製でき、それは本発明の範囲内であることを認識するであろう。実施例８：Δ−９デサチュラーゼのためのリボザイム発現転写ユニットの構築 Δ−９デサチュラーゼｍＲＮＡを切断することを標的としたリボザイムは、植 物ゲノム内へ挿入された遺伝子から（安定形質転換）、またはプラスミドベクタ ーまたはウイルス配列の一部であるエピソーム転写ユニット（一過性発現）から 植物中で内在的に発現される。これらのリボザイムはＲＮＡポリメラーゼＩ、II またはIII植物または植物ウイルスプロモーター（ＣａＭＶのような）を経て発 現できる。プロモーターは構成的、組織特異的または発育的に発現されたもので あろう。Δ９ ２５９単量体リボザイム構築物（ＲＰＡ１１４、１１５） これらはΔ−９デサチュラーゼ２５９単量体ハンマーヘッドリボザイムクロー ンである。リボザイムは３ｂｐ長ステムIIおよび部位２５９を標的とした２０ｂ ｐ（総計）長基質結合アームを持つように設計された。ＲＰＡ１１４は活性であ り、ＲＰＡ１１５は不活性である。親プラスミド、ｐＤＡＢ３６７はＮｏｔＩで 消化され、平滑受容部位を作るためにクレノーが付けられた。ベクターは次にＨ ｉｎｄIII制限酵素で消化された。リボザイム含有プラスミドはＥｃｏＲＩで切 断され、クレノーで満たされ、ＨｉｎｄIIIで再切断された。全リボザイム転写 ユニットを含む挿入物はゲルで精製され、ｐＤＡＢ３６７ベクター内へ連結され た。構築物はＳｇｆＩ／ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩ／ＳｓｔＩで消化すること により検査され、配列決定により確認された。Δ９ ４５３マルチマーリボザイム構築物（ＲＰＡ１１８、１１９） これらはΔ−９デサチュラーゼ４５３マルチマーハンマーヘッドリボザイムク ローンである（図１７参照）。リボザイムは３ｂｐ長ステムII領域を持つように 設計された。マルチマー構築物の基質結合アームの総計の長さは４２ｂｐであっ た。ＲＰＡ１１８は活性であり、ＲＰＡ１１９は不活性である。構築物は２５９ 単量体で説明したように作製された。マルチマー構築物はΔ−９デサチュラーゼ ＲＮＡ内の部位４５３、４６４、４７５および４８４を標的とする四つのハンマ ーヘッドリボザイムを持つように設計された。Δ９ ２５２マルチマーリボザイム構築物（ＲＰＡ８５、１１３） これらはｂａｒ（ホスホイノトリシン アセチルトランスフェラーゼ；Ｔｈｏ ｍｐｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１９−２５２３ ）読み取り枠の３’末端に置かれたΔ−９デサチュラーゼ２５２マルチマーハン マーヘッドリボザイムクローンである。マルチマー構築物は３ｂｐ長ステムII領 域を持つように設計された。マルチマー構築物の基質結合アームの総計の長さは ９１ｂｐであった。ＲＰＡ８５は活性リボザイムであり、ＲＰＡ１１３は不活性 である。ベクターは以下のように構築された：親プラスミドｐＤＡＢ３６７はＢ ｇｌIIで部分消化され単一切断プラスミドはゲルで精製された。これはＥｃｏＲ Ｉで再切断され、再びゲル精製して正しいＢｇｌII／ＥｃｏＲＩ切断断片を単離 する。リボザイム構築物からのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ挿入物がゲル単離され（ これはリボザイムおよびＮＯＳポリＡ領域を含んでいる）、３６７ベクター内へ 連 結された。陽性プラスミドの同一性はＮｃｏＩ／ＳｓｔＩ消化および配列決定を 実施することにより確認された。 有用なトランスジェニック植物は標準アッセイにより同定できる。トランスジ ェニック植物は以下の実施例で説明するようにΔ−９デサチュラーゼ発現および Δ−９デサチュラーゼ活性を減少させることで評価できる。実施例９：ＧＢＳＳ ＲＮＡの潜在的リボザイム切断部位の同定 ２４１ハンマーヘッドリボザイム部位がコーンＧＢＳＳ ｍＲＮＡポリペプチ ドコード領域で同定された（表IIIＡ参照）。ハンマーヘッド部位はウリジンお よびグアニンを除いた任意のヌクレオチドから成っている（ＵＨ）。下記はコー ンのＧＢＳＳコード領域の配列である（配列ＩＤ番号：２５）。番号付けシステ ムは以下の配列を持つ（５’から３’）ＧＢＳＳ ｃＤＮＡクローンの５’末端 の１から始まっている： ＧＢＳＳ ｍＲＮＡ中に約５３の潜在的ヘアピンリボザイム部位が存在する。 リボザイムおよび標的配列は表Ｖに掲げられている。 上記のように基質結合アームとして５から１００またはそれ以上の間の塩基を 持つそのような部位に対するリボザイムは容易に設計および合成できる。実施例１０：ＧＢＳＳに対するリボザイム切断部位の選択 ＧＢＳＳ ｍＲＮＡの二次構造はＭ．Ｚｕｋｅｒ（Ｚｕｋｅｒ Ｍ．，１９８ ９ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，４８−５２）により開発されたようなアルゴリズ ムを用いるコンピューター分析により評価された。８つ以上のヌクレオチドのＲ ＮＡ／ＲＮＡステムと二次折り畳み構造を形成せずおよび可能性のあるハンマー ヘッドリボザイム切断部位を含むｍＲＮＡの領域が同定された。 これらの部位はＲＮａｓｅＨアッセイによるオリゴヌクレオチド到達度が評価 された（図６参照）。各々２１ヌクレオチド長の５８のＤＮＡオリゴヌクレオチ ドがこれらのアッセイで使用された。これらのオリゴヌクレオチドは８５部位を カバーしている。これらのオリゴヌクレオチドの位置および名称は１９５、２０ ５、２４０、３０７、３９０、４２４、４７２、４８１、５３９、５９２、６２ ５、６３６、６７８、７２５、７４１、８１１、８５９、８９１、８９７、９１ ２、９１８、９２８、９５１、９５８、９６９、９９３、９９９、１０１５、１ ０２７、１０３２、１０５６、１０８４、１１０５、１１５６、１１６８１、１ ８６、１１９５、１２０４、１２１３、１２２２、１２４０、１２６９、１２８ ４、１２９３、１３４５、１３５１、１４２０、１４７１、１５３３、１５６３ 、１７１４、１７５０、１７８６、１８０６、１８１９、１９２１、１９５４お よび１９７８であった。二次的部位もまたカバーされ、２０２、３９４、３８４ 、３８５、４８４、６２４、６２７、６２８、６７９、８６２、９０１、９３０ 、９５０、９５２、９６７、９９０、９９１、１０２６、１０３５、１１０８、 １１５９、１２２５、１２７３、１５３４、１５６４、１５５８および１７１７ が含まれた。実施例１１：ＧＢＳＳに対するＲＮａｓｅＨアッセイ ＲＮａｓｅ Ｈアッセイ（図７）はＧＢＳＳコード領域、３’非コード領域お よび５’非コード領域の一部の完全長転写体を用いて実施された。Ｄｒａｐｅｒ ら（上記文献、本明細書において援用される）に一般的に記載されている方法に より切断部位への到達性でＧＢＳＳ ＲＮＡがスクリーニングされた。簡単に記 すと、リボザイム切断部位を示すＤＮＡオリゴヌクレオチドが合成された。コー ンｃＤＮＡクローンからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写のための基質を発生させ るため、ポリメラーゼ連鎖反応が使用された。標識されたＲＮＡ転写体はこれら の鋳型からインビトロで合成された。オリゴヌクレオチドおよび標識転写体はア ニール化され、ＲＮＡｓｅＨが加えられ、混合物は３７℃で１０分間インキュベ ートされた。反応が停止され、ＲＮＡはシークエンシングポリアクリルアミドゲ ルで分離された。ホスホロイメージングシステムを用いたオートラジオグラフィ ーの定量により切断された基質のパーセントが決定された（図７）。実施例１２：ＧＢＳＳのためのハンマーヘッドリボザイム ＲＮａｓｅ Ｈアッセイで最もよく切断したオリゴによりカバーされた部位に 対し、１０／１０（すなわち、リボザイムの各々のアームで１０塩基対が形成で きる）ヌクレオチド結合アームを持つハンマーヘッドリボザイムが設計された。 これらのリボザイムは次にコンピューター折り畳みによる分析にかけられ、著し い二次構造を持っていたリボザイムは捨てられた。このスクリーニング法の結果 、２３のリボザイムがＧＢＳＳ ｍＲＮＡ中の最も開かれた領域に対して設計さ れ、これらのリボザイムは表IVに示されている。 リボザイムは化学的に合成された。使用された合成法は前に記載されたような 普通のＲＮＡ合成のための方法に従い（およびＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，上記文 献、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ.,上記文献、およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，上記文献、本明細書において援用される）、および５’末端でのジメト キシトリチルおよび３’末端でのホスホロアミダイトのような共通の核酸保護お よび結合基が使用された。平均段階的カップリング収率は＞９８％であった。不 活性リボザイムはＵをＧ₅におよびＵをＡ₁₄（Ｈｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，上 記文献、からの番号付け）に置換することにより合成された。ヘアピンリボザイ ムは二つの部分が合成され、アニール化して活性リボザイムを再構築した（Ｃｈ ｏｗｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−）。すべてのリボザイムは２’−Ｏ−メチル基での ５’および３’末端の両方の五つのリボヌクレオチド修飾により安定性を促進す るように修飾された。リボザイムは一般的方法を用いるゲル電気泳動により精製 されるか（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）、または上記のように高速液体クロマトグラフィーにより精製 され、水に再懸濁された。実施例１３：ＧＢＳＳに対する長い基質試験 本研究で使用された標的ＲＮＡは９００ｎｔ長であり、ＧＢＳＳ ＲＮＡを標 的とするすべてのＨＨリボザイムのための切断部位を含んでいる。ＧＢＳＳ標的 配列の上流のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む鋳型はｃＤＮＡクロ ーンからＰＣＲ増幅された。標的ＲＮＡはこのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用い るＰＣＲ増幅鋳型から転写された。転写体は転写の間に四つのリボヌクレオチド 三リン酸の一つとして［α−³²Ｐ］ＣＴＰを含ませることにより内部的に標識し た。転写混合物は転写後にＤＮａｓｅ−Ｉを用いて３７℃にて２時間処理し、転 写で使用したＤＮＡ鋳型を消化して除く。転写混合物は変性ポリアクリルアミド ゲル上で分離した。完全長ＲＮＡに相当するバンドをゲルスライスから単離し、 ＲＮＡはイソプロパノールで沈澱させ、ペレットは４℃で貯蔵した。 リボザイム切断反応はリボザイム過剰（ｋ_cat／Ｋ_M）条件で実施された（Ｈｅ ｒｓｃｈｌａｇ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，上記文献）。簡単に記すと、１０００ｎＭ のリボザイムおよび＜１０ｎＭ内部標識標的ＲＮＡは５０ｍＭトリス．ＨＣｌ、 ｐＨ７．５および１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂存在下９０℃で２分間加熱することによ り別々に変性させた。ＲＮＡは反応温度（３７℃、２６℃または２０℃）を１０ −２０分間冷却させることにより復元させた。切断反応は適当な温度でリボザイ ムおよび標的ＲＮＡを混合させることにより開始させた。一定の時間間隔で一部 を採り、反応は等量の停止緩衝液を加えることにより停止させた。試料は４％シ −クエンシングゲルで分離させた。 三つの異なった温度でのリボザイム切断反応の結果は図８に要約されている。 七つの先導的リボザイムが選択された（４２５、８９２、９１９、９５９、９６ ８、１２４１および１７８７）。活性リボザイムの一つ（８１１）は切断生成物 の奇妙なパターンを生み出した；その結果、それは我々の先導的リボザイムの一 つとしては選択されなかった。実施例１４：多リボザイム組み合わせを用いるＧＢＳＳ ＲＮＡの切断 以下の組み合わせで先導的リボザイムの四つ（８９２、９１９、９５９、１２ ４１）が内部標識標的ＲＮＡとインキュベートされた：８９２単独；８９２＋９ １９；８９２＋９１９＋９５９；８９２＋９１９＋９５９＋１２４１。ＲＮＡ切 断の分画は、切断反応に使用されたリボザイムの数の増加に従って加法的様式で 増加した（図９）。リボザイム切断反応は前記のように２０℃で実施された。こ れらのデータは同一のｍＲＮＡ上の異なった部位を標的とした多リボザイムは標 的ＲＮＡの減少を加法的様式で増加させるであろう。実施例１５：ＧＢＳＳに対するリボザイム発現転写ユニット ＧＢＳＳマルチマーリボザイムＲＰＡ６３（活性）およびＲＰＡ６４（不活性） のクローニング ＧＢＳＳ ｍＲＮＡの四つのハンマーヘッドリボザイム標的部位８９２、９１９ 、９５９および９６８を含むマルチマーリボザイムが構築された。１８ヌクレオ チドが重複している二つのＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｓｅｓ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）が注文された 。これらの配列は以下のようである： オリゴ１： オリゴ２： 上記のオリゴの不活性版は各々のリボザイムモチーフの触媒コア内のＴをＧ５に 、およびＴをＡ１４に置換することにより作製された。 これらは１ｘクレノー緩衝液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中、９０℃にて５分間ア ニール化され、徐々に室温（２２℃）まで冷却された。ＮＴＰを０．２ｍＭまで 加え、オリゴは３７℃にて１時間、１単位／μｌのクレノー酵素で伸長された。 これはフェノール／クロロホルム抽出され、エタノールで沈澱させた後、１Ｘ Ｒｅａｃｔ３緩衝液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に再懸濁し、３７℃にて１時間、Ｂ ａｍＨＩおよびＳｓｔＩで消化された。ＤＮＡはＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを 用い、２％アガロースゲルでゲル精製された。 ＤＮＡ断片はＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ消化ｐＤＡＢ３５３内へ連結された。連結 は受容能のあるＤＨ５αＦ’細菌へ形質転換する（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）。可能 性のあるクローンはＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化することによりスクリーニン グした。クローンは配列決定することにより確認された。標的配列との相同性の 全長は９６ヌクレオチドである。９１９モノマーリボザイム（ＲＰＡ６６） １０／１０アームを持ち、ＧＢＳＳ ｍＲＮＡの部位９１９に対する単一リボザ イムが以下のように構築された。二つのＤＮＡオリゴが注文された： オリゴ１： オリゴ２： オリゴは１Ｘキナーゼ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で個々にリン酸化され、 熱変性されおよび合併させ９０℃で１０分続いて室温（２２℃）までゆっくりと 冷却することによりアニール化された。ベクターはｐＤＡＢ３５３をＳｓｔＩで 消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑端化することにより調製された。ベクタ ーはＢａｍＨＩで再消化し、前記のようにゲル精製された。アニール化オリゴは １６℃にて一夜、１Ｘ連結緩衝液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中でベクターへ連結さ れた。可能性のあるクローンはＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化され、配列決定す ることにより確認された。実施例１６：Δ９リボザイム実験で使用された植物形質転換プラスミドｐＤＡＢ ３６７およびＧＢＳＳリボザイム実験で使用されたｐＤＡＢ３５３ パートＡ ｐＤＡＢ３６７ プラスミドｐＤＡＢ３６７は以下のＤＮＡ構造を持っている：ｐＵＣ１９（塩基 ４４１；参照文献１）のＳｐｈＩ部位の最終Ｃ残基より後の塩基で始まり、Ｌａ ｃＺ遺伝子コード鎖に隣接する鎖、リンカー配列ＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＴ ＴＡＡＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＴＡ ＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＧ ＴＧ、ＣａＭＶ ＤＮＡのヌクレオチド７０９３から７３４４（２）、リンカー 配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３から７４３９、リンカ ー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧ、ＭＳＶのヌクレオチド１６ ７から１８６（３）、ＭＳＶのヌクレオチド１８８から２７７（３）、エキソン １およびイントロン１の一部を含むトウモロコシＡｄｈ １Ｓのヌクレオチド１ １９から２０９が続くＣ残基（４）、Ａｄｈ １Ｓイントロン１およびエキソン ２の一部を含むヌクレオチド５５５から６７２（４）、リンカー配列ＧＡＣＧＧ ＡＴＣＴＧ、ＭＳＶのヌクレオチド２７８から３１７。これに二番目の位置でＧ ＣＣアラニンコドンにより置換されたＡＧＣセリンコドン、およびＢｇｌII部位 を除去するためにＧからＡへ変更されたコード領域のヌクレオチド５４６を持つ ｐＩＪ４１０４からの修飾ＢＡＲコード領域（５）が続く。次に、リンカー配列 ＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ、Ｎｏｓのヌクレオチド１ ２９８から１５５４（６）およびｐＵＣ１９配列の残り（ＥｃｏＲＩ部位を含む ）が続いたＧ残基。パートＢ ｐＤＡＢ３５３ プラスミドｐＤＡＢ３５３は以下のＤＮＡ構造を持っている：ｐＵＣ１９（塩基 ４４１；参照文献１）のＳｐｈＩ部位の最終Ｃ残基より後の塩基で始まり、Ｌａ ｃＺ遺伝子コード鎖に隣接する鎖、リンカー配列ＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴ ＧＧＧＴＧ、ＣａＭＶ ＤＮＡのヌクレオチド７０９３から７３４４（２）、リ ンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３から７４３９、 リンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧ、エキソン１およびイントロン１の一 部を含むトウモロコシＡｄｈ １Ｓのヌクレオチド１１９から２０９（４）、Ａ ｄｈ １Ｓイントロン１およびエキソン２の一部を含むヌクレオチド５５５から ６７２（４）、およびリンカー配列ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ、ここで ＧＧＡＴＣＣはＢａｍＨＩ制限酵素の認識配列を示している。これにＮｃｏＩ／ ＳａｃＩとしてクローン化されたｐＲＡＪ２７５からのベーターグルクロニダー ゼ（ＧＵＳ）遺伝子（７）、リンカー配列ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ、Ｎｏｓのヌク レオチド１２９８から１５５４中のポリＡ領域（６）、およびｐＵＣ１９配列の 残り（ＥｃｏＲＩ部位を含む）が続いたＧ残基が続く。 以下の文献は本明細書において援用される： １． Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８３）”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ”（Ｗｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，編）１０１：２０−７８。 ２． Ｆｒａｎｃｋ，Ａ．，Ｈ．Ｇｕｉｌｌｅｙ，Ｇ．Ｊｏｎａｒｄ，Ｋ．Ｒｉ ｃｈａｒｄｓ，ａｎｄ Ｌ．Ｈｉｒｔｈ（１９８０）カリフラワーモザイクウイ ルスＤＮＡのヌクレオチド配列，Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２９４。 ３． Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ．Ｐ．Ｍ．，Ｊ．Ｄｏｎｓｏｎ，Ｂ．Ａ．Ｍ．Ｍｏ ｒｒｉｓ−Ｋｒｓｉｎｉｃｈ Ｍ．Ｉ．Ｂｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｗ．Ｄａ ｖｉｅｓ（１９８４）トウモロコシしまウイルスＤＮＡのヌクレオチド配列，Ｅ ＭＢＯ Ｊ．３：３０６３−３０６８。 ４． Ｄｅｎｎｉｓ．Ｅ．Ｓ．，Ｗ．Ｌ．Ｇｅｒｌａｃｈ，Ａ．Ｊ．Ｐｒｙｏｒ ，Ｊ．Ｌ．Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ Ａ．Ｉｎｇｌｉｓ，Ｄ．Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ， Ｍ．Ｍ．Ｓａｃｈｓ，Ｒ．Ｊ．Ｆｅｒｌ，ａｎｄ Ｗ．Ｊ．Ｐｅａｃｏｃｋ（１ ９８４）トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈｌ）遺伝子の分子 分析Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３９８３−４０００。 ５． Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．，Ｓ−Ｙ Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｂｂ，ａｎｄ Ｍ ．Ｊ．Ｂｉｂｂ（１９９０）ストレプトミセス ヒグロスコピカスのｂａｒ遺伝 子を含むカセット：植物形質転換の選択可能マーカー，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０６２。 ６． ＤｅＰｉｃｋｅｒ，Ａ．，Ｓ．Ｓｔａｃｈｅｌ，Ｐ．Ｄｈａｅｓｅ，Ｐ． Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ，ａｎｄ Ｈ．Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ（１９８２）ノパリン合 成酵素：転写体地図作製およびＤＮＡ配列，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ ｅｔ．１：５６１−５７３。 ７． Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９８７）植物におけるキメラ遺伝子の アッセイ：ＧＵＳ遺伝子融合系，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏ ｒｔｅｒ ５：３８７−４０５。実施例１７：ガンマ−ゼインプロモーター、アンチセンスＧＢＳＳおよびＮｏｓ ポリアデニル化配列を含む植物形質転換プラスミドであるプラスミドｐＤＡＢ３ ５９ プラスミドｐＤＡＢ３５９は以下の配列要素を含む６７０２ｂｐの二本鎖、環 状ＤＮＡである：塩基２３８から塩基４０４のｌａｃオペロン配列およびＭ１３ ｍｐ１８ポリリンカーのＨｉｎｄIIIを持つ末端を含むｐＵＣ１８からのヌクレ オチド１−４０４（１、２）；ヌクレオチド４１２から６６８のＮｏｓポリアデ ニル化配列（３）；ＧＡＧＣＴＣをＧＡＧＣＴＴに変え、およびＣＴＣＧＡＧを 加えることによりＳａｃＩ部位をＸｈｏＩ部位に変換したヌクレオチド６７９− ６９０からの合成アダプター配列；塩基６９１から２９５３のトウモロコシ顆粒 結合デンプン合成酵素ｃＤＮＡ、配列ＩＤ番号：２５のヌクレオチド１−２２５ ５に対応している。プラスミドｐＤＡＢ３５９中のＧＢＳＳ配列は、酵素認識配 列を満たすためにクレノーを用い、５’ＸｈｏＩおよび３’ＮｃｏＩ部位を加え 、ならびに内部ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を欠損させることにより本来のｃＤ ＮＡを修飾した。塩基２９７１から４４５３はトウモロコシ２７ｋＤガンマーゼ イン遺伝子の５’非翻訳配列であり、報告されている配列のヌクレオチド１０７ ８から２５６５に対応している（４）。ガンマーゼイン配列は５’ＫｐｎＩおよ び３’ＢａｍＨ／ＳａｌＩ／ＮｃｏＩ部位を含むように修飾された。報告されて いる配列と比較して、ガンマ−ゼイン配列の追加の変化には、ヌクレオチド１０ ４でのＴ欠損、ヌクレオチド６１３でのＴＡＣＡ欠損、ヌクレオチド８１２での ＣからＴへの変換、ヌクレオチド１１６５でのＡ欠損およびヌクレオチド１３５ ３でのＡ挿入が挙げられる。最後に、ｐＤＡＢ３５９の４４５４から６７２０は ｐ ｕｃ１８の塩基４５６から２６８６と同一であり、４４５４から４４７１のＭ１ ３／ｍｐ８のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ部位、４４７１から４６９７のｌ ａｃオペロン断片および５６４２から６４３３のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含ん でいる（１、２）。 以下の文献は本明細書において援用される： ｐＵＣ１８−Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｋｅｍｐｅ，Ｔ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ ．Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：１０１−１０６；Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｈ．，Ｅ ｎｇｅｒ−Ｖａｌｋ，Ｂ．Ｅ．，Ｂｒａｍｍａｒ．Ｗ．Ｊ．Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖ ｅｃｔｏｒｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９８５ および付録。 ＮｏｓＡ −ＤｅＰｉｃｋｅｒ，Ａ．，Ｓｔａｃｈｅｌ，Ｓ．，Ｄｈａｅｓｅ， Ｐ．，Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．（１９８ ２）ノパリン合成酵素：転写体地図作製およびＤＮＡ配列，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａ ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３。 Ｍａｉｚｅ ２７ｋＤ ガンマ−ゼイン −Ｄａｓ，Ｏ．Ｐ．，Ｐｏｌｉａｋ， Ｅ．Ｌ.,Ｗａｒｄ，Ｋ.,Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ １９，３３２５−３３３０（１９９１）。実施例１８：ユビキチンプロモーター／イントロン（Ｕｂｉｌ）により発現され るアンチセンスΔ−９デサチュラーゼ含有プラスミドｐＤＡＢ４３０の構築 パートＡ プラスミドｐＤＡＢ４２１の構築 プラスミドｐＤＡＢ４２１はトウモロコシ ユビキチンプロモーター／イントロ ンに隣接する特異的平滑末端ＳｒｆＩクローニング部位およびノパリン合成酵素 ポリアデニル化配列を含んでいる。ｐＤＡｂ４２１は以下のように作製された： ｐＤＡＢ３５５を制限酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化して２．２ｋｂ断片 上のＲコード領域を脱落させる。ゲル精製後、ベクターは二つのアニール化した オリゴヌクレオチドＯＦ２３５およびＯＦ２３６から成るアダプターに結合させ る。ＯＦ２３５は配列５’− ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＧ Ｇ ＧＣＧ ＧＴＡ Ｃ −３’を持ちＯＦ２３６は配列５’− ＣＧＣ ＣＣ Ｇ ＧＧＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＧ −３’を持っている。このアダプターを含 むクローンはアダプターを切断するが、プラスミドの他の場所は切断しない酵素 ＳｒｆＩおよびＳｍａＩでプラスミドＤＮＡを消化および線状化することにより 同定された。一つの代表的なクローンが、プラスミド内へアダプターがただ一つ 挿入されたことを確認するために配列決定された。得られたプラスミドｐＤＡＢ ４２１は続いてのΔ−９デサチュラーゼアンチセンスプラスミドｐＤＡＢ４３０ の構築に使用された。パートＢ プラスミドｐＤＡＢ４３０（アンチセンスΔ−９デサチュラーゼ）の 構築 プラスミドｐＤＡＢ４３０に存在するアンチセンスΔ−９デサチュラーゼ構築物 は、プラスミドｐＤＡＢ４２１の平滑末端クローニング部位への増幅生成物のク ローニングにより製作された。同じ実験から二つの構築物が同時に製造された。 第一の構築物はユビキチンプロモーターの後ろにセンス配向しているΔ−９デサ チュラーゼ遺伝子、およびトランスジェニック株でのタンパク質の過剰産生の免 疫学的検出のためにΔ−９デサチュラーゼ読み取り枠のＣ末端に融合されたｃ− ｍｙｃタグを含んでいる。この構築物はトウモロコシΔ−９デサチュラーゼを発 現しない系でのリボザイムの試験が意図されていた。この構築物は使用されなか ったが、Δ−９デサチュラーゼアンチセンス遺伝子の増幅および構築に使用され たプライマーは同一であった。本明細書に記載されたΔ−９デサチュラーゼｃＤ ＮＡ配列は二つのプライマーで増幅された。Ｎ末端プライマーＯＦ２７９は配列 ５’− ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＣＡ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＴＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＧＡＣ −３’を持っている。下線を付けた塩基はｃＤＮＡ配列のヌク レオチド１４６−１６６に対応している。Ｃ末端プライマーＯＦ２８０は配列５ ’− ＴＣＡ ＴＣＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＡＴ Ｃ ＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＣＴ Ａ ＣＣ ＧＴＡ −３’を持っており、それは配列５’− ＴＡＣ ＧＧＴ ＡＧ Ｇ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＴ Ｃ ＡＧＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＧＡ ＴＧＡ −３’の逆補 体である。この配列において、この配列において下線を付けた塩基はｃＤＮＡ配 列のヌクレオチド１３０４−１３２４に対応し、イタリック体の塩基はｃ−ｍｙ ｃエ ピトープの配列に対応する。１１７９ｂｐの増幅生成物は１．０％アガロースゲ ルを通して精製され、制限酵素ＳｒｆＩで直線状化されたプラスミドｐＤＡＢ４ ２１内へ連結された。コロニーハイブリダイゼーションが挿入物を持つｐＤＡＢ ４２１プラスミドを含むクローンを選択するために使用された。挿入物の配向は プラスミドＤＮＡの診断的酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限消化によ り決定された。ユビキチンプロモーター／イントロンに関してセンス配向でΔ− ９デサチュラーゼコード配列を含むクローンが回収され、ｐＤＡＢ４２９と名付 けられた。プロモーターに関してアンチセンス配向でΔ−９デサチュラーゼコー ド配列を含む別のクローンはｐＤＡＢ４３０と名付けられた。プラスミドｐＤＡ Ｂ４３０は配列分析にかけられ、期待される配列と比較してこの配列は三つのＰ ＣＲ誘導エラーを含むことが決定された。一つのエラーはプライマーＯＦ２８０ に対応する配列内に観察され、コード配列の内部に二つのヌクレオチド変化が観 察された。アンチセンスダウンレギュレーションは、アンチセンス転写体および ダウンレギュレーション標的間の１００％配列同一性を必要としないので、これ らのエラーは訂正されなかった。実施例１９：胚形成トウモロコシ培養のヘリウムブラスティングおよび続いての トランスジェニック子孫の再生 パートＡ 胚形成トウモロコシ培養の確立。 形質転換実験に用いられた組織培 養は遺伝子型”Ｈｉ−II”の未成熟接合胚から開始された。Ｈｉ−IIはＢ７３ｘ Ａ１８８交雑種（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９０）由来の２Ｒ₃株をかけあわ せたハイブリッドである。培養した場合、この遺伝子型はタイプIIとして知られ ているカルス組織を産生する。タイプIIカルスは砕けやすく、急速に増殖し、お よび長期間に渡り高レベルの胚形成能を維持する能力を示す。 タイプII培養は温室生育Ｈｉ−II植物の制御された授粉により得られた１．５ −３．０ｍｍの未成熟胚から開始された。使用された開始培地は１．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２５ｍＭ Ｌ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌカゼイン水解物、１０ｍ ｇ／Ｌ ＡｇＮＯ₃、２．５ｇ／Ｌゲルライトおよび２％スクロースを含むｐＨ ５．８に調整されたＮ６（Ｃｈｕ，１９７８）であった。約２−８週間でタイプ IIカルスおよび非胚形成性および／またはタイプＩカルスの選択が起こる。タイ プIIカルスが選択されたら、ＡｇＮＯ₃が除かれおよびＬ−プロリンを６ｍＭに 減少させた維持培地に移した。 胚形成培養の質および量が増加した約３ヶ月後、培養物は形質転換実験での使 用に受容可能だと思われた。 パートＢ プラスミドＤＮＡの調製。 プラスミドＤＮＡは形質転換実験での使 用に先だって、金粒子の表面に吸着させた。ＧＢＳＳ標的での実験では球形で１ ．５−３．０ミクロンの直径範囲を持つ金粒子が使用された（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｌ）。Δ−９デサチュラー ゼ標的の形質転換実験では１．０ミクロンの金粒子が使用された（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。すべての金粒子は使用に先立ってエタノールで 表面が殺菌された。吸着は３００μｌのプラスミドＤＮＡおよび滅菌Ｈ₂Ｏへ７ ４μｌの２．５ Ｍ塩化カルシウムおよび３０μｌの０．１Ｍスペルミジンを加 えることにより達成された。プラスミドＤＮＡの濃度は１４０μｇであった。Ｄ ＮＡ被覆金粒子は直ちにボルテックスされ、放置して懸濁液を沈降させた。得ら れた透明の上清液を除去し、粒子は１ｍｌの１００％エタノールに再懸濁させた 。ヘリウムブラスティングですぐに使用できる最終希釈はエタノールｍｌ当たり ７．５ｍｇＤＮＡ／金であった。 パートＣ 組織標的の調製およびヘリウムブラスティング。 標的当たり約６０ ０ｍｇの胚形成カルス組織を、浸透圧剤として０．２Ｍソルビトールおよび０． ２Ｍマンニトールを加えたタイプIIカルス維持培地を含むペトリ皿の表面に広げ た。約４時間の前処置後、すべての組織を２％寒天ブラスティング培地（維持培 地に浸透圧剤および２％寒天を加えたもの）を含むペトリ皿に移した。 ヘリウムブラスティングは調製された組織標的に対しておよび内への懸濁した ＤＮＡ被覆金粒子を加速するものである。使用された装置は初期の原型からＤｏ ｗＥｌａｎｃｏ、米国特許（第５，１４１，１３１号）（本明細書において援用 される）に記載されているものであるが、両方とも同様に機能する。装置は高圧 ヘリウム源、ＤＮＡ／金懸濁液を含んでいるシリンジおよびヘリウム源および前 もって加えられているＤＮＡ／金懸濁液のループ間の制御された連結を提供する 気圧作動式多目的バルブから成っている。 ブラスティングに先立ち、衝撃の間に組織をその場所に保つように滅菌１０４ ミクロンステンレス鋼の網で標的を覆う。次に、装置中の主室を真空にして標的 を置いた。ＤＮＡ被覆金粒子は１５００ｐｓｉのヘリウム圧を用いて４回標的に 加速して与えた。各々の吹き付けで２０μｌのＤＮＡ／金懸濁液が送達された。 ブラスティング直後、標的は回復のため１６から２４時間浸透圧剤を加えた維持 培地に戻した。 パートＤ 形質転換組織の選択およびトランスジェニック培養物からの植物の再 生。 ブラスティング１６から２４時間後、組織を小片に分割し、選択培地（維 持培地に３０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ^TMをくわえたもの）へ移した。３ヶ月の間４ 週間毎に、組織片を選択しないで新しい選択培地に移した。８週間から２４週間 後まで、増殖が阻害された組織のバックグラウンドに対して増殖が観察された区 域を取り出し単離した。推定形質転換組織は新しい選択培地で継代培養した。ト ランスジェニック培養物は１から３回さらに継代培養した後で確立された。 Ｂａｓｔａ^TM耐性カルスが株として確立されたら、シトキニンに基づく誘導培 地を含むペトリ皿へカルス組織を移すことにより植物再生を開始させ、それは次 に弱い光（１２５ｆｔカンデラ）に１週間置き続いて強い光（３２５ｆｔカンデ ラ）の元に１週間置いた。誘導培地はＭＳ塩およびビタミン類（Ｍｕｒａｓｈｉ ｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２）、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／ Ｌミオイノシトール、５ｍｇ／Ｌ６−ベンジルアミノプリン、０．０２５ｍｇ／ Ｌ ２，４−Ｄ、２．５ｇ／Ｌゲルライトからなり、ｐＨは５．７に調整されて いる。２週間の誘導期間後、組織は選択しないでホルモンを含まない再生培地に 移し、強い光を保った。再生培地はＭＳ塩およびビタミン類、３０ｇ／Ｌスクロ ース、および２．５ｇ／Ｌゲルライトからなり、ｐＨは５．７に調整されている 。誘導および再生培地の両方とも３０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ^TMを含んでいる。組 織は２−４週間で若枝および根に分化し始めた。小さな（１．５−３ｃｍ）植物 を 採り、ＳＨ培地を含む試験管に入れた。ＳＨ培地はＳＨ塩およびビタミン類（Ｓ ｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，１９７２）、１０ｇ／Ｌスクロ ース、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、５ｍＬ／Ｌ ＦｅＥＤＴＡおよび７ｇ ／Ｌ寒天かまたは２．５ｇ／Ｌゲルライトから成っており、ｐＨ５．８に調整さ れている。小植物が十分な根茎に発育および分化したら（１−２週間）すぐに約 ０．１ｋｇのＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ^R３６０（Ｔｈｅ Ｓｃｏｔｔｓ Ｃｏ．，Ｍ ａｒｙｓｖｉｌｌｅ，ＯＨ）を含む１０ｃｍのポットに移した。３−５枚の葉の 段階で、約４ｋｇのＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ^R３６０を含む５ガロンのポットに移し 、発育させて成熟させる。これらのＲ₀植物はトランスジェニック子孫を得るた めに自己授粉および／または非トランスジェニック近交種と交雑授粉させた。Ｇ ＢＳＳ標的のために産生されたトランスジェニック植物の場合、Ｒ₀授粉から産 生されたＲ₁種子が再び植えられた。Ｒ₁植物を成熟するまで成長させ、分析に必 要とされる量のＲ₂種子を産生する。実施例２０：Δ９トランスジェニック材料の製造および再生 パートＡ 胚形成カルスの形質転換および単離。 前に記載したΔ−９デサチュ ラーゼを標的とする６つのリボザイム構築物が前に記載したように再生可能なタ イプIIカルス培養物内へ形質転換された。これら６つの構築物は３つの活性／不 活性対から成っている；すなわち、ＲＰＡ８５／ＲＰＡ１１３、ＲＰＡ１１４／ ＲＰＡ１１５およびＲＰＡ１１８／ＲＰＡ１１９。総計で１６２１組織標的が準 備され、吹き付けられおよび選択された。これらのブラスティング実験から、３ ３４の独立したＢａｓｔａ^R耐性形質転換体（”系統”）が単離され選択された 。これらの系統の約５０％が、どれを再生まで進ませおよびどれを捨てるかを決 定する手段としてＤＮＡ ＰＣＲまたはＧＣ／ＦＡＭＥにより分析した。残りの ５０％は、非胚形成的になったりまたは汚染したため分析されなかった。 パートＢ トランスジェニックカルスからのΔ９植物の再生。 トランスジェニ ックカルスの分析に続いて、再生のためリボザイム構築物当たり１２の株が選択 され、株当たり産生されるべき１５のＲ₀植物。これらの株は一般的に１０の分 析陽性株に２つの陰性対照が加えられているが、しかしながら、いくつかの培養 物では再生率が悪く、構築物ＲＰＡ１１３、ＲＰＡ１１５、ＲＰＡ１１８および ＲＰＡ１１９では１２未満の株から植物が産生された。全体で８５４Ｒ₀植物が ６６の個々の株から再生された（表Ｘ参照）。植物が成熟したら、自己−または 関係種授粉が最も優先的に行われたが、このことが不可能な場合は、花粉供与体 および場合によっては花粉受容体として近交系ＣＱ８０６、ＣＳ７１６、ＯＱ４ １４、またはＨＯ１を用いる交雑受粉が行われた。７１５以上の制御された受粉 が行われ、その多くは（５５％）自己−または関係種授粉から成っており、少数 派（４５％）はＦ１交雑種から成っている。Ｒ₁種子は授粉後約４５日で集めら れた。実施例２１：ＧＢＳＳのためのトランスジェニックトウモロコシの産生および再 生 パートＡ 胚形成トウモロコシカルスの形質転換および続いての選択およびトラ ンスジェニック培養物の確立。 ＧＢＳＳを標的とするリボザイムマルチマーの 活性／不活性対であるＲＰＡ６３およびＲＰＡ６４は、前に記載したようにタイ プIIカルス内へｂａｒ選択プラスミドｐＤＡＢ３０８とともに挿入された。５９ ０のブラスティングした組織標的からの選択により総計で１１５のＢａｓｔａ^R 耐性独立形質転換体が回収された。問題とする遺伝子の資格を決定するためにす べての確立された培養物からのカルス試料にサザン分析が実施された。 パートＢ ＧＢＳＳを標的とするリボザイムで形質転換された培養物からの植物 の再生並びにＲ₂発生への前進。 サザン”陽性”トランスジェニック培養物か ら植物を再生し、温室内で成熟するまで成長させた。一次再生物はＲ₁種子を産 生するために授粉された。授粉後３０から４５日に種子を採取し、湿気含量を正 すために乾燥させ、再び種をまいた。総計で７５２のＲ₁植物（１６の元々の株 に相当する）を性成熟まで成長させ、授粉した。授粉後約１９から２２日に、穂 を採取し、穂当たり３０の殻粒を無作為に切り出し、その後の分析のために冷凍 した。実施例２２：安定に形質転換されたカルスであるトウモロコシ ブラックメキシ カンスイート（ＢＭＳ）中のＧＢＳＳ標的化リボザイムの試験 パートＡ ＧＢＳＳおよびＧＢＳＳ標的化リボザイムで安定に形質転換されたＢ ＭＳカルスの産生。 ＢＭＳはトウモロコシで内在的に観察されるものに相同的 であるＧＢＳＳ ｍＲＮＡは産生しない。従って、標的およびリボザイムの両方 を発現する形質転換体を産生するために二重形質転換系が開発された。ヘリウム ブラスティングのため”ＺＭ”ＢＭＳ懸濁液（Ｊａｃｋ Ｗｉｄｈｏｌｍ，Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手した、Ｗ． Ｆ． Ｓｈｅ ｒｉｄａｎ，”ブラックメキシカンスイート：組織培養でのその使用、Ｍａｉｚ ｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，Ｗ．Ｆ．Ｓｈｅｒｉｄ ａｎ編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ− Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｄａｋｏｋｔａ，Ｇｒａｎｄ Ｆｏｒｋｓ，ＮＤ，１９８２，ｐｐ ．３８５−３８８も参照されたい）を調製し、１００ｘ２０ｍｍペトリ皿（Ｆｉ ｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移すことに より継代培養して４日後、液体培地を部分的に除いて細胞の薄いペーストを形成 させる。標的はブラスティング培地、６０ｘ２０ｍｍプレート中、２％ＴＣ寒天 （ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）で固形化した ＤＮ６［Ｎ６塩およびビタミン類（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９７８）、２０ｇ ／Ｌスクロース、１．５ ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸(２．４ −Ｄ)、２５ｍＭ Ｌ−プロリン；ｐＨ＝５．８、１２１℃で２０分間オートク レーブする前］、の上に置いた１／２”抗生物質円盤(Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ)上の１００−１２５ｍｇ新鮮重量 の細胞から成っている。ＤＮＡは金粒子上に沈澱させた。第一の形質転換のため 、ｐＤＡＢ４２６（Ｕｂｉ／ＧＢＳＳ）およびｐＤＡＢ３０８（３５Ｔ／Ｂａｒ ）が使用された。標的はＤｏｗＥｌａｎｃｏヘリウムブラスティング装置１を用 いて個々に撃たれた。６５０ｍｍ Ｈｇの真空圧および１５．５ｃｍの標的と装 置ノズルの距離で、各々の試料は５００ｐｓｉにてＤＮＡ／金混合物で一度ブラ スティングされた。ブラスティング直後、抗生物質円盤は標的組織の回復のため ０．８％Ｔ Ｃ寒天で作製したＤＮ６培地に１週間移した。回復後、各々の標的は、３ｍｇ／ ＬのＢａｓｔａ^R（Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を 加え、プロリンを除いたＤＮ６上に置かれた５．５ｃｍＷｈａｔｍａｎ ＃４フ ィルター上に広げた。２週間後、フィルターを６ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ^Rを加え た新しい選択培地に移した。２週間間隔で移し変えを行った。単離物はフィルタ ーから拾い上げ、６ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ^Rを含む０．８％ＴＣ寒天で固化した ＡＭＣＦ−ＡＲＭ培地（Ｎ６塩およびビタミン類、２０ｇ／Ｌスクロース、３０ ｇ／Ｌマンニトール、１００ｍｇ／Ｌ酸カゼイン水解物および１ｍｇ／Ｌ ２， ４−Ｄ、２４ｍＭ Ｌ−プロリン；ｐＨ＝５．８、１２１℃で２０分間オートク レーブする前）に置いた。単離物は２週間毎に新鮮な培地に継代培養することに より維持された。 ＧＢＳＳを発現するＢａｓｔａ^R耐性単離物は第二の形質転換にかけられた。 ＢＭＳ懸濁液と同様に、トランスジェニックカルス標的は継代培養４日後に１／ ２”フィルター上に組織を広げることにより調製された。しかしながら、ＡＭＣ Ｆ−ＡＲＭ選択培地で形質転換体を維持するため、ブラスティングには２％ＴＣ 寒天を含むＡＭＣＦ−ＡＲＭ培地が使用された。各々の試料は滅菌１０４μｍの メッシュ網で覆われ、１５００ｐｓｉでブラスティングが行われた。標的組織は ｐＤＡＢ３１９（３５Ｓ−ＡＬＳ；３５Ｔ−ＧＵＳ）およびＲＰＡ６３（活性リ ボザイムマルチマー）またはｐＤＡＢ３１９およびＲＰＡ６４（不活性リボザイ ムマルチマー）で同時に、またはｐＤＡＢ３１９単独で撃たれた。ブラスティン グ直後、すべての標的は回復のために１週間非選択培地（ＡＭＣＦ−ＡＲＭ）に 移された。次に、標的は二つの選択試薬、６ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ^Rおよび２μ ｇ／Ｌのクロロスルフロン（ＣＳＮ）を含むＡＭＣＦ−ＡＲＭ培地に置かれた。 パートＢ ＧＢＳＳおよびＧＢＳＳ−標的化リボザイムを発現しているＢＭＳ安 定形質転換の分析。 第一の形質転換からの単離物は機能性標的遺伝子（ＧＢＳ Ｓ）の検出し、発現の相対的レベルを決定するためノーザンブロット分析により 評価された。分析された２５の単離体の１２でＧＢＳＳ転写体が検出された。発 現の範囲が観察され、形質転換が独立して起こっていることを示している。第二 の形質転換で発生した単離物は連続したＧＢＳＳ発現の検出はノーザンブロット 分析により、およびリボザイム転写体の存在のスクリーニングはＲＴ−ＰＣＲに より評価された。一つの以前に形質転換した株からの試験された１９の単離物の １８が活性リボザイム（ＲＰＡ６３）を発現しており、すべてＧＢＳＳを発現し ていた。ＧＢＳＳは６つのベクター対照の各々で検出された；リボザイムはこれ らの試料で発現されていない。本明細書で記載されているように、ＲＮａｓｅ保 護アッセイ（ＲＰＡ）およびノーザンブロット分析は、活性リボザイムの存在ま たは不在下でのＧＢＳＳ転写体のレベルを比較するためにリボザイム発現および ベクター対照組織で実施された。ＧＢＳＳ値は内部対照（Δ−９デサチュラーゼ ）に規格化された；ノーザンブロットデータは図２５に示されている。ノーザン ブロットの結果はベクター対照と比較して、リボザイム存在下ではＧＢＳＳメッ セージのレベルを著しく下げることを明らかにした。ＲＰＡデータは活性リボザ イムを発現している個々の試料のいくつかは（”Ｌ”および”Ｏ”）ベクター対 照とは著しく異なっているが、非形質転換対照と類似していることを示している 。実施例２３：植物およびカルス材料の分析 ｐＤＡＢ３０８およびベクター、ｐＲＰＡ６３、ｐＲＰＡ６４、ｐＲＰＡ８５ 、ｐＲＰＡ１１３、ｐＲＰＡ、１１４、ｐＲＰＡ１１５、ｐＲＰＡ１１８または ｐＲＰＡ１１９を含むリボザイムの一つで同時形質転換された植物材料がカルス レベル、Ｒ₀レベルおよびＦ１で分析された選択株レベルで分析された。葉材料 は植物が６−８葉の段階に達したときに採取された。植物およびカルス材料から のＤＮＡはＳａｇｈａｉ−Ｍａｒｏｏｆ ｅｔ ａｌ．（上記文献）により記載 されているように凍結乾燥組織から調製された。８マイクログラムの各々のＤＮ Ａは、各々の構築物に特異的な制限酵素により、製造元（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に より示唆されている条件を用いて消化され、アガロースゲル電気泳動により分離 された。ＤＮＡはＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．１９７５”ゲル電気泳動により分離さ れたＤＮＡ断片の中での特異的配列の検出”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０ ３およびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．１９８０”制限断片のゲル電気泳動”Ｍｅｔｈ ｏ ｄｓ Ｅｎｚｍｏｌ．６９：１５２（これらは本明細書において援用される）に 記載されているようにナイロン膜へブロットされた。 リボザイムコード領域に特異的なプローブは膜へハイブリダイズした。プロー ブＤＮＡの５０ｎｇを１０分間煮沸し、氷で迅速に冷却した後に５０マイクロキ ューリーのα³²Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ． Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を持つＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ標 識ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に加え ることによりプローブＤＮＡを調製する。プローブはナイロン膜上でゲノムＤＮ Ａにハイブリダイズした。膜は０．２５ＸＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中、６０ ℃にて４５分洗浄し、乾燥し、二つの補カスクリーンを用いてＸＡＲ−５フィル ムに一夜暴露した。 ＲＰＡ６３およびＲＰＡ６４からのＤＮＡは制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃ ｏＲＩで消化され、これらの試料を含むブロットはＲＰＡ６３プローブへハイブ リダイズされた。ＲＰＡ６３プローブはＲＰＡ６３リボザイムマルチマーコード 領域から成っており、ＲＰＡ６３またはＲＰＡ６４材料とハイブリダイズした場 合、単一の１．３ｋｂハイブリダイゼーション生成物を産生しなければならない 。１．３ｋｂハイブリダイゼーション生成物は促進された３５Ｓプロモーター、 ＡｄｈＩイントロン、リボザイムコード領域およびノパリン合成酵素ポリＡ３’ 末端を含んでいなければならない。ＲＰＡ８５およびＲＰＡ１１３からのＤＮＡ は制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩで消化され、これらの試料を含むブロ ットはＲＰＡ１２２プローブへハイブリダイズされた。ＲＰＡ１２２はＧＵＳレ ポーターを置き換えたｐＤＡＢ３５３中の２５２マルチマーリボザイムである。 ＲＰＡ１２２プローブはＲＰＡ１２２リボザイムマルチマーコード領域およびノ パリン合成酵素３’末端から成っており、ＲＰＡ８５またはＲＰＡ１１３材料と ハイブリダイズした場合、単一の２．１ｋｂハイブリダイゼーション生成物を産 生しなければならない。２．１ｋｂハイブリダイゼーション生成物は促進された ３５Ｓプロモーター、ＡｄｈＩイントロン、ｂａｒ遺伝子、リボザイムコード領 域およびノパリン合成酵素ポリＡ３’末端を含んでいなければならない。ＲＰＡ １１４およびＲＰＡ１１５からのＤＮＡは制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＳｍａＩ で消化され、 これらの試料を含むブロットはＲＰＡ１１５プローブへハイブリダイズされた。 ＲＰＡ１１５プローブはＲＰＡ１１５リボザイムコード領域から成っており、Ｒ ＰＡ１１４またはＲＰＡ１１５材料とハイブリダイズした場合、単一の１．２ｋ ｂハイブリダイゼーション生成物を産生しなければならない。１．２ｋｂハイブ リダイゼーション生成物は促進された３５Ｓプロモーター、ＡｄｈＩイントロン 、リボザイムコード領域およびノパリン合成酵素ポリＡ３’末端を含んでいなけ ればならない。ＲＰＡ１１８およびＲＰＡ１１９からのＤＮＡは制限酵素Ｈｉｎ ｄIIIおよびＳｍａＩで消化され、これらの試料を含むブロットはＲＰＡ１１８ プローブへハイブリダイズされた。ＲＰＡ１１８プローブはＲＰＡ１１８リボザ イムコード領域から成っており、ＲＰＡ１１８またはＲＰＡ１１９材料とハイブ リダイズした場合、単一の１．３ｋｂハイブリダイゼーション生成物を産生しな ければならない。１．３ｋｂハイブリダイゼーション生成物は促進された３５Ｓ プロモーター、ＡｄｈＩイントロン、リボザイムコード領域およびノパリン合成 酵素ポリＡ３’末端を含んでいなければならない。実施例２４：トランスジェニックカルスからのゲノムＤＮＡの抽出 ３００ｍｇの活発に増殖しているカルスは急速にドライアイス上で凍結された 。それは冷やしたＢｅｓｓｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ（Ｓｐ ｅｃｔｒｕｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で細かい粉末に挽かれ、４００μｌの２ ｘＣＴＡＢ緩衝液（２％ヘキサデシルトリメチルアンモニウム ブロミド、１０ ０ｍＭトリスｐＨ ８．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、１％ポ リビニルピロリドン）で抽出した。懸濁液は６５℃で２５分間溶解させ、等容量 のクロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。水相に０．１容量の１０％ ＣＴＡＢ緩衝液（１０％ヘキサデシルトリメチルアンモニウム ブロミド、０． ７Ｍ ＮａＣｌ）を加えた。続いて等容量のクロロホルム：イソアミルアルコー ルで抽出した。水相に０．６容量の冷イソプロピルアルコールを加え、−２０℃ に３０分置いた。１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、得られた沈澱は 真空下１０分間乾燥させた。それは２００μｌのＴＥ(１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０)に６５℃で２０分再懸濁した。２０％キレックス（Ｂ ｉｏ ｒａｄ）を最終濃度が５％になるようにＤＮＡに加え、不純物を除去するため５ ６℃で１５−３０分インキュベートした。ＤＮＡ濃度はＨｏｅｆｅｒ Ｆｌｕｏ ｒｉｍｅｔｅｒ（Ｈｏｅｆｅｒ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）で測定した。実施例２５：カルスゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析 トランスジェニックトウモロコシカルスの染色体内へのリボザイム遺伝子の安 定な挿入を示すためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用。パートＡ リボザイムＤＮＡを検出するために使用された方法 ポリメラーゼ連 鎖反応(ＰＣＲ)がＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｐ ＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃｅｔｕｓ）を使用して供給元のプロ トコールに記載されているように実施された。３００ｎｇのカルスゲノムＤＮＡ の一部、１μｌの５０μＭ下流プライマー（５’ ＣＧＣ ＡＡＧ ＡＣＣ Ｇ ＧＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ３’）、１μｌの上流プライマーおよび１μｌのＰｅｒ ｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａ）ＰＣＲエンハンサーがキ ットの成分と混合された。ＰＣＲ反応は以下のパラメーターを用いて４０サイク ル実施された；９４℃で１分間の変性、５５℃で２分間のアニーリングおよび７ ２℃で３分間の伸長。各々のＰＣＲ反応の０．２ｘ容量が標準ＴＡＥアガロース ゲル条件を用いて２％ ３：１アガロース（ＦＭＣ）ゲルで電気泳動された。パートＢΔ−９デサチュラーゼリボザイム遺伝子の検出に使用された上流プライ マー ＢＡＲ ３’ＯＲＦに融合されたＲＰＡ８５／ＲＰＡ１１３ ２５１マルチマ ー ＲＰＡ１１４／ＲＰＡ１１５ ２５８リボザイムモノマー ＲＰＡ１１８／ＲＰＡ１１９ ４５２リボザイムマルチマー ５’ ＴＧＧ ＡＴＴ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＴＡ ＴＣＴ ＣＣＡ Ｃ ３’ このプライマーは３５Ｓプロモーター中のＥｃｏＲＶを横切っての増幅に使用 される。 プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４ＤＮＡ／ＲＮ Ａ合成機により、標準オリゴ合成プロトコールを用いて製造された。実施例２６：トランスジェニックトウモロコシカルスおよび植物からの全ＲＮＡ の調製 パートＡ トランスジェニック非再生可能および再生可能カルス組織からの全Ｒ ＮＡの調製。３００ｍｇの活発に増殖しているカルスは急速にドライアイス上で 凍結された。組織は冷やしたＢｅｓｓｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｕｌｖｅｒｉｚ ｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で細かい粉末に挽かれ、激し くボルテックスしてＲＮＡ抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、 ４％パラーアミノサリチル酸、１％トリ−イソ−プロピルナフタレンスルホン酸 、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭメタ−亜硫酸水素ナトリウム）で 抽出した。ホモジネートは次に等容量の０．１％８−ヒドロキシキノリンを含む フェノールで抽出された。遠心分離後、水層をクロロホルム：イソアミルアルコ ール（２４：１）を含む等容量のフェノールで抽出し、続いてクロロホルム：オ クタノール（２４：１）で抽出した。続いて、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを最終 濃度が２．５Ｍになるように加え、ＲＮＡを４℃で１から３時間沈澱させた。４ ℃にて１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、ＲＮＡを滅菌水に再懸濁し、２． ５Ｍ ＮＨ₄ＯＡｃおよび２容量の１００％エタノールで沈澱させ、−２０℃で 一夜インキュベートした。採取されたＲＮＡペレットは７０％エタノールで洗浄 し、真空下で乾燥させた。ＲＮＡは滅菌水に再懸濁し、−８０℃で貯蔵した。 パートＢ トランスジェニックトウモロコシ植物からの全ＲＮＡの調製。活発に 成長しているトウモロコシ葉組織の５ｃｍ区域（約１５０ｍｇ）を切り出し、ド ライアイスで急速に凍結させた。葉は冷やしたモーターで細かい粉末に挽いた。 使用説明書に従い、Ｑａｉｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ Ｒ ＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて 全ＲＮＡが精製された。全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙカラムから、前もって温めた( ５０℃)滅菌水（各々３０μｌ）の２回の連続的な溶出回転により放出され、− ８０℃で貯蔵された。実施例２７：トランスジェニックトウモロコシカルスおよび植物中のリボザイム の発現を示すためのＲＴ−ＰＣＲ分析の使用 パートＡ リボザイムＲＮＡを検出するために使用された方法。熱安定性ｒＴｔ ｈ ＤＮＡポリメラーゼを用い、使用説明書に記載されているように逆転写−ポ リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が実施された（ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラ ーゼＲＮＡ ＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）。全ＲＮ Ａ（葉またはカルス）の一部３００ｎｇおよび１５μＭ下流プライマー（５’Ｃ ＧＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ３’）の１μｌがキットのＲ Ｔ成分と混合された。逆転写反応は６０℃、６５℃および７０℃での５分間のイ ンキュベーションによる３段階勾配で実施された。ＰＣＲ反応のため、分析され ているリボザイムＲＮＡに特異的な上流プライマーの１μｌをＰＣＲ成分を含む ＲＴ反応液に加えた。ＰＣＲ反応は以下のパラメーターを用いて３５サイクル実 施された；９６℃で１分間インキュベーション、９４℃で３０秒間の変性、５５ ℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３分間の伸長。各々のＰＣＲ反応液 の０．２ｘ容量が標準ＴＡＥアガロースゲル条件を用いて２％ ３：１アガロー ス（ＦＭＣ）ゲルで電気泳動された。 パートＢ ＧＢＳＳリボザイムの検出に使用された特異的上流プライマー。 ＧＢＳＳ活性および不活性マルチマー ５’ＣＡＧ ＡＴＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＣＧ ＧＡＣ ＧＧ Ａ ＴＣＴ Ｇ ３’ このプライマーは第一のリボザイムアームの上流のＡｄｈ Ｉイントロンをカバ ーしている。 ＧＢＳＳ ９１８イントロン（−）モノマー： ５’ ＡＴＣ ＣＧＡ ＴＧＣ ＣＧＴ ＧＧＣ ＴＧＡ ＴＧ ３’ このプライマーは１０塩基対リボザイムアームおよびリボザイム触媒ドメインの 最初の６塩基をカバーしている。 トランスジェニックカルスおよび植物におけるＧＢＳＳリボザイム発現はＲＴ− ＰＣＲにより確認された。 安定に形質転換されたカルス中のＧＢＳＳマルチマーリボザイム発現もまたリ ボヌクレアーゼ保護アッセイにより決定された。 パートＣ Δ−９デサチュラーゼリボザイムの検出に使用された特異的上流プラ イマー。 ＢＡＲ ３’ＯＲＦに融合されたＲＰＡ８５／ＲＰＡ１１３ ２５２マルチマー ５’ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＴＣ ＣＧＧ ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＧ ３’ このプライマーはＢＡＲ遺伝子およびＲＰＡ８５／１１３リボザイムの接合部に 広がっている。 ＲＰＡ１１４／ＲＰＡ１１５ ２５９リボザイムモノマー ５’ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＡＣ ＴＧＡ ＴＧ ３’ このプライマーは１０塩基対リボザイムアームおよびリボザイム触媒ドメインの 最初の６塩基をカバーしている。 ＲＰＡ１１８／ＲＰＡ１１９ ４５３リボザイムマルチマー ５’ ＣＡＧ ＡＴＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＣＧ ＧＡＣ Ｇ ＧＡ ＴＣＴ Ｇ ３’ このプライマーは第一のリボザイムアームの上流のＡｄｈ Ｉイントロンをカバ ーしている。 トランスジェニック植物株８５−０６、１１３−０６および８５−１５における Δ−９デサチュラーゼリボザイムの発現はＲＴ−ＰＣＲにより確認された。 プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４ＤＮＡ／Ｒ ＮＡ合成機により、標準オリゴ合成プロトコールを用いて製造された。実施例２８：トランスジェニックトウモロコシカルスおよび植物における標的ｍ ＲＮＡレベルのリボザイム仲介減少の証明 パートＡ 標的ｍＲＮＡレベルの減少を示すために使用されたノーザン分析法。 全ＲＮＡの５μｇを真空下で乾燥し、充填緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６ ．８、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％ホルムアミド：１６％ホルムアルデヒド：１０ ％ グリセロール）に再懸濁し、６５℃で１０分間変性させた。電気泳動は５０ボル トで、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中、緩衝液を再循環させながら１％ アガロースゲルを通した。ＢＲＬ ０．２４−９．５Ｋｂ ＲＮＡラダー（Ｇｉ ｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）はゲル中でエチジウムブロ ミドで染色された。ＲＮＡは滅菌水によるキャピラリー輸送によりＧｅｎｅＳｃ ｒｅｅｎメンブランフィルター（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ） へ移された。ハイブリダイゼーションはＤｅＬｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３ ）により記載されているように４２℃で実施され、フィルターは非ハイブリダイ ズプローブを除去するために５５℃で洗浄された。ブロットは標的遺伝子および 内部ＲＮＡ対照遺伝子からのｃＤＮＡ断片で連続的に探査された。内部ＲＮＡ標 品は真のリボザイム仲介ＲＮＡ減少と充填または取扱エラーによる標的ｍＲＮＡ レベルの変化を区別するために利用された。各々の試料に対し、標的ｍＲＮＡの レベルがその試料内の対照ｍＲＮＡレベルと比較された。断片はＱｉａｅｘ樹脂 (Ｑａｉｇｅｎ Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ)により１ｘＴＡＥアガロ ースゲルから精製された。それらはアルファ³²Ｐ ｄＣＴＰを含むＡｍｅｒｓｈ ａｍニックトランスレーションキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＩＩ．）を用いて切断修復標 識した。オートラジオグラフィーは−７０℃にて補カスクリーン（ＤｕＰｏｎｔ ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）を用いて１から３日行った。各々のプローブの オートラジオグラム信号は２４時間暴露後にデンシトメーターにより測定され、 標的／内部対照ｍＲＮＡレベルの比が計算された。 リボヌクレアーゼ保護アッセイは以下のように実施された：ＲＮＡはＱｉａｇ ｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡキットを用いて、ＢＭＳ 原形質体またはカルス材料から調製された。プローブはＡｍｂｉｏｎ Ｍａｘｉ ｓｃｒｉｐｔキットを用いて作製され、典型的には１０⁸ｃｐｍ／マイクログラ ムまたはそれ以上であった。プローブはそれらが使用される日と同じ日に作製さ れた。それらはゲル精製され、ＲＮａｓｅを含まない１０ｍＭトリス（ｐＨ８） に再懸濁して、氷上で保たれた。プローブは使用直前に５ｘ１０⁵ｃｐｍ／μｌ に希釈された。５μｇのカルス由来のＲＮＡまたは２０μｇの原形質体由来のＲ ＮＡは４Ｍグアニジン緩衝液中で５ｘ１０⁵ｃｐｍのプローブとインキュベート された。［４Ｍグアニジン緩衝液：４Ｍグアニジン チオシアネート／０．５％ サルコシル／２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）］。４０μｌのＰＣＲ 鉱物油が蒸発を防ぐために各々のチューブに加えられた。試料は９５℃に３分間 加熱され、すぐに４５℃の水浴に入れられた。インキュベーションは一夜続けら れた。試料当たり６００μｌのＲＮａｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｍｉｘが加え られ、３７℃で３０分インキュベートされた。（ＲＮａｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎ ｔ Ｍｉｘ：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０単位／ｍｌ ＲＮａｓｅおよびＴ１） 。チューブ当たり１２μｌの２０％ＳＤＳが加えられ、直後に各々のチューブに １２μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）のプロテイナーゼＫが加えられた。チューブは穏や かにかき混ぜ、３７℃で３０分インキュベートした。各々のチューブに７５０μ ｌの室温のＲＮａｓｅを含まないイソプロパノールを加え、繰り返し逆にしてＳ ＤＳを溶液に溶解させる。試料は室温で２０分間最高速度で微量遠心した。ペレ ットは４５分、風乾した。１５μｌのＲＮＡ Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液を各々のチ ューブに加え、３０秒間強くボルテックスした。（ＲＮＡ Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝 液：９５％ホルムアミド・２０ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ブロモフェノール ブ ルー／０．１％キシレンサイアノール）。試料は９５℃に３分間加熱し、８％変 性アクリルアミドゲルにのせた。ゲルは真空乾燥され、ホスホロイメージャース クリーンへ４から１２時間暴露した。 パートＢ ＧＢＳＳおよびＧＢＳＳ標的化リボザイムＲＮＡの両方を発現してい る非再生可能カルスにおけるＧＢＳＳ ｍＲＮＡレベルの減少を示している結果 。ＧＢＳＳ標的遺伝子に対するＲＮＡおよびＧＢＳＳ ｍＲＮＡを標的とする活 性マルチマーリボザイムを発現している非再生可能カルスの産生が実施された。 ＧＢＳＳおよびリボザイム（−）対照ＲＮＡを発現しているトランスジェニック もまた産生された。全ＲＮＡはトランスジェニック株から調製された。７つのリ ボザイム（−）対照形質転換体および８つの活性ＲＰＡ６３株にノーザン分析が 実施された。この分析のためのプローブは完全長トウモロコシＧＢＳＳ ｃＤＮ ＡおよびトウモロコシΔ９ｃＤＮＡ断片であった。充填または取扱エラーによる Ｇ ＢＳＳ ｍＲＮＡレベルの変位と真のリボザイム仲介ＲＮＡ減少を区別するため 、ＧＢＳＳ ｍＲＮＡのレベルがその試料内のΔ９ｍＲＮＡのレベルと比較され た。リボザイム仲介標的ＲＮＡ減少を示す株を同定するため、リボザイム発現お よびリボザイム（−）カルス間で完全長ＧＢＳＳ転写体のレベルが比較された。 ブロット間の変位は二重の分析で調節された。 ＧＢＳＳ／Δ９比の幅がリボザイム（−）トランスジェニック間で観察された 。標的ｍＲＮＡは導入遺伝子により産生され、内在性Δ９ｍＲＮＡよりも発現が 変化しやすいであろう。活性系統（ＲＰＡ６３）ＡＡ，ＥＥ、ＫＫおよびＪＪは 、リボザイム（−）対照トランスジェニック物に比較して１０倍ほどもＧＢＳＳ ／Δ９のレベルが減少しているのが示され、これは図２５にグラフで示されてい る。これらの活性系統はここに説明されているＲＴ−ＰＣＲによりＧＢＳＳ標的 化リボザイムを発現していることが示された。 Δ９ｍＲＮＡと比較したＧＢＳＳｍＲＮＡの減少はＲＮＡｓｅ保護アッセイで も観察された。 パートＣ Δ−９デサチュラーゼｍＲＮＡを標的とするリボザイムを発現してい るトランスジェニック植物におけるΔ−９デサチュラーゼレベルの減少の実証。 高ステアリン酸トランスジェニック体、ＲＰＡ８５−０６およびＲＰＡ８５−１ ５は各々融合リボザイムマルチマー遺伝子の無傷のコピーを含んでいる。各々の 株内で、植物はリボザイムＲＮＡの存在をＲＴ−ＰＣＲによりスクリーニングさ れた。実施例２７に記載したプロトコールを使用した。ＲＰＡ８５リボザイム発 現は、葉に高ステアリン酸を含む８５−０６および８５−１５株の植物で実証さ れた。各々の株のからの６つの高ステアリン酸植物ならびに非形質転換（ＮＴ） および形質転換対照（ＴＣ）植物でノーザン分析が実施された。この分析のため のプローブはトウモロコシΔ−９デサチュラーゼｃＤＮＡおよびトウモロコシア クチンｃＤＮＡからのｃＤＮＡ断片であった。充填または取扱エラーによるΔ９ ｍＲＮＡレベルの変位を真のリボザイム仲介減少から区別するため、Δ９ｍＲＮ Ａのレベルはその試料内のアクチンｍＲＮＡのレベルと比較された。前記のデン シトメーター読み取りを用いて、各々の試料に対して比が計算された。０．５５ から０．８８の範囲のΔ９／アクチン比の値が８５−０６植物で計算された。非 形質転換対照の平均Δ９／アクチン比は２．７であった。８６−０６およびＮＴ 葉の間にはΔ９／アクチン比で明かな４倍の減少があった。８５−０６高ステア リン酸およびＴＣ植物間のΔ９／アクチン比の比較では、平均３倍の減少がΔ９ ／アクチンで観察された。このデータは図２６にグラフにされている。０．３５ から０．５３のΔ９／アクチン比の幅（平均０．４３）がＲＰＡ８５−１５高ス テアリン酸トランスジェニック体で計算された。この実験において、ＮＴ植物に 対する平均Δ９／アクチン比は１．７であった。ＮＴ対照および８５−１５高ス テアリン酸植物間の平均Δ９／アクチン比を比較すると、８５−１５Δ９ｍＲＮ Ａにおいての３．９倍の減少が示された。Δ９／アクチン比が８５−１５高ステ アリン酸および正常ステアリン酸（ＴＣ）植物間で比較された場合、明かなΔ９ ｍＲＮＡレベルの３倍の減少がＲＰＡ８５−１５高ステアリン酸トランスジェニ ック体で観察された。これらのデータは図２７にグラフにされている。これらの データはＲＰＡ８５リボザイムを発現し、葉に高められたレベルのステアリン酸 を産生しているトランスジェニック植物におけるΔ−９デサチュラーゼｍＲＮＡ のリボザイム仲介減少を示している。実施例２９：活性なリボザイム活性の結果としてのトウモロコシ葉におけるΔ− ９デサチュラーゼダウンレギュレーションの証拠 Δ−９デサチュラーゼリボザイム遺伝子の不活性体で形質転換された植物が製造 された。不活性Δ９リボザイムトランスジェニック株ＲＰＡ１１３−０６および １１３−１７においては対照レベルの葉ステアリン酸をデータは示している。リ ボザイム発現およびノーザン分析がＲＰＡ１１３−０６株で実施された。Δ−９ デサチュラーゼタンパク質レベルがＲＰＡ１１３−０６株の植物で決定された。 リボザイム発現は前に記載したように測定された。植物１１３−０６−０４、− ７および−１０は検出可能なレベルのＲＰＡ１１３不活性Δ９リボザイムを発現 していた。１．８％−３．９％の葉ステアリン酸を持つ（すべて対照の範囲内に 含まれる）１１３−０６株の５つの植物でノーザン分析が実施された。対照と比 較した場合、ＲＰＡ１１３−１６植物ではリボザイム発現または葉ステアリン酸 の上昇と相関したΔ−９デサチュラーゼｍＲＮＡの減少は観察されず、図２８に グラフ化されている。タンパク質分析はＲＰＡ１１３−１７植物での上昇した葉 ステアリン酸と相関したΔ−９デサチュラーゼタンパク質レベルの減少を示さな かった。このデータは図２９（ａ）にグラフ化されている。二つのＲＰＡ１１３ 不活性トランスジェニック株からのデータを一緒にすると、リボザイム活性はＲ ＰＡ８５株で観察された高ステアリン酸表現型の原因であることを示している。 ＲＰＡ８５リボザイムはＲＰＡ１１３リボザイムの活性版である。実施例３０：トウモロコシ葉（ＲＯ）におけるステアロイル−ＡＣＰΔ−９デサ チュラーゼレベル、トウモロコシ葉（ＲＯ）におけるΔ−９デサチュラーゼレベ ルのリボザイム仲介減少の実証 パートＡ トウモロコシ葉からのステアロイル−ＡＣＰ Δ−９デサチュラーゼ の部分精製。特に記述しない限り、すべての方法は４℃で実施された。トウモロ コシ葉（５０ｍｇ）を採取し、液体Ｎ₂中、乳鉢および乳棒で細かい粉末になる まで挽いた。タンパク質は、２５ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．５、１ｍＭエ チレンジアミン四酢酸、２ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭフェニルメチルス ルホニウム フルオリド、５ｍＭロイペプチンおよび５ｍＭアンチパピンから成 る等容量の緩衝液Ａで抽出した。粗ホモジネートは１０，０００ｘｇで５分、遠 心分離した。上清はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で総タンパク質濃度をア ッセイした。総タンパク質の１００マイクログラムを緩衝液Ａで希釈して５００ μｌの最終容量とし、５０μｌの混合ＳＰ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ加え、簡 単にボルテックスして再懸濁した。氷上に１０分間放置してタンパク質をセファ ロースビーズに結合させた。結合後、Δ−９デサチュラーゼ−セファロースを１ ０秒遠心分離し（１０，０００ｘｇ）、デカントし、緩衝液Ａ（５００μｌ）で ３回洗浄し、２００ｍＭ塩化ナトリウム（５００μｌ）で１回洗浄した。５０μ ｌの処理緩衝液（１２５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、４％ドデシル硫酸ナ トリウム、２０％グリセロールおよび１０％ ２−メルカプトエタノール）中で ５分間煮沸することにより溶出させた。試料は５分間遠心分離した（１０，００ ０ｘｇ）。上清をウェスタン分析にために保存し、セファロースビーズからなる ペレットは廃棄した。 パートＢ ステロイル−ＡＤＰ Δ−９デサチュラーゼの減少を示すために使用 されたウェスタン分析法。部分的に精製されたタンパク質はＬａｅｍｍｌｉ，Ｕ ．Ｋ．（１９７０）”ファージＴ４の頭部の組立における構造タンパク質の切断 ”，Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６６０−６８５に記載されているようにドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル（１０％ ＰＡＧＥ）で分離 した。各々のブロットに含まれるΔ−９デサチュラーゼレベルの変位を区別する ため、以下に説明するように大腸菌からの過剰発現されたΔ−９デサチュラーゼ が精製および定量され標品とされた。タンパク質はＰｈａｒｒｎａｃｉａ Ｓｅ ｍｉ−Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｅｒ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ ．．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ)およびＴｏｗｂｉｎ緩衝液(Ｔｏｗｂｉｎ ｅ ｔ ａｌ．１９７９)を用いて電気泳動的にＥＣＬ^TMニトロセルロース膜（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈ ｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）へ移された。非特異的結合部位は１０％乾燥ミルクを 含むリン酸緩衝液で１時間かけて遮断した。免疫反応性ポリペプチドはＥＣＬ^TM ウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎ ｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用い大腸 菌発現トウモロコシΔ−９デサチュラーゼに対して上げられた抗血清で検出され た。抗体はＢｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．による標準プロトコー ルに従って産生された。第二抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＢｉｏＲａｄ ）に複合されたヤギ抗ウサギ血清であった。オートラジオグラムはデンシトメー ターで走査され精製大腸菌Δ−９デサチュラーゼとの相対量に基づいて定量され た。これらの実験は２回行い、平均減少が記録された。 パートＣ Δ−９デサチュラーゼｍＲＮＡへ標的化されたリボザイムを発現して いるＲ０トウモロコシ葉中のΔ−９デサチュラーゼレベルの減少の実証。高ステ アリン酸トランスジェニック株、ＲＰＡ８５−１５は融合マルチマー遺伝子の無 傷のコピーを含んでいる。本明細書に記載されているプロトコールを用いてＲ０ トウモロコシ葉からΔ−９デサチュラーゼが部分精製された。パートＢで説明し たように、リボザイム活性（ＲＰＡ８５−１５）およびリボザイム不活性（ＲＰ Ａ１１３−１７）植物および非形質転換（ＨｉII）植物に対してウェスタン分析 が実施された。ウェスタン分析により、非形質転換株（ＨｉII）でΔ−９デサチ ュラーゼの天然の変位が決定された、図２９Ａを参照されたい。リボザイム不活 性株ＲＰＡ１１３−１７ではΔ−９デサチュラーゼの減少は観察されず、非形質 転換株（ＨｉII）と比較してもその範囲内であった。対照と比較した場合、Δ− ９デサチュラーゼの明かな５０％減少が株ＲＰＡ８５−１５の６つの植物で観察 された（図２９Ｂ）。これと同時に、これら同一の６つの植物はステアリン酸が 増加し、Δ−９デサチュラーゼｍＲＮＡが減少していた（実施例２８および３２ に記載したように）。しかしながら、株ＲＰＡ８５−１５からの９つの活性リボ ザイム植物は非形質転換株（ＨｉII）およびリボザイム不活性株（ＲＰＡ１１３ −１７）と比較しても有意な減少を示さなかった（図２９ＡおよびＢ）。ひとま とめにして、これらの結果は株ＲＰＡ８５−１５からの６つの植物におけるリボ ザイム活性は減少したΔ−９デサチュラーゼの原因となっていることを示唆して いる。実施例３１：大腸菌発現およびトウモロコシΔ−９デサチュラーゼ酵素の精製 パートＡ トウモロコシΔ−９デサチュラーゼｃＤＮＡの一部をコードしている 成熟タンパク質が細菌Ｔ７発現ベクターｐＥＴ９Ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ． ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内へ挿入された。成熟タンパク質コード領域は成熟ヒ マの実ポリペプチド配列から演繹された。３２位のアラニン（ｃＤＮＡのｎｔ２ ３９−２４１）は最初の残基と称されている。これは配列Ａｌａ．Ｖａｌ．Ａｌ ａ．Ｓｅｒ．Ｍｅｔ．Ｔｈｒ内に観察される。制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ 部位がＰＣＲによりトウモロコシ配列内へ導入され、ＧＣＣＴＣＣをＧＣＴＡＧ Ｃに換えることにより、およびＢａｍＨＩ部位が３’末端に加えられた。このこ とはタンパク質のアミノ酸配列は変化させない。ｃＤＮＡ配列はＮｈｅＩおよび Ｂａ ｍＨＩ部位を用いてｐＥＴ９ｄベクター内へクローン化された。この組換えプラ スミドはｐＤＡＢ４２８と称された。細菌で発現されるトウモロコシΔ−９デサ チュラーゼタンパク質は追加のメチオニン残基を５’末端に持っている。このｐ ＤＡＢ４２８プラスミドは細菌株ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄ ｉｓｏｎ，ＷＩ）内へ形質転換され、ＬＢ／カナマイシンプレート（２５ｍｇ／ ｍｌ）に置かれた。コロニーはカナマイシン（２５ｍｇ／ｍｌ）およびＩＰＴＧ （１ｍＭ）を含む１０ｍｌのＬＢに再懸濁され、３７℃にて３時間振とう機で増 殖させた。４℃で１０分、１０００ｘｇで遠心分離して細胞を採取した。細胞ペ レットは凍結−融解を２回繰り返し、続いて１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ トリトンＸ１００、１００μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮＡ ｓｅ、および１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）を加えることにより細胞を溶解させた 。混合物は３７℃で１５分インキュベートした後、４℃で１０分１０００ｘｇで 遠心分離した。上清は可溶性タンパク質分画として使用される。 ２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に調整した上清は氷上で１時間冷却させ た。その後、羊毛のような沈澱は遠心分離により除去した。氷インキュベーショ ン工程をもう二回繰り返した後は、溶液は透明のままである。清澄化した溶液は ２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化されているＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ１ ０／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加えた。カラムマトリックスに吸着し た塩基性タンパク質は０ー５００ｍＭ ＮａＣｌ濃度勾配を用い、１時間以上か けて（２ｍｌ／ｍｉｎ；２ｍｌ分画）溶出した。問題とする推定タンパク質はＳ ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜上にブロットし、クーマシーブルーで可視化 し、切り出し、およびアミノ末端配列分析のためＨａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｏｃ ｈｅｍへ送られた。ｃＤＮＡクローンによりコードされているタンパク質アミノ 末端配列との比較により、本タンパク質は本当にΔ９であったことが明らかにさ れた。発現されたタンパク質と会合しているジ鉄−オキソ成分の分光学的分析( Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ ．９０，２４８６−２４９０)、ならびに非ヘム鉄株を用いる同定(Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７，３１７−３２ ０) から精製されたタンパク質はΔ９であることが確認された。 パートＢ ポリクローナル抗血清の産生 大腸菌産生Δ−９タンパク質（アミノ末端配列決定により決定されたように） はウサギにおけるポリクローナル血清製造のため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりゲル 精製し、切り出し、ゲルマトリックスに入れたままＢｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉ ｂｏｄｙ Ｃｏ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡへ送られた。Δ９に対する抗体の力 価はＥＣＬ検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用いるウェスタン分析によ り決定された。 パートＣ コーン殻粒からのΔ−９デサチュラーゼの精製 タンパク質沈澱：ワーリングブレンダーを用い、２５ｍＭ亜硫酸水素ナトリウム および２．５％ポリビニルポリピロリドンを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７ ．０）中でホモジナイズしてコーン殻粒からΔ９が精製される。粗ホモジネート はチーズ布を通して濾過され、０．２５時間遠心分離され（１０，０００ｘｇ） 、得られた上清はチーズ布をもう一度通して濾過された。ある場合は、上清は２ ０％ｖ／ｖでの、続いての８０％ｖ／ｖによる沈澱による飽和硫酸アンモニウム 沈澱により分画された。高油性胚原質から得られた抽出物は、５−および２５％ ｖ／ｖの最終濃度で５０％ポリエチレングリコール溶液(ｍｗ＝８０００)を添加 することにより分画された。すべての場合において、Δ９タンパク質は８０％硫 酸アンモニウムまたは２５％ポリエチレングリコールで沈澱された。得られたペ レットは２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でよく透析された。 カチオン交換クロマトグラフィー：前記のように可溶化されたペレット物質は遠 心分離により清澄化され、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化されて いるＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ１０／１０カラムに加えた。よくカラムを洗浄した後、 カラムマトリックスに結合された塩基性タンパク質は０ー５００ｍＭ ＮａＣｌ 濃度勾配を用い、１時間以上かけて（２ｍｌ／ｍｉｎ；２ｍｌ分画）溶出した。 酵素的およびウェスタン分析により決定されるように、典型的には、Δ９タンパ ク質は２６０−および３５０ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出された。透析後、この物 質はアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）−セファロースおよびフェニルセファ ロースクロマトグラフィーによりさらに分画された。 アシルキャリアタンパク質−セファロースクロマトグラフィー：ＡＣＰはビーズ に結合する前にＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入され、 ｐＨ４．１での沈澱により精製された（Ｒｏｃｋ ａｎｄ Ｃｒｏｎａｎ １９ ８１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，７１１６−７１２２）。ＡＣＰ−セフ ァロースは本質的にＰｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．により記載されているように 、包装品の１００ｍｇのＡＣＰをシアノーゲンブロミド活性化セファロース４Ｂ ビーズに共有結合させることにより調製される。結合、および残存部位をグリシ ンで塞いだ後、ＡＣＰ−セファロースはＨＲ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ，Ｉｎｃ．）に充填し、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡 化した。前記の同定された透析分画をカラムに加えた（ＭｃＫｃｏｎ ａｎｄ Ｓｔｕｍｐｆ，１９８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１２１４１−１２ １４７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２５７８−２５８２）。カラムをよく洗浄した 後、ＡＣＰ−結合タンパク質は１Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出された。酵素的およ びウェスタン分析、続いてのアミノ末端配列決定は溶出液がΔ−９タンパク質を 含んでいることを示した。コーンから精製されたΔ−９タンパク質はＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析により約３８ｋＤａの分子サイズを持っていることが決定された（Ｈ ａｍｅｓ，１９８１，Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ＢＤ およびＲｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．編，ＩＲＬ Ｐｒｃｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。 フェニルセファロースクロマトグラフィー：ＡＣＰ−セファロースカラムから得 られたΔ９含有分画は０．４Ｍ硫酸アンモニウムに調整され（２５ｍＭリン酸ナ トリウム、ｐＨ７．０）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ フェニルセファロースカラム( Ｈ Ｒ１０／１０)に加えられた。タンパク質は濃度勾配（０．４−０．０Ｍ硫酸ア ンモニウム）を行いながら２ｍｌ／ｍｉｎで１時間溶出させた。酵素的およびウ ェスタン分析により決定されたところ、Δ９タンパク質は典型的には６０−およ び３０ｍＭ硫酸アンモニウムの間で溶出された。実施例３２：Δ−９デサチュラーゼリボザイムでの植物の形質転換の結果として 葉中のステアリン酸の増加の証拠 パートＡ 植物組織中のステアリン酸レベルの決定に使用された方法。植物組織 からの脂肪酸の抽出およびエステル化のための方法は以前に記載されている方法 （Ｂｒｏｗｓｅ ｅｔ．ａｌ．，１９８６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２ ，１４１−１４５）を修正したものである。２０ｍｇの植物組織の一つをＰｙｒ ｅｘ １３ｍｍねじ栓付き試験管に入れた。１ｍｌのメタノール性ＨＣｌ（Ｓｕ ｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を加えた後、試験管は窒素ガスでパ ージして封をした。試験管は８０℃で１時間加熱し、放置して冷却した。メタノ ール性ＨＣｌ存在下で加熱すると、脂肪酸の抽出ならびにエステル化が行われる 。ヘキサンで抽出することにより、反応混合物から脂肪酸メチルエステルが除か れる。１ｍｌのヘキサンおよび１ｍｌの０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを加え、続 いて試験管を激しく振とうさせた。２０００ｒｐｍで５分間試験管を遠心分離し 、上部のヘキサン層を取りだして、脂肪酸メチルエステルの分析に使用した。ガ スクロマトグラフ分析は、水素炎イオン化検出器およびＪ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ（Ｆｏｌｓｏｍ，ＣＡ）ＤＢ−２３カラムを備えたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａ ｃｋａｒｄ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）Ｓｅｒｉｅｓ II モデル５８９０ ガスクロマトグラフに１μｌの試料を注入することにより実施した。測定を通し てオーブン温度は１５０℃であり、キャリアガス（ヘリウム）の流量は８０ｃｍ ／ｓｅｃであった。測定時間は２０分であった。この条件は問題とする５つの脂 肪酸メチルエステルの分離を可能にする：Ｃ１６：０、パルミチン酸メチルエス テル；Ｃ１８：０、ステアリン酸メチルエステル；Ｃ１８：１、オレイン酸メチ ルエステル；Ｃ１８：２リノール酸メチルエステル；およびＣ１８：３、リノレ ン酸メチルエステル。データ収集および分析はＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｅｒｉｅｓ IIモデル３３９６積分計およびＰＥ Ｎｅｌｓｏｎ（Ｐｅｒｋｉ ｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）データ収集システムにより実施された 。試料中の各々の脂肪酸のパーセントはデータ収集システムの読み出しにより直 接的に得られた。各々の脂肪酸の定量的量は５つの脂肪酸メチルエステルの既知 の量を含む標準品（Ｍａｔｒｅｙａ，Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡ）のピー ク面積を用いて計算された。計算された量は、試料中の５つの脂肪酸により表さ れるパーセント（総新鮮重量の）の推定に使用された。抽出およびエステル化過 程の間の脂肪酸損失の補正は行われなかった。抽出およびエステル化過程にかけ た後の（組織なしで）標準試料の回収率は、試料の元々の量に依存して９０から １００％の範囲であった。抽出混合物中に植物組織が存在しても、標準品の既知 の量の回収には何の影響も与えなかった。 パートＢ Δ−９デサチュラーゼリボザイムの導入による葉中のステアリン酸増 加の実証。個々の植物からの葉組織のステアリン酸がパートＡに記載したように アッセイされた。活性Δ−９デサチュラーゼリボザイム（ＲＰＡ８５、ＲＰＡ１ １４、ＲＰＡ１１８）で形質転換された３５系統からの総計で４２８の植物およ びΔ−９デサチュラーゼ不活性リボザイム（ＲＰＡ１１３、ＲＰＡ１１５、ＲＰ Ａ１１９）で形質転換された３１系統からの４０６植物がアッセイされた。表Ｘ Ｉはこれらの植物中のステアリン酸レベルについて得られた結果を要約している 。活性系統からの植物の７パーセントは３％を超えるステアリン酸レベルを持っ ており、２％が５％を超えるレベルを持っていた。不活性系統からの植物の３％ のみが３％を超えるステアリン酸レベルを持っていた。対照植物の２パーセント が３％を超えるステアリン酸を含む葉を持っていた。対照には４９の非形質転換 植物および７３のΔ−９デサチュラーゼに関係しない遺伝子で形質転換された植 物である。不活性系統または対照からの植物で４％を超える葉ステアリン酸を持 っているものはなかった。活性Δ−９デサチュラーゼリボザイムＲＰＡ８５で形 質転換された系統の二つは葉にステアリン酸が増加した多くの植物を産生した。 系統ＲＰＡ８５−０６はアッセイされた１５の植物の内の６が３および４％の間 のステアリン酸レベルを持ち、対照の平均の約２倍である(図３０)。対照植物（ １ ２２植物）の平均ステアリン酸含量は１．６９％（ＳＤ±０．４９％）であった 。系統ＲＰＡ８５−０６からの葉の平均ステアリン酸含量は２．８６％（±０． ５７％）であった。系統ＲＰＡ８５−１５のステアリン酸レベルがアッセイされ た１５の植物の内の６は対照の平均より約４倍であった（図３１）。系統ＲＰＡ ８５−１５の平均葉ステアリン酸含量は３．８３％（±２．５３％）であった。 葉分析がＲＰＡ８５−１５植物で繰り返された場合、前に正常なステアリン酸レ ベルを示した植物からの葉中のステアリン酸レベルは正常のまま残っており、高 ステアリン酸を持つ植物からの葉は再び高いことが観察された（図３１）。不活 性ででリボザイム（ＲＰＡ１１３）で形質転換された二つの系統からの植物の葉 中のステアリン酸レベルは図３２および３３に示されている。ＲＰＡ１１３−０ ６は３％またはそれより高いステアリン酸含量を持つ３つの植物を持っていた。 系統ＲＰＡ１１３−０６からの葉の平均ステアリン酸含量は２．２６％（±０． ６５％）であった。ＲＰＡ１１３−１７は３％を超えるステアリン酸含量の葉を 含む植物は持っていない。系統ＲＰＡ１１３−１７からの葉の平均ステアリン酸 含量は１．７６％（±０．２９％）であった。１５の対照植物からの葉のステア リン酸含量が図３４に示されている。これら１５の対照植物の平均ステアリン酸 含量は１．７０％（±０．６％）であった。対照および不活性Δ−９デサチュラ ーゼリボザイムデータを比較した場合、ＲＰＡ８５−０６およびＲＰＡ８５−１ ５中のステアリン酸含量から得られた結果は、Δ−９デサチュラーゼリボザイム の導入によるステアリン酸含量の増加を示している。実施例３３：葉における高ステアリン酸特性の遺伝 Ａ 高ステアリン酸植物の子孫の葉におけるステアリン酸レベルの結果 ＲＰＡ８５−１５株由来の植物はここに述べる方法にて受粉された。受粉の２ ５日後、接合子胚はこれらＲＰＡ８５−１５植物の未熟な種子より摘出され、再 生植物体の成長のためにここに記述された培地上に置かれた。その植物が温室へ 移された後、脂肪酸分析が葉組織で行われた。図３５は交配のひとつ、ＲＰＡ８ ５−１５．０７の自家受粉で作られた１０個の異なる植物体から得た葉のステア リン酸レベルを示す。５０％の植物が高い葉中ステアリン酸値を示し、５０％が 通常のステアリン酸値を示した。表１２はＲＰＡ８５−１５植物体の５つの異な る交配の結果を示す。高ステアリン酸値を示した植物の範囲は２０％から５０％ であった。 Ｂ△９デサチュラーゼｍＲＮＡを標的としたリボザイムを発現している、次世代 （Ｒ１）トウモロコシ葉における△９デサチュラーゼレベルの減少を示す結果 高ステアリン酸含量を示した次世代トウモロコシ植物体（上記Ａ参照）におけ る△９デサチュラーゼは、ここに記述された方法を使ってＲ１トウモロコシ葉か ら部分精製された。ウエスタン分析が高ステアリン酸を示す植物のいくつかで行 われた。次世代の葉においては、高ステアリン酸含量をもつこれらの植物体で、 △９デサチュラーゼの４０％から５０％の減少が観察された（図３６）。その減 少はＲ０トウモロコシ葉に匹敵した。この減少はＲＰＡ８５−１５花粉で受粉さ せたＯＱ４１４株でも、自家受粉または同胞の植物体の花粉で受粉させたＲＰＡ −８５−１５株でも観察された。その結果、リボザイムにコードされた遺伝子は 遺伝しうることが示唆された。実施例３４ ： アンチセンスー△９デサチュラーゼ不飽和酵素を用いた植物組 織におけるステアリン酸の増加 Ａ トウモロコシ体細胞胚の培養法 トウモロコシ胚形成カルスの生産と再生がここで述べられた。体細胞胚はこの 胚形成カルスの大部分を形作っている。体細胞胚は二週間毎に継代されたため、 カルスの形態をとり続けた。胚形成カルス内の体細胞胚は増殖を続けたが、通常 培地中の２，４−Ｄの影響で胚発生の早いステージに留まっていた。カルスはこ こで述べられた再生法で処理されたため、小さな植物体へ再生した。体細胞胚は 再生中は根や芽を形成し、胚としての発生を終了した。体細胞胚は特別な培地で 処理することにより、胚形成カルスや非再生過程においてみられた発生初期のス テージを越えて種子胚として発生した。この培地処理は胚形成胚形成カルスを６ ％（ｗ／ｖ）しょ糖含有、植物ホルモン不含のＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇ の培地（ＭＳ；Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６２）へ移 すことを含んでいる。カルスは６％しょ糖を含むＭＳ培地で７日間生育され、体 細胞胚は６％しよ糖と１０ｕＭアブシジン酸（ＡＢＡ）を含んだＭＳ培地に個々 に移された。体細胞胚はＡＢＡ培地で３日から７日間生育後、ここに記述された ように脂肪酸組成を調べられた。上記培地で生育された体細胞胚の脂肪酸組成は 、胚形成カルスや受粉１２日後のトウモロコシ接合子胚の脂肪酸組成と比較され た（表１３）。体細胞胚の脂肪酸組成は、胚形成カルスの脂肪酸組成とは異なっ ていた。胚形成カルスはＣ１６：０とＣ１８：３の高いパーセンテージとＣ１８ ：１とＣ１８：２の低いパーセンテージを持っていた。生重量当たりの脂肪の割 合は胚形成カルスと体細胞胚とを比較した場合、０．４％対４．０％で異なって いた。接合子胚と体細胞胚の脂肪酸組成はよく似ており、両者の生重量当たりの 脂肪の割合はほとんど同じであった。このことは上記の体細胞胚培養系がトウモ ロコシの胚発生において、脂肪合成に関係するいくつかの遺伝子の影響をテスト するための有用なｉｎ ｖｉｔｒｏの系となるであろうことを示している。 Ｂ △９デサチュラーゼ遺伝子導入の結果としてのトウモロコシ体細胞胚におけ るステアリン酸の増加 体細胞胚はｐＤＡＢ３０８／ｐＤＡＢ４３０でトランスフォームした胚形成カ ルスから、ここに記述した方法を用いて作成した。１６個の異なる株からの体細 胞胚の脂肪酸組成を測定した。３０８／４３０−１２と３０８／４３０−１５の ２つの株が高いステアリン酸値を持つ体細胞胚を作成した。これら２つの株から の量を図３７、３８のようにコントロール株の体細胞胚のステアリン酸量と比較 した。コントロール株はトランスフォームしないだけで、トランスフォームした 元の同じ培養からのものである。３０８／４３０−１２株については体細胞胚に おけるステアリン酸の割合は１％から２３％で、一方コントロールの割合は０． ５％から３％であった。３０８／４３０−１５株については体細胞胚におけるス テアリン酸の割合は２％から１５％であり、コントロールの割合は０．５％から ３％であった。トランスフォームした株の両方で５０％以上の体細胞胚がコント ロールの上記の割合のステアリン酸値を持っていた。上記の結果はアンチセンス −△９デサチュラーゼ遺伝子がトウモロコシの体細胞胚においてステアリン酸値 を上昇させるのに使用できることを示している。 Ｃ アンチセンス−△９デサチュラーゼ遺伝子の導入による、葉におけるステア リン酸増加の証拠 ３０８／４３０−１２株と３０８／４３０−１５株からの胚形成培養組織が植 物体の再生に用いられた。これらの植物体の葉は前述の方法を使って脂肪酸組成 が分析された。３０８／４３０−１５培養組織から４個の植物体のみが得られた が、これらの植物体のステアリン酸レベルは正常、すなわち１−２％であった。 ３０８／４３０−１２株のの植物体の葉におけるステアリン酸レベルが図３９に 示されている。３０８／４３０−１２株からの植物体では葉におけるステアリン 酸レベルは１％から１３％の範囲にあった。３０８／４３０−１２株からの植物 体の約３０％がコントロールで観察された範囲、１−２％を越えていた。これら の結果はアンチセンス−△デサチュラーゼ遺伝子の導入により、トウモロコシの 葉において増加しうることを示している。 「アンチセンス」によるというのは、ＲＮＡ−ＲＮＡ、あるいはＲＮＡ−ＤＮ Ａ、あるいは ＲＮＡ−ＰＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ； Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５， ５６６） の相互作用によってＲＮＡ（標的となるＲＮＡ）と結合し、標的ＲＮＡの活性を 部分的に変える、非酵素的な核酸分子を意味する（総説としてＳｔｅｉｎ ａｎ ｄ Ｃｈｅｎｇ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １００４参照）。実施例３５： 貯蔵されたデンプンの試料や種子１個中のトウモロコシのアミロ ース含量の分析 アミロース含量はＨｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（ Ｐｏｔａｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：２４１−２４６） の変法により分析 された。プールされたデンプン試料については、１０ｍｇから１００ｍｇのデン プンがプラスチックの培養チューブ中で、５ｍｌの４５％過塩素酸に溶解された 。その溶液はボルテックスによってときどき撹拌された。１時間後、０．２ｍ ｌのデンプン溶液は水で１０ｍｌまで希釈された。０．４ｍｌの希釈溶液はそれ から１ｍｌのキュベット中で０．５ｍｌの希釈されたルゴール液（Ｓｉｇｍａ） と混合された。６１８ｎｍと５５０ｎｍにおける吸光度が直ちに測定され、Ｒ比 （６１８ｎｍ／５５０ｎｍ）が計算された。ジャガイモのアミロースとトウモロ コシのアミロペクチン（シグマ、セントルイス）から作られた標準方程式を用い て、アミロース含量が決定された。冷凍された種子試料１個については、４５％ 過塩素酸中での抽出が１時間ではなくて２０分であるということ以外は上記と同 じ方法が用いられた。実施例３６： デンプンの精製と顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）分析 デンプンの精製と以下のＧＢＳＳ活性測定はＳｈｕｒｅ等の方法（Ｃｅｌｌ， ３５：２２５−２３３， １９８３）とネルソン等の方法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ ｓｉｏｌｏｇｙ， ６２： ３８３−３８６， １９７８）を修正したものであ った。トウモロコシの種子は２倍量（ｖ／ｗ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， １０ｍＭ ＥＤＴＡ中でホモジナイズされ、１２０ｕｍ のナ イロン膜で濾過された。材料はそれから５０００ｇで２分間遠心分離され、上清 が捨てられた。沈殿は水に再溶解することによって３回洗浄され、遠心分離操作 によって上清が除かれた。洗浄後、デンプンは２０ｕｍのナイロン膜で濾過され 、遠心分離された。沈殿はそれから凍結乾燥され、活性の測定に用いるまで−２ ０℃で保存された。 標準ＧＢＳＳ反応混合液は、全量２００ｕｌ中に０．２Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ、 ｐＨ８．５、２５ｍＭグルタチオン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ １４Ｃ ＡＤ ＰＧ （６ ｎｃｉ／ ｕｍｏｌ）、１０ｍｇ デンプンを含んでいた。反応は ３７℃で５分間行われ、２００ｕｌの７０％エタノール（ｖ／ｖ）、０．１Ｍ ＫＣｌ中を加えることにより止められた。材料は遠心分離され、上清中の結合し ていないＡＤＰＧが除かれた。沈殿はそれから１ｍｌの水で、同じ方法で４回洗 浄された。洗浄後、沈殿は５００ｕｌの水に溶かされ、シンチレーションバイア ル中に移され、取り込まれたＡＤＰＧがベックマン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ ） シンチレーションカウンターで測定された。比活性は１ｍｇのデンプン中、１分 当たりにデンプン中に取り込まれたＡＤＰＧの濃度、ｐｍｏｌで与えられた。実施例３７： アンチセンス−ＧＢＳＳ植物体の解析 Ｒ２種子を分離するため、１個の種子がアミロース含量の分析に用いられ、表 現型が同定されるべきである。この研究では大量の試料が生ずるため、２段階の スクリーニング方法が用いられた。第一段階では３０個の種子が同じ穂からラン ダムに取り出され、凍結乾燥され、デンプン粉の中にホモジナイズされた。デン プン粉の上でアミロース解析が行われた。アミロース含量の減少した株は統計解 析により決定された。第二段階ではアミロース含量が減少した株における種子１ 個のアミロース含量がより詳細に調べられた(１穂当たり２５から５０個の種子) 。スクリーニングには２セットのコントロールが用いられた。そのセットのひと つは同じ遺伝的な背景をもつがトランスフォームしていない株であり、もうひと つは分離するためのトランスジーンを持たない（サザン分析がネガティブな株） トランスフォームした株である。 １６個のトランスフォームを代表する８１株がデンプン貯蔵量を調べられた。 それらの株のうち、統計処理によりアミロース含量が有意に減少していた６株に ついてさらに詳細な種子１個の解析が行われた。ある株、３０８／４２５−１２ ．２．１はアミロース含量の有意な減少を示した（図４０）。 従来のトウモロコシの近交系であるＣＱ８０６株の、２５個それぞれの種子が 分析された。ＣＱ８０６株のアミロース含量は２４．４％から３２．２％の範囲 で、平均は２９．１％であった。１個の種子におけるアミロース含量の分布は、 低アミロース含量に少し傾いていた。３０８／４２５−１２．２．１．１株の４ ９個の種子が分析された。半接合の個体の自家受粉から由来した３０８／４２５ −１２．２．１．１については、内胚乳が３倍体なのでどう頻度で存在する、４ つの異なる遺伝的な種類より構成される分布が期待される。４つの遺伝学的なク ラスはそれぞれアンチセンス構築物を０、１、２、３コピー持つ個体によって構 成されている。導入遺伝子による大きな量的効果があるとすると、アミロース含 量の分布は４つのモードを持つはずである。得られた分布のうちのひとつのモー ドは導入遺伝子のなしの親と区別がつかない。もし導入遺伝子（１、２、３コピ ーの導入遺伝子を持つ個体は等価の表現形質を持つ）の量的効果が無いならば、 ひとつは親のモードと同一なふたつのモードを持つはずである。このモードでの 個体の数は遺伝子導入：親の比が３ ： １になるはずである。３０８／４２５ −１２．２．１．１の分布は明瞭な３つのモードを持つ。中心のモードは他のふ たつのモードのサイズの約２倍である。２つの端のモードはおおよそ同じサイズ である。１：２：１比の適合度が調べられ、うまく行くことがわかった。 最も高いアミロース含量のモードが遺伝子を導入をされていない親と等しいと いうこを示すさらなる証拠を得ることできる。これはディスクリミナント分析を 使って行われた。ＣＱ８０６と３０８／４２５−１２．２．１．１のデータセッ トはこの分析のために結合された。この分析に用いる測定基準はアミロース含量 のデータのみを使って計算された。それぞれの分析からの分散の見積もりはすべ てのテストで用いられた。プールされない分散の見積もりが採用された。オリジ ナルデータはクラスの再編成のために用いられた。ディスクリミナント分析に基 づき、３０８／４２５−１２．２．１．１の高いアミロース値を伴う全体のモー ドは親としてクラス分けするのがより望ましいかもしれない。その分布のこのモ ードが親からきていることは強く確かめられた。残り２つのモードにおいて、中 央のモードは最低のアミロース含量のモードの約２倍のサイズであった。このこ とから中央のモードはふたつの遺伝的なクラス、すなわちアンチセンスコンスト ラクトの１つか２つを持つ個体を含むことが期待されよう。もっとも低いアミロ ース含量を示すモードはこのようにそれらの個体がアンチセンスコンストラクト のコピー完全なホモ接合体（３コピー）表している。２：１の比率がテストされ 、データの基礎として却下することはできなかった。 この分析はアンチセンスＧＢＳＳ遺伝子が３０８／４２５−１２．２．１．１ において機能しているように、トウモロコシ種子におけるアミロース含量の濃度 依存的な減少を証明している。実施例３８： リボザイム−ＤＧＢＳＳ植物体の分析 アンチセンス研究（例３７）と同様に２段階のスクリーニングがリボザイム− ＧＢＳＳ植物体の分析にも用いられた。１１回のトランスフォーメーションに相 当する１６０株が貯蔵デンプンレベルを測定された。コントロール株（トランス フォーメーションしなかった株とサザン分析でネガティブだった株の両方）の中 でアミロース含量は２８％から１９％まで変化した。リボザイム遺伝子を維持し ているすべての株（サザン分析がポジティブだった株）においては有意な減少は 認められなかった。２０株以上が種子１個のレベルでさらに分析されたが、分離 パターンと同様に有意なアミロースの減少も観察されなかった。このことはリボ ザイムが表現型においてはなんの変化も引き起こさないことを明らかにした。 トランスフォームした株はそれらのＧＢＳＳ活性（例３６で述べたように）に よってさらに調べられた。各株につき、３０個の種子が冷凍保存された穂から取 り出され、デンプンが精製された。表１４は貯蔵デンプン試料におけるＧＢＳＳ 活性、貯蔵デンプンにおけるアミロース含量やサザン分析の結果について、ひと つのトランスフォーメーションに相当する９個の植物体に関する結果を示してい る。サザン分析がネガティブな３つの株、すなわちＲＰＡ６３．０２８３、ＲＰ Ａ６３．０２３６、ＲＰＡ６３．０２１９は対照株として使われた。対照株ＲＰ Ａ６３．０２８３、ＲＰＡ６３．０２３６及びＲＰＡ６３．０２１９のＧＢＳＳ 活性は約３００ ｕｎｉｔｓ／ｍｇデンプンであった。ＲＰＡ６３．０２１１、 ＲＰＡ６３．０２１８、ＲＰＡ６３．０２０９及びＲＰＡ６３．０２１０株にお いて、ＧＢＳＳ活性の３０％以上の減少が観察された。この群のサザン分析に対 するＧＢＳＳ活性の相関はＧＢＳＳ活性の減少はトウモロコシゲノムへ取り込ま れたリボザイム遺伝子の発現によることを示す。ＲＰＡ６３．０２１８株（サザ ン分析はポジティブで貯蔵デンプン中のＧＢＳＳ活性が低下）の種子１個におけ るＧＢＳＳ活性をＲＰＡ６３．０３０６（サザン分析はネガティブで貯蔵デンプ ン中のＧＢＳＳ活性は正常０を対照としてさらに検討した。それぞれの株より採 手された約３０個の種子を個々の種子ごとに、デンプン試料の精製を行った。図 ４１はＲＰＡ６３．０２１８株におけるＧＢＳＳ活性は、ＲＰＡ６３．０３０６ と比較して明らかに低下することが示された。 他の態様は以下の請求の範囲に含まれている。 表１ 天然に生ずるリボザイムの特徴 グループＩイントロン ・サイズ：約１５０から＞１０００ヌクレオチド ・標的配列中、切断部位のすぐ５’側にＵを必要とする。 ・切断部位の５’側で４−６ヌクレオチドに結合する。 ・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨにより攻撃して、３’−ＯＨおよび ５’−グアノシンを有する切断生成物を生成する。 ・場合により、折り畳みおよび活性構造の維持を助けるために別の蛋白質補助因 子を必要とする（１）。 ・このクラスには３００個を越えるメンバーが知られている。Ｔｅｔｏｒａｈｙ ｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ｒＲＮＡ、真菌ミトコンドリア、クロロプ ラスト、Ｔ４ファージ、らん藻類、および他のものにおいて介在配列として見い だされている。 ・主要な構造的特徴は、主に系統発生学的比較、突然変異、および生化学的研究 により確立された（２，３）。 ・１つのリボザイムについては、完全な速度論的フレームワークが確立されてい る（４，５，６，７）。 ・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングの研究が進行中である（８，９， １０）。 ・重要な残基の化学的修飾研究はよく確立されている（１１，１２）。 ・小さい（４−６ヌクレオチド）結合部位のため、このリボザイムは標的ＲＮＡ 切断に対して非常に非特異的であるが、ＴｅｔｏｒａｈｙｍｅｎａグループＩイ ントロンは、新規ｂ−ガラクトシダーゼ配列を不完全メッセージ上にライゲート することにより、「不完全」ｂ−ガラクトシダーゼメッセージの修復に用いられ てきた（１３）。 ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ （Ｍ１ ＲＮＡ） ・サイズ：約２９０から４００ヌクレオチド ・偏在するリボヌクレオ蛋白質酵素のＲＮＡ部分。 ・ｔＲＮＡ前駆体を切断して、成熟ｔＲＮＡを形成する（１４）。 ・反応メカニズム：Ｍ²⁺−ＯＨにより攻撃して、３’−ＯＨおよび５’−ホスフ ェートを有する切断生成物を生成する可能性がある。 ・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物に広く見いだされる。ＲＮＡサブユニ ットは、細菌、酵母、齧歯類および霊長類から配列決定されている。 ・外部ガイド配列（ＥＧＳ）を標的ＲＮＡにハイブリダイズさせることにより治 療での応用のための内因性ＲＮａｓｅＰの補給が可能である（１５，１６）。 ・重要なホスフェートと２’ＯＨとの接触が最近同定された（１７，１８）。 グループIIイントロン ・サイズ：＞１０００ヌクレオチド ・最近、標的ＲＮＡのトランス切断が示された（１９，２０）。 ・配列要件は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが、３’−ＯＨならびに３’− ５’および２’−５’分岐点を含む「輪縄」ＲＮＡを有する切断生成物を生成す る。 ・天然のリボザイムのみ、ＲＮＡ切断およびライゲーションに加えてＤＮＡ切断 への関与が示されている（２１，２２）。 ・主要な構造的特徴は、主に系統発生学的比較により確立された（２３）。 ・重要な２’ＯＨ接触が同定され始めている（２４）。 ・速度論的フレームワークは開発中である（２５）。 Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ ・サイズ：約１４４ヌクレオチド ・最近、ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断が示された（２６）。 ・配列要件は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：切れやすい結合の５’側の２’−ＯＨにより攻撃して、２’ ， ３’−環状ホスフェートおよび５’−ＯＨ末端を有する切断生成物を生成する。 ・結合部位および構造的要件は完全には決定されていない。 ・このクラスには１個のメンバーのみが知られている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡにおいて見いだされている。 ハンマーヘッドリボザイム （参考文献については本文を参照されたい） ・サイズ：約１３から４０ヌクレオチド ・切断部位のすぐ５’側に標的配列ＵＨを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドに結合する。 ・反応メカニズム：切れやすい結合の５’側の２’−ＯＨにより攻撃して、２’ ，３’−環状ホスフェートおよび５’−ＯＨ末端を有する切断生成物を生成する 。 ・このクラスには１４個のメンバーが知られている。感染剤としてＲＮＡを用い る多くの植物病原体（ウイルソイド）において見いだされている。 ・必須の構造的特徴はほぼ決定されており、２つの結晶構造を含む。 ・最小ライゲーション活性が示されている（インビトロ選択による工学的処置の ため）。 ・２つまたはそれ以上のリボザイムについて、完全な速度論的フレームワークが 確立されている。 ・重要な残基の化学的修飾研究はよく確立されている。 ヘアピンリボザイム ・サイズ：約５０ヌクレオチド ・切断部位のすぐ３’側に標的配列ＧＵＣを必要とする。 ・切断部位の５’側の４−６ヌクレオチドおよび切断部位の３’側の可変数のヌ クレオチドに結合する。 ・反応メカニズム：切れやすい結合の５’側の２’−ＯＨにより攻撃して、２’ ，３’−環状ホスフェートおよび５’−ＯＨ末端を有する切断生成物を生成する 。 ・このクラスには３個のメンバーが知られている。感染剤としてＲＮＡを用いる ３つの植物病原体（タバコリングスポットウイルス、アラビスモザイクウイルス およびチコリイエローモットルウイルスのサテライトＲＮＡ）において見いださ れている。 ・必須の構造的特徴はほぼ決定されている（２７，２８，２９，３０）。 ・ライゲーション活性（切断活性に加えて）により、このリボザイムはインビト ロ選択による工学的処置が可能である（３１）。 ・１つのリボザイムについて、完全な速度論的フレームワークが確立されている （３２）。 ・重要な残基の化学的修飾研究が始められた（３３，３４）。 デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム ・サイズ：約６０ヌクレオチド ・標的ＲＮＡのトランス切断が示された（３５）。 ・結合部位および構造的要件は完全には決定されていないが、切断部位の５’側 の配列は必要ではない。折り畳まれたリボザイムはシュードノット構造を含む( ３６)。 ・反応メカニズム：切れやすい結合の５’側の２’−ＯＨにより攻撃して、２’ ，３’−環状ホスフェートおよび５’−ＯＨ末端を有する切断生成物を生成する 。 ・このクラスには２個のメンバーのみが知られている。ヒトＨＤＶにおいて見い だされている。 ・環状形状のＨＤＶは活性であり、増加したヌクレアーゼ安定性を示す（３７） 。 ＊ 待機時間は送達中の接触時間を含まない Ｘは、ＨＨリボザイムのステムII領域を表す(Hertel et al.,1992 Nucleic Acids Res.20,3252)。ステムIIの長さは≧２塩基対でありうる。 Ｘは、ＨＨリボザイムのステムII領域を表す(Hertel et al.,1992 Nucleic Acids Res.20,3252)。ステムIIの長さは≧２塩基対でありうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エディントン，ブレント・ブイ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボウル ダー，グレンウッド・ドライブ 2955，ナ ンバー 201 (72)発明者 マクスウィゲン，ジェームズ・エイ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボウル ダー，フランクリン・ドライブ 4866 (72)発明者 マーロ，パトリシア・アン・オーウェンズ アメリカ合衆国インディアナ州46032，カ ーメル，ダービン・ドライブ 11845 (72)発明者 グオ，ライニング アメリカ合衆国インディアナ州46112，ブ ラウンズバーグ，ネルソン・サークル ７ (72)発明者 スコークト，トーマス・エイ アメリカ合衆国インディアナ州46032，カ ーメル，サットン・アベニュー 2539 (72)発明者 ヤング，スコット・エイ アメリカ合衆国インディアナ州46254，イ ンディアナポリス，ホリー・スプリング ス・ドライブ・イースト 5329 (72)発明者 フォルカーツ，オット アメリカ合衆国インディアナ州46032，カ ーメル，レッド・オーク・レーン 159 (72)発明者 マーロ，ドナルド・ジェイ アメリカ合衆国インディアナ州46032，カ ーメル，ダービン・ドライブ 11845

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子であって、前記核酸分子は植物遺伝 子の発現を調節することを特徴とする核酸分子。 ２．前記植物が単子葉植物である、請求項１記載の酵素的核酸分子。 ３．前記植物が双子葉植物である、請求項１記載の酵素的核酸分子。 ４．前記植物が裸子植物である、請求項１記載の酵素的核酸分子。 ５．前記植物が被子植物である、請求項１記載の酵素的核酸分子。 ６．前記核酸がハンマーヘッドコンフィギュレーションのものである、請求項１ 記載の酵素的核酸分子。 ７．前記核酸がヘアピンコンフィギュレーションのものである、請求項１記載の 酵素的核酸分子。 ８．前記核酸が、肝炎Δウイルス、グループＩイントロン、グループＩＩイント ロン、ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸コンフィギュレーションのものである、 請求項１記載の酵素的核酸分子。 ９．前記核酸が前記遺伝子のＲＮＡに相補的な１２から１００塩基を含む、請求 項１−８のいずれかに記載の酵素的核酸。 １０．前記核酸が前記遺伝子のＲＮＡに相補的な１４から２４塩基を含む、請求 項１−８のいずれかに記載の酵素的核酸。 １１．前記ハンマーヘッドが２塩基対以上の長さのステムII領域を含む、請求項 ６記載の酵素的核酸。 １２．前記ヘアピンが３−７塩基対の長さのステムII領域を含む、請求項７記載 の酵素的核酸。 １３．前記ヘアピンが、２塩基対以上の長さのステムIV領域を含む、請求項７記 載の酵素的核酸。 １４．前記単子葉植物が、トウモロコシ、イネ、小麦、および大麦からなる群よ り選択される、請求項２記載の酵素的核酸。 １５．前記双子葉植物が、カノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、綿、落花生 、オリーブ、ゴマ、キュフェア、アマ、ホホバ、およびブドウからなる群より選 択 される、請求項３記載の酵素的核酸。 １６．前記遺伝子が、前記植物における脂肪酸生合成に関与する、請求項１記載 の酵素的核酸。 １７．前記遺伝子がΔ−９デサチュラーゼである、請求項１６記載の酵素的核酸 。 １８．前記植物が、トウモロコシ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、綿、落花生ｓ、 ベニバナ、ダイズおよびイネからなる群より選択される、請求項１６または１７ に記載の酵素的核酸。 １９．前記遺伝子が、前記植物におけるデンプン生合成に関与する、請求項１記 載の酵素的核酸。 ２０．前記遺伝子が、顆粒結合デンプンシンターゼである、請求項１９記載の酵 素的核酸。 ２１．前記植物が、トウモロコシ、ジャガイモ、小麦、およびカッサバからなる 群より選択される、請求項１９または２０に記載の酵素的核酸。 ２２．前記遺伝子がカフェイン合成に関与する、請求項１記載の酵素的核酸。 ２３．前記遺伝子が、７−メチルグアノシンおよび３−メチルトランスフェラー ゼからなる群より選択される、請求項２２記載の酵素的核酸。 ２４．前記植物がコーヒーである、請求項２２または２３に記載の酵素的核酸。 ２５．前記遺伝子が、前記植物におけるニコチン生成に関与する、請求項１記載 の酵素的核酸。 ２６．前記遺伝子が、Ｎ−メチルプトレシンオキシダーゼおよびプトレシンＮ− メチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項２５記載の酵素的 核酸。 ２７．前記植物がタバコである、請求項２５または２６のいずれかに記載の酵素 的核酸。 ２８．前記遺伝子が、前記植物における果実熟成過程に関与する、請求項１記載 の酵素的核酸。 ２９．前記遺伝子が、エチレン形成酵素、ペクチンメチルトランスフェラーゼ、 ペクチンエステラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、１−アミノシクロプロパンカ ルボン酸（ＡＣＣ）シンターゼ、およびＡＣＣオキシダーゼからなる群より選択 される、請求項２８記載の酵素的核酸。 ３０．前記植物が、リンゴ、トマト、ナシ、プラムおよびモモからなる群より選 択される、請求項２８または２９に記載の酵素的核酸。 ３１．前記遺伝子が、前記植物における花色素形成に関与する、請求項１記載の 酵素的核酸。 ３２．前記遺伝子が、カルコンシンターゼ、カルコンフラバノンイソメラーゼ、 フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、デヒドロフラバノールヒドロキシラーゼ 、およびデヒドロフラバノールレダクターゼからなる群より選択される、請求項 ３１記載の酵素的核酸。 ３３．前記植物が、バラ、ペチュニア、キク、およびマリゴールドからなる群よ り選択される、請求項３１または３２に記載の酵素的核酸。 ３４．前記遺伝子が前記植物におけるリグニン生成に関与する、請求項１記載の 酵素的核酸。 ３５．前記遺伝子が、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シンナモイル−ＣｏＡ： ＮＡＤＰＨレダクターゼおよびシンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼからな る群より選択される、請求項３４記載の酵素的核酸。 ３６．前記植物が、タバコ、ハコヤナギ、ポプラ、およびマツからなる群より選 択される、請求項３４または３５に記載の酵素的核酸。 ３７．トウモロコシΔ−９デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡ配列を含む核酸 フラグメントであって、前記配列が配列番号１で表されることを特徴とする核酸 フラグメント。 ３８．前記核酸が、表ＶＩにおいて規定される配列のいずれかを特異的に切断し 、ここで前記核酸がハンマーヘッドコンフィギュレーションのものである、請求 項１７記載の酵素的核酸分子。 ３９．前記核酸が表ＶＩＩＩにおいて規定される配列のいずれかを特異的に切断 し、ここで前記核酸がヘアピンコンフィギュレーションのものである、請求項１ ７記載の酵素的核酸分子。 ４０．本質的に表ＶＩＩおよびＶＩＩＩに示される群より選択される１またはそ れ以上の配列からなる、請求項３８または３９に記載の酵素的核酸分子。 ４１．前記核酸が、表ＩＩＩＡにおいて規定される配列のいずれかを特異的に切 断し、ここで前記核酸がハンマーヘッドコンフィギュレーションのものである、 請求項２０記載の酵素的核酸分子。 ４２．前記核酸が表ＶＡおよびＶＢにおいて規定される配列のいずれかを特異的 に切断し、ここで前記核酸がヘアピンコンフィギュレーションのものである、請 求項２０記載の酵素的核酸分子。 ４３．本質的に表ＩＩＩＢ、ＩＶ、ＶＡおよびＶＢに示される群より選択される １またはそれ以上の配列からなる、請求項４１または４２に記載の酵素的核酸分 子。 ４４．本質的に配列番号２−２４のいずれかにより規定される配列からなる、請 求項４１記載の酵素的核酸分子。 ４５．請求項１−８、１１−１７、１９−２０、２２−２３、２５−２６、２８ −２９、３１−３２、３４−３５、３７−３９、４１−４２または４４のいずれ かに記載の酵素的核酸分子を含む植物細胞。 ４６．請求項１−８、１１−１７、１９−２０、２２−２３、２５−２６、２８ −２９、３１−３２、３４−３５、３７−３９、４１−４２または４４のいずれ かに記載の酵素的核酸分子を含むトランスジェニック植物およびその子孫。 ４７．請求項１−８、１１−１７、１９−２０、２２−２３、２５−２６、２８ −２９、３１−３２、３４−３５、３７−３９、４１−４２または４４のいずれ かに記載の酵素的核酸分子をコードする核酸を、植物細胞中において該酵素的核 酸分子の発現および／または送達を可能とするような様式で含む発現ベクター。 ４８．請求項１−８、１１−１７、１９−２０、２２−２３、２５−２６、２８ −２９、３１−３２、３４−３５、３７−３９、４１−４２または４４のいずれ かに記載の複数の酵素的核酸分子をコードする核酸を、植物細胞中において前記 酵素的核酸分子の発現および／または送達を可能とするような様式で含む発現ベ クター。 ４９．請求項４７記載の発現ベクターを含む植物細胞。 ５０．請求項４８記載の発現ベクターを含む植物細胞。 ５１．請求項４７記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物およびその 子孫。 ５２．請求項４８記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物およびその 子孫。 ５３．請求項１６または１７に記載の酵素的核酸を含む植物細胞。 ５４．前記細胞がトウモロコシ細胞である、請求項５３記載の植物細胞。 ５５．前記細胞がカノーラ細胞である、請求項５３記載の植物細胞。 ５６．請求項１６または１７に記載の酵素的核酸を含むトランスジェニック植物 およびその子孫 ５７．前記植物がトウモロコシである、請求項５６記載のトランスジェニック植 物およびその子孫。 ５８．前記植物がカノーラである、請求項５６記載のトランスジェニック植物お よびその子孫。 ５９．請求項１９または２０に記載の酵素的核酸を含む植物細胞。 ６０．前記細胞がトウモロコシ細胞である、請求項５９記載の植物細胞。 ６１．請求項１９または２０に記載の酵素的核酸を含むトランスジェニック植物 およびその子孫。 ６２．前記植物がトウモロコシである、請求項６１記載のトランスジェニック植 物およびその子孫。 ６３．植物に請求項１−８に記載の酵素的核酸分子を投与することにより、前記 植物において遺伝子の発現を調節する方法。 ６４．前記植物が単子葉植物である、請求項６３記載の方法。 ６５．前記植物が双子葉植物である、請求項６３記載の方法。 ６６．前記植物が裸子植物である、請求項６３記載の方法。 ６７．前記植物が被子植物である、請求項６３記載の方法。 ６８．前記遺伝子がΔ−９デサチュラーゼである、請求項６３記載の方法。 ６９．前記植物がトウモロコシである、請求項６８記載の方法。 ７０．前記植物がカノーラである、請求項６８記載の方法。 ７１．前記遺伝子が顆粒結合デンプンシンターゼである、請求項６３記載の方法 。 ７２．前記植物がトウモロコシである、請求項７１記載の方法。 ７３．前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終了領域； ｃ） 少なくとも１つの前記酵素的核酸分子をコードする遺伝子； を含み、かつ、前記遺伝子が前記開始領域および前記終了領域に、前記植物細胞 中において前記酵素的分子の発現および／または送達を可能とするような様式で 、作動可能なように連結されている、請求項４７記載の発現ベクター。 ７４．前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終了領域； ｃ） オープンリーディングフレーム； ｄ） 前記酵素的核酸分子をコードする少なくとも１つの遺伝子、ここで前記遺 伝子は前記オープンリーディングフレームの３’−末端に作動可能なように連結 されている； を含み、かつ、前記遺伝子は前記開始領域、前記オープンリーディングフレーム および前記終了領域に、前記植物細胞中における前記酵素的分子の発現および／ または送達を可能とするような様式で、作動可能なように連結されている、請求 項４７記載の発現ベクター。 ７５．前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終了領域； ｃ） イントロン； ｄ） 前記酵素的核酸分子をコードする少なくとも１つの遺伝子； を含み、かつ、前記遺伝子が、前記開始領域、前記イントロンおよび前記終了領 域に、前記植物細胞中における前記酵素的分子の発現および／または送達を可能 とするような様式で、作動可能なように連結されている、請求項４７記載の発現 ベクター。 ７６．前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終了領域； ｃ） イントロン； ｄ） オープンリーディングフレーム； ｅ） 前記酵素的核酸分子をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、 前記遺伝子は前記オープンリーディングフレームの３’−末端に作動可能なよう に連結されており；かつ 前記遺伝子は、前記開始領域、前記イントロン、前記オープンリーディングフレ ームおよび前記終了領域に、前記植物細胞中における前記酵素的分子の発現およ び／または送達を可能とするような様式で、作動可能なように連結されている、 請求項４７記載の発現ベクター。 ７７．前記植物が、トウモロコシ、イネ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、 綿、小麦、大麦、ヒマワリ、アマおよび落花生からなる群より選択される、請求 項１記載の酵素的核酸。 ７８．ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子をコードする核酸を含むトランス ジェニック植物であって、前記核酸分子は前記植物において遺伝子の発現を調節 することを特徴とするトランスジェニック植物。 ７９．前記植物が、トウモロコシ、イネ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、 綿、小麦、大麦、ヒマワリ、アマおよび落花生からなる群より選択される、請求 項７８記載のトランスジェニック植物。 ８０．前記遺伝子が顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）である、請求項７ ８記載のトランスジェニック植物。 ８１．前記遺伝子がデルタ９デサチュラーゼである、請求項７８記載のトランス ジェニック植物。 ８２．該植物が、アグロバクテリウム、ＤＮＡ被覆マイクロ発射体による衝撃、 ホイスカー、またはエレクトロポレーションにより形質転換されている、請求項 ７８記載のトランスジェニック植物。 ８３．前記ＤＮＡ被覆マイクロ発射体による衝撃が遺伝子銃により行われる、請 求項８２記載のトランスジェニック植物。 ８４．前記植物が、クロロスルフロン、ヒグロマイシン、ｂａｒ遺伝子、ブロモ キシニルおよびカナマイシンおよび類似のものからなる群より選択される選択マ ーカーを含む、請求項７８または８２に記載のトランスジェニック植物。 ８５．前記核酸が、オクトピンシンセターゼ、ノパリンシンターゼ、マノピンシ ンセターゼ、カリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓ）；リブロース−１，６− ビホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼスモールサブユニット（ｓｓｕ） 、ベータ−コングリシニン、ファセオリンプロモーター、ナピン、ガンマゼイン 、グロブリン、ＡＤＨプロモーター、ヒートショック、アクチンおよびユビキチ ンからなる群より選択されるプロモーターに作動可能なように連結されている、 請求項７８または８２に記載のトランスジェニック植物。 ８６．前記酵素的核酸分子が、ハンマーヘッド、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス 、グループＩイントロン、グループＩＩイントロン、ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅ Ｐ核酸コンフィギュレーションのものである、請求項７８記載のトランスジェニ ック植物。 ８７．ＲＮＡ切断活性を有する前記酵素的核酸が単量体としてコードされている 、請求項８６記載のトランスジェニック植物。 ８８．ＲＮＡ切断活性を有する前記酵素的核酸が多量体としてコードされている 、請求項８６記載のトランスジェニック植物。 ８９．ＲＮＡ切断活性を有する前記酵素的核酸分子をコードする核酸が、オープ ンリーディングフレームの３’末端に作動可能なように連結されている、請求項 ７８記載のトランスジェニック植物。 ９０．前記遺伝子が内因性遺伝子である、請求項７８記載のトランスジェニック 植物。 ９１．転写の５’から３’方向に： 前記植物において機能的なプロモーター； 配列番号１のデルタ９遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）配列、こ こで、前記ｄｓＤＮＡの転写された鎖は、前記植物に内因性であるＲＮＡに相補 的であり；および 前記植物において機能的な終了領域； を含むトランスジェニックトウモロコシ植物。 ９２．転写の５’から３’方向に、 前記植物において機能的なプロモーター； 配列番号２５の顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）遺伝子をコードする二 本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）配列、ここで、前記ｄｓＤＮＡの転写された鎖は、前 記植物に内因性であるＲＮＡに相補的であり；および 前記植物において機能的な終了領域； を含むトランスジェニックトウモロコシ植物 ９３．前記遺伝子が内因性遺伝子である、請求項１記載の酵素的核酸分子。 ９４．請求項６３記載の遺伝子の発現を調節する方法であって、前記遺伝子が内 因性遺伝子である方法。 ９５．図４２のベクターであって、植物細胞の形質転換に用いられるベクター。