JP2001506123A

JP2001506123A - 解糖効率が上昇したトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物

Info

Publication number: JP2001506123A
Application number: JP50891597A
Authority: JP
Inventors: ジョルグリエスメイアー; リチャードトレズウェイ; ローザーウィルミツァー
Original assignee: プランテックバイオテクノロジスクゲーエムベーハー
Priority date: 1995-08-11
Filing date: 1996-08-08
Publication date: 2001-05-15
Also published as: AU719452B2; CN1196090A; AU6820496A; DE19529696A1; EP0846180A1; CA2229061A1; WO1997007221A1; BR9610227A

Abstract

(57)【要約】本発明は、解糖効率が上昇したトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物に関する。解糖効率は、インベルターゼ好ましくは制御されにくいまたは制御を受けないインベルターゼをコードするDNA配列、ならびにヘキソキナーゼ好ましくは制御されにくいまたは制御を受けないヘキソキナーゼをコードするDNA配列を植物細胞に導入し発現させることにより上昇する。さらに、本発明は、解糖効率の上昇した植物細胞および植物を生産するための方法および組み換えDNA分子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】解糖効率が上昇したトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物本発明は、非形質転換植物と比較して解糖効率の上昇を示すトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物に関する。解糖効率の上昇は、サイトゾルのインベルターゼ、好ましくは制御されにくいまたは制御を受けないインベルターゼをコードするDNA配列の植物細胞内への導入および発現、ならびにサイトゾルのヘキソキナーゼ、好ましくは制御されにくいまたは制御を受けないヘキソキナーゼをコードするDNA配列の植物細胞内への導入および発現の結果として生ずる。本発明はまた、解糖効率が上昇したトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を生産するための方法および組み換えDNA分子、ならびに解糖効率の上昇を示す植物の生産を目的とした、インベルターゼの酵素活性を有する蛋白質またはヘキソキナーゼの酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA 配列の使用にも関する。世界人口が増加し続ける結果として食料の需要も増大の一途をたどっており、このため有用植物の増産がバイオテクノロジー研究の一つの課題となっている。組み換えDNA技術により植物の代謝を特異的に改変することで、この目的が達成できる可能性がある。このような改変の標的としては、たとえばCO₂炭酸固定につながる光合成の一次過程、植物体内における光合成産物の分配に関与する輸送過程、またはデンプン、蛋白質もしくはオレイン酸化合物などの貯蔵物質の合成につながる代謝経路などがある。たとえば、原核生物のアスパラギンシンテターゼを植物細胞で発現させることにより、他の現象とともに、トランスジェニック植物体内におけるバイオマス生産が増加することが説明されている（EP-B 0 511 979）。また、原核生物のポリホスフェートキナーゼをトランスジェニック植物のサイゾル、この場合にはジャガイモ植物体のサイトゾル内で発現させることにより、塊茎重にして最大で30％収量が増加すると提唱されている。さらに、EP-A 2 0 442 592において、アポプラスティック（apoplastic）インベルターゼをジャガイモ植物体内で発現させることにより、同様の方法で形質転換したトランスジェニック植物体で収量の増加が見られると説明されている。ほとんどの植物において最も重要な輸送代謝物の一つであるショ糖の合成に関与する酵素の活性の改変については、さらに研究が行われている（たとえば、Sonnewaldら、Plant Cell an d Environment 17(1995)，649〜658を参照）。国際公開公報第91/19896号においても、制御を受けにくくしたADPグルコースピロホスホリラーゼ酵素の過剰発現によるデンプンの生合成の増加により、より多くのショ糖がジャガイモ塊茎に輸送されデンプンとして貯蔵されることが説明されている。これらの使用例の多くは、葉における光合成産物の形成（EP 466 995も参照）またはトランスジェニック植物の貯蔵器官におけるデンプンもしくはフルクタンなどのポリマーの形成（たとえば、国際公開公報第94/04692号）のいずれかにつながる段階に関するものであったが、解糖効率を上昇させるため一次代謝経路に影響を及ぼすような改変について記載している有望なアプローチは現在までの所なかった。解糖効率の上昇は、たとえば、多量のATPが必要とされる植物における全ての過程において重要である。これはたとえば、H⁺-ATPaseの活性により産生される膜ポテンシャルまたはプロトン勾配により作動する、膜を介した輸送過程の多くについて言えることである。さらに、解糖効率の上昇は、分裂組織における成長、栄養成長から生殖成長への変化、ならびにいろいろな貯蔵物質、特に油脂類の合成に重要である。従って、本発明の目的は、解糖効率が上昇した植物細胞および植物、ならびにその生産のための方法およびDNA分子を提供することである。この問題は、請求の範囲に記載されている態様を提供することにより解決される。従って、本発明は、非形質転換植物細胞と比較して解糖効率の上昇を示すトランスジェニック植物細胞で、サイトゾルのインベルターゼをコードするDNA配列およびサイトゾルのヘキソキナーゼをコードするDNA配列を導入し発現させることにより、インベルターゼおよびヘキソキナーゼ活性の増加を示すトランスジェニック植物細胞に関する。このトランスジェニック細胞はそれぞれ、インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードする一つ以上のDNA配列を含みうる。驚くべきことに、植物細胞のサイトゾルにヘキソキナーゼ酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を導入および発現させ、かつ同時にインベルターゼ酵素活性を持つ蛋白質をコードするDNA配列を導入し発現させることにより、非形質転換植物細胞と比較して、このような方法で形質転換した植物細胞の解糖効率が劇的に上昇しうることが発見された。菌類に由来するインベルターゼをサイトゾル内で発現させた例はすでに報告されている（EP-A2 442 592を参照）。しかしながら、開示されたのは菌類のインベルターゼの植物細胞のサイトゾル内での発現のみである。解糖効率の上昇を目的としたサイトゾルのインベルターゼの、特にヘキソキナーゼの発現との組み合わせによる使用については説明されていない。解糖効率の上昇とは、細胞のサイトゾルにおけるインベルターゼおよびヘキソキナーゼの付加的な合成を導くDNA配列で形質転換されたトランスジェニック植物細胞が、非形質転換植物細胞と比較して、解糖効率の上昇、好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％から100％、および特に好ましくは100 ％から200％、最も好ましくは300％以上の上昇を示すことを意味する。対応する代謝中間体の定量による解糖効率の測定は、実施例において詳細に説明する。解糖効率の上昇は、たとえば、グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、3- ホスホグリセリン酸、ピルビン酸またはATPの濃度の上昇により測定してもよい。本発明の枠組においては、解糖効率の上昇は、好ましくはピルビン酸の増加を評価することにより測定される。本文脈において、解糖効率の上昇は非形質転換細胞と比較して測定される。すなわち、上述のDNA配列の導入のための出発材料として用いた植物材料を、解糖効率の測定の際にも用いることを意味する。このようにして決定された解糖効率は、つぎに、上述のDNA配列で形質転換した後の、対応する種または植物系統の植物材料の解糖効率と比較する。解糖効率の上昇によりATP供給量が増加すると、たとえば、さまざまなエネルギー依存型の輸送および成長過程の促進が可能となる。解糖効率が上昇した結果ピルビン酸濃度が高くなると、アセチルCoAの量が増加し、該アセチルCoAはたとえば油脂類またはイソプレノイド誘導体の合成を増強するのに用いることができる。ポリヒドロキシアルカン酸の合成を可能にするDNA配列が細胞内で同時に発現すれば、アセチルCoAはこれらのアルカン酸の生成にも利用されるかもしれない。本発明の好ましい態様において、インベルターゼまたは場合によってはヘキソキナーゼをコードするDNA配列は、植物体内で通常発生するインベルターゼおよびヘキソキナーゼと比較して制御されにくいまたは制御を受けないインベルターゼまたは場合によってはヘキソキナーゼをコードするDNA配列である。これについて、制御を受けにくいとは、これらの酵素が、改変されていない植物細胞内で通常形成されるインベルターゼおよびヘキソキナーゼ酵素と同様には制御を受けないことを意味する。特に、これらの酵素は異なる制御機構の対象となる、すなわち、植物細胞内に存在する阻害物質により同程度の阻害を受けない、または代謝産物によるアロステリックな制御を受けない。これについて、制御されにくいとは、好ましくは、その酵素が植物細胞内で内生的に発現しているインベルターゼまたはヘキソキナーゼよりも高い活性を示すことを意味する。本発明の枠組みにおいて、制御を受けないとは、その酵素が植物細胞内のいかなる制御も受けないことを意味する。インベルターゼ酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA配列は、原核生物のインベルターゼ、特に細菌類のインベルターゼをコードするDNA配列であってもよい。それらはまた、真核生物のインベルターゼ、すなわち、植物、藻類、菌類または動物由来のインベルターゼをコードするDNA配列であってもよい。本発明の枠組みにおいて、菌類という言葉は、酵母類、特にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロミセス属（Saccharomyces）の酵母を指す。これらの配列にコードされる酵素は、さまざまな物質、特に植物インベルターゼ阻害剤による異常な制御を示す、既知で自然に存在する酵素であってもよい。それらはまた、細菌類、藻類、菌類、動物または植物に由来する既知の酵素をコードするDNA配列に変異を起こすことにより作成された酵素であってもよい。本発明の好ましい態様において、DNA配列は菌類由来のインベルターゼの酵素活性を有する蛋白質をコードする。このような酵素は、植物のインベルターゼと比較して、植物インベルターゼの阻害剤により制御されないという点で有利である。好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces）由来のインベルターゼをコードするDNA配列でできているものを使用する。このような配列は既知であり説明されている（Taussigら、Nucleic Acids Res．11(1983)，1943-1954；EP A2 0 442 592を参照）。インベルターゼを植物細胞のサイトゾル内に局在させるために、自然に存在する可能性のあるシグナルペプチドをコードするDNA配列を取り除かねばならず、また必要であればコード領域に新しい開始コドンを提供しなければならない（EP-A2 0 442 592を参照）。上述のサッカロミセス・セレビシエ（Sacchar omyces cerevisiae）由来のDNA配列の他にも、インベルターゼ酵素活性を有する蛋白質をコードする他のDNA配列が知られており（EMBL寄託番号X67744 S．xylos us、M26511 V.alginolyticus、L08094 Zymomonas mobilis、L33403 Zymomonas m obilis、U16123 Zea mays、U17695 Zea mays、X17604 S.occidentalis、Z22645 S．tuberosum、Z21486 S．tuberosum、M81081 トマト、Z35162 V.faba、Z35163 V．faba、D10265 V．radiata、Z12025 L．esculentum、Z12028 L．pimpinellif olium、Z12026 L．pimpinellifolium、X73601 A．sativa、S70040 酸インベルターゼ、V01311酵母遺伝子、U11033 Arabidopsis thaliana、X81795 B．vulgari s BIN35、X81796 B．vulgalis、X81797 B.vulgaris、X81792 C．rubrum、X81793 C.rubrum、X77264 L.esculentum、Z12027 L．esculentum、D10465 Z．mobilis 、D17524 Zymomonas mobilisを参照）、その特性により本発明の植物細胞を生産するのに使用することもできる。蛋白質が植物細胞のサイトゾル内で形成されることに注意しなくてはならない。合成された酵素を植物細胞のサイトゾルに局在化させることを目的としたDNA配列の改変の方法は、当業者には公知である。インベルターゼが分泌または特異的な亜細胞内局在、たとえば細胞外空間または液胞内部の局在に必要な配列を含んでいる場合には、それぞれのDNA配列を取り除かなくてはならない。ヘキソキナーゼ酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA配列は、原核生物のインベルターゼ、特に細菌類のインベルターゼをコードするDNA配列、ならびに真核生物のインベルターゼ、すなわち植物、藻類、菌類または動物のインベルターゼをコードするDNA配列であってもよい。ヘキソキナーゼ（EC 2.7.1.1）は、次の反応を触媒する酵素である：ヘキソース+ATP＜-＞ヘキソースリン酸+ADP このDNA配列にコードされるヘキソキナーゼは、様々な物質による異常な制御を示す、自然に存在する既知の酵素であってもよい。それらはまた、細菌類、藻類、菌類、動物または植物由来の既知の酵素をコードするDNA配列に変異を起こすことにより作成された酵素であってもよい。ヘキソキナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA配列は、サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）、ヒト、ラットおよび様々な微生物などの多様な生物種で説明されている(DNA 配列については、EMBLジーンバンク（gene bank）の寄託番号M92054、L04480、M 65140、X61680、M14410、X66957、M75126、J05277、J03228、M68971、M86235、X 63658を参照）。好ましい態様において、DNA配列はグルコキナーゼ、特に、たとえばグルコース-6-リン酸によるアロステリック制御を受けにくいグルコキナーゼをコードする。グルコキナーゼ（EC 2.7.1.2）はグルコースに高い親和性を持ち、以下の反応を触媒するヘキソキナーゼである：グルコース+ATP＜-＞グルコース-6-リン酸+ADP 好ましい態様において、DNA配列はツィモモナス・モビリス（Zymomonas mobil is）由来のグルコキナーゼ（Barnellら、J．Bacteriol．172(1990)，7227-7240 ；EMBLジーンバンク（gene bank）寄託番号M60615）をコードする。他のグルコキナーゼはヒトおよびラットで説明されている（DNA配列については、EMBLジーンバンク（gene bank）寄託番号M69051、M90299、J04218およびM25807を参照）。さらに、インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするDNA配列は、すでに知られている上述のDNA配列の助けを得て、いかなる所望の生物種からも単離できる。このようなDNA配列の単離および同定のための方法、たとえば既知の配列を用いたハイブリダイゼーション、または既知の配列由来のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応などは、当業者に公知である。同定されたDNA配列にコードされる酵素は、次にその酵素活性および制御について調べられる。インベルターゼまたはヘキソキナーゼ活性を測定する方法は、当業者に知られている。当業者に知られている方法に従った変異および改変の導入により、それらのDN A配列にコードされる蛋白質を、制御されにくいまたは制御を受けない酵素を得るために、その制御特性についてさらに改変することができる。植物細胞内で発現させるために、サイトゾルのインベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするこれらのDNA配列を、一般的には、植物細胞内で機能するいかなる所望のプロモーターの制御下に置いてもよい。前記のDNA配列の発現は一般的に、本発明の形質転換植物細胞から再生された植物体のどの組織で起こっても、どの時点で起こってもよい。しかしながら、好ましくは、解糖効率の上昇が植物の生長、イオンおよび代謝産物の吸収と輸送、または植物体内における代謝産物の形成のいずれかに対して有利となるような組織で発現が起こる。従って、植物の生長の特定の時期に特定の組織内で、または植物の特定の器官で特異的に発現を起こすようなプロモーターが最も適していると思われる。よって、ナタネ、ダイズ、ヒマワリおよびアブラヤシなどの油料生産植物の種子における、アセチル CoA含量の増加による脂肪酸の生合成の増加のためには、内胚乳内または形成期の種子の子葉で特異的に活性のあるプロモーターが、特に適していると思われる。このようなプロモーターには、たとえば、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris ）由来のファセオリンプロモーター、ビシア・ファーバ（Vicia faba）由来のUS Pプロモーターまたはコムギ由来のHMGプロモーターがある。さらに、種子特異的な発現を起こすプロモーターの使用が有利である。トウモロコシ、コムギ、オオムギまたは他の穀類などデンプンを貯蔵する植物の場合、それにより種子での解糖効率が上昇し、ピルビン酸およびアセチルCoAの生成ならびに脂肪酸の生合成の増大が起こる。これは、光合成産物の流れが、デンプンの生合成よりもむしろ脂肪酸の生合成などのピルビン酸依存的生合成経路に向かうように変化することを意味する。塊茎または根などの貯蔵器官内、たとえば砂糖大根の貯蔵根またはジャガイモの塊茎内などで活性のあるプロモーターも好ましくは使用される。この場合、インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするDNA配列の発現により、生合成経路の方向が変化し、解糖効率の上昇によって糖類またはデンプンの形成が低下しピルビン酸およびアセチルCoAがより多く形成されるようになる。さらに、これらのDNA配列の発現は、開花の誘導時に特異的に活性化されるプロモーター、または開花の誘導に必要な組織内で活性であるようなプロモーターによって調節されるかもしれない。光、温度、化学物質などの外的影響によってのみ調節されるような特定の時期に活性化されるようなプロモーターの使用も可能である（たとえば、国際公開公報第93/07279号参照）。ATP含量の増加による土壌からのイオン吸収効率の上昇のための興味深いプロモーターとしては、たとえば、根毛または根の表皮で特異的に発現するプロモーターがある。葉からの光合成同化産物の輸送効率の上昇のための興味深いプロモーターとしては、たとえば伴細胞で特異的な発現を示すプロモーターがある。このようなプロモーターは公知である（たとえば、毛根病菌（Agrobacterium rhizogenes）由来のrolC遺伝子のプロモーター）。さらに、インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするDNA配列はプロモーターだけでなく、いわゆるエンハンサー因子など転写をさらに増大させるDNA 配列、または合成されたRNAから対応する蛋白質への翻訳をより効率よく行うための転写領域内にあるDNA配列（いわゆる翻訳エンハンサー）とも結合させる方が有利である。このような領域はウイルスの遺伝子または適当な植物の遺伝子に由来するものでも、合成的に作成されたものでもよい。それらは使用されるプロモーターに対して同質であっても異質であってもよい。インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするDNA配列は、転写の終結および転写産物のポリアデニル化を行うための3’非翻訳DNA配列と結合させた方が有利である。このような配列は公知であり、たとえばAgrobadterium tumefaciens由来のオクトピンシンターゼ遺伝子のものが報告されている。これらの配列はいかなる望ましい方法によっても交換することができる。好ましくは、インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするDNA配列は、本発明の植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれる。サイトゾルインベルターゼおよびサイトゾルヘキソキナーゼの付加的発現により解糖効率の上昇を示すトランスジェニック植物細胞は、通常、いかなる所望の植物種の細胞であってもよい。興味の対象となるのは単子葉植物の細胞ならびに双子葉植物の細胞、特にデンプンを貯蔵する植物、油分貯蔵植物、またはライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、ジャガイモ、トウモロコシ、イネ、ナタネ、エンドウ、サトウダイコン、ダイズ、タバコ、ワタ、ヒマワリ、アブラヤシ、ブドウ、トマトなど農業上有用な植物の細胞、または観賞用植物の細胞である。本発明の植物細胞は、解糖効率の上昇とは別に、ゲノム中に安定的に組み込まれたサイトゾルインベルターゼまたは場合によってはサイトゾルヘキソキナーゼをコードする外来のDNA配列を含むという点で対応する非形質転換植物細胞とは異なる。本文脈において、「外来のDNA配列」という用語は、以下のことを意味する：これらは形質転換植物細胞について異質なDNA配列であってもよく、すなわちその植物細胞において自然には発生しない。形質転換植物細胞内で自然に発生するようなDNA配列の場合には、「外来の」とは、形質転換植物細胞のゲノム内の、自然には発生しない位置に組み込まれていること、すなわち新しいゲノム環境に置かれていることを意味する。このことは、たとえば、サザンブロット解析により確認することができる。さらに、植物細胞に導入されたDNA分子は、通常の場合組み換えDNA分子である、すなわち、この組成では自然には発生しない様々な断片から構成される分子である。さらに、本発明の主題は、本発明のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物である。このような植物は本発明の植物細胞より、たとえば再生などにより作出することができる。解糖効率が上昇した植物細胞の提供により、改変された有利な特性を持つトランスジェニック植物の作出が可能となる。たとえば、特にトランスジェニック植物の伴細胞内での解糖効率の上昇により、ショ糖-プロトン−共輸送体（cotrans porter）による師管因子-伴細胞複合体(sieve-element-companion-cell-complex ）へのショ糖の輸送が増加し、それにより光合産物の輸送効率が増加するかもしれない。同様に、リン酸、硫酸、硝酸およびその他の無機イオンの、根を介した土壌からの吸収も増加するかもしれない。根の細胞、特に根毛および表皮細胞における解糖効率の特異的な上昇は、H⁺AT Pアーゼ活性の増加により、土壌へのプロトン分泌の促進につながるかもしれない。このような土壌の酸性化により流動化が起こり、その結果リン酸など様々な無機塩類が土壌から吸収されやすくなる。種子の内胚乳もしくは子葉または他の油料貯蔵器官などの、植物の油分貯蔵組織における解糖効率の上昇により、これらの種子または器官に輸送される光合成産物の流れを、ピルビン酸およびアセチルCoAの形成に向けることができる。この可能性は特に興味深い。トリグリセリドの生合成のためのこれらの中間体の量が増加すれば、油料の合成の増加、およびそれによる収量の増加につながる。また、アセチルCoA量の増加は、イソプレノイドの生合成など植物において自然に起こる他の多くの過程のみならず、ポリヒドロキシアルカン酸などのポリマー形成（たとえば、Poivierら、Bio/Technology 13(1995)，142-150）においても重要である。デンプン貯蔵組織、たとえば様々な種類の穀類の種子またはジャガイモ塊茎などにおける解糖効率の上昇により、光合成産物の流れはデンプンの生合成から、脂肪酸生合成などのピルビン酸依存的生合成経路に向けられる。この結果、各組織におけるデンプン量の低下が起こり、おそらく同時に脂肪酸生合成の増加が起こることになる。さらに、解糖効率の上昇により生じた高いアセチルCoA濃度により、イソプレノイド合成が増加するかもしれないこと、または、ポリヒドロキシアルカン酸の合成のための対応する遺伝子の発現と組み合わせることにより、トランスジェニック植物細胞内でのポリヒドロキシアルカン酸の合成につながるかもしれないことも重要である。さらに、本発明は、非形質転換植物細胞と比較して解糖効率の上昇を示すトランスジェニック植物細胞を生産する方法にも関する。この方法において、サイトゾルインベルターゼをコードするDNA配列およびサイトゾルヘキソキナーゼをコードするDNA配列が植物細胞に導入される。そしてこれらのDNA配列は、形質転換植物細胞内で発現される。このような方法には、好ましくは以下の段階が含まれる：（a）以下のDNA配列を含む、組み換え二本鎖DNA分子を作成する段階：（ｉ）植物細胞内での転写を行うプロモーター；（ii）センス方向でプロモーターと結合しており、インベルターゼ酵素活性を有するサイトゾル蛋白質をコードするDNA配列；（b）以下のDNA配列を含む、組み換え二本鎖DNA分子を作成する段階：（ｉ）植物細胞内での転写を行うプロモーター；（ii）センス方向でプロモーターと結合しており、ヘキソキナーゼ酵素活性を有するサイトゾル蛋白質をコードするDNA配列；ならびに（c） (a)および(b)の段階に従って作成されたDNA分子の植物細胞内へのトランスファー。植物種、プロモーター、さらに隣接するDNA配列の選択、ならびにインベルターゼまたは場合によってはヘキソキナーゼをコードするDNA配列の選択および改変については、本発明の細胞との関係ですでに述べられている内容が当てはまる。インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするDNA配列は、別々のDNA分子上に位置していても、一つの組み換えDNA分子上に一緒に位置していてもよい。その配列が二つの異なるDNA分子上に位置する場合には、DNA分子のトランスファーは同時に行ってもよいし、または植物細胞をまず一つのDNA分子で形質転換し、選抜した植物細胞および植物を引き続いて第二のDNA分子で形質転換するという方法で行ってもよい。さらに、付加的なサイトゾルインベルターゼならびに付加的なサイトゾルヘキソキナーゼを発現する植物は、まずインベルターゼまたは場合によってはヘキソキナーゼをコードする二つの独立なトランスジェニック植物系統を作成し、引き続いてこれら二つの植物系統を交配させることにより、作成することもできる。インベルターゼまたはヘキソキナーゼをコードするDNA配列を含むDNA分子のトランスファーは、好ましくはプラスミド、特に形質転換植物細胞のゲノムへのDN A分子の安定的な組み込みを行うようなプラスミドを用いて行われる；このようなプラスミドの例としては、バイナリープラスミドまたはAgrobacterium tumefa ciensの系のTi-プラスミドがある。Agrobacteriumの系のほか、いわゆるバイオリスティック法またはプロトプラストの形質転換などの他の系も植物細胞へのDN A分子の導入に用いることができる（総説としてWillmitzer L．(1993)，Transge nic Plants，Biotechnology 2，627-659を参照）。基本的に、全ての植物種の細胞を形質転換に用いることができる。単子葉および双子葉植物が特に興味の対象となる。様々な単子葉および双子葉植物種において、形質転換の技術が説明されている。農業上有用な植物、たとえばライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、ジャガイモ、トウモロコシ、イネ、ナタネ、エンドウ、サトウダイコン、ダイズ、タバコ、ワタ、ヒマワリ、アブラヤシ、ブドウ、トマトなどの細胞、または観賞用植物の細胞が好ましくは用いられる。サイトゾルインベルターゼおよびサイトゾルヘキソキナーゼの付加的発現により解糖効率の上昇を示す、上記の方法により得られるトランスジェニック植物細胞、およびそれから再生された植物もまた本発明の主題である。さらに、本発明は、本発明の細胞を含む、本発明の植物の繁殖材料に関する。繁殖材料とは、繁殖を可能にするような、本発明の植物のすべての種類の組織または器官でありうる。それらの中には、たとえば、本発明の細胞の組織培養物、種子、果実、根茎、挿し木、苗木、塊茎などがある。本発明はさらに、植物細胞内での転写および翻訳を行うためのDNA配列と組み合わせた、ヘキソキナーゼ、好ましくはグルコキナーゼの酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を含む組み換えDNA分子に関する。このヘキソキナーゼは好ましくは、制御されにくいまたは制御を受けない酵素である。さらに、本発明は以下のDNA配列を含む組み換えDNA分子に関する：（ｉ）植物細胞内での転写および翻訳を行うためのDNA配列と組み合わせた、サイトゾルインベルターゼをコードするDNA配列；および、（ii）植物細胞内での転写および翻訳を行うためのDNA配列と組み合わせた、サイトゾルヘキソキナーゼをコードするDNA配列。植物細胞内での転写および翻訳を可能にするDNA配列の選択、およびインベルターゼまたは場合によってはヘキソキナーゼをコードするDNA配列の選択については、本発明の細胞および方法に関して述べられている内容が組み換えDNA分子についても同様に適用される。最後に、本発明は、非形質転換植物細胞と比較して解糖効率の上昇を示すトランスジェニック植物細胞の生産のための、インベルターゼ、好ましくは制御されにくいまたは制御を受けないインベルターゼをコードするDNA配列の使用に関する。非形質転換植物細胞と比較して解糖効率の上昇を示トランスジェニック植物細胞の生産のための、ヘキソキナーゼ、好ましくは制御されにくいまたは制御を受けないヘキソキナーゼをコードするDNA配列の使用もまた、本発明の主題である。図面の説明図１は、12.68kbの大きさを有するプラスミドpB33Hyg-GKを示す。このプラスミドは以下の断片を含む： A ＝断片A（1498kb）は、パタチン造伝子B33（Rocha-Sosaら、EMBO J．8(198 9)，23-29）のプロモーター領域のDraI-DraI断片（-1512の位置から+14の位置まで）を含む。 B ＝断片B（1025kb）は、ツィモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）のグルコキナーゼのコード領域（GenEMBLの寄託番号：M60615;第5128から6153塩基）を有するDNA断片を含む。 C ＝断片C（192bp）は、Ti-プラスミドpTi-ACH5の遺伝子３のポリアデニル化シグナル、第11749〜11939塩基を含む。方法１．クローニングの方法大腸菌へのクローニングには、pUC18ベクターを使用した。植物の形質転換のため、遺伝子構築物はバイナリーベクターpBinAR(HofgenおよびWillmitzer，Pla nt Sci．66(1990)，221-233）にクローニングした。２．細菌菌株 pUCベクターおよびpBinAR構築物については、大腸菌DH5α（Bethesda Researc h Laboratories，Gaithersburgh，USA）を使用した。ジャガイモ植物体へのプラスミドの形質転換は、根頭がんしゅ病菌（Agrobact erium tumefaciens）C58C1 pGV2260株（Deblaereら、Nucl．Acids Res．13(1985 )，4777-4788）を用いて行った。３．根頭がんしゅ病菌（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換 DNAのトランスファーは、HofgenおよびWillmitzer(Nucleic Acids Res．16(19 88)，9877)の方法に従い、直接形質転換により行った。形質転換されたアグロバクテリウム（Agrobacteria）のプラスミドDNAは、BirnboimおよびDolyの方法（N ucleic Acids Res．7(1979)，1513-1523）に従って単離し、適当な制限酵素により切断後、ゲル電気泳動により解析した。４．ジャガイモの形質転換メスで傷をつけたジャガイモ無菌培養物（Solanum tuberosum L．cv．Desiree ）の小葉10枚を、２％ショ糖を含むMS培地（Murashige & Skoog，Physiol．Plan t．15(1962），473)10ml中に置いた。この培地には、選択下で増殖させた根頭がんしゅ病菌（Agrobacterium tumefaciens）の終夜培養液50μlが含まれていた。これを3〜5分間穏やかに振とうさせた後、暗黒下でさらに２日間インキュベーションした。次に、カルスを誘導するためこれらの葉を、1.6％グルコース、5mg/l ナフチル酢酸、0.2mg/lベンジルアミノプリン、250mg/lクラフォラン、50mg/lカナマイシンおよび0.80％バクトアガー（Bacto Agar）を含むMS培地に移した。25 ℃および3000ルクスで1週間インキュベーションした後、苗条を誘導するため、葉を1.6％グルコース、1.4mg/lゼアチンリブロース、20mg/lナフチル酢酸、20mg /lジベレリン酸、250mg/lクラフォラン、50mg/lカナマイシンおよび0.80％バクトアガー（Bacto Agar）を含むMS培地に移した。５．DNA断片の放射性標識 DNA断片の放射性標識は、Boehringer（ドイツ）のDNA-ランダムプライマーラベリングキットを用い、製造者の指示に従って行った。６．植物体の維持管理ジャガイモ植物体は以下の条件下で温室内で維持した：明期 25000ルクスおよび22℃で16時間暗期 15℃で８時間空気中の湿度 60％７．ジャガイモ塊茎のデンプン含量および乾重（dry matter）の測定ジャガイモ塊茎のデンプン含量および乾重の測定は、特異的重量（specific w eight）の測定法（Scheeleら、Landw．Vers．Sta．127(1937)，67-96)により以下の公式に従って行った：乾重（％）＝24.182+211.04×（特異的重量-1.0988）デンプン量（％）＝17.546+199.07×（特異的重量-1.0988）８．ジャガイモ塊茎のリン酸化された代謝中間体の定量ジャガイモ塊茎のリン酸化された代謝中間体の定量は、若干の改変を加えたWe inerおよびStitt（Biochim．Biophys．Acta 893(1987)，13-21）の方法に従って行った。ジャガイモ塊茎抽出物の調製： 200mgの塊茎材料をモルタル中、液体窒素下でホモジナイズした。リン酸化中間体を16％トリクロロ酢酸ジェチルエーテル溶液で抽出した。氷上で3時間インキュベートした後、ジェチルエーテルで３回抽出することによりトリクロロ酢酸を取り除いた。その後、抽出物を５M KOH／1Mトリエタノールアミンで中和した。直ちにホスホエノールピルビン酸（PEP）およびピルビン酸の定量を行った。他の中間体の定量のため、抽出物を数日間-70℃で保存できる。リン酸化中間体の定量は、stittら（Mehods in Enzymology 174，518-552）に従い、酵素反応の組み合わせにより、二波長光度計（Sigma ZWS 11）で行った。 a） PEP およびピルビン酸の定量反応用緩衝液の組成:50mM Hepes-KOH pH7.0; 5mM MgCl₂; 0.025mM NADH; 1mM ATP ピルビン酸の定量：１U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ PEPの定量：+2U/mlピルビン酸キナーゼ測定は、柚出物50〜100μlを用い25℃で行った。 b） UPD グルコース(UDPG)の定量反応用緩衝液の組成：200mM グリシンpH8.7; 5mM MgCl₂; 1mM NAD; 0.025u/ml UDPグルコースデヒドロゲナーゼ測定は、抽出物50〜100μlを用い25℃で行った。 c）グルコース-6-リン酸（G6P）、フルクトース-6-リン酸（F6P）およびグルコース-1-リン酸（G1P）の定量反応用緩衝液の組成：50mM Hepes-KOH pH7.0; 5mM MgCl₂； 0.25mM NADP; G6Pの定量：２U/mlグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ FIPの定量： +２U/mlホスホグルコイソメラーゼ GIPの定量： +２U/mlホスホグルコムターゼ測定は、抽出物50〜100μlを用い25℃で行った。 d）ATP の定量反応用緩衝液の組成：50mM Hepes-KOH pH7.0; 5mM MgCl₂; 0.25mM NADP; 1mM グルコース；２U/mlグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；２U/mlホスホグルコイソメラーゼ；１U/mlヘキソキナーゼ測定は、抽出物50〜100μlを用い25℃で行った。 e） ADP の定量反応用緩衝液の組成：50mM Hepes-KOH pH7.0; 5mM MgCl₂; 0.05mM NADH; 0.2mM PEP; 0.2U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ； 1U/mlピルビン酸キナーゼ測定は、抽出物50〜100μlを用い25℃で行った。 f） 3- ホスホグリセリン酸（3-PGA）の定量反応用緩衝液の組成：100mM Tris-HCl pH8.1; 5mM MgCl₂; 0.05mM NADH; 1.33mM ATP; 0.1U/mlホスホグリセリン酸キナーゼ； 2U/mlグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ測定は、抽出物50〜100μlを用い25℃で行った。９．ジャガイモ塊茎内での炭水化物代謝の酵素活性の測定ジャガイモ塊茎内での酵素活性（たとえば、グルコキナーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースシンターゼ、インベルターゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼまたはピルビン酸キナーゼ）を測定するために、200mgの塊茎材料を500μlの抽出バッファー（50mM Hepes-KOH pH 7.5;５mM MgCl₂;１mM EDTA;１mM EGTA;１mM DTT;２mMベンズアミジン；２mMε- アミノ-n-カプロン酸；0.5mM PMSF;10%(vol./vol.)グリセロール；0.1％(vol./v ol.)Triron X-100）中でホモジナイズした。遠心後、10〜40μlの無細胞脱塩抽出物を酵素活性の測定に用いた。酵素活性は、スクロースシンターゼおよびインベルターゼ活性を除き、分光光度計を用いて酵素反応の組み合わせ（coupled en zymatic reaction）により測定した。グルコキナーゼおよびフルクトキナーゼ活性はRenzら（Planta 190(1993)，15 6-165）の方法に従って測定し、スクロースシンターゼおよびインベルターゼ活性はZrennerら（Plant J．(1995），97-107)の方法に従って測定し、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼの活性はBu rellら（Planta 194(1994)，95-101）の方法に従って測定し、またホスホグルコムターゼ活性はPressey（Journal of Food Science 32(1967)，381-385）の方法に従って測定した。１０．ジャガイモ塊茎のガス交換の定量塊茎（約30ｇ）を温室内の植物体から直接採取し、30分以内に赤外線ガス分析装置（Binos 100 Rosemound，Dusseldorf，FRG）にかけた。CO₂生産量の決定は2 0℃で20分間行った。データの解析にはWaltzソフトウエア（Effeltrich，FRG）を用いた。実施例で本発明を説明する。実施例１バイナリープラスミドP33-Cy-Invの構築プラスミドp33-Cy-Invの構築およびこのプラスミドのジャガイモゲノムへの組み込みについては、EP-A2 0 442 592に説明されている。バイナリー構築物p33-C y-Invで形質転換されたジャガイモの再生植物体は、土壌に移植し、インベルターゼ活性により選抜した。こうして、対照植物体に比べて最大で100倍高いインベルターゼ活性を示すいくつかの遺伝子型が同定された。実施例２バイナリープラスミドpB33Hyg-GKの構築植物の形質転換のために、ツィモモナス・モビリス（Zymomonasmobilis）由来のグルコキナーゼ遺伝子のコード領域を、ツィモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）のゲノムDNAを開始材料として用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。ツィモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のグルコキナーゼの配列はGenEMBLバンクに寄託されており、その寄託番号はM60615である。増幅された断片はこの配列の第5128〜6153ヌクレオチド領域に相当する。5’ 末端にAsp718の制限部位を組み込み、3’末端にHindIIIの制限部位を組み込んだ。1025bpの長さを持つPCR産物を、これらの２つの付加的部位を用いて、ベクターpUCBM20ベクターにクローニングした。このプラスミドを用いて、グルコキナーゼの完全なコード領域を、EcoRIおよびHindIIIで切断後、pBluescriptSKベクターにサブクローニングした。生じたプラスミドpSK-GKを含む大腸菌細胞抽出物において、非形質転換大腸菌細胞の抽出物と比較して100倍増加したグルコキナーゼ活性が見られた。これを調べるため、20mlの終夜培養液の細胞を採集し、50 0μlの抽出バッフアー（30mM KH₂PO₄;２mM MgCl₂;10mM 2-メルカプトエタノール；0.1％（vol./vol/）Nonidet P40）中に再懸濁した。酸で洗浄した同量のガラスパール（直径0.1mm）を加えた後、懸濁液を４回、各30秒間、激しく撹拌した。遠心後、無細胞抽出物のグルコキナーゼ活性を、Scopesら（Biochem．J．228( 1985)，627-634）の説明に従い評価した。こうしてPCR産物の機能性について証明された後、挿入断片をpBIN19（Bevan，Nucl．Acds Res．12(1984)，8711-8720 ）から派生したバイナリーベクターに再度クローン化した。これが以下のプラスミドとなる：プラスミドpB33Hyg-GK（図１を参照）。植物体内で導入遺伝子を発現させるため、この構築物はソラナム・ツベロッサム（Solanum tuberosum)のB3 3プロモーター（Rocha-Sosaら、EMBO J．8(1989)，23-29）を含む。 pB33Hyg-GK構築物は以下のようにして作成した：この構築物は、NPT-II-遺伝子を発現する、すでにトランスジェニックであるジャガイモ植物体への形質転換を意図しているため、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼをコードするHPT遺伝子を含むプラスミドpBIBを用いた（Bec ker，Nucl．Acids Res．18(1990)，203）。ソラナム・ツベロッサム（Solanum tuberosum）のB33遺伝子のプロモーターを DraI断片（Rocha-Sosaら、EMBO J.8(1989)，23-29によれば-1512〜+14の位置）として、粘着末端を分解後、ポリメラーゼIIを用いて、pUC19プラスミドのSacI 部位にクローン化した。プロモーター領域はバイナリーベクターpBIN19にEcoRI/ SmaI断片としてクローン化した。pBIN19ベクターは、根頭がんしょ病菌（Agroba cterium tumefaciens）のオクトピンシンターゼ遺伝子の終結シグナルを、M13mp 19由来のポリリンカーのすぐ隣に含む。この過程で、pB33が形成された。このpB 33プラスミドのプロモーター-ポリリンカー-ターミネーター断片を、EcoRIおよびHindIIIを用いてEcoRI/HindIII断片として線状化したpBIBプラスミドにクローン化した。このようにして、pB33Hygが作成された。次に、グルコキナーゼのコード領域を、Asp718／SaIIを用いて消化した後、プラスミドpSK-GKより単離し、Asp718/SaII断片としてプラスミドpB33Hygにクローン化した。この結果、トランスジェニックジャガイモ系統U-Inv-2（系統30）の形質転換に用いるプラスミドpB33Hyg-GKが生じた。根頭がんしゅ病菌（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換のために、このバイナリープラスミドを、Hofgen & Willmitzer（Nucl．Acids Res．16(1988)， 9877）の方法に従い、直接形質転換法により細胞に導入した。形質転換されたアグロバクテリウム（Agrobacteria）のプラスミドDNAをBirnboimら（Nucl．Acids Res．７(1979)，1513-1523）の方法に従って単離し、適当な制限酵素切断の後にゲル電気泳動により解析した。ジャガイモ植物体を形質転換するために、たとえば、メスで傷をつけた無菌培養の小葉10枚を２％（重量／容積）ショ糖を含む 10mlのMS培地に置いた。この培地には、選択下で増殖させた根頭がんしゅ病菌（ Agrobacterium tumefaciens）の終夜培養液50μlが含まれていた。3〜5分穏やかに振とうさせた後、ペトリ皿を暗黒下、25℃でインキュベートした。２日後、葉を1.6％（重量／容積）グルコース、2mg/lゼアチンリボース、0.02mg/lナフチル酢酸、0.02mg/lジベレリン酸、500mg/lクラフォラン、3mg/lハイグロマイシンおよび0.8％バクトアガー（Bacto Agar）を含むMS培地上に置いた。25℃、3000ルクスで１週間インキュベートした後、培地中のクラフォラン濃度を50％に下げた。その後の培養はRocha-Sosaら（EMBO J．８(1989)，23-29）に従って行った。実施例３酵母のインベルターゼおよびツィモモナス・モビリス（Zynlomonas mobilis）のグルコキナーゼを塊茎で発現するトランスジェニックジャガイモ植物体の解析バイナリー構築物pB33Hyg-GKで形質転換したU-Inv-2系統（30）の再生ジャガイモ植物体を土壌に移し、塊茎におけるグルコキナーゼ活性によって選抜した。対照植物体より最大で５倍高いグルコキナーゼ活性を示した遺伝子型がいくつか同定された（たとえば、GK-41、GK-29、GK-38）。さらに、これらの遺伝子型が、依然として酵母由来のインベルターゼ遺伝子を発現していることが証明された（表I参照）。上記の酵素活性は、５個の独立した植物体を用いた少なくとも５回の測定の平均値である。上述の遺伝子型GK-41、GK-29およびGK-38を増殖させ、それぞれ15個体を温室に移した。塊茎は４カ月後に収穫した。驚くべきことに、トランスジェニック植物体であるGK-41、GK-29およびGK-38 の塊茎は、対照植物体の40〜60％のデンプン量しか含まず、デンプンを除いた乾重は同じままであることが判明した（表IIを参照）。このことは、グルコキナーゼの発現と組み合わせたインベルターゼの発現により、GK-植物体の塊茎においてデンプン量のみが減少していることを示している。さらに、収量が25％抑えられていることも判明した。これは一方で、デンプン量の減少とも相関している。グルコース、フルクトースおよびショ糖などの可溶性糖類の解析により、驚くべきことに、U-Inv-2植物体において7倍に増加したグルコース濃度が、グルコキナーゼの発現により、野生型に比べて非常に減少していることが示された。つまり、グルコース量は野生型対照植物体の塊茎のグルコース量のわずか30％である。トランスジェニック系統におけるフルクトース濃度は対照植物体と比べて変化していなかった。U-Inv-2植物体におけるショ糖量の激減は、グルコキナーゼの発現により部分的に緩和される（表III参照）。まとめると、たとえばGK-38植物体の塊茎は、非形質転換対照植物体の塊茎に含まれるものと比較して、40％のデンプン量、50％の可溶性糖類しか含まないことが判明した。成熟した葉から師部を経て塊茎に輸送される光合成産物の量がGK-植物体では減少していることを示す結果は得られなかった。一方、デンプンおよび可溶性糖類の割合の減少が測定されている。従って、植物細胞のサイトゾルにおけるグルコキナーゼの発現と組み合わせて、植物細胞のサイトゾルにおいてインベルターゼを発現させることにより、解糖および呼吸が増加することが推定できる。この驚くべき結果は、GK植物体の塊茎抽出物中の代謝産物含量の変化および酵素活性の変化により強調される。グルコース-6-リン酸含量は5倍まで増加し、フルクトース-6-リン酸含量は5倍まで増加し、3-ホスホグリセリン酸含量は約40％増加し、ピルビン酸含量は約6倍に増加し、またATP含量は50％まで増加していることがわかった（表IV参照）。上記の代謝産物量は、５個の独立した植物体を開始材料として用いた少なくとも５回の測定の平均値である。値は鮮重（fresh weight）１グラムあたりのnmol 数で示す。さらに、解糖反応を触媒する酵素の活性が、GK-植物体の塊茎抽出物において増加することが示された（表V参照）。たとえば、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド -3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAP-DH）およびピルビン酸キナーゼの特異的活性が上昇している。従って、植物細胞のサイトゾルにおけるグルコキナーゼの発現と組み合わせた、植物細胞のサイトゾルにおけるインベルターゼの発現は、解糖および呼吸の増加につながる方法となる。上記の酵素活性は、５個の独立した植物体を開始材料として用いた少なくとも５回の測定の平均値である。値は鮮重（fresh weight）1mgあたり、１分間あたりのnmol数で示す。実施例４塊茎のガス交換の定量 CO₂生産はまだ成長中の塊茎で測定した（表VI）。上記の値は６個の独立した植物体を開始材料として用いた６回の測定の平均値である。値は鮮重（fresh weight）1gあたりのCO₂のnmol数で示す。表VIのデータは、二酸化炭素の生産量が、U-Inv-2植物体において３倍、GK-植物体において５倍高いことを示している。この驚くべき結果は、グルコキナーゼの発現と組み合わせたサイトゾルにおけるインベルターゼの発現が、植物細胞内における解糖および呼吸の増加につながる方法となることを意味する。上述の実験において対照として示したのは、形質転換に用いた植物種または亜種の非形質転換植物体である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウィルミツァーローザードイツ国ディー−14109 ベルリンアムクレイネンワンシィー 34

Claims

【特許請求の範囲】１．サイトゾルインベルターゼをコードするDNA配列およびサイトゾルヘキソキナーゼをコードするDNA配列を導入し発現させることにより、非形質転換植物細胞と比較して解糖効率の上昇を示し、インベルターゼおよびヘキソキナーゼ活性が増加した、トランスジェニック植物細胞。２．インベルターゼが制御されにくい酵素である、請求項１記載のトランスジェニック植物細胞。３．インベルターゼが制御を受けない酵素である、請求項１記載のトランスジェニック植物細胞。４．ヘキソキナーゼが制御されにくい酵素である、請求項１から３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。５．ヘキソキナーゼが制御を受けない酵素である、請求項１から３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。６．ヘキソキナーゼがグルコキナーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。７．インベルターゼをコードするDNA配列が菌類のインベルターゼをコードしている、請求項１から６のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。８．インベルターゼが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi ae）由来のインベルターゼである、請求項７記載のトランスジェニック植物細胞。９．インベルターゼをコードするDNA配列が、サッカロミセス・セレビシエ（S accharomyces cerevisiae）由来のSuc2遺伝子である、請求項８記載のトランスジェニック植物細胞。１０．ヘキソキナーゼが原核生物由来のヘキソキナーゼである、請求項１から９のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。１１．ヘキソキナーゼが、ツィモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のグルコキナーゼである、請求項１０記載のトランスジェニック植物細胞。１２．インベルターゼをコードするDNA配列が、組織特異的プロモーター、植物において特定の成長過程で活性であるプロモーター、または外的要因により誘導可能なプロモーターの制御下にある、請求項１から１１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。１３．ヘキソキナーゼをコードするDNA配列が、組織特異的プロモーター、植物において特定の成長過程で活性であるプロモーター、または外的要因により誘導可能なプロモーターの制御下にある、請求項１から１２のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。１４．有用植物由来の細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。１５．油分貯蔵植物（oil-storing plant）由来の細胞である、請求項１４記載のトランスジェニック植物細胞。１６．ナタネ、ダイズ、ヒマワリまたはアブラヤシ由来の細胞である、請求項１５記載のトランスジェニック植物細胞。１７．デンプン貯蔵植物由来の細胞である、請求項１４記載のトランスジェニック植物細胞。１８．トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギまたはジャガイモ由来の細胞である、請求項１７記載のトランスジェニック植物細胞。１９．請求項１から１８のいずれか一項に記載の植物細胞の再生によって得られるトランスジェニック植物。２０．請求項１から１８のいずれか一項に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。２１．伴細胞における解糖効率の上昇により、光合成産物の輸送効率が増加している、請求項１９または２０記載のトランスジェニック植物。２２．根の表皮または根毛の細胞における解糖効率の上昇により、土壌からの無機塩類の吸収が増加している、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。２３．内胚乳および／または種子の子葉における解糖効率の上昇により、脂肪酸の生合成が増加している、請求項１９から２２のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。２４．ある器官における解糖効率の上昇により脂肪酸含量が増加していると同時にデンプン含量が減少している、請求項１９から２３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。２５．請求項１から１８のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞を含む、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の植物の繁殖材料。２６．サイトゾルインベルターゼをコードするDNA配列ならびにサイトゾルヘキソキナーゼをコードするDNA配列を植物細胞に導入し、これらのDNA配列が形質転換植物細胞内で発現される、解糖効率が上昇したトランスジェニック植物細胞を生産するための方法。２７．インベルターゼが、制御されにくいまたは制御を受けない酵素である、請求項２６記載の方法。２８．ヘキソキナーゼが、制御されにくいまたは制御を受けない酵素である、請求項２６または２７記載の方法。２９．ヘキソキナーゼがグルコキナーゼである、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。３０．（ｉ）植物細胞内での転写および翻訳を行うDNA配列と共に、サイトゾルインベルターゼをコードするDNA配列と、（ii）植物細胞内での転写および翻訳を行うDNA配列と共に、サイトゾルヘキソキナーゼをコードするDNA配列とを含む、組み換えDNA分子。３１．植物細胞内での転写および翻訳を行うDNA配列と共に、ヘキソキナーゼ酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を含む組み換えDNA分子。３２．ヘキソキナーゼがグルコキナーゼである、請求項３０または３１記載の組み換えDNA分子。３３．非形質転換植物細胞と比較して解糖効率の上昇が示されるトランスジェニック植物細胞の作製を目的とする、インベルターゼをコードするDNA配列の使用。３４．非形質転換植物細胞と比較して解糖効率の上昇が示されるトランスジェニック植物細胞の作製を目的とする、ヘキソキナーゼをコードするDNA配列の使用。３５．ヘキソキナーゼがグルコキナーゼである、請求項３４記載の使用。