ES2229222T3 - Produccion de trehalosa en plantas. - Google Patents
Produccion de trehalosa en plantas.Info
- Publication number
- ES2229222T3 ES2229222T3 ES94923710T ES94923710T ES2229222T3 ES 2229222 T3 ES2229222 T3 ES 2229222T3 ES 94923710 T ES94923710 T ES 94923710T ES 94923710 T ES94923710 T ES 94923710T ES 2229222 T3 ES2229222 T3 ES 2229222T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- plant
- trehalose
- plants
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
- A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
- A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23L3/3562—Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
- A23L3/40—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution
- A23L3/42—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution with addition of chemicals before or during drying
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/1066—Sucrose phosphate synthase (2.4.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Ceramic Products (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA PRODUCCION DE TREHALOSA EN UNA PLANTA ANFITRIONA DEBIDO A LA PRESENCIA EN DICHA PLANTA DE UN GEN EXPRESABLE EN UNA PLANTA QUE INCLUYE EN ESTE ORDEN; (A) UNA REGION DE INICIACION TRANSCRIPCIONAL QUE ES FUNCIONAL EN DICHA PLANTA ANFITRIONA, (B) UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA UNA ACTIVIDAD SINTASA DE FOSFATO TREHALOSA, Y OPCIONALMENTE (C) UNA SECUENCIA DE TERMINACION TRANSCRIPCIONAL QUE ES FUNCIONAL EN DICHA PLANTA ANFITRIONA.
Description
Producción de trehalosa en plantas.
Esta invención se refiere a la modificación del
metabolismo de hidratos de carbono vegetales empleando técnicas de
ADN recombinante, al ADN recombinante para uso en la misma, así como
a plantas y a partes de plantas que tienen una constitución genética
modificada. Dichas plantas se pueden emplear para extraer compuestos
de hidratos de carbono específicos o, alternativamente, se pueden
procesar como alimento, comida para animales o ingredientes de los
mismos, que tienen propiedades mejoradas debido a la presencia de
dichos compuestos carbohidratos, p. ej., durante el
procesamiento.
La trehalosa es un nombre general dado a los
D-glucosil-D-glucósidos
que comprenden disacáridos que se basan en dos moléculas de glucosa
enlazadas en \alpha, \alpha,\beta y \beta,\beta. La
trehalosa y especialmente la
\alpha-trehalosa-1-(O-a-D-glucopiranosil)-1'-O-\alpha-D-glucopiranosa)
es un disacárido muy extendido y presente en la naturaleza.
La síntesis química de la trehalosa tiene
dificultad (son necesarios grupos protectores) y es ineficaz. Las
fuentes naturales ordinarias de trehalosa son hongos y la levadura
Saccharomyces cerevisiae, que puede acumular más de 10% del
peso en seco en forma de trehalosa. Sin embargo, la producción está
obstaculizada por la alta actividad de la trehalasa, que causa una
rápida metabolización de la trehalosa. Elbein A.D. (1974, Adv.
Carbohydrate Chem. and Biochem. 30, 227-256)
proporciona una revisión de la presencia y del metabolismo del
disacárido trehalosa, particularmente de la
\alpha,\alpha-trehalosa, en organismos vivos.
En las plantas, la presencia de trehalosa ha sido descrita en
algunas especies vegetales inferiores, así como en una cantidad de
especies vegetales superiores que pertenecen a los spermatophyta;
Echinops persicus, Carex brunescens; Fagus silvaticus. Sin
embargo, estos resultados no han sido establecidos nunca de forma
firme por otros autores (p. ej., Kendall y col., 1990,
Phytochemistry 29, nº 8, 2525-2528). Por
ejemplo, Kendall y col., véase arriba, en donde hacen referencia a
la presencia de trehalosa en espermatofitas, manifestando que su
presencia sólo se ha documentado firmemente en semilla de carvis
(Carum carvi). Una información sobre la presencia de
trehalosa en girasol, de Cegla y col., (1977, J. Am. Oil Chem. Soc.
54, 150 y sig.) fue cuestionada por Kandler y col. (en:
The Biochemistry of Plants Vol. 3 Carbohydrates: Structure
and Function; Preiss, J., compilador, p. 228. Academic Press) según
Kendall y col., 1990, véase arriba. Informaciones sobre trehalosa en
hayas (Fagus sylvaticus) y en coles, no las han podido
verificar otros autores (Kendall y col., 1990, véase arriba, y sus
referencias).
A pesar de la aparente rareza de la trehalosa en
plantas superiores, la presencia de actividades que degradan la
trehalosa ha sido descrita en un número significativo de familias de
plantas investigadas. Una actividad trehalasa alta y estable se
encontró en endosperma de trigo, pino banksiano y en Selaginella
lepidophylla. Una actividad trehalasa baja y estable se encontró
en la alfalfa, maíz dulce negro mejicano y en pícea blanca.
Actividades inestables y moderadas se encontraron en dos
suspensiones diferentes de colza, pero estas no se podían atribuir
probablemente a una actividad trehalasa específica. En cebada, bromo
velloso, semilla de soja y pícea negra se describió que no contenían
ninguna actividad trehalasa (Kendall, 1990, véase arriba).
En organismos capaces de su producción, se cree
que la trehalosa se biosintetiza como 6-fosfato,
mientras que la forma de almacenamiento es el azúcar libre. Por
tanto, se cree que los organismos que producen y/o almacenan
trehalosa, contienen una fosfatasa capaz de cortar la
trehalosa-6-fosfato (Elbein, 1974,
véase arriba). Se conoce poco sobre la presencia de fosfatasas
específicas de la trehalosa-fosfato en plantas
superiores.
El documento de solicitud de patente
internacional WO93/17093 A1, publicado el 2 de septiembre, 1993,
describe la producción de trehalosa en levadura transgénica en los
genes de la levadura que codifican la sintetasa de
trehalosa-fosfato. Se sugirió que la trehalosa se
puede producir también en plantas superiores, empleando estos genes
de levadura, pero no existe una descripción real de la producción de
trehalosa en una planta. Hay que tener en cuenta que el documento
WO93/17093 A1 fue publicado antes de la fecha de presentación de la
presente solicitud pero con posterioridad a la fecha de prioridad de
la misma.
La presente invención proporciona un método para
la producción de trehalosa en una planta hospedadora debido a la
presencia en dicha planta hospedadora de un gen expresable en la
planta que comprende en este orden:
(a) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(b) una secuencia de ADN que codifica una
sintetasa de trehalosa-fosfato representada por la
secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:2 y,
opcionalmente,
(c) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora.
También se describe la producción de trehalosa en
una planta hospedadora debido a la presencia en dicha planta
hospedadora de un gen expresable en la planta que comprende en este
orden:
(d) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(e) una secuencia de ADN que codifica una
actividad sintetasa de trehalosa-fosfato y,
opcionalmente,
(f) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora, y
un gen expresable en la planta que comprende en
este orden:
(a) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(b) una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de ARN que es al menos parcialmente complementaria a una
secuencia de ARN que codifica una enzima sintetasa de
sacarosa-fosfato (SPS) presente de forma natural en
dicha planta hospedadora y, opcionalmente,
(c) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora.
También se describe la producción de trehalosa en
una planta hospedadora debido a la presencia en dicha planta
hospedadora de un gen expresable en la planta que comprende en este
orden:
(d) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(e) una secuencia de ADN que codifica una
actividad de sintetasa de trehalosa-fosfato y,
opcionalmente,
(f) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora, y
un gen expresable en la planta que comprende en
este orden:
(a) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(b) una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de ARN que es al menos parcialmente complementaria a una
secuencia de ARN que codifica una enzima de pirofosforilasa de
ADP-glucosa, presente de forma natural de dicha
planta hospedadora y, opcionalmente,
(c) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora.
También se describe la producción de trehalosa en
una planta hospedadora debido a la presencia en dicha planta
hospedadora de un gen expresable en la planta que comprende en este
orden:
(a) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(b) una secuencia de ADN que codifica una
actividad sintetasa de trehalosa-fosfato y,
opcionalmente,
(c) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora,
y un gen expresable en la planta que comprende en
este orden:
(d) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(e) una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de ARN que es al menos parcialmente complementaria a una
secuencia de ARN que codifica una enzima sintetasa de
sacarosa-fosfato, presente en la naturaleza en dicha
planta hospedadora y, opcionalmente,
(f) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora,
y un gen expresable en una planta que comprende
en este orden:
(g) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(h) una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de ARN, al menos parcialmente complementaria a una
secuencia de ARN que codifica una enzima pirofosforilasa de
ADN-glucosa presente en la naturaleza en dicha
planta hospedadora, y opcionalmente,
(i) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora.
La invención también se extiende a los genes
expresables en la planta, empleados en el procedimiento para
preparar trehalosa, así como a las combinaciones de genes
expresables en plantas, así como a los plásmidos de clonación, los
vectores de transformación, los microorganismos y a los genes
expresables en plantas de acuerdo con la invención que se cosechan
en células vegetales individuales.
La invención también proporciona un genoma de ADN
vegetal recombinante que contiene un gen de la sintetasa de
trehalosa-fosfato expresable en plantas que no está
presente de forma natural en el mismo. También se describe un genoma
de ADN vegetal recombinante que comprende un gen de la sintetasa de
trehalosa-fosfato expresable en plantas que no está
presente de forma natural en el mismo y, además, un gen expresable
en plantas, capaz de inhibir la biosíntesis de una actividad SPS,
y/o un gen expresable en plantas capaz de inhibir la biosíntesis de
una actividad AGPasa.
La invención también proporciona un método para
obtener una planta capaz de producir trehalosa que comprende las
etapas de
(1) introducir en una célula vegetal receptora un
gen expresable en plantas que comprende en este orden:
(a) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(b) una secuencia de ADN que codifica una
actividad sintetasa de trehalosa-fosfato,
(c) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora y un gen
expresable en plantas que comprende en este orden:
(d) una región de iniciación de la transcripción
que es funcional en dicha planta hospedadora,
(e) una secuencia de ADN que codifica un gen
marcador seleccionable que es funcional en dicha planta hospedadora,
y, opcionalmente,
(f) una secuencia de terminación de la
transcripción que es funcional en dicha planta hospedadora,
(2) generar una planta a partir de una célula
transformada bajo condiciones que permitan la selección por la
presencia del gen marcador seleccionable.
La invención también comprende plantas que
producen (niveles incrementados de) trehalosa como resultado de la
modificación genética.
La invención comprende adicionalmente plantas que
tienen un genoma de ADN recombinante que contiene un gen expresable
en plantas de acuerdo con la invención. La invención también
comprende plantas que tienen un genoma de ADN recombinante que
contiene un gen expresable en plantas de acuerdo con la invención y
cuyas plantas producen trehalosa.
Se describen adicionalmente plantas que tienen un
genoma de ADN recombinante de acuerdo con la invención y que
muestran una resistencia incrementada a la desecación.
La invención también se extiende a partes de
plantas de acuerdo con la invención, tales como células o
protoplastos o sus cultivos, flores, frutos, hojas, polen, raíces
(que incluyen cultivos de raíces pilosas), semillas, tallos,
tubérculos (incluidos los denominados microtubérculos) y
similares.
La invención también se extiende a un método para
conservar plantas o partes de plantas en presencia de trehalosa que
comprende las etapas de:
(1) hacer crecer una planta de acuerdo con la
invención que produce trehalosa,
(2) cosechar la planta o las partes de las
plantas que contienen trehalosa y
(3) secar al aire las plantas o las partes de las
plantas o alternativamente,
(4) liofilizar las plantas o las partes de las
plantas.
La invención comprende adicionalmente las plantas
y las partes de las plantas que se han conservado según un método de
acuerdo con la invención.
La invención también incluye un método para la
producción de trehalosa que comprende las etapas de:
(1) hacer crecer una planta que en virtud de un
genoma de ADN vegetal recombinante, es capaz de producir (niveles
incrementados de) trehalosa,
(2) cosechar dicha planta o dicha parte de la
planta,
(3) aislar la trehalosa de dicha planta o de
dicha parte de la planta.
La invención incluye adicionalmente un método
para la producción de trehalosa que comprende las etapas de:
(1) hacer crecer en cultivo células vegetales que
en virtud de un genoma de ADN vegetal recombinante son capaces de
producir (niveles incrementados de) trehalosa,
(2) aislar la trehalosa de dicho cultivo de
células vegetales.
La invención proporciona adicionalmente una
secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica una actividad
sintetasa de trehalosa-fosfato. Una secuencia de
ácidos nucleicos aislada preferida es una obtenida a partir de E.
coli, aún más preferida es la secuencia de ácidos nucleicos
aislada representada por SEQ ID NO:2. Otra realización preferida
comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una
secuencia de ácidos nucleicos tal como SEQ ID NO:3.
Las siguientes figuras ilustran adicionalmente la
invención.
Figura 1. Representación esquemática de partes de
las rutas biosintéticas de la sacarosa y del almidón en tejidos de
endosperma vegetales. La figura muestra que el carbohidrato
producido en la hoja mediante fotosíntesis se transporta a través
del tejido del floema en forma de sacarosa. Antes de formar el
endosperma se descarga por una actividad invertasa ligada a la
membrana para conseguir los monoazúcares de glucosa y fructosa. Por
la acción de varias etapas enzimáticas, estos monoazúcares se
convierten en almidón y/o sacarosa tal y como se muestra aquí a
grandes rasgos. Los metabolitos de la glucosa G6P y UDPG se cree que
se emplean como sustratos para la enzima TPS de ingeniería genética,
en la planta mediante la introducción del gen otsA expresable
en vegetales. La figura muestra cómo la cantidad de UDPG y G6P
disponible como sustrato, se incrementa reduciendo los niveles de la
enzima SPS y AGPasa. Su inhibición se marca con una cruz.
Figura 2. Mapa esquemático del
clon-EMBL4 7F11 procedente de Kohara y col. (1987),
que contiene el operón otsBA de E. coli. El inserto de
18,8 kb está sombreado. Los sitios de restricción para las enzimas
EcoRV y HindIII empleadas para clonar el gen
otsA están indicados, así como su distancia en kb en relación
con el sitio a mano izquierda del inserto. Los genes otsA y B
están indicados, las flechas muestran la dirección de la
transcripción. (Véase la Fig. 8, mapa extendido).
Figura 3. Secuencia del ADNc de SPS de patata
clonado. Subrayado: secuencias de ADNc de SPS de maíz empleadas como
oligonucleótidos en la reacción de amplificación con PCR.
Figura 4. Representación esquemática del vector
binario pMOG664.
Figura 5. Mapa de restricción de parte de pTiB6
que muestra dos fragmentos clonados en pMOG579.
Figura 6. Representación esquemática de pMOG579
empleada para la construcción del plásmido auxiliar sin la región T
en la cepa MOG101 de Agrobacterium.
Figura 7. Representación esquemática del vector
de expresión pMOG180.
Figura 8. Mapa extendido del
clon-EMBL4 7F11 de Kohara y col. (1987), que
contiene el operón otsBA de E. coli. La posición del
marco de lectura abierto (ORF) de TPS está indicada. (*: sitios de
HindIII no presentes en el mapa de Kohara y col., véase abajo).
Figura 9. Representación esquemática del vector
binario pMOG799.
Figura 10. Representación esquemática del vector
binario pMOG801.
Figura 11. Representación esquemática del vector
binario pMOG802.
Una realización preferida de la invención
comprende una planta de patata capaz de producir trehalosa en
tubérculos debido a la presencia en dicha planta de patata de un gen
expresable en la planta que comprende en este orden:
(a) una región de iniciación de la transcripción
obtenida a partir del ARN 35S de CaMV flanqueado aguas arriba por un
potenciador doble,
(b) una secuencia de ADN que codifica una
sintetasa de trehalosa-fosfato que es la región
codificadora del gen otsA localizado en el operón
otsBA de E. coli,
(c) una secuencia de terminación de la
transcripción obtenida a partir del gen de la sintetasa de nopalina
(nos) de Agrobacterium. Los tubérculos de las plantas
transgénicas que contienen el gen de TPS expresable en plantas
producían trehalosa, mientras que las plantas testigos que carecían
de este gen no producían. Según parece, la
trehalosa-fosfato que se produce en los tubérculos
transgénicos se convierte en trehalosa. Según parece, no es
necesario proporcionar una actividad fosfatasa de la
trehalosa-fosfato porque parece estar presente en la
patata.
También se ilustra en la figura 1 un acercamiento
para mejorar la disponibilidad del sustrato para TPS. Para este fin,
se clonaron bajo el control del promotor 35S de CaMV, dos genes que
influyen en la disponibilidad de la
glucosa-6-fosfato (G6P) y UDPG, un
gen de SPS de hebra complementaria y una APGasa de hebra
complementaria, para la expresión en plantas hospedadoras. Si se
introducen en una planta hospedadora que contiene un gen TPS
expresable en plantas de acuerdo con la invención, en ésta se
incrementará la disponibilidad de sustrato para TPS y de este modo
la síntesis de trehalosa. Para algunos expertos en la técnica, será
evidente que se pueden emplear también otros genes de hebra
complementaria para bloquear la síntesis de sacarosa y de almidón,
para mejorar así la disponibilidad del sustrato.
Aunque la invención se describe en detalle para
plantas de patata que expresan un gen de la sintetasa de
trehalosa-fosfato, expresable en plantas,
procedente de E. coli, bajo el control del promotor 35S de
CaMV como región de iniciación de la transcripción, será evidente
para los expertos en la técnica que hay otras plantas hospedadoras
espermatofitas que son igualmente adecuadas para la producción de
trehalosa. Las plantas hospedadoras preferidas entre las
spermatophyta son las Angiospermae, especialmente las
Dicotyledoneae, que comprenden, entre otras, las
Solanaceae como una familia representativa y las
Monocotyledoneae, que comprenden, entre otras, las
Gramineae como familia representativa. Las plantas
hospedadoras adecuadas, tal y como se define en el contexto de la
presente invención, incluyen plantas (así como partes y células de
dichas plantas) y su progenie que se ha modificado genéticamente
empleando técnicas de ADN recombinante, para provocar o mejorar la
producción de la trehalosa de interés en la planta deseada o en el
órgano de la planta; estas plantas se pueden usar directamente (p.
ej., las especies de plantas que producen partes comestibles) o
después de purificar la trehalosa desde dicho hospedador (que puede
ser de plantas hospedadoras comestibles o no comestibles). Cultivos
con partes comestibles de acuerdo con la invención, incluyen los que
tienen flores, tales como la coliflor (Brassica oleracea),
alcachofa (Cynara scolymus), frutos como la manzana
(Malus, p. ej., domesticus), plátano (Musa, p.
ej., acuminata), bayas (tales como la grosella roja,
Ribes, p. ej., rubrum), cerezas (tales como la cereza
dulce, Prunus, p. ej., avium), pepino (Cucumis,
p. ej., sativus), uvas (Vitis, p. ej.,
vinifera), limón (Citrus limon), melón (Cucumis
melo), frutos secos (tales como la nuez, Juglans, p. ej.,
regia; cacahuete, Arachis hypogeae), naranja
(Citrus, p. ej., máxima), melocotón (Prunus, p.
ej., persica), pera (Pyra, p. ej., communis),
pimiento (Solanum, p. ej., capsicum), ciruela
(Prunus, p. ej., domestica), fresa (Fragaria,
p. ej., moschata), tomate (Lycopersicon, p. ej.,
esculentum), hojas, tales como alfalfa (Medicago
sativa), coles (tales como Brassica oleracea), escarola
(Cichoreum, p. ej., endivia), puerro (Allium
porrum), lechuga (Lactuca sativa), espinaca (Spinacia
oleraceae), tabaco (Nicotiana tabacum), raíces, tales
como arruruz (Maranta arundinacea), -remolacha (Beta
vulgaris), zanahoria (Daucus carota), mandioca
(Manihot esculenta), nabo (Brassica rapa), rábano
(Raphanus sativus), yame (Dioscorea esculenta), batata
(Iponomea batatas) y semillas, tales como judía (Phaseolus
vulgaris), guisante (Pisum sativum), soja (Glycin
max), trigo (Triticum aestivum), cebada (Hordeum
vulgare), maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa),
tubérculos, tales como colinabo (Brassica oleraceae), patata
(Solanum tuberosum), y similares. Las partes comestibles se
pueden conservar por secado en presencia de niveles mejorados de
trehalosa producida en las plantas, debido a la presencia de un gen
de la sintetasa de trehalosa-fosfato, expresable en
la planta. Puede ser ventajoso para producir niveles mejorados de
trehalosa, poner el ADN que codifica la actividad TPS bajo el
control de un promotor específico de un órgano de la planta o de un
tejido; la elección del mismo puede determinarla fácilmente un
experto en la técnica.
Cualquier gen de la sintetasa de
trehalosa-fosfato bajo el control de elementos
reguladores necesarios para la expresión del ADN en células
vegetales, se puede utilizar tanto de forma específica como
constitutiva, en tanto que sea capaz de producir una actividad de
sintetasa de trehalosa-fosfato activa. La secuencia
de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO:2, de hecho,
cualquier marco de lectura abierto que codifique una actividad
sintetasa de la trehalosa-fosfato de acuerdo con la
invención, se puede alterar sin alterar necesariamente la secuencia
de aminoácidos de la proteína codificada por la misma. Este hecho
está causado por la degeneración del código genético. Por tanto, el
marco de lectura abierto que codifica la actividad sintetasa de la
trehalosa-fosfato, se puede adaptar al uso de los
codones en la planta hospedadora elegida.
También la secuencia de ácidos nucleicos aislada
representada por SEQ ID NO:2 se puede utilizar para identificar
actividades de sintetasa de trehalosa-fosfato en
otros organismos y aislarlas posteriormente hibridando el ADN de
otras fuentes con un fragmento de ADN o de ARN obtenible a partir
del gen de E. coli. Preferentemente, tales secuencias de ADN
se escrutan mediante hibridación bajo condiciones rigurosas (tales
como la temperatura y la fuerza iónica de la mezcla de hibridación).
El que las condiciones sean o no rigurosas depende también de la
naturaleza de la hibridación, es decir, ADN:ADN, ADN:ARN, ARN:ARN,
así como de la longitud del fragmento más corto de la hibridación.
Los expertos en la técnica son capaces de establecer un régimen de
hibridación riguroso.
Las fuentes para aislar actividades de sintetasa
de trehalosa-fosfato incluyen microorganismos (p.
ej., bacterias, levaduras, hongos), plantas, animales y similares.
Las secuencias de ADN aisladas que codifican la actividad de
trehalosa-fosfato procedentes de otras fuentes, se
pueden utilizar asimismo en un método para producir trehalosa de
acuerdo con la invención.
La invención también engloba secuencias de ácido
nucleico que se han obtenido modificando la secuencia de ácidos
nucleicos representada en SEQ ID NO:2, mutando uno o varios codones
de modo que da como resultado cambios en los aminoácidos en la
proteína codificada, en tanto que la mutación de la secuencia de
aminoácidos no destruya totalmente la actividad sintetasa de
trehalosa-fosfato.
En principio, cualquier planta hospedadora es
adecuada junto con cualquier gen de la sintetasa de
trehalosa-fosfato expresable en plantas. Como genes
de trehalosa de otras fuentes se pueden utilizar los que se emplean
de forma similar para obtener una combinación de un gen de la
sintetasa de trehalosa-fosfato expresable en
plantas, tal y como se ha descrito en esta memoria.
La inhibición de los genes endógenos para
potenciar la disponibilidad de sustrato para la sintetasa de
trehalosa-fosfato, tal y como se ilustra en esta
memoria, con la inhibición del gen endógeno de la sintetasa de
sacarosa fosfato y el gen de la pirofosforilasa de
ADP-glucosa, se puede realizar de diversos modos,
cuya elección no es decisiva para la invención. La inhibición de los
genes se consigue preferentemente mediante el llamado
"acercamiento de hebra complementaria". En éste, se expresa una
secuencia de ADN que produce un ARN que es al menos parcialmente
complementario al ARN que codifica la actividad enzimática que se va
a bloquear (p. ej., AGPasa o SPS, en los ejemplos). Se prefiere el
uso de genes homólogos de cadena complementaria ya que éstos son más
eficaces que los genes heterólogos. El aislamiento de un gen SPS de
cadena complementaria de patata, empleando una secuencia de gen SPS
de maíz como sonda, sirve para ilustrar la ejecución de esta
estrategia. No se quiere indicar que para la puesta en práctica de
la invención sea necesario el uso de fragmentos homólogos de cadena
complementaria. Un método alternativo para bloquear la síntesis de
actividades enzimáticas no deseadas, es la introducción en el genoma
de la planta hospedadora de una copia adicional de un gen endógeno
presente en la planta hospedadora. Se ha observado frecuentemente
que una copia adicional de un gen tal, silencia el gen endógeno:
este efecto se denomina en la bibliografía el efecto
co-supresor o co-supresión.
En principio, ambas plantas dicotiledóneas y
monocotiledóneas que son adecuadas para la transformación, se pueden
modificar introduciendo un gen expresable en la planta, de acuerdo
con la invención, en una célula receptora y dejando crecer una nueva
planta en la que se cosecha y se expresa el gen expresable en la
planta. Las plantas preferidas de acuerdo con la invención son las
que son capaces de convertir la trehalosa-fosfato en
trehalosa y que no contienen actividad degradadora de la trehalosa o
contienen muy poca. Se entiende que las plantas que carecen de la
capacidad de convertir la trehalosa-fosfato en
trehalosa, están también incluidas en la presente invención. Estas
plantas se pueden modificar adicionalmente introduciendo genes
adicionales que codifican fosfatasas que son capaces de la
conversión de trehalosa-fosfato en trehalosa. En
principio, también se incluyen las plantas que contienen trehalasas,
puesto que estas plantas se pueden volver adecuadas para la
producción de trehalosa inhibiendo la actividad de tales enzimas,
por ejemplo, inhibiendo la expresión de los genes que codifican
tales enzimas empleando el acercamiento de hebra complementaria.
El método para introducir el gen de la sintetasa
de trehalosa-fosfato expresable en plantas en una
célula vegetal receptora no es crucial, mientras que el gen se
incorpore de forma estable en el genoma de dicha célula vegetal.
Además del uso de cepas del género Agrobacterium, se pueden
utilizar otras técnicas diversas para introducir el ADN en células
vegetales, tales como transformación de protoplastos empleando el
método de calcio/polietilenglicol, electroporación y microinyección
o bombardeo de partículas (revestidas) (Potrykus, 1990, Bio/Technol.
8, 535-542).
Además de estos métodos denominados de
transformación directa del ADN, sistemas de transformación que
implican vectores están ampliamente disponibles, tales como vectores
víricos (p. ej., del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y
vectores bacterianos (p. ej., del género Agrobacterium)
(Potrykus, 1990, Bio/Technol. 8, 535-542).
Después de seleccionar y/o escrutar, los protoplastos, las células o
las partes de plantas que se han transformado se pueden regenerar in
las plantas completas, empleando métodos conocidos en la técnica
(Horsch y col., 1985, Science 225,
1228-1231).
Se ha observado que las plantas monocotiledóneas
son capaces de transformación y que las plantas transgénicas
fértiles se pueden regenerar a partir de células transformadas. El
desarrollo de sistemas de cultivo de tejidos reproducibles para
estos cultivos, junto con los métodos poderosos para la introducción
de material genético en las células vegetales han facilitado la
transformación. Actualmente, los métodos preferidos para la
transformación de monocotiledóneas son el bombardeo con
microproyectiles de explantes o células en suspensión, y la
absorción directa de ADN o la electroporación (Shimamoto y col.,
1989, Nature 338, 274-276). Las plantas de
maíz transgénico se han obtenido introduciendo el gen bar de
Streptomyces hygroscopicus, que codifica la acetiltransferasa
de fosfinotricina (una enzima que inactiva el herbicida
fosfinotricina), en células embrionarias de un cultivo en suspensión
de maíz mediante bombardeo de microproyectiles
(Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2,
603-618). La introducción de material genético en
protoplastos de aleurona de otros cultivos de monocotiledóneas,
tales como trigo y cebada, también se han descrito (Lee, 1989, Plant
Mol. Biol. 13, 21-30). Las plantas de trigo
se han regenerado a partir de un cultivo embrionario en suspensión,
seleccionando sólo los tejidos de callos embrionarios compactos,
envejecidos y nodulares, para establecer los cultivos embrionarios
en suspensión (Vasil, 1990 Bio/Technol. 8
429-434). La combinación con sistemas de
transformación para estos cultivos, permite la aplicación de la
presente invención a monocotiledóneas. Estos métodos también se
pueden aplicar a la transformación y a la regeneración de
dicotiledóneas.
dicotiledóneas.
Las plantas monocotiledóneas que incluyen
cultivos de importancia comercial, tales como el maíz, son capaces
de transferir ADN a través de cepas de Agrobacterium
(documento de patente europea 159418 B1; Gould J, Michael D,
Hasegawa O, Ulian EC, Peterson G, Smith RH, (1991) Plant. Physiol.
95, 426-434).
En relación con la elección de la planta
hospedadora, se prefiere seleccionar especies de plantas con poca o
ninguna actividad degradadora de trehalosa. Sin embargo, las plantas
que muestran actividad trehalasa no están excluidas de ser una
planta hospedadora adecuada para la producción de trehalosa, aunque
puede ser necesario proporcionar una inhibición de la actividad
trehalasa si ésta evita en conjunto la acumulación de trehalosa. Tal
inhibición se puede conseguir empleando el acercamiento de hebra
complementaria bien conocido en la técnica e ilustrado para otros
fines en esta memoria descriptiva.
Se debe entender también que la invención no está
limitada al uso del promotor 35S de CaMV como región de iniciación
de la transcripción. Las secuencias de ADN adecuadas para el control
de la expresión de los genes expresables en la planta, que incluyen
genes marcadores, tales como regiones de iniciación de la
transcripción, potenciadores, líderes no transcritos y similares, se
pueden obtener a partir de cualquier gen que se exprese en una
célula vegetal cuyos genes, tales como los genes endógenos
vegetales, se expresen naturalmente en las células vegetales tales
como los localizados en el ADN-T de tipo silvestre
de Agrobacterium, los genes de virus vegetales, así como
otros genes eucarióticos que incluyen una región de iniciación de la
transcripción que está conforme con la secuencia de consenso para la
iniciación de la transcripción en eucariontes. También se aplica a
promotores híbridos que combinan partes funcionales de diversos
promotores o a sus equivalentes sintéticos. Además de los promotores
constitutivos, los promotores inducibles o los promotores regulados
de otro modo en su patrón de expresión, p. ej., en el desarrollo o
los específicos del tipo celular, se pueden utilizar para el control
de la expresión de los genes expresables en la planta de acuerdo con
la invención, en tanto que se expresen en partes de la planta que
contiene sustrato para TPS.
Para seleccionar o escrutar las células
transformadas se prefiere incluir un gen marcador ligado al gen
expresable en la planta de acuerdo con la invención, para ser
transferido a una célula vegetal. La elección de un gen marcador
adecuado en la transformación de la planta está dentro del alcance
de la media de los trabajadores especializados; algunos ejemplos de
genes marcadores empleados de forma rutinaria son los genes de la
fosfotransferasa de neomicina que confieren resistencia a kanamicina
(documento EP-B 131623), el gen de la
S-transferasa de glutatión de hígado de rata, que
confiere resistencia a herbicidas derivados del glutatión (documento
EP-A 256223), la sintetasa de glutamina que confiere
después de la sobre-expresión, resistencia a los
inhibidores de la sintetasa de glutamina, tales como fosfinotricina
(documento WO87/05327), el gen de la transferasa de acetilo de
Streptomyces viridochromogenes que confiere resistencia al
agente selectivo fosfinotricina (documento EP-A
275957), el gen que codifica una sintetasa de
5-enolshikimato-3-fosfato
(EPSPS) que confiere tolerancia a
N-fosfonometilglicina, el gen bar que
confiere resistencia a Bialaphos (p. ej., documento WO91/02071) y
similares. La elección real del marcador no es crucial mientras que
sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células
de la planta de elección.
El gen marcador y el gen de interés no tienen que
estar ligados puesto que la co-transformación de
genes no ligados (documento de patente de EE.UU. 4.399.216) es
también un procedimiento eficaz en la transformación de plantas.
El material vegetal preferido para la
transformación, especialmente para cultivos de dicotiledóneas, son
discos de hojas que se pueden transformar fácilmente y que tienen
una buena capacidad regenerativa (Horsch R.B. y col., (1985) Science
227, 1229-1231).
Mientras que la producción de trehalosa se puede
conseguir con el gen de la sintetasa de
trehalosa-fosfato expresable en la planta, como
único gen que modifica carbohidratos, la invención se ilustra
adicionalmente con ejemplos de genes de hebra complementaria
adicionales, expresables en la planta, que son capaces de efectuar
un incremento de la disponibilidad del sustrato para la sintetasa de
trehalosa-fosfato. Ejemplos específicos de tales
genes son los genes de hebra complementaria expresables en plantas
para SPS, procedentes de maíz y de patata y la AGPasa procedente de
patata. La regulación deficiente de las enzimas que modifican
carbohidratos empleando el acercamiento de la hebra complementaria,
no está limitada a los ejemplos específicos. Por ejemplo, los genes
de hebra complementaria expresables en la planta, parcialmente
complementarios, se pueden utilizar para inhibir la expresión de un
gen diana, en tanto que el gen de hebra complementaria expresable en
la planta produzca un transcrito que sea suficientemente
complementario con el transcrito del gen diana y suficientemente
largo para inhibir la expresión de dicho gen diana.
Es indiferente para la invención cómo se efectúa
la presencia de dos o más genes en la misma planta. Esto se puede
realizar, entre otros, según uno de los siguientes métodos:
(a) transformación de la envuelta vegetal con una
estructura artificial de genes múltiples que contiene más de un gen
para introducir,
(b) co-transformación de
diferentes estructuras artificiales en la misma envuelta vegetal
simultáneamente,
(c) rondas de transformación posteriores de la
misma planta con los genes que se van a introducir,
(d) cruzar dos plantas conteniendo cada una un
gen diferente que se va a introducir en la misma planta.
El campo de aplicación de la invención es tanto
la agricultura como la horticultura, por ejemplo, debido a las
propiedades mejoradas de las plantas modificadas como tales, así
como a cualquier forma industrial en donde la trehalosa se aplique o
se pueda aplicar. La trehalosa-fosfato y la
trehalosa se pueden utilizar como tales, por ejemplo, en forma
purificada o en mezclas por adición, o en forma de producto de
almacenamiento en partes de la planta. Las partes de la planta en
las que se cosecha (niveles incrementados de)
trehalosa-fosfato o de trehalosa, se pueden utilizar
como tales o procesarlas sin la necesidad de añadir trehalosa.
La trehalosa también se puede purificar a partir
de plantas o de partes de plantas que la producen y emplearlas
posteriormente en un procedimiento industrial. En la industria
alimentaria, la trehalosa se puede emplear añadiendo trehalosa a los
alimentos antes del secado. El secado de alimentos es un método
importante de conservación en la industria. La trehalosa parece ser
especialmente útil para conservar productos alimentarios mediante el
secado con aire convencional y para permitir una rápida
reconstitución después de la adición de agua a un producto de alta
calidad (Roser y col., julio 1991, Trends in Food Science and
Technology, págs. 166-169). Los beneficios incluyen
la retención de olores/fragancias naturales, sabor de producto
fresco y valor nutricional (proteínas y vitaminas). Se ha observado
que la trehalosa tiene la capacidad de estabilizar proteínas y
membranas y de formar un vidrio estable, químicamente inerte. La
baja actividad del agua de tales productos alimentarios secados de
este modo, evita reacciones químicas que podrían echar a perder el
alimento.
Los cultivos de campo tales como maíz, mandioca,
patata, remolacha y caña de azúcar se han utilizado desde hace mucho
tiempo como una fuente natural para la producción de carbohidratos a
granel (almidones y sacarosa). La producción de trehalosa en tales
cultivos, facilitada por la ingeniería genética de la ruta
biosintética de la trehalosa en estas especies vegetales, permitiría
la explotación de tales cultivos genéticamente transformados para la
producción de trehalosa.
Todas las referencias citadas en esta memoria
descriptiva son indicativas del nivel técnico al cual pertenece la
invención. Todas las publicaciones, patentes o de otro tipo,
mencionadas previamente o a continuación en esta memoria
descriptiva, se incorporan en esta memoria como referencia tal y
como si se hubiera incorporado cada una de ellas individualmente
como referencia.
Los Ejemplos citados a continuación sólo tienen
el fin de explicar y no pretenden de ningún modo limitar el alcance
de la invención.
Todos los procedimientos del ADN (aislamiento del
ADN a partir de E. coli, restricción, ligación,
transformación, etc.) se realizan de acuerdo con protocolos
convencionales (Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: a
laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH,
Nueva York).
En todos los ejemplos se emplea la cepa
DH5\alpha de E. coli K-12 para la
clonación. La cepa de Agrobacterium tumefaciens empleada para
los experimentos de transformación en plantas es MOG101 que es una
cepa auxiliar de tipo octopina no oncogénica, obtenida a partir de
LBA1010 (Koekman y col. (1982) Plasmid 7, 119) mediante sustitución
del ADN-T por un marcador de resistencia a
espectinomicina.
Un sistema binario de vectores (Hoekama A.,
Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. y Schilperoort, R.A. (1983) Nature
303, 179) se emplea para transferir estructuras artificiales génicas
en plantas de patata y de tabaco. El plásmido auxiliar que confiere
a Agrobacterium tumefaciens funciones virulentas, se obtiene
a partir del plásmido Ti de octopina, pTiB6. MOG101 es una cepa de
Agrobacterium tumefaciens portadora de un plásmido Ti no
oncogénico (Koekman y col. 1982, véase arriba), a partir del cual se
deleciona la región T completa y se sustituye por un marcador de
resistencia a espectinomicina bacteriana procedente del transposón
Tn1831 (Hooykaas y col., 1980 Plasmid 4,
64-75).
64-75).
El plásmido Ti pTiB6 contiene dos regiones T
adyacentes, TL (izquierda de T) y TR (derecha de T). Para obtener un
derivado que carezca de las regiones TL y TR, construimos un vector
intermedio pMOG579. El plásmido pMOG579 es un derivado de pBR322 que
contiene 2 fragmentos del plásmido Ti homólogos a los fragmentos
localizados a la izquierda y a la derecha fuera de las regiones T de
pTiB6 (sombreado en las figuras 5 y 6). Los 2 fragmentos están
separados en pMOG579 por un fragmento de 2,5 kb
BamHI-HindIII del transposón Tn1831 (Hooykaas y col.,
1980 Plasmid 4, 64-75) portador del marcador
de resistencia a la espectinomicina (Figura 6). El plásmido se
introduce en la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA1010
(C58-C9 (pTiB6) = una cepa C58 curada en la que se
introduce pTiB6 (Koekman y col., (1982), véase arriba), mediante
apareamiento triparental de E. coli, empleando HB101 8pRK2013
como un auxiliar. Los transconjugados se seleccionan por la
resistencia a rifampicina (20 mg/l) y espectinomicina (250 mg/l).
Una recombinación doble entre pMOG579 y pTiB6 da como resultado la
pérdida de resistencia a carbenicilina (el marcador de pBR322) y la
deleción de la región T completa. De 5000 transconjugados
resistentes a la espectinomicina, replicados extendidos en placas
sobre carbenicilina (100 mg/l), se encontraron 2 sensibles. El
análisis por transferencia de tipo Southern (no se muestra) mostraba
que un doble entrecruzamiento genético había delecionado la región T
completa. La cepa resultante se denomina MOG101. Esta cepa y su
construcción es análoga a la cepa GV2260 (Deblaere y col. 1985,
Nucl. Acid Res. 13, 4777-4788).
Una cepa auxiliar alternativa para MOG101 es, p.
ej., LBA4404; esta cepa también se puede utilizar de forma adecuada
para introducir un plásmido binario, tal como pMOG799 y una
posterior transformación de la planta. Otras cepas auxiliares
adecuadas están fácilmente a disposición.
El vector de expresión pMOG180 es un derivado de
pMOG18 (documento EP 0479359 A1, Ejemplo 2b) en el que el gen que
codifica GUS se retira y se pueden insertar otros genes entre el
líder AlMV RNA4 y el terminador 3' nos, como un fragmento
BamHI.
Para este fin, el fragmento
EcoRI/NcoI de pMOG18, que contiene las secuencias del
promotor 35S y del líder AlMV RNA4, se sintetiza empleando
tecnología de PCR con los conjuntos de cebadores 5'
GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA 3' Y 5' CAGCTATGACCATGATTACG
3', mutando de este modo el sitio NcoI en un sitio
BamHI. El vector pMOG18 se corta a continuación con
EcoRI y BamHI, después de lo cual el fragmento
EcoRI/BamHI sintetizado recientemente se puede ligar
entre estos sitios de restricción. Para evitar las mutaciones al
azar inducidas con la PCR en las secuencias del promotor, el
fragmento EcoRI/EcoRV en el fragmento
EcoRI/BamHI sintetizado con PCR, se reemplaza por las
secuencias de tipo silvestre de pMOG18. En el
EcoRV/BamHI corto se comprueban las mutaciones por
secuenciación. El vector de expresión resultante es el plásmido
pMOG180 (Figura 7).
Los vectores binarios se movilizan en
apareamientos triparentales con la cepa de E. coli HB101 que
contiene el plásmido pRK2013 (Ditta G., Stanfield, S., Corbin, D. y
Helinski, D.R. y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347) en
la cepa MOG101 de Agrobacterium tumefaciens y se emplean para
la transformación.
El tabaco se transforma por
co-cultivo del tejido vegetal con la cepa MOG101 de
Agrobacterium tumefaciens (Hoekema y col., 1983, Nature
303, 179-180) que contiene el vector binario
de interés tal y como se ha descrito. La transformación se lleva a
cabo empleando el co-cultivo de discos de hojas de
tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) tal y como
describen Horsch y col., 1985, Science 227,
1229-1231). Las plantas transgénicas se regeneran a
partir de los brotes que crecen en el medio de selección que
contiene kanamicina o higromicina, dependiendo del gen de
resistencia presente en el plásmido binario, echan raíces y se
transfieren al suelo.
La patata (Solanum tuberosum cv. Désiree)
se transforma con la cepa MOG101 de Agrobacterium tumefaciens
que contiene el vector binario de interés tal y como se ha descrito
(Hoekema A., Huisman, M.J., Molendijk, L., Van den Elzen, P.J.M. y
Cornelissen, B.J.C. (1989) Bio/technology 7, 273). El medio de
cultivo básico es MS30R30 que consta de medio MS (Murashige, T. y
Skoog, F. (1962) Physiol. Plan. 14, 473), suplementado con 30 g/l de
sacarosa, vitaminas R3 (Ooms y col. G., Burrell, M.M., Karp, A.,
Bevan, M. y Hille, J. (1987) Theor. Appl. Genet. 73, 744), ribósido
de zreatina 5 \muM (ZR) y ácido indolacético (IAA) 0,3 \muM. Los
medios se solidifican cuando es necesario con 0,7 g/l de agar
Daichin.
Tubérculos de Solanum tuberosum cv.
Désiree se pelan y se esterilizan en la superficie durante 20
minutos en solución de hipoclorito al 0,6% que contiene 0,1% de
Tween-20. Las patatas se lavan a fondo en grandes
volúmenes de agua esterilizada durante al menos 2 horas. Los discos
se cortan en rodajas de aproximadamente 2 mm de espesor, a partir de
cilindros de tejido del tubérculo preparados con un perforador de
corcho. Los discos se incuban durante 20 minutos en una suspensión
que consta del medio MS30R3 sin ZR ni IAA, que contiene
10^{6}-10^{7} bacterias/ml de MOG101 de
Agrobacterium que contienen el vector binario. Los discos se
transfieren en seco posteriormente sobre papel de filtro estéril y
se transfieren a medio MS30R3 sólido con ZR e IAA. Los discos se
transfieren a medio de nuevo aporte con 100 mg/l de cefotaxima y 50
mg/l de vancomicina, después de 2 días. Una semana después, los
discos se transfieren de nuevo al mismo medio, pero esta vez con 100
mg/l de kanamicina para seleccionar los brotes transgénicos. Después
de 4-8 semanas, los brotes que emergen de los discos
se escinden y se colocan sobre medio de enraizamiento (medio MS30R3
sin ZR ni IAA, pero con 100 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de
kanamicina). Los brotes se propagan de forma axénica por cortes del
meristemo y se transfieren al suelo después de crecer las raíces.
Cuando es adecuado, se emplean 10 mg/l de higromicina para la
selección en lugar de 100 mg/l de kanamicina.
La transformación de la patata cv. Kardal se
realizó esencialmente como con cv. Désiree, exceptuando las
siguientes modificaciones:
fitohormonas en el medio de cultivo básico: 3,5
mg/l de ribósido de zeatina; 0,03 mg/l de IAA (ácido indolacético).
La suspensión de Agrobacterium empleada en la transformación
contiene 10^{5} a 10^{6} bacterias por milímetro. La
concentración de kanamicina en el medio de enraizamiento era 50
mg/l.
La trehalosa se determina esencialmente tal y
como han descrito Hottiger y col. (Hottiger y col. (1987) J. Bact.
169, 5518). Tejido de tubérculo de patata se congela en nitrógeno
líquido, se alimenta con mano de mortero y mortero y se extrae
posteriormente durante 60 minutos a temperatura ambiente, en aprox.
3 volúmenes de ácido tricloroacético 500 mM. Después de centrifugar,
se extrae el sedimento del mismo modo una vez más. El material
sobrenadante combinado de las dos extracciones se somete a ensayo
para estudiar la presencia de material positivo a antrona (Spiro
R.G. (1966) Meth. Enzymol. 8, 3). La trehalosa se determina
cualitativamente por TLC. Los extractos se desionizan (Merck, Ion
exchanger V) y se cargan sobre placas de gel de sílice 60 (Merck).
Después de la cromatografía, las placas se revelan con
n-butanol-piridina-agua
(15:3:2, v/v). Las manchas se visualizan vaporizando 5 mg/ml de
vainilla en H_{2}SO_{4} concentrado y calentando a 130ºC. La
trehalosa disponible comercialmente (Sigma) se emplea como
patrón.
Alternativamente, la trehalosa se determinó
cuantitativamente mediante cromatografía de intercambio aniónico con
detección amperométrica de impulsos. Los extractos se prepararon
añadiendo 1 ml de agua hirviendo a 1 g de material congelado que se
había calentado posteriormente durante 15' a 100ºC. Las muestras (25
\mul) se analizaron sobre un cromatógrafo de líquidos de Dionex
DX-300, equipado con una columna de Dionex 35391
carbopac PA-1 de 4 x 250 mm y una precolumna de
Dionex 43096 carbopac PA-1 de 4 x 50 mm. La elución
era con NaOH 100 mM a 1 ml/min. Los azúcares se detectaron con un
detector amperométrico de impulsos (Dionex, PAD-2).
La trehalosa a disposición comercial (Sigma) se empleó como
patrón.
En todas las determinaciones, el material de
tubérculo no transgénico o el material de tabaco no transgénico se
empleó como testigo. El contenido en proteínas en todas las muestras
se determina tal y como ha descrito Bradford (Bradford (1976) Anal.
Biochem. 72, 248). Para los ensayos de extractos de tubérculo,
rodajas de patatas congeladas de aproximadamente 100 mg se
homogeneizaron en 100 \mul de HEPES 20 mM pH 7,4, se centrifugaron
(Eppendorf, 5 minutos a velocidad máxima). El material sobrenadante
se empleó para los ensayos de la actividad.
Actividad SPS - La actividad SPS se
determinó esencialmente tal y como han descrito Amir, J. y Preiss,
J. (1982). Plant Physiol. 69, 1027-1030). Cambiando
la composición de la mezcla de reacción, se pueden determinar dos
formas diferentes de actividad SPS; V_{máx} y V_{sel}. La mezcla
de reacción V_{máx} contenía UDP-glucosa 3,2 mM,
[^{14}C]-UDP-glucosa 81 \muM,
fructosa-6-fosfato 3,2 mM,
glucosa-6-fosfato 16 mM, Hepes 100
mM pH 7,4, MgCl_{2} 20 mM y EDTA 5 mM, en un volumen total de 50
\mul. En la mezcla de restricción V_{sel}, la concentración de
fructosa-6-fosfato y de
glucosa-6-fosfato se divide en dos y
se añade fosfato inorgánico 5 mM. Como testigo, se mide la actividad
de SPS en la mezcla de reacción de V_{máx} sin
fructosa-6-fosfato ni
glucosa-6-fosfato. La reacción se
lleva a cabo a temperatura ambiente durante 30' y se detiene
calentando la mezcla durante 5' a 95ºC. Los productos de la reacción
se tratan con fosfatasa alcalina y la
[^{14}C]-sacarosa resultante se separa de los
sustratos por cromatografía de extracción iónica. La cantidad de
sacarosa radiomarcada formada en la reacción se mide con un contador
de centelleo.
Actividad TPS - La actividad TPS se midió
de un modo similar al descrito para SPS. Después de la cromatografía
de intercambio iónico, las muestras contenían sacarosa
desfosforilada así como trehalosa. Para determinar qué proporción de
los productos formados es trehalosa, las muestras se separaron por
TLC del modo descrito. Los extractos se desionizaron (Merck, Ion
exchanger V) y se cargaron sobre placas de gel de sílice 60 (Merck).
Después de la cromatografía, las manchas que contenían
[^{14}C]-sacarosa y
[^{14}C]-trehalosa se separaron por rascado y se
midieron en un contador de centelleo.
Actividad AGPasa - La actividad AGPasa se
determina tal y como describen Müller-Röber y col.
(Müller-Röber B., Sonnewald, U. y Willmitzer, L.
(1992) EMBO J. 11, 1229). La producción de
glucosa-1-fosfato a partir de
ADP-glucosa se determina en un sistema de
glucosa-6-fosfato ligado a NAD. El
ensayo de reacción contenía HEPES 80 mM pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM,
ADP-glucosa 1 mM, NAD 0,6 mM,
glucosa-1,6-difosfato 10 \muM, DTT
3 mM, 0,02% de seroalbúmina bovina, 1 U de fosfoglucomutasa de
músculo de conejo (Sigma), 2,5 U de deshidrogenasa de
glucosa-6-fosfato ligada a NAD de
Leuconostoc mesenteroides y extracto de tubérculo. La
reacción se inicia añadiendo pirofosfato sódico hasta tener una
concentración final de 2 mM. La reducción con NAD se mide
espectrofotométricamente a 340 nm y 30ºC. Una unidad de actividad
AGPasa se define como nmol de
glucosa-1-fosfato generado por
minuto a 30ºC.
La sintetasa de trehalosa-fosfato
(TPS) de E. coli está codificada por el gen otsA
localizado en el operón otsBA. La posición y la dirección de
la transcripción de este operón en el cromosoma de E. coli
son conocidas (Kaasen, I., Falkenberg, P., Styrvold, O.B. y Ström,
A.R. (1992) J. Bact. 174, 889). El gen otsA está
localizado a 42' y según Kaasen y col. está confinado en un
fragmento de 18,8 kb presente en el clon genómico de EMBL4
denominado 7F11 del mapa de Kohara y col. (Kohara, Y., Akiyama, K. e
Isono, K. (1987) Cell 50, 495). El ADN se preparó a partir de un
lisado del clon 7F11 de lambda y se digirió con HindIII. El
fragmento de 2,9 kb de HindIII (el sitio "a mano derecha" de
HindIII, a 14,3 kb en el inserto, fue omitido en el mapa de Kohara y
col., como ya han indicado Kaasen y col.) se clona en pUC18
linealizado con HindIII. El inserto de 2,9 kb de HindIII del
plásmido resultante, denominado pMOG674, se secuencia. En la
secuencia se encontró parte del gen araH del operón de
transporte de arabinosa (Scripture, J.B., Voelker, C., Miller, S.,
O'Donnell, R.T., Polgar, L., Rade, J., Horazdovsky, B.F. y Hogg,
R.W. (1987) J. Mol. Biol. 197, 37), el gen otsB que codifica
TPP, tal y como localizaron Kaasen y col. y parte del gen
otsA que codifica TPS. El otsA se encontró que no
estaba confinado en el fragmento de 2,9 kb de HindIII tal y como
describen Kaasen y col. Para completar la secuencia, se aisló un
fragmento solapante BamHI/EcoRI y se secuenció parcialmente. La
secuencia completa que codifica TPS del gen otsA se muestra
en SEQ ID NO:2. La posición del gen otsA en el clon 7F11, con
los sitios de las enzimas de restricción empleados, se muestra en la
Figura 8. Un sitio HindIII adicional que no está presente en el mapa
publicado por Kohara y col., se encontró en el sitio "a mano
izquierda" del fragmento de 2,9 kb de HindIII.
El sitio de HindIII en pMOG180 está reemplazado
por un sitio de SstI, por clonación del dúplex de
oligonucleótidos:
\hskip2cmSstI
5' AGCTCACGAGCTCTCAGG 3'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:8)
3' GTGCTCGAGAGTCCTCGA 5'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:9)
en pMOG180 cortado con HindIII. El
vector resultante se denomina pMOG746. El dúplex de
oligonucleótidos:
se clona en el vector pMOG746
linealizado con BamHI. El vector con el dúplex de oligonucleótidos
con la orientación deseada (comprobada por digestión con enzimas de
restricción) se denomina pMOG747. El fragmento de HindIII de 2,9 kb
del plásmido pMOG674 se clona en pMOG747 linealizado con HindIII,
dando como resultado el vector pMOG748. Los fragmentos de
aproximadamente 2,4 kb EcoRV/SstI y de aproximadamente 3,5 kb
SstI/SmaI de pMOG748, se aíslan, se ligan y se transforman en E.
coli, delecionando de este modo el extremo 3' del fragmento de
2,9 kb de HindIII. El plásmido resultante se denomina pMOG749. El
extremo 5' del gen otsA se sintetiza mediante PCR empleando
los oligonucleótidos sintéticos TPS1 y TPS2 con pMOG749 como
molde.
TPS1 5' GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3'
\hskip0.7cm(SEQ ID NO:12)
TPS2 5' GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 3'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:13)
Por secuenciación se ha confirmado que el
fragmento de 0,4 kb de PCR tiene la secuencia correcta. El fragmento
de 1 kb BamHI/HindIII de pMGO749 se clona junto con el fragmento de
PCR de 0,4 kb XmaI/BamHI en pMOG747 linealizado con XmaI y HindIII.
En el plásmido resultante, digerido con HindIII y SstI, se clona el
dúplex de oligonucleótidos sintético TPS6/7 que codifica los tres
aminoácidos C-terminales de TPS.
En el plásmido resultante, digerido con HindIII y
SstI, se clona el fragmento de 0,25 kb HindIII/SstI del plásmido
pMOG749, que comprende el terminador procedente del gen de la
sintetasa de nopalina (NOS) de Agrobacterium tumefaciens,
dando como resultado el plásmido pMOG798. Este plásmido contiene el
gen otsA de E. coli con la orientación correcta bajo
el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV) con un potenciador doble (Guilley y col. (1982) Cell 30,
763), la secuencia líder RNA4 del virus del mosaico de la alfalfa
(AMV) (Brederode y col. (1980) Nucl. Acids Res. 8, 2213) y la
secuencia de terminación de la transcripción de la sintetasa de
nopalina de Agrobacterium tumefaciens. La casete de expresión
completa se clona como un fragmento de 2,5 kb EcoRI/SstI en el
vector binario pMOG23 linealizado con EcoRI y SstI. El vector
binario resultante, pMOG799 (Fig. 9) se emplea para transformar
patata y tabaco (una cepa de E. coli en la que se cosecha
pMOG799, se ha depositado en el "Central Bureau voor
Schimmelcultures", Phabagen collections, Padualaan 8, Utrecht,
Holanda, el 23 de agosto de 1993, con el número de depósito 430.93;
pMOG23 se ha depositado en el CBS el 29 de junio de 1990, con el
número de depósito CBS 102.90).
Los discos de hojas de tabaco se transforman con
el vector binario pMOG799 empleando Agrobacterium
tumefaciens. Se analizó una cantidad de 20 brotes transgénicos
independientes en busca de actividad sintetasa de
trehalosa-fosfato (TPS). En algunas plantas de
tabaco que crecían in vitro, se encontró que tenían raíces
extremadamente gruesas comparadas con las de plantas no
transformadas. El análisis de las raíces de estas plantas de tabaco
transgénicas muestra los elevados niveles de trehalosa en
comparación con las plantas testigo no transgénicas.
Los discos de tubérculos de patatas se
transforman con el vector binario pMOG799 empleando Agrobacterium
tumefaciens. Los brotes transgénicos se seleccionan con
kanamicina. Se analiza una cantidad de 20 brotes transgénicos
independientes en busca de actividad sintetasa de
trehalosa-fosfato (TPS). Algunos brotes que
contenían la enzima se hacen crecer hasta obtener plantas maduras.
El análisis de los tubérculos maduros de estas plantas de patata
transgénicas muestra elevados niveles de trehalosa, en comparación
con las plantas testigo no transgénicas. La línea de plantas
transgénicas MOG799.1 se propaga para un trabajo posterior.
Dos oligonucleótidos que se corresponden con la
secuencia del ADNc de la subunidad pequeña de la pirofosforilasa de
ADP-glucosa (AGPasaB) del tubérculo de patata cv.
Désiree (Müller-Röber, B., Kossmann, J., Hannah,
L.C., Willmitzer, L. y Sonnewald, U. (1990) Mol. Gen. Genet. 224,
136-146) se sintetizaron:
5' TCCCCATGGAATCAAAGCATCC 3'
\hskip0.55cm(SEQ ID NO:4)
5' GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:5)
Los oligonucleótidos se diseñan para contener
sitos de restricción adecuados (BamHI y NcoI, subrayados) en sus
extremos para permitir el ensamblaje en una casete de expresión con
una orientación de hebra complementaria, después de la digestión con
estas enzimas. Un fragmento de aproximadamente 1 kb se amplifica con
PCR con estos oligonucleótidos, empleando un ADN aislado a partir de
una genoteca de ADNc de patata cv. Désiree, preparado a partir de un
tejido de hoja de 2 meses (Clontech) como molde. Con la
secuenciación se observa que el fragmento es idéntico al de la
secuencia de la AGPasa B de patata cv. Désiree
(Müller-Röber, B., Kossmann, J., Hannah, L.C.,
Willmitzer, L. y Sonnewald, U. (1990) Mol. Gen. Genet. 224,
136-146). Después de la digestión con BamHI y NcoI,
el fragmento se clona en pMOG18 linealizado con BamHI y NcoI. A
partir del plásmido resultante, el fragmento de 1,85 kb EcoRI/BamHI
(que contiene el promotor 35S de CaMV, el líder RNA4 de AMV y el
fragmento de la AGPasa con una orientación de hebra complementaria),
así como el fragmento BamHI/HindIII que contiene el terminador del
gen de la sintetasa de nopalina (NOS) procedente de Agrobacterium
tumefaciens, se clonan en una ligación de tres direcciones en el
vector binario pMOG22, linealizado con EcoRI y HindIII. El vector
binario pMOG22 contiene un gen HPTII expresable en plantas para la
selección con higromicina en plantas transgénicas (pMOG22 se ha
depositado en el "Central Bureau voor Schimmelcultures", el 29
de enero de 1990, con el número de entrada 101.90). El vector
binario resultante pMOG664 (Fig. 4) se emplea para la transformación
de patatas.
Un grupo de oligonucleótidos complementarios a la
secuencia de ADNc de la sintetasa de
sacarosa-fosfato de maíz (SPS) (Worrell, A.C.,
Bruneau, J-M., Summerfalt, K., Boersig, M. y
Voelker, T.A. (1991) Plant Cell 3, 1121) se sintetizó. Sus
secuencias son las siguientes:
5' CTAGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTG 3'
\hskip0.9cm(SEQ ID NO:6)
5' CAGCATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC 3'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:7)
Estos oligonucleótidos se emplean para amplificar
con PCR un fragmento de ADN de 370 pb, empleando un ADN aislado de
una genoteca de ADNc de patata cv. Désiree, preparado a partir de un
tejido de hoja de 2 meses (Clontech) como molde. Con la
secuenciación de este fragmento se observa que es homólogo a la
secuencia de SPS de maíz (véase la Figura 3 y Worrell y col.
(1991)). El fragmento de PCR se emplea para escrutar una genoteca
ADNc de lambda gt10 de patata cv. Désiree, preparada con tejido de
hoja de 2 meses (Clontech). El inserto de un clon que se hibrida
positivamente se secuencia. En la secuencia del fragmento de ADN de
654 pb se observa un 65% de identidad con la parte correspondiente
de la secuencia de SPS de maíz (partiendo del nucleótido número 349
en la Figura 11 en Worrell y col. (1991)). El inserto de EcoRI de
este clon se clona en pMOG180 digerido con BamHI, en una ligación en
tres direcciones con el siguiente dúplex de oligonucleótidos
sintéticos.
5' GATCGTCAGATCTAGC 3'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:14)
3' CAGTCTAGATCGTTAA 5'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:15)
El plásmido que tiene el fragmento SPS con la
orientación de hebra complementaria en relación con el promotor 35S
de CaMV, se denomina pMOG787. El fragmento EcoRI/HindIII del
plásmido pMOG787 se clona en una ligación con tres direcciones con
un enlazador sintético:
5' AGCTTCCCCCCCG 3'
\hskip0.6cm(SEQ ID NO:16)
3' AGGGGGGGCTTAA 5'
\hskip0.5cm(SEQ ID NO:17)
en el vector binario pMOG22 linealizado con
EcoRI. El vector binario pMOG22 contiene un gen HPTII expresable en
plantas para la selección con higromicina en plantas transgénicas
(pMOG22 se ha depositado en el "Central Bureau voor
Schimmelcultures" el 29 de enero de 1990, con el número de
entrada 101.90). El vector binario resultante pMOG801 (Fig. 10) se
usa para la transformación de patata.
El fragmento EcoRI del plásmido pMOG801 que
contiene la casete de expresión SPS de hebra complementaria, se
clona en el vector binario pMOG664 (que contiene la casete de AGPasa
de hebra complementaria), linealizado con EcoRI. El vector binario
resultante se denomina pMOG802 (Fig. 11).
Discos de tubérculo de patata de la línea
MOG799.1 de plantas resistentes a la kanamicina que expresan TPS
(Ejemplo IX), se transforman con el vector binario pMOG664, que
contiene la casete de expresión de la AGPasa de hebra
complementaria. Brotes transgénicos, seleccionados con 10 mg/l de
higromicina, se analizan en busca de la presencia de las secuencias
de TPS y de AGPasa de hebra complementaria, mediante PCR. Las
plantas transgénicas que contienen ambas, se analizan en busca de
actividad TPS y AGPasa.
Mediante el análisis de tubérculos transgénicos
en busca de actividad AGPasa, se observa que tienen lugar
reducciones de los niveles de actividad en las líneas transgénicas
individuales, en comparación con los testigos no transgénicos.
Mediante transferencias de tipo Northern se observa que los niveles
de ARNm para la AGPasa están reducidos en las plantas transgénicas,
comparados con los de plantas testigo no transgénicas. Los niveles
de trehalosa en tubérculos de plantas de patata transgénicas, que
mostraban actividad TPS y tenían niveles reducidos de AGPasa,
muestran un incremento en comparación con los niveles encontrados en
tubérculos de plantas transgénicas de la línea MOG799.1.
Discos de tubérculos de patata de la línea
MOG799.1 de plantas resistentes a la kanamicina que expresan TPS
(Ejemplo IX), se transforman con el vector binario pMOG801, que
contiene la casete de expresión de SPS de hebra complementaria.
Brotes transgénicos, seleccionados con 10 mg/l de higromicina, se
analizan en busca de la presencia de las secuencias de TPS y de SPS
de hebra complementaria mediante PCR. Las plantas transgénicas que
contienen ambas, se analizan en busca de actividad TPS y SPS.
Mediante el análisis de tubérculos transgénicos
en busca de actividad SPS, se observa que tienen lugar reducciones
de los niveles de actividad en las líneas transgénicas individuales,
en comparación con los testigos no transgénicos. Mediante
transferencias de tipo Northern se observa que los niveles de ARNm
para SPS están reducidos en las plantas transgénicas, comparados con
los de plantas testigo no transgénicas. Los niveles de trehalosa en
tubérculos de plantas de patata transgénicas, que mostraban
actividad TPS y tenían niveles reducidos de SPS, muestran un
incremento en comparación con los niveles encontrados en tubérculos
de plantas transgénicas de la línea MOG799.1.
Discos de tubérculos de patata de la línea
MOG799.1 de plantas resistentes a la kanamicina, que expresan TPS
(Ejemplo IX), se transforman con el vector binario pMOG802, que
contiene casetes de expresión de SPS y de AGPasa de hebra
complementaria. Los brotes transgénicos, seleccionados con 10 mg/l
de higromicina, se analizan en busca de la presencia de las
secuencias de TPS, de AGPasa y de SPS de hebra complementaria,
mediante PCR. Las plantas transgénicas que contienen las tres
estructuras artificiales, se analizan en busca de actividad TPS,
AGPasa y SPS.
Mediante el análisis de tubérculos transgénicos
en busca de actividad AGPasa y SPS, se observa que tienen lugar
reducciones de los niveles de actividad para ambas enzimas, en
líneas transgénicas individuales, en comparación con los testigos no
transgénicos. Mediante transferencias de tipo Nothern, se observa
que los niveles de ARNm para la AGPasa y la SPS están reducidos en
las plantas transgénicas, comparados con los de plantas testigo no
transgénicas. Los niveles de trehalosa en tubérculos de plantas de
patata transgénicas, que mostraban actividad TPS y tenían niveles
reducidos de SPS, muestran un incremento en comparación con los
niveles encontrados en tubérculos de plantas transgénicas de la
línea MOG799.1.
pMOG22; Depósito número CBS 101.90 (página 23,
líneas 18-21; página 24, líneas
21-23)
pMOG23; Depósito número CBS 102.90 (página 22,
línea 10)
pMOG799; Depósito número CBS 430.93 (página 22,
línea 6)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MOGEN International N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Einsteinweg 97
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LEIDEN
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Zuid-Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP):NL-2333 CB
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (31).(71).258282
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (31).(71).221471
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN DE TREHALOSA EN PLANTAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: WO PCT/EP93/02290
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 370 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.500000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Solanum tuberosum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Désiree
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Hoja
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1446 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 7F11
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 41-42'
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19..1446
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "sintetasa de trehalosa-fosfato"
\hskip3cm/gen= "otsA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 476 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCCCTGGA ATCAAAGCAT CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTGGATCC AGGGCACGGC TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCATCGGC ATAGTGCCCA TGTATCACGT AAGGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTCACGAG CTCTCAGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCTCGAGA GTCCTCGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCCCCGG GGCATGCAAG CTTG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGCCCCGT ACGTTCGAAC CTAG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAAAATAC CCGGGGTGAT GAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATAATCGTG GATCCAGATA ATGTC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCGTCAGA TCTAGC
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCTAGAT CGTTAA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTCCCCC CCG
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGGGGGGCT TAA
\hfill13
Claims (11)
1. Un ácido nucleico que cuando se expresa en una
planta o en una célula vegetal se incrementa el contenido en
trehalosa de dicha planta o dicha célula vegetal, comprendiendo
dicho ácido nucleico: (a) una región de iniciación de la
transcripción que es funcional en dicha planta o en dicha célula
vegetal; (b) una secuencia de ADN que codifica una sintetasa de
trehalosa-fosfato de E. coli, representada
por la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:2 y,
opcionalmente, (c) una región de terminación de la transcripción que
es funcional en dicha planta o en dicha célula vegetal.
2. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
en donde dicha secuencia de ADN está representada por la secuencia
de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:2.
3. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
en donde dicha secuencia de ADN codifica una sintetasa de
trehalosa-fosfato de E. coli que comprende el
marco de lectura abierto del gen otsA de E. coli, tal y como
está presente en pMOG799, depositado ante el "Central Bureau voor
Schimmelcultures" con el número de orden 430.93.
4. Un ácido nucleico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho sitio de iniciación de la
transcripción comprende un ADN que codifica una región promotora del
ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor y la región de
terminación de la transcripción del gen de la sintetasa de nopalina
de Agrobacterium tumefaciens.
5. Un vector de clonación que comprende un ácido
nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en
donde dicho vector de clonación es un vector binario.
6. Un microorganismo que comprende un vector
según la reivindicación 5, en donde dicho microorganismo es del
género Agrobacterium.
7. Un método para obtener una planta con una
capacidad mejorada de producción de trehalosa, comprendiendo dicho
método las etapas de:
a) introducir en una célula receptora de una
planta, un ácido nucleico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 o un vector de clonación según la
reivindicación 5; y una secuencia de ADN que codifica un gen de un
marcador seleccionable que es funcional en dicha planta; y
b) generar una planta a partir de una célula
transformada bajo condiciones que permitan la selección por la
presencia del gen del marcador seleccionable.
8. Un genoma de ADN vegetal recombinante, que
contiene un ácido nucleico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
9. Una célula vegetal que tiene un genoma de ADN
vegetal recombinante, según la reivindicación 8.
10. Un cultivo celular vegetal que comprende una
célula vegetal, según la reivindicación 9.
11. Una planta que contiene una célula según la
reivindicación 9.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93201904 | 1993-06-30 | ||
| EP93201904 | 1993-06-30 | ||
| WOPCT/EP93/02290 | 1993-08-24 | ||
| PCT/EP1993/002290 WO1995006126A1 (en) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | Production of trehalose in plants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2229222T3 true ES2229222T3 (es) | 2005-04-16 |
Family
ID=26070055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94923710T Expired - Lifetime ES2229222T3 (es) | 1993-06-30 | 1994-06-30 | Produccion de trehalosa en plantas. |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0711353B1 (es) |
| JP (1) | JP3645260B2 (es) |
| KR (1) | KR960703436A (es) |
| CN (1) | CN1131315C (es) |
| AT (1) | ATE284446T1 (es) |
| AU (1) | AU697997B2 (es) |
| CA (1) | CA2166063C (es) |
| CZ (1) | CZ290830B6 (es) |
| DE (1) | DE69434173T2 (es) |
| ES (1) | ES2229222T3 (es) |
| FI (1) | FI956317A0 (es) |
| HU (1) | HU221124B1 (es) |
| NO (1) | NO955354L (es) |
| NZ (1) | NZ269548A (es) |
| PL (1) | PL179629B1 (es) |
| RO (1) | RO115650B1 (es) |
| SK (1) | SK166095A3 (es) |
| UA (1) | UA39958C2 (es) |
| WO (1) | WO1995001446A1 (es) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI943133A0 (fi) * | 1994-06-29 | 1994-06-29 | Alko Ab Oy | Transgena vaexter |
| JP3563104B2 (ja) * | 1994-03-23 | 2004-09-08 | 呉羽化学工業株式会社 | トレハロースホスホリラーゼおよびその製造法 |
| DE4444460A1 (de) * | 1994-11-29 | 1996-05-30 | Inst Genbiologische Forschung | Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen |
| IL116564A0 (en) * | 1995-01-04 | 1996-03-31 | Mogen Int | Process for producing trehalose in plants |
| EP0784095A3 (en) * | 1996-01-12 | 1997-12-29 | Mogen International N.V. | Enhanced accummulation of trehalose in plants |
| IN1997CH00924A (en) | 1996-05-03 | 2005-03-04 | Syngenta Mogen Bv | Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate |
| MX205414B (es) * | 1996-05-08 | 2001-12-07 | Univ Mexico Nacional Autonoma | Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla. |
| TW466116B (en) | 1997-03-04 | 2001-12-01 | Hayashibara Biochem Lab | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity, method for inhibiting the reduction of said activity, and composition containing said agent |
| EP1064365A2 (en) | 1998-03-11 | 2001-01-03 | Novartis AG | Expression of trehalose biosynthetic genes in plants |
| EP1002867A1 (en) * | 1998-10-15 | 2000-05-24 | K.U. Leuven Research & Development | Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment |
| BRPI0806995A2 (pt) * | 2007-02-08 | 2014-04-08 | Basf Plant Science Gmbh | Planta transgênica, semente, vetor de expressão, método para aumentar a resistência a nematódeo em uma planta |
| MX2010007319A (es) | 2008-01-03 | 2010-10-26 | Proterro Inc | Microorganismos fotosinteticos transgenicos y fotobioreactor. |
| CN103664333B (zh) * | 2013-11-12 | 2015-03-04 | 宿迁市设施园艺研究院 | 一种含有5-ala和海藻糖的组合物及其制备的叶面肥 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0451896B1 (en) * | 1990-03-28 | 1996-01-17 | Gist-Brocades N.V. | New yeast strains with enhanced trehalose content, process to obtain such yeasts and the use of these yeasts |
| US5422254A (en) * | 1992-02-14 | 1995-06-06 | Oy Alko Ab | Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase |
| EP0577915A1 (fr) * | 1992-07-09 | 1994-01-12 | N.V. Algist-Bruggeman | Souches de levures transformées de manière à posséder une résistance au stress et/ou un pouvoir fermentatif amélioré |
-
1994
- 1994-06-30 AT AT94923710T patent/ATE284446T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-30 EP EP94923710A patent/EP0711353B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-30 KR KR1019950706055A patent/KR960703436A/ko active IP Right Grant
- 1994-06-30 DE DE69434173T patent/DE69434173T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-30 CN CN94193026A patent/CN1131315C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-30 NZ NZ269548A patent/NZ269548A/en unknown
- 1994-06-30 SK SK1660-95A patent/SK166095A3/sk unknown
- 1994-06-30 WO PCT/EP1994/002167 patent/WO1995001446A1/en active IP Right Grant
- 1994-06-30 UA UA95125515A patent/UA39958C2/uk unknown
- 1994-06-30 CA CA002166063A patent/CA2166063C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-30 JP JP50328695A patent/JP3645260B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-30 CZ CZ19953449A patent/CZ290830B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-30 HU HU9503723V patent/HU221124B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-30 RO RO95-02295A patent/RO115650B1/ro unknown
- 1994-06-30 ES ES94923710T patent/ES2229222T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-30 AU AU73846/94A patent/AU697997B2/en not_active Ceased
-
1995
- 1995-12-22 PL PL94312303A patent/PL179629B1/pl unknown
- 1995-12-29 NO NO955354A patent/NO955354L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-12-29 FI FI956317A patent/FI956317A0/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI956317A (fi) | 1995-12-29 |
| WO1995001446A1 (en) | 1995-01-12 |
| EP0711353A1 (en) | 1996-05-15 |
| PL179629B1 (pl) | 2000-10-31 |
| RO115650B1 (ro) | 2000-04-28 |
| HUT74666A (en) | 1997-01-28 |
| AU7384694A (en) | 1995-01-24 |
| CN1131315C (zh) | 2003-12-17 |
| FI956317A0 (fi) | 1995-12-29 |
| NZ269548A (en) | 1997-09-22 |
| AU697997B2 (en) | 1998-10-22 |
| DE69434173T2 (de) | 2005-05-19 |
| KR960703436A (ko) | 1996-08-17 |
| JP3645260B2 (ja) | 2005-05-11 |
| HUP9503723D0 (en) | 1996-02-28 |
| JPH09501313A (ja) | 1997-02-10 |
| NO955354L (no) | 1996-01-02 |
| HU221124B1 (en) | 2002-08-28 |
| NO955354D0 (no) | 1995-12-29 |
| SK166095A3 (en) | 1997-01-08 |
| CZ344995A3 (en) | 1997-05-14 |
| DE69434173D1 (de) | 2005-01-13 |
| EP0711353B1 (en) | 2004-12-08 |
| CZ290830B6 (cs) | 2002-10-16 |
| PL312303A1 (en) | 1996-04-15 |
| CA2166063C (en) | 2008-04-22 |
| ATE284446T1 (de) | 2004-12-15 |
| UA39958C2 (uk) | 2001-07-16 |
| CA2166063A1 (en) | 1995-01-12 |
| CN1129015A (zh) | 1996-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4101304B2 (ja) | フルクトシルポリメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子 | |
| ES2229222T3 (es) | Produccion de trehalosa en plantas. | |
| US6881877B2 (en) | Enhanced accumulation of trehalose in plants | |
| JP3431177B2 (ja) | 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド | |
| WO1995006126A1 (en) | Production of trehalose in plants | |
| US5648249A (en) | Method of improving the quality of stored potatoes | |
| AU5872599A (en) | Isoforms of starch branching enzyme ii (sbe-iia and sbe-iib) from wheat | |
| HU221515B (en) | Transgenic plants with improved biomass production | |
| WO1996021030A1 (en) | Enhanced accumulation of trehalose in plants | |
| US9890387B2 (en) | Modification of fructan biosynthesis, increasing plant biomass, and enhancing productivity of biochemical pathways in a plant | |
| US5925804A (en) | Production of trehalose in plants | |
| AU720418B2 (en) | Modified plants and plant products | |
| US6653532B1 (en) | Methods for influencing the flowering behavior of plants by enhancing the saccharose-cleaving activity in the apical meristem | |
| CA2339346C (en) | Selection method using a galactose metabolising enzyme | |
| JP2004522420A (ja) | イソマルトを生産するトランスジェニック植物 | |
| Ohyama et al. | Introducing an antisense gene for a cell-wall-bound acid invertase to tomato (Lycopersicon esculentum) plants reduces carbohydrate content in leaves and fertility | |
| AU2015264827A1 (en) | Modification of fructan biosynthesis, increasing plant biomass, and enhancing productivity of biochemical pathways in a plant (2) | |
| AU754482B2 (en) | Enhanced accumulation of trehalose in plants |