PL179629B1 - mogacy podlegac ekspresji w roslinie, wektor do klonowania, mikroorganizm zawierajacy taki wektor, sposób otrzymywania rosliny lub komórki roslinnej, zrekombinowany roslinny genomowy DNA, komórka roslinna, kultura komórek roslinnych, sposób konserwowania rosliny lub czesci rosliny,sposób wytwarzania trehalozy i wyizolowana sekwencja DNA kodujaca aktywnosc syntazy trehalozofosforanowej PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

DNA kodujaca syntaze trehalozofosforanow a obejm ujaca otw arta ram ke od- czytu genu otsA z H coli przedstaw iona z SEK W NR ID 2 lub kw as nuklei- nowy, ja k obecny w pM O G 799 zdeponowanym w Centraal B ureau Voor Schim inelcuU ures pod nr 430 93 3 Sekw encja kw asu nukleinow ego zawierajaca gen m ogacy podlegac ekspresji w roslinie, która obejm uje w kolejnosci (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roslinnym , (b) sekwencje D N A kodujaca aktywnosc syntazy trehalozofosforanowej, która obejmuje otwarta ramke odczytu genu otsA z E coli przedstawiona w SEKW NR ID 2 lub kw as nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau V oorS chnnm elculturespodnr430 93, oraz ew entualnie (c) sekw encje term inacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w gospo- darzu roslinnym , oraz A gen m ogacy podlegac ekspresji w roslinie, zaw ierajacy w kolejnosci (a) region inicjacji transkrypcji, który je st funkcjonalny w tym gospoda- rzu roslinnym , (b) sekw encje D N A kodujaca RN A , która jest co najm niej czesciowo kom plem entarna do sekw encji RN A kodujacej enzym syntaze sacharozofos- foranow a (S PS ) naturalnie w ystepujacy w tym gospodarzu roslinnym , oraz ew entualnie (c) sekw encje term inacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w gospo- darzu roslinnym , lub B gen mogacy podlegac ekspresji w roslinach, zaw ie- rajacy w kolejnosci (a) region inicjacji transkrypcji, kto iy jcst funkcjonalny w tym gospoda- rzu roslinnym (b) sekw encje D NA kodujaca RNA, która jest co najmniej czesciowo kom plem entarna do sekwencji RNA kodujacej enzym pirofosforylaze ADP-glu- kozow a naturalnie wystepujacy w gospodarzu roslinnym, oraz ewentualnie c) sekw encje terminacji transkrypcji, która j est funkcjonalna w gospo- darzu roslinnym , lub zaiow no A i B FIGURA 1. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy, sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca gen mogący podlegać ekspresji w roślinie, wektor do klonowania, mikroorganizm zawierający taki wektor, sposób otrzymywania rośliny lub komórki roślinnej, zrekombinowany roślinny genomowy DNA, komórka roślinna, hodowla komórek roślinnych, sposób konserwowania rośliny lub części rośliny, sposób wytwarzania trehalozy i wyizolowana sekwencja DNA kodująca aktywność syntazy trehalozofosforanowej

Wynalazek dotyczy modyfikacji metabolizmu węglowodanów w roślinach przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA, zrekombinowanego DNA stosowanego w tym celu, jak również roślin i części roślin mających zmodyfikowany materiał genetyczny. Rośliny takie mogą być stosowane do otrzymywania z nich specyficznych związków węglowodanowych lub, alternatywnie, mogą być przetwarzane na produkty spożywcze, pasze lub ich składniki, mające udoskonalone własności wskutek obecności tych węglowodanów, np. w czasie przetwarzania.

Trehaloza jest to ogólna nazwa nadana D-glukozylo-D-glukozydom, która obejmuje disacharydy oparte na dwóch cząsteczkach glukozy połączonych wiązaniami α-, α, β i β, β-, Trehaloza, a w szczególności α-trehaloza (l-(O-a-D-glukopiranozylo)-l'-O-a-D-glukopiranoza) jest szeroko rozpowszechnionym, naturalnie występującym di sacharydem.

Chemiczna syntaza trehalozy jest trudna (wymaga grup osłaniających) i niewydajna. Obecnymi naturalnymi źródłami są grzyby i drożdże Saccharomyces cerevisiae, które mogąakumulować w postaci trehalozy ponad 10% suchej masy. Jednakże przeszkodą przy produkcji jest wysoka aktywność trehalozy, powodująca szybkie metabolizowanie trehalozy. Elbein A.D. (1974, Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem. 30,227- 256) daje przegląd występowania i metabolizmu disacharydu trehalozy, a w szczególności a, a-trehalozy, w żywych organizmach. Odnośnie roślin, obecność trehalozy opisano zarówno w niektórych gatunkach roślin niższych, jak i licznych gatunkach roślin wyższych należących do Spermathophyta; Echinops persicus, Carex brunescens, Fagus silvaticus. Jednakże wyniki te nigdy nie były w pełni potwierdzone przez innych autorów (np. Kendall i wsp., 1990, Phytochemistry 29, Nr 8, 2525-2528). Przykładowo Kendall i wsp., jak wyżej, odnosząc się do obecności trehalozy u Spermathophyta twierdzi, że jej obecność została w pełni potwierdzona jedynie w nasionach kminku (Carum carvi). Doniesienie o obecności trehalozy w słoneczniku zgłoszone przez Cegła i wsp., (1977, J. Am. Oil

179 629

Chem. Soc. 54,150 i następne) zostało zakwestionowane przez Kandler i wsp. (w The Biochemistry of Plants Tom 3, Carbohydrates: Structure and Function; wyd. Preiss J. str. 228. Academic Press) zgodnie z Kendall i wsp., 1990, jak wyżej. Doniesień o trehalozie w buku (Fagus sylvaticus) i w kapuście nie udało się potwierdzić innym autorem (Kendall i wsp., 1990, jak wyżej, oraz odnośniki tamże).

Pomimo obserwowanego rzadkiego występowania trehalozy w roślinach wyższych, stwierdzono obecność aktywności degradujących trehalozę w znacznej liczbie badanych rodzin roślin. Stabilną wysoką aktywność trehalozy znaleziono w trzech liniach pszenicy, sośnie i Salaginella lepidophylla. Stabilną niską aktywność znaleziono w lucernie, czarnej meksykańskiej słodkiej kukurydzy, białym świerku. Niestabilne średnie aktywności znaleziono w dwóch różnych zawiesinach ang. canola, ale prawdopodobnie nie można ich przypisywać specyficznej aktywności trehalazy. Dla jęczmienia, stokłosy, soi i czarnego świerku doniesiono o całkowitym braku aktywności trehalazy (Kendall 1990, jak wyżej).

Uważa się, że w organizmach zdolnych do jej wytwarzania, trehałoza powstaje na drodze biosyntezy jako 6-fosforan, podczas gdy formą magazynowąjest wolny cukier. Uważa się zatem, że organizmy, które wytwarzają i/lub gromadzą trehalozę zawierają fosfatazę zdolną do cięcia trehalozo-6-fosforanu (Elbein, 1974, jak wyżej). Mało wiadomo na temat obecności specyficznych fosfataz fosforanu trahalozy w roślinach wyższych.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO93/17093 Al, opublikowane 2 września 1993 r, opisuje wytwarzanie trehalozy w transgenicznych drożdżach zawierających geny drożdży, kodujące syntazę fosforanu trehalozy. Sugerowano, że trehałoza może być wytwarzana również w roślinach wyższych przy użyciu genów drożdżowych, jednakże nie ma aktualnego doniesienia o wytwarzaniu trehalozy w roślinach. Warto zauważyć, że WO93/17093 Al zostało opublikowane przed datą złożenia, ale po dacie pierwszeństwa bieżącego zgłoszenia.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania trehalozy w gospodarzu roślinnym dzięki obecności w tym gospodarzu roślinnym genu mogącego podlegać ekspresji w roślinach, który zawiera w kolejności:

(a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy fosforanu trehalozy, oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, którajest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym. W innym wykonaniu wynalazek obejmuje wytwarzanie trehalozy w gospodarzu roślinnym dzięki obecności w tym gospodarzu roślinnym genu mogącego podlegać ekspresji w roślinach, który zawiera w kolejności:

(d) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym;

(e) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy fosforanu trehalozy, oraz ewentualnie (f) sekwencję terminacj i transkrypcji, którajest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym oraz gen mogący podlegać ekspresji w roślinach zawierający w kolejności:

(a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującąRNA, którajest co najmniej częściowo komplementarna do sekwencji RNA kodującej syntazę fosforanu sacharozy (SPS), naturalnie występującej w tym gospodarzu roślinnym, oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, którajest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazek obejmuje wytwarzanie trehalozy w gospodarzu roślinnym dzięki obecności w tym gospodarzu roślinnym genu mogącego podlegać ekspresji w roślinach, który zawiera w kolejności:

(d) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (e) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy fosforanu trehalozy, oraz ewentualnie (f) sekwencję terminacji transkrypcji, którajest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym oraz gen mogący podlegać ekspresji w roślinach zawierający w kolejności' (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym,

179 629 (b) sekwencję DNA kodującą RNA, która jest co najmniej częściowo komplementarna do sekwencji RNA kodującej enzym fosforylazę ADP-glukozy, naturalnie występującej w tym gospodarzu roślinnym oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazek obejmuje wytwarzanie trehalozy w gospodarzu roślinnym dzięki obecności w tym gospodarzu roślinnym genu mogącego podlegać ekspresji w roślinach, który zawiera w kolejności:

(d) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (e) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy fosforanu trehalozy, oraz ewentualnie (f) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym, oraz gen mogący podlegać ekspresji w roślinach, zawierający w kolejności:

(a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą RNA, która jest co najmniej częściowo komplementarna do sekwencji RNA kodującej enzym syntazę fosforanu sacharozy, naturalnie występującej w tym gospodarzu roślinnym, oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym oraz gen mogący podlegać ekspresji w roślinach zawierający w kolejności:

(g) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (h) sekwencję DNA kodującąRNA, która jest co najmniej częściowo komplementarna do sekwencji RNA kodującej enzym fosforylazę ADP-glukozy, naturalnie występującej w tym gospodarzu roślinnym, oraz ewentualnie (i) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym

Wynalazek obejmuje również geny podlegające ekspresji w roślinach stosowane w procesie wytwarzania trehalozy, jak również kombinacje genów podlegających ekspresji w roślinach, a także plazmidy do klonowania, wektory do transformacji, mikroorganizmy, poszczególne komórki roślinne niosące geny ulegające ekspresji w roślinach według wynalazku.

Wynalazek dostarcza również zrekombinowany genomowy DNA roślin, zawierający gen dla syntazy fosforanu trehalozy mogący podlegać ekspresji w roślinach, który nie jest w nich naturalnie obecny. Wynalazek obejmuje również zrekombinowany roślinny genomowy DNA, zawierający gen dla syntazy fosforanu trehalozy mogący podlegać ekspresji w roślinach, który nie jest w nich naturalnie obecny i dodatkowo gen mogący podlegać ekspresji w roślinach, zdolny do hamowania biosyntezy SPS i/oraz gen mogący podlegać ekspresji w roślinach, zdolny do hamowania biosyntezy AGPazy.

Wynalazek dotyczy także sposobu otrzymywania rośliny zdolnej do wytwarzania trehalozy, obejmującego następujące etapy:

(1) wprowadzenie do komórki gospodarza roślinnego genu mogącego podlegać ekspresji w roślinach, który zawiera w kolejności:

(a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy fosforanu trehalozy, (c) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w gospodarzu roślinnym, oraz genu mogącemu podlegać ekspresji w roślinach, który zawiera w kolejności:

(d) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (e) sekwencję DNA kodującą gen dla markera selekcyjnego, funkcjonalnego w tym gospodarzu roślinnym oraz ewentualnie (f) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w tym gospodarzu roślinnym, (2) wytworzenie rośliny ze stransformowanej komórki w warunkach umożliwiających selekcję na obecność genu dla markera selekcyjnego.

Wynalazek obejmuje również rośliny, które wytwarzają (mają zwiększony poziom) trehalozę jako rezultat modyfikacji genetycznej.

Dalej wynalazek obejmuje rośliny mające zrekombinowany DNA genomowy, zawierający gen mogący podlegać ekspresji w roślinach według wynalazku.

179 629

Wynalazek obejmuje również rośliny mające zrekombinowany DNA genomowy, zawieraj ący gen mogący podlegać ekspresji w roślinach według wynalazku, które to rośliny wytwarzają trehalozę.

Wynalazek obejmuje również rośliny mające zrekombinowany DNA genomowy według wynalazku i wykazujące zwiększoną odporność na wysychanie.

Wynalazek rozciąga się również na część roślin według wynalazku, takie jak komórki lub protoplasty lub ich hodowle, kwiaty, owoce, liście, pyłek, korzenie (włączając w to hodowle korzeni włosowatych), nasiona, łodygi, bulwy (włączając w to tak zwane mikrobulwy) i temu podobne.

Wynalazek rozciąga się również na sposób przechowywania roślin lub części roślin w obecności trehalozy, obejmujący następujące etapy:

(1) hodowanie rośliny lub części rośliny według wynalazku, która wytwarza trehalozę, (2) zbieranie rośliny lub części rośliny, które zawierają trehalozę, oraz (3) suszenie roślin lub części roślin powietrzem lub, alternatywnie (4) suszenie zamrożonych roślin lub części roślin.

Wynalazek rozciąga się również na rośliny lub części rośliny, które były przechowywane sposobem według wynalazku.

Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania trehalozy obejmujący następujące etapy:

(1) hodowanie rośliny, która za sprawązrekombinowanego roślinnego genomowego DNA jest zdolna do wytwarzania (ma podwyższony poziom) trehalozy, (2) zbieranie takiej rośliny lub części rośliny, (3) izolowanie trehalozy z takiej rośliny lub takich części rośliny.

Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania trehalozy obejmujący następujące etapy:

(1) hodowanie kultur komórek roślinnych, które za sprawą zrekombinowanego roślinnego genomowego DNA są zdolne do wytwarzania (maja podwyższony poziom) trehalozy, (2) izolowanie trehalozy z takiej kultury komórek roślinnych.

Dalej wynalazek obejmuje izolowanie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej syntazę fosforanu trehalozy. Preferowana izolowana sekwencja kwasu nukleinowego jest sekwencją otrzymana z E. coh, a jeszcze bardziej preferowana jest izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, przedstawiona jako sekwencja SEK NR ID.: 2. Inne preferowane wykonanie wynalazku obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą sekwencję aminokwasów SEK. NRID.: 3.

Następujące figury dalej ilustrują wynalazek

Opis figur

Figura 1. Przedstawia schematycznie części dróg biosyntezy cukru i skrobi w podziemnych tkankach roślin. Figura pokazuje, że węglowodany wytwarzane w wyniku fotosyntezy w liściu są transportowane przez floem w postaci sacharozy. Po wejściu do podziemnych tkanek są uwalniane poprzez związaną z błoną inwertazę, z wytworzeniem monocukrów glukozy i fruktozy. W kilku enzymatycznych etapach monocukry te są przekształcane w skrobię i/lub sacharozę, jak schematycznie tutaj pokazano. Uważa się, że metabolity glukozy G6P i UDPG są używane jako substraty dla enzymu TPS obecnego w roślinie dzięki wprowadzeniu do rośliny genu otsA mogącego podlegać ekspresji w roślinach. Figura pokazuje w jaki sposób ilość UDPG i G6P, dostępnych jako substrat, zwiększa się wraz z obniżeniem poziomu enzymów SPS i AGPazy. Ich hamowanie jest zaznaczone krzyżykiem.

Figura 2. Schematyczna mapa klonu 7F11 EMBL4 z Kohara i wsp., (1987), zawierającego operon otsBA z E. coli. Wstawka o wielkości 18.8 kb jest zacieniowana. Zaznaczono miejsca restrykcyjne dla enzymów EcoRV i Hindlll użytych do klonowania genu otsA, a także ich odległość w kb w stosunku do lewego końca wstawki. Zaznaczono geny otsA i B, strzałki pokazują kierunek transkrypcji. (Patrz Fig. 8, mapa powiększona).

Figura 3. Sekwencja sklonowanego cDNAdla SPS z ziemniaka. Podkreślone: sekwencje cDNA dla SPS z kukurydzy, użyto jako oligonukleotydy w reakcji amplifikacji PCR.

Figura 4. Schematyczne przedstawienie binarnego wektora pMOG664.

179 629

Figura 5. Mapa restrykcyjna części pTiB6, pokazująca dwa fragmenty sklonowane w pMOG579.

Figura 6. Schematyczne przedstawienie pMOG579, użytego do konstrukcji plazmidu pomocniczego pozbawionego regionu T w szczepie Agrobacterium M0G1O1.

Figura 7. Schematyczne przedstawienie wektora ekspresyjnego pMOG180.

Figura8. Powiększona mapa klonu 7F11 EMBL4 z Kohara i wsp., (1987), zawierającego operon otsBA z E. coli. Zaznaczono lokalizację otwartej ramki odczytu (ORF) TPS. (*: miejsca Hidlll nie pokazane na mapie Kohara i wsp., jak wyżej).

Figura 9. Schematyczne przedstawienie binarnego wektora pMOG799.

Figura 10. Schematyczne przedstawienie binarnego wektora pMOG801.

Figura 11. Schematyczne przedstawienie binarnego wektora pMOG802.

Dokładny opis wynalazku

W korzystnym wykonaniu wynalazek obejmuje ziemniaki zdolne do wytwarzania trehalozy w bulwach dzięki obecności w takich zmieniakach genu mogącego podlegać ekspresji w roślinach, zawierającego w kolejności:

(a) region inicjacji transkrypcji pochodzący z RNA 35S CaMV poprzedzony podwójnym elementem wzmacniającym (ang. enhancer), (b) sekwencję DNA kodującą syntazę fosforanu trehalozy, która stanowi region kodujący genu otsA, znajdującego się w operonie otsBA E. coli, (c) sekwencję terminatora transkrypcji pochodzącą z genu dla syntazy nopaliny (nos) Agrobacterium. Bulwy transgenicznych roślin zawierających gen TPS mogący podlegać ekspresji w roślinach wytwarzały trehalozę, podczas gdy rośliny kontrolne bez tego genu nie wytwarzały jej. Fosforan trehalozy, który jest wytwarzany w transgenicznych bulwach jest w widoczny sposób przekształcany w trehalozę. Widać, że nie trzeba dostarczać aktywności fosfatazy trehalozy, ponieważ wydaj e się ona być obecna w ziemniakach.

Na figurze 1 zilustrowano również sposób zwiększenia dostępności substratu dla TPS. W tym celu dwa geny wpływające na dostępność glukozo-6 fosforanu (g6P) i UDPG, geny dla SP6 i AGPazy, sklonowano w postaci genów antysensownych pod kontrolą promotora CaMV 35S, umożliwiającego ekspresję w gospodarzu roślinnym. Po wprowadzeniu do gospodarza roślinnego, zawierającego gen TPS według wynalazku mogący podlegać ekspresji w roślinach, zwiększa się dostępność substratu dla TPS, a co za tym idzie syntaza trehalozy. Będzie od razu oczywiste dla biegłych, że również inne antysensowne geny mogą być używane do blokowania syntazy sacharozy lub skrobi celem zwiększenia dostępności substratu.

Jakkolwiek wynalazek jest szczegółowo opisany dla ziemniaków, które wyrażają zdolny do ekspresji w roślinach gen dla syntazy fosforanu trehalozy z E. coli pod kontrolą promotora 35S z CaMV jako regionu inicjacji transkrypcji, będzie jasne dla biegłych w tej dziedzinie, że inne rośliny nasienne są równie odpowiednie jako gospodarze do wytwarzania trehalozy. Preferowanymi gospodarzami roślinnymi wśród Spermatophyta są Angiospermae, a szczególnie Dicotyledoneae, obejmujące między innymi Solanaceae jako reprezentatywną rodzinę i Monocotyledoneae, obejmujące między innymi Graminae jako reprezentatywną rodzinę. Odpowiedni gospodarze roślinni, w kontekście niniejszego wynalazku, obejmują rośliny (a także części i komórki tych roślin) i ich potomstwo, które zostało zmodyfikowane genetycznie przy użyciu technik rekombinowania DNA dla zwiększenia wytwarzania trehalozy w żądanej roślinie lub organie rośliny; rośliny te mogą być użyte bezpośrednio (np. gatunki roślin wytwarzające jadalne części) lub po oczyszczeniu trehalozy z takich gospodarzy (którymi mogą być jadalni i niejadalni gospodarze roślinni). Rośliny uprawne z częściami jadalnymi według wynalazku obejmują rośliny, które mają kwiaty, takie jak kalafior (Brassica oleracea), karczochy (Cynara scolymus), owoce takie jak jabłka (Malus, np. domesticus), banany (Musa, np. acuminata), jagody (takie jak porzeczki, Ribes np. rubrum), wiśnie (takie jak czereśnie Prunus np. avium), ogórki (Cucumis np. sativus), winorośl (Vitis np. vinifera), cytryny (Citrus limon), melony (Cucumis melo), orzechy (takie jak orzech włoski, Juglans np. regia; orzeszki ziemne, Arachis hypogeae), pomarańcze (Citrus np. maxima), brzoskwinie (Prunus np. persica), gruszki (Pyra, np. communis), pieprz

179 629 (Solanum np. capsicum), śliwki (Prunus np. domestica), truskawki (Fragaria np. moschata), pomidory (Lycopersicon np. Esculentum); liście, takie jak lucerna (Medicago sativa), kapusta (takie jak Brassica oleracea), cykoria (Cichoreum np. endivia), por (Allium porrum), sałata (Lactuca sativa), szpinak (Spinacia oleraceae), tytoń (Nicotiana tabacum); korzenie, takie jak ararut (Maranta arundinacea), burak (Beta vulgaris), marchew (Daucus carota), maniok (Manihot esculenta), rzepa (Brassica rapa), rzodkiewka (Raphanus sativus), słodki ziemniak (Dioscorea esculenta), batat (Ipomoea batatas); nasiona, takie jak fasola (Phaseolus vulgaris), groch (Pisum sativum), soja (Glycin max), pszenica (Triticum aestivum), jęczmień (Hordeum vulgare), kukurydza (Zea mays), ryż (Oryza sativa); bulwy, takie jak kalarepa (Brassica oleraceae), ziemniaki (Solanum tuberosum) i temu podobne. Jadalne części mogąbyć konserwowane poprzez suszenie w obecności podwyższonego poziomu trehalozy, wytwarzanej w nich na skutek obecności genu dla syntazy trehalozy mogącego podlegać ekspresji w roślinach. Może być korzystne wytwarzanie podwyższonego poziomu trehalozy poprzez umieszczenie DNA kodującego aktywność TPS pod kontrolą promotora specyficznego dla organu lub tkanki roślinnej, wybór którego może być z łatwością dokonany przez biegłych w tej dziedzinie.

Można użyć dowolnego genu dla syntazy fosforanu trehalozy pod kontrolą elementów regulacyjnych niezbędnych dla ekspresji DNA w komórkach roślin, o ile jest on zdolny do wytwarzania aktywnej syntazy fosforanu trehalozy. Sekwencja kwasu nukleinowego przedstawiona jako SEK NR ID: 2, a w rzeczywistości dowolna otwarta ramka odczytu kodująca syntazę fosforanu trehalozy według wynalazku, może być zmieniona bez konieczności zmiany sekwencji aminokwasów zakodowanego białka. Przyczyną tego faktu jest degeneracja kodu genetycznego. Zatem otwarta ramka odczytu, kodująca syntazę fosforanu trehalozy może być dostosowana do częstości użycia poszczególnych kodonów w wybranym gospodarzu roślinnym.

Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, przedstawiona jako SEK NR ID: 2 może być również użyta do wykrywania syntaz fosforanu trehalozy w innych organizmach, a następnie ich izolowania poprzez hybrydyzację DNA z innych źródeł z fragmentami RNA lub DNA otrzymanymi z genu E. coli. Korzystne jest, jeżeli takie fragmenty DNA sąwyszukiwane poprzez hybrydyzację w ostrych warunkach (takich jak temperatura i siła jonowa mieszaniny hybrydyzacyjnej). To, czy warunki są ostre czy nie, zależy od rodzaju hybrydyzacji, czyli DNA:DNA, DNA:RNA, RŃA:RNA, jak również długości najkrótszego hybrydyzującego fragmentu. Biegli w tej dziedzinie będą od razu potrafili ustalić warunki ostrej hybrydyzacji.

Źródła izolowania syntazy fosforanu trehalozy obejmują mikroorganizmy (np. bakterie, drożdże, grzyby), rośliny, zwierzęta i temu podobne. Izolowane sekwencje DNA kodujące syntazę fosforanu trehalozy z innych źródeł mogąbyć użyte w taki sam sposób, jak przy wytwarzaniu trehalozy według wynalazku.

Wynalazek obejmuje również sekwencje kwasu nukleinowego, ^trzymane poprzez modyfikacje sekwencji kwasu nukleinowego, przedstawioną]ako SEKNR ID- 2, przez wprowadzenie mutacji do jednego lub więcej kodonów, w rezultacie czego następuje zmiana aminokwasów w zakodowanym białku, o ile mutacja sekwencji aminokwasowej nie zakłóca całkowicie aktywności syntazy fosforanu trehalozy.

Zasadniczo dowolny gospodarz roślinny jest odpowiedni do użycia w kombinacji z genem dla syntazy fosforanu trehalozy podlegającym ekspresji w roślinach. Z chwilą gdy geny dla trehalozy z innych źródeł stająsię dostępne, mogąbyć one użyte do otrzymania kombinacji genu dla syntazy fosforanu trehalozy mogącej podlegać ekspresji w roślinach, w podobny sposób jak tu opisano.

Inhibicja endogennych genów celem zwiększenia dostępności substratu dla syntazy fosforanu trehalozy, jak pokazano tu na przykładzie inhibicji endogennego genu dla syntazy fosforanu sacharozy i genu dla pirofosforylazy ADP-glukozy, może być przeprowadzona różnymi sposobami, których wybór nie jest krytyczny dla wynalazku. Korzystne jest, jeżeli inhibicja genu jest uzyskiwana poprzez tak zwane “podejście antysensowne”. W tym przypadku fragment DNA podlega ekspresji z wytworzeniem RNA, który jest przynajmniej częściowo komplementarny do RNA, kodującego aktywność enzymatyczną którą ma być blokowana (np. AGP-aza lub SPS,

179 629 w przykładach). Korzystne jest użycie homologicznych antysensownych genów, ponieważ są one bardziej wydajne niż geny heterologiczne. Izolacja anty sensownego genu SPS z ziemniaka przy użyciu jako sondy sekwencji genu SPS z kukurydzy służy jako przykład wykonalności takiej strategii. Nie ma to oznaczać, że przy realizacji wynalazku wymagane jest użycie homologicznych antysensownych fragmentów. Alternatywnym sposobem blokowania syntazy niepożądanych aktywności enzymatycznych jest wprowadzenie do genomu gospodarza roślinnego dodatkowej kopii endogennego genu obecnego w gospodarzu roślinnym. Obserwuje się często, że ta dodatkowa kopia genu wycisza endogenny gen: efekt ten jest określony w literaturze jako efekt kosupresyjny lub kosupresja.

W zasadzie zarówno rośliny dwuliścienne jaki jednoliścienne mogąpodlegać transformacji, mogą być modyfikowane poprzez wprowadzenie do komórki biorcy genu mogącego ulegać ekspresji w roślinach według wynalazku i wyhodowanie nowej rośliny, niosącej i wyrażającej gen mogący podlegać ekspresji w roślinach. Preferowanymi roślinami według wynalazku są takie, które majązdolność przekształcania fosforanu trehalozy w trehalozę i które nie zawierająłub zawierają małą aktywność degradującą trehalozę. Będzie zrozumiałym, że rośliny pozbawione zdolności przekształcania fosforanu trehalozy w trehalozę są również objęte niniejszym wynalazkiem. Rośliny te mogą być dalej modyfikowane poprzez wprowadzenie dodatkowych genów, które kodują fosfatazy zdolne do przekształcania fosforanu trehalozy w trehalozę. W zasadzie rośliny, które zawierają trehalozy mogą być również brane pod uwagę, ponieważ rośliny te mogą być uczynione odpowiednimi do wytwarzania trehalozy poprzez zahamowanie aktywności takich enzymów, na przykład poprzez zahamowanie ekspresji genów kodujących takie enzymy przy użyciu podejścia z anty sensownymi genami.

Sposób wprowadzania do komórki gospodarza roślinnego genu dla syntazy fosforanu trehalozy mogącego podlegać ekspresji w roślinach nie jest najistotniejszy, o ile gen jest stabilnie włączany do genomu tej komórki roślinnej. Poza użyciem szczepów rodzaju Agrobacterium, dostępne sąróżne inne techniki dla wprowadzania DNA do komórek roślinnych, takie jak transformacja protoplastów przy użyciu metody z wapniem/glikolem polietylenowym, elektroporacja i mikroiniekcja lub bombardowanie (opłaszczonymi) cząstkami (Potrykus, 1990, Bio/Technol. 8, 535-542).

Poza tymi, tak zwanymi bezpośrednimi metodami transformowania DNA, szeroko dostępne są systemy transformacji oparte o wektory, takie jak wektory wirusowe (np. z Wirusa Mozaiki Kalafiora (CaMV) i wektory bakteryjne (np. z rodzaju Agrobacterium) (Potrykus, 1990, Bio/Technol. 8, 535-542). Po selekcji i/lub wyszukiwaniu, transformowane protoplasty, komórki lub części roślin mogą być regenerowane do całych roślin, przy użyciu znanych w tej dziedzinie sposobów (Horsch i wsp., 1985, Science 225, 1229-1231).

Wykazano, że rośliny jednoliścienne mogąpodlegać transformacji i że ze stransformowanych komórek można zregenerować płodne transgeniczne rośliny. Rozwój zdolnych do rozmnażania się systemów hodowli tkankowych dla tych roślin uprawnych, łącznie z wydajnymi metodami wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych ułatwiło transformację. Obecnie preferowanymi sposobami transformacji jednoliściennych jest bombardowanie eksplantatów lub zawiesiny komórek mikropociskami i bezpośrednie pobieranie DNA lub elektroporacja (Shimamoto i wsp., 1989, Naturę 338,274-276). Transgeniczne rośliny kukurydzy otrzymano poprzez wprowadzenie genu bar ze Streptomyces hygroscopicus, kodującego acetylotransferazę fosfoinotricyny (enzym, który inaktywuje herbicyd fosfomotricynę) do komórek zarodkowych w zawiesinie hodowli kukurydzy poprzez bombardowanie mikropociskami (Gordon-Kamm, 1990, Plant Celi, 2, 603-618). Opisano wprowadzenie materiału genetycznego do protoplastów z aleuronu innych jednoliściennych roślin uprawnych, takich jak pszenica i jęczmień (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13,21 -30). Rośliny pszenicy regenerowano z zawiesiny hodowli zarodkowej poprzez selekcjęjedynie starszych, zwartych i brodawkowych tkanek kallusa dla utworzenia zawiesiny embrionalnej hodowli (Vasil, 1990 Bio/Technol. 8,429-434). W kombinacji z systemem transformacji tych roślin uprawnych możliwe staje się zastosowanie niniejszego

179 629 wynalazku do roślin jednoliściennych. Sposoby te mogądać również stosowane do transformacji i regeneracji roślin dwuliściennych.

Rośliny jednoliścienne, włączając w to ważne komercyjne rośliny uprawne, takie j ak kukurydza, są podatne na przenoszenie DNA przez szczepy Agrobacterium (patent europejski 159 418 BI; GouldD., HasegawaO.,UlianE. C., PetersonG., SmithR. H., (1991)PlantPhysioL 95, 426-434).

Co się tyczy wyboru gospodarza roślinnego, korzystny jest wybór gatunków roślin z małą lub brakiem aktywności degradującej trehalozę. Jednakże rośliny, które wykazują aktywność trehalozy nie mogą być wykluczone spośród gospodarzy roślinnych odpowiednich do wytwarzania trehalozy, jakkolwiek może być koniecznym uzyskanie inhibicji aktywności trehalazy, o ile uniemożliwia to całkowicie nagromadzanie się trehalazy. Hamowanie takie można uzyskać przy zastosowaniu podejścia z antysensownymi genami, dobrze znanego w tej dziedzinie i zilustrowanego w tym opisie dla innych celów.

Powinno być również zrozumiałym, że wynalazek nie ogranicza się do użycia promotora 35S CaMV jako regionu inicjacji transkrypcji. Odpowiednie sekwencje DNA dla kontroli ekspresji genów podlegających ekspresji w roślinach, włączając w to geny markerowe, takie, jak regiony inicjacji transkrypcji, wzmacniacze, sekwencje liderowe nie podlegające transkrypcji i temu podobne, mogą pochodzić z dowolnego genu, który jest wyrażany w komórkach roślinnych, takiego jak endogenne geny roślinne, geny naturalnie wyrażane w komórkach roślinnych, takie jak te znajdujące się w T-DNA typu dzikiego z Agrobacterium tumefaciens, geny wirusów roślinnych, jak również inne eukariotyczne geny, które zawierają region inicjacji transkrypcji, który odpowiada sekwencji największej zgodności dla eukariotycznej inicjacji transkrypcji. Dotyczy to również promotorów hybrydowych, będących połączeniem funkcjonalnych części różnych promotorów lub ich syntetycznych ekwiwalentów. Poza promotorami konstytutywnymi do kontroli ekspresji genów podlegających ekspresji w roślinach według wynalazku mogą być użyte promotory podlegającymi indukcji lub promotory, których wzór ekspresji jest regulowany w inny sposób, np. specyficzny dla fazy rozwoju lub typu komórek, o ile podlegają one ekspresji w częściach rośliny, które zawierają substrat dla TPS.

Celem wybrania lub wyszukania stransformowanych komórek, korzystnie jest użyć genu markerowego połączonego z genem mogącym podlegać ekspresji w roślinach według wynalazku, który ma być przeniesiony do komórki roślinnej. Wybór odpowiedniego genu markerowego do transformacji roślin jest w zasięgu umiejętności przeciętnego pracownika w tej dziedzinie; przykładami niektórych rutynowo stosowanych genów markerowych sągeny dla fosfotransferazy neomycyny, powodujące oporność na kanamycynę (EP-B 131 623), gen dla transferazy-Sglutationu z wątroby szczura, powodujący oporność na herbicydy będące pochodnymi glutationu (EP-A 256 223), syntaza glutaminy powodująca w przypadku nadprodukcji oporność na inhibitory syntetazy glutaminowej, takie jak fosfoinotrycyna (WO87/05327), gen dla transferazy acetylowej ze Streptomyces viridochromogenes powodujący oporność na czynnik selekcyjny fosfoinotrycynę (EP-A 275 957), gen kodujący syntazę 3-fosforanu 5-enoloszikimowego (EPSPS) powodującego tolemacje na N-fosfonometyloglicynę, gen bar powodujący oporność na Bialaphos (np. WO91/02071) i temu podobne. Konkretny wybór markera nie jest najważniejszy, o ile jest on funkcjonalny (to znaczy selektywny) w kombinacji z wybranymi komórkami roślinnymi.

Gen markerowy i gen będący przedmiotem zainteresowania nie muszą być połączone, ponieważ kotransformacja niepołączonych ze sobą genów (patent USA, 4,399,216) jest również wydajnym procesem przy transformacji roślin.

Preferowanym materiałem roślinnym do transformacji, szczególnie dla dwuliściennych roślin uprawnych są krążki liściowe, które dają się łatwo transformować i maja dużą zdolność do regeneracji (Horsch R.B. i wsp., (1985) Science 227, 1229-1231).

Zważywszy, ze wytwarzanie trehalozy może być osiągnięte za pośrednictwem genu dla syntazy fosforanu trehalozy jako jedynego genu modyfikującego węglowodany, wynalazek jest dalej zilustrowany przykładami innych antysensownych genów mogących ulegać ekspresji w ro

179 629 ślinach, które mają zdolność zwiększenia dostępności substratu dla syntazy fosforanu trehalozy. Konkretnymi przykładami takich genów są anty sensowne geny dla SPS z kukurydzy i ziemniaka oraz AGPazy z ziemniaka, mogące podlegać ekspresji w roślinach Regulacja obniżająca poziom enzymów modyfikujących węglowodany przy zastosowaniu podejścia z antysensownymi genami nie jest ograniczona przez konkretne przykłady. Przykładowo, można użyć anty sensowne geny zdolne do ekspresji w roślinach, wykazujące częściową komplementamość, o ile antysensowny gen mogący podlegać ekspresji w roślinach wytwarza transkrypt, który jest dostatecznie komplementarny do transkryptu docelowego genu i dostatecznie długi dla zahamowania ekspresji tego docelowego genu.

Nie ma znaczenia dla wynalazku, w jaki sposób uzyskuje się obecność dwóch lub większej liczby genów w tej samej roślinie. Można to osiągnąć między innymi następującymi metodami:

(a) transformacja linii roślinnej wielogenowym konstruktem, zawierającym więcej niż jeden gen, który ma być wprowadzony, (b) równoczesne kotransformowanie różnych konstruktów do tej samej linii roślinnej, (c) następujące po sobie rundy transformacji tej samej rośliny genami, które mają być wprowadzane, (d) krzyżowanie dwóch roślin, z których każda zawiera różne geny, które mają być wprowadzone do tej samej rośliny.

Dziedzina zastosowania wynalazku obejmuje zarówno rolnictwo i ogrodnictwo, na przykład ze względu na ulepszone właściwości zmodyfikowanych roślin jako takich, jak i dowolne formy przemysłu, w którym trehaloza jest lub będzie wykorzystywana. Fosforan trehalozy i trehaloza mogąbyć użyte jako takie, na przykład w postaci oczyszczonej lub jako dodatki, albo w postaci produktu magazynowanego w częściach rośliny. Części roślin zawierające (zwiększony poziom) fosforanu trehalozy lub trehalozy mogąbyć użyte w czystej postaci lub poddane obróbce bez konieczności dodania trehalozy.

Trehaloza może być również oczyszczana z wytwarzających jąroślin lub części roślin, a następnie użyta w procesach przemysłowych. W przemyśle spożywczym trehaloza może być stosowana poprzez dodawanie trehalozy do produktów spożywczych przed suszeniem. Suszenie produktów spożywczych jest ważną metodą konserwowania stosowaną w przemyśle. Trehaloza wydaje się szczególnie przydatna do konserwowania produktów spożywczych poprzez konwencjonalne suszenie powietrzem i umożliwia szybką rekonstytucję po dodaniu wody do produktów o wysokiej jakości (Roser i wsp., Lipiec 1991, Trends in Food Science and Technology, pp. 166-169). Do zalet należy utrzymanie naturalnych zapachów/aromatów, smaku świeżych produktów i wartości odżywczej (białka i witaminy). Wykazano, że trehaloza ma własności stabilizowania białek i błon i do tworzenia chemicznie biernej, stabilnej szklistej powłoki. Mała aktywność wody w takich starannie wysuszonych produktach spożywczych zapobiega reakcjom chemicznym, które mogłyby powodować psucie.

Rośliny uprawiane na polach, takie jak kukurydza, maniok, ziemniaki, buraki cukrowe, i trzcina cukrowa były od dawna stosowane jako naturalne źródło dla przeważającej części produkcji węglowodanów (skrobia i sacharoza). Wytwarzanie trehalozy w takich roślinach uprawnych, ułatwione przez wprowadzenie do tych gatunków roślin drogi biosyntezy trehalozy poprzez zastosowanie inżynierii gnetycznej, mogłoby umożliwić wykorzystanie tak zmienionych roślin uprawnych do produkcji trehalozy.

Wszystkie odnośniki literaturowe w tym opisie wynalazku są wyznacznikiem poziomu umiejętności, które wchodzą w zakres wynalazku. Wszystkie publikacje, opatentowane lub inne, na które powoływano się wcześniej lub później, w dalszej części opisu, sątu włączone jako odnośnik, tak jakby każda z nich była włączana odrębnie jako odnośnik.

Przykłady podane poniżej są podane jedynie dla umożliwienia wykonania, a nie z zamiarem jakiegokolwiek ograniczenia zakresu wynalazku odnoszą się do

179 629

Część doświadczalna

Manipulowanie DNA

Wszystkie procedury dotyczące DNA (izolację DNA z E. coli, analizę restrykcyjną ligację, transformację itp.) wykonywano zgodnie ze standardowymi protokołami (Sambrook i wsp., (1989) Molecular Cloning: a laboratory manuał wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York).

Szczepy

We wszystkich przykładach do klonowania używano szczepu DH5a. E. coli K-12. Szczepem Agrobacterium tumefaciens użytym w ekspeiymentach transformacji roślin jest szczep M0G1O1, który jest nieonkogennym szczepem pomocniczym typu oktopinowego, pochodzącym odLBAlOlO (Koekman i wsp. (1982) Plasmid7,119) w wyniku zastąpienia T-DNA przez marker oporności na spektynomycynę.

Konstrukcja szczepu Agrobacterium M0G1O1

Binarny system wektorowy (Hoekema A., Hirsch P. R., Hooykaas P. J. J. i Schilperoort R.A. (1983) Naturę 303, 179) jest używany do przeniesienia konstruktów genowych do roślin ziemniaka i tytoniu. Plazmid pomocniczy, odpowiedzialny za funkcje związane z wirulencją Agrobacterium tumefaciens, pochodzi z oktopinowego plazmidu Ti, pTiBó. MOG101 jest szczepem Agrobacterium tumefaciens niosącym nie-oktopinowy plazmid Ti (Koekman i wsp., 1982, jak wyżej), z którego usunięto cały region T i zastąpiono bakteryjnym markerem oporności na spektomycynę, pochodzącym z transpozonu Tnl831 (Hooykaas i wsp., 1980 Plasmid 4, 64-75).

Plazmid Ti pTiB6 zawiera dwa sąsiadujące regiony T, TL (T-lewy) i TR (T-prawy). Celem otrzymania pochodnej pozbawionej regionów TL i TR skonstruowaliśmy wektor pośredni pMOG579. Plazmid pMOG579 jest pochodnąpBR322, która zawiera 2 fragmenty plazmidu Ti, homologiczne do fragmentów zlokalizowanych na zewnątrz, na lewo i na prawo, od regionu T pTiB6 (zacieniowane na figurach 5 i 6). W pMOG579 te dwa fragmenty sąrozdzielone przez fragment BamHI-Hindlll o wielkości 2.5 kb, pochodzący z transpozonu Tnl831 (Hooykaas i wsp., 1980 Plasmid 4,64-75) niosący marker oporności na spektynomycynę (figura 6). Plazmid wprowadza się do szczepu LBA1010 Agrobacterium tumefaciens [C58-C9 (pTiB6) = wyleczony szczep C58, do którego jest wprowadzony pTiB6 (Koekman i wsp., (1982), jak wyżej)] zE. coli przez trójrodzicielskie krzyżowanie przy użyciu HB101 8pRK2013 jako szczepu pomocniczego. Transkoniganty selekcjonuje się na odporność na rifampicynę (20 mg/1) i spektynomycynę (250 mg/1). W wyniku podwójnej rekombinacji pomiędzy pMOG579 i pTiB6 następuje utrata oporności na karbenicylinę (marker pBR322) i delecja całego regionu T. Spośród 5000 transkoniugantów opornych na spektynomycynę replikowanych na płytki z karbenicyliną (100 mg/1) 2 były wrażliwe. Analiza Southema (nie pokazana) pokazuje, że w wyniku podwójnego Crossing ov.er ulega delecji cały region T. Otrzymany szczep jest nazwany MOG101. Szczep i konstrukty są analogiczne do szczepu GV2260 (Deblaere i wsp. 1985, Nuci. Acid Res. 13, 4777-4788).

Alternatywnym szczepem pomocniczym doMOGlOl jestnp. LBA4404; szczep ten może być także przydatny do użycia celem wprowadzenia binarnego plazmidu, takiego jak pMOG799, a następnie transformacji roślin. Inne odpowiednie szczepy pomocnicze są łatwo dostępne.

Konstrukcja wektora ekspresyjnego pMOG180.

Ekspresyjny wektor pMOGl 80 pochodzi od pMOGl 8 (EP 0 479 359 Al, Przykład 2b), w którym gen kodujący GUS jest usunięty, a inne geny mogąbyć wstawione jako fragment BamHl pomiędzy liderem RNA4 A1MV i terminatorem nos.

W tym celu fragment EcoRl/Ncol z pMOGl 8, zawierający promotor 35S i sekwencję liderową RNA4 A1MV jest syntetyzowany przy użyciu technologii PCR i zestawu starterów 5' GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA 3' i 5' CAGCTATGACCATGATTACG 3', w wyniku czego następuje mutacja miejsca Ncol na miejsce BamHl. Wektor pMOGl8 jest następnie cięty EcoRl i BamHl, po czym nowo zsyntetyzowany fragment EcoRI/BamHI może być wstawiony pomiędzy tymi miejscami restrykcyjnymi poprzez ligację. Dla uniknięcia powstałych w wyniku PCR przypadkowych mutacji w sekwencji promotora, fragment EcoRI/EcoRV w zsyntetyzowanym za pomocą PCR fragmencie EcoRI/BamHI jest zastę

179 629 powany sekwencjątypu dzikiego z pM0G18. Krótki fragment EcoRV/BamHI jest sprawdzany poprzez sekwencjonowanie pod katem obecności mutacji. Powstałym w ten sposób wektorem ekspresyjnym jest plazmid pMOG180 (figura 7).

Krzyżówki trój rodzicielskie

Wektory binarne mobilizuje się w krzyżówkach trójrodzicielskich ze szczepem E. coli HB101 zawierającym plazmid pRK2013 (Ditta G., Stanfield S., Corbin D., Helinski D.R. i wsp. (1980) Proc. Natl. Acad Sci. USA 77, 7347) w szczepie Agrobactenum tumefaciens MOG101 i używa do transformacji.

Transformacja tytoniu (Nicotiana tabacum SR1)

Tytoń transformuje się poprzez wspólną hodowlę tkanki roślinnej ze szczepem Agrobacterium tumefaciens M0G101 (Eloekemaiwsp., 1983, Naturę 303,179-180) zawierającym binarny wektor będący przedmiotem zainteresowania, jak to zostało opisane. Transformację wykonuje się stosując wspólną hodowlę krążków liściowych tytoniu (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1), tak opisał Horsch i wsp. 1985, Science 227,1229-1231). Rośliny transgeniczne regeneruje się z pędów hodowanych na pożywce selekcyjnej zawierającej albo kanamycynę albo higromycynę, w zależności od obecności genu oporności obecnego w binarnym plazmidzie, ukorzenia i przenosi do gleby.

Transformacja ziemniaka

Ziemniaki (Solanum tuberosum cv. Desiree) transformuje się szczepem Agrobacterium tumefaciens MOG101, zawierającym wektor binarny będący przedmiotem zainteresowania, jak opisano (Hoekema A., Huisman M.J., Molendijk L., Van den Elzen P.J.M. i Comelissen B.J.C. (1989) Bio/Technology 7,273). PodstawowąpożywkąhodowlanąjestMS30R30, składającą się zpożywkiMS (MurashigeT., Skoog, F. (1962)Physiol. Plan 14,473)uzupełnionej sacharozą30 g/1, witaminami R3 (Ooms G. i wsp., Burrell, Μ. .M., Karp, A., Bevan, M. i Hille, J. (1987) Theor. Appl. Genet. 73,744), 5 μΜ rybozydem zeatyny (ZR) i 0,3μΜ kwasem indolilooctowym (IAA). Pożywkę zestala się, jeżeli to konieczne, agarem Daichin 0,7 g/1.

Bulwy Solanym tuberosum cv. Desiree obiera się i powierzchnię jałowi przez 20 minut w 0,6% roztworze podchlorynu zawierającym 0,1 % Tween-20. Ziemniaki przemywa się dokładnie w dużej objętości jałowej wody przynajmniej przez 2 godziny. Krążki o grubości w przybliżeniu 2 mm tnie się z cylindrów tkanki bulwy otrzymanych przy użyciu korkobora. Krążki inkubuje się przez 20 min. w zawiesinie składającej się z pożywki MS30R3 pozbawionej ZR i IAA, zawierającej 10⁶ - 10⁷ bakterii/ml Agrobacterium MOG101 z wektorem binarnym. Krążki następnie osusza się na jałowej bibule i przenosi do pożywki MS30R3 z ZR i IAA. Po 2 dniach krążki przekłada się do świeżej pożywki zawierającej cefotaxim 100 mg/1 i wankomycynę 50 mg/1. Po tygodniu krążki przekłada się ponownie do tej samej pożywki, ale tym razem zawierającej 100 mg/1 kanamycyny celem wyselekcjonowania transgenicznych pędów. Po 4-8 tygodniach, pędy powstające na krążkach wycina się i przekłada do pożywki ukorzeniającej (pożywka MS30R3 - bez ZR i IAA, ale z 100 mg/1 cefotaxium i 100 mg/1 kanamycyny). Pędy rozmnaża się osiowo przez cięcie merystemów i przekładanie do ziemi po wytworzeniu się korzenia. Tam gdzie potrzeba do selekcji stosuje się 10 mg/1 higromycyny zamiast 100 mg/1 kanamycyny.

Transformację ziemniaka cv. Kardal wykonuje się zasadniczo tak, jak cv. Desiree z wyjątkiem następujących modyfikacji: fitohormony w podstawowej pożywce hodowlanej: 3,5 mg/1 rybazyd zeatyny; 0,03 mg/1 IAA (kwas indolilooctowy). Zawiesina Agrobacterium użyta do transformacji zawiera 10⁵ - 10⁶ bakterii na mililitr. Stężenie kanamycyny w pożywce ukorzeniającej wynosiło 50 mg/1.

Test na trehalozę

Trehalozę określa się zasadniczo tak, jak opisał (Hottiger i wsp., (1987) J.Bact. 169,5518). Tkankę bulwy ziemniaka mrozi się w ciekłym azocie, rozdrabnia na proszek tłuczkiem w moździeżu, a następnie ekstrahuje przez 60 minut w temperaturze pokojowej ok. 3 objętościami 500 mM kwasu trójchlorooctowego. Po odwirowaniu osad ekstrahuje się ponownie w ten sam sposób. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji bada na obecność antronu (Spiro R.G. (1966) Meth. Enzymol. 8, 3). Trehalozę określa się jakościowo na TLC. Ekstrakty dejonizuje się

179 629 (Marek, wymieniacz jonowy V) i nakłada na płytki z żelem krzemionkowym Silica Gel 60 (Merck). Po chromatografii płytki -wywołuje się mieszaninąn-butanol-pirydyna-woda (15:3:2 v/v). Plazmy uwidacznia się spryskując wanillinąŚ mg/ml w stężonym H₂SO₄ i podgrzewając do 130°C. Jako standardu używa się handlowo dostępną trehalozę (Sigma).

Alternatywnie, trehalozę określano ilościowo na chromatografii aniono-wymiennej z pulsacyjnym pomiarem amperometycznym. Ekstrakty przygotowywano przez dodanie 1 ml gotującej wody do 1 g zamrożonego materiału, który następnie gotowano przez 15' w 100°C. Próbki (25 μΐ) analizowano metodą ciekłej chromatografii na Dionex DX-300 na kolumnach 4 x 250 Dionex 35391 carbopac PA-11 prekolumnach 4 x 50 mm Dionex 43096 carbopac PA-1. Elucję prowadzono 100 mM NaOH przy 1 ml/min. Cukry wykrywano pulsacyjnym czujnikiem amperometrycznym (Dionex, PAD-2). Jako standardu używano handlowo dostępnej trehalozy (Sigma).

Test enzymatyczny

We wszystkich oznaczeniach materiał z nietransgenicznych bulw lub nietransgenicznego tytoniu używano jako kontrolę. Zawartość białek we wszystkich próbkach ustala się tak, jak opisał Bradford (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72,248). Do testów w ekstraktach z bulw, mrożone skrawki z bulw ziemniaka o masie ok. 100 mg homogenizuje się w 100 μΐ 20 mM HEPES pH 7,4, zatęża (Eppendorf, 5 minut przy maksymalnej prędkości) .Dla pomiarów aktywności używa się suprematantu.

Aktywność SPS - Aktywność SPS określano zasadniczo jako opisali Amir J. i Press J. (1982) Plant Physiol. 69, 1027-1030). Zmieniając skład mieszaniny reakcyjnej, można określić dwie różne formy aktywności SPS; V_max i V_sel. Reakcyjna mieszanina V_max zawierała 3,2 mM glukozo-UDP, 81 μΜ [¹⁴C]-glukozo-UDP, 3,2 mM fruktozo-6-fosforan, 16 mM glukozo-6-fosforan, 100 mM HEPES pH 7,4,20 mM MgCl₂ i 5 mM EDTA w całkowitej objętości 50 μΐ. W mieszaninie reakcyjnej V_sei stężenie fiuktozo-6-fosforanu i glukozo-6-fosforanu jest dwukrotnie mniejsze i dodany jest 5 mM nieorganiczny fosforan. Jako kontrola mierzona jest aktywność SPS w mieszaninie reakcyjnej V_max bez fruktozo-6-fosforanu i glukozo-6-fosforanu. Reakcję wykonuje się w temperaturze pokojowej przez 30⁷ i zatrzymuje przez podgrzanie mieszaniny przez 5' w 95°C. Produkty reakcji poddaje się działaniu alkalicznej fosfatazy i powstałą w wyniku tego [^l4C]-sacharozę oddziela od substratu na chromatografii jonowymiennej. Ilość utworzonej w reakcji radioaktywnej sacharozy mierzy się w liczniku scyntylacyjnym.

Aktywność TPS - Aktywność TPS mierzy się w podobny sposób jak opisano dla SPS. Po chromatografii jonowymiennej próbki zawierały obok trehalozy defosforylowanąsacharozę. Do określenia, która część utworzonego produktu jest trehalozę, próbki rozdzielano na TLC w sposób podobny do opisanego. Ekstrakty dejonizowano (Merck, łon exchanger V) i nakładano na płytki z żelem krzemionkowym Silica Gel 60 (Merck). Po chromatografii, plamy zawierające [¹⁴C]-sacharozę i [¹⁴C]-trehalozę zeskrobywano i mierzono w liczniku scyntylacyjnym.

Aktywność AGPazy - Aktywność AGPazy określano jak opisał Muller-Rober i wsp. (Muller-Rober B., Sonnewald U. I Willmitzer L. (1992) EMBO J. 11, 1229). Wytworzenie glukozo-1-fosforanu z ADP-glukozy określano w systemie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej związanej z NAD. Test reakcyjny zawierał 80 mM HEPES pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 1 mM ADP-glukozę, 0,6 mM NAD, 10 μΜ glukozo-1,6-difosforan, 3 mMDTT, 0,02% aluminę z surowicy wołowej, 1 jedn. fosfogłukomutazy z mięśnia królika (Sigma), 2,5 jedn. dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej związanej z NAD z Leuconostoc mesenteroides i ekstraktu z bulw. Reakcja jest inicjowana poprzez dodawanie pirofosforanu sodowego do końcowego stężenia 2 mM. Redukcję NAD mierzy się spektrofotometrycznie przy 340 nm i 30°C. Jednostkę aktywności AGPazy określa się jako ilość nmol glukozo-1-fosforanu powstałą w ciągu min. w 3Ó°C.

Przykład I. Klonowanie genu otsA E. coli pełnej długości.

W E. coli syntaza fosforanu trahalozy (TPS) jest kodowana w genie otsA położonym w operonie otsBA. Położenie i kierunek transkrypcji tego operonu w chromosomie E. coli są znane (Kaasen. I., Falkenberg P., Stryvold O.B. i Strom A.R. (1992) J. Bact. 174, 889). Gen otsA jest położony na 42' i zgodnie z Kaasen i wsp., znajduje się we fragmencie o wielkości 18.8 kb w klonie genomowym EMBL4 oznaczonym jako 7F11 na mapie przedstawionej przez Kohara i wsp.,

179 629 (Kohara Y, Akiyama K. I Isono K. (1987) Celi 50,495). DNA otrzymane z lizatu klonu lambda 7F11 trawiono Hindlll. Wyizlowany fragment Hindin o wielkości 2,9 kb (miejsce HindUI po prawej-stronie wstawki o wielkości 14,3 kbjest pominięte na mapie Kohara i wsp., co już wcześniej odnotowano u Kaasen i wsp.,) sklonowano w pUC 18 przeprowadzonym w formę liniowąenzymem Hindlll. Wstawkę Hindlll o wielkości 2,9 kb z powstałego w ten sposób plazmidu, oznaczonego pMOG674, sekwencjonowano. Stwierdzono, że sekwencja zawiera część genu araH z operonu transportu arabinozy (Scripture J.B., Voelker C., Miller S., ODonnell R.T., Polgar L., Rade J., Horazdovsky B.F. i Hogg R.W. (1987) J.Mol. Biol. 197, 37), gen otsB kodujący TPP zlokalizowany przez Kaasen i wsp., i część genu otsA kodującego TPS. Wykazano, że otsA nie zawiera się w całości we fragmencie Hindlll o wielkości 2,9 kb, jak opisał Kaasen i wsp. Aby uzupełnić sekwencję, wyizolowano i częściowo zsekwencjonowano zachodzący fragmentBamHI/EcoRI. Pełną sekwencję kodującą TPS genu otsA pokazano w SEK NR ID: 2. Pozycję genu otsA w klonie 7F11 z zaznaczonymi miejscami dla użytych enzymów restrykcyjnych pokazano na fig. 8. Dodatkowe miejsce Hindlll nieobecne na mapie opublikowanej przez Kohara i wsp. znajduje się po lewej stronie fragmentu HindUI o wielkości 2,9 kb.

Miejsce Hindlll w pMOGl 80 jest zastąpione przez miejsce Sstl poprzez wklonowanie dupleksu nukleotydowego:

Sstl

5' AGCTCACGAGCTCTCAGG 3' (SEK. NR ID.: 8)

3' GTGCTCGAGAGTCCTCGA 5' (SEK. NR ID.: 9) do pMOGl 80 przeciętnego Hindlll. Powstały w rezultacie wektor oznaczono pMOG746. Dupleks oligonukleotydowy:

BamHI SphI Hindin

I Smal I I BamHI

II II I

5’ GATCCCCCGGGGCATGCAAGCTTG 3' (SEK. NR ID.: 10) i

3' GGGGCCCCGTACGTTCGAACCTAG 5 (SEK. NR ID.: 11) sklonowano w wektorze pMOG746 przeprowadzonym w formę linową enzymem BamHI. Wektor z dupleksem oligonukleotydowym w pożądanej orientacji (sprawdzonej poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym) oznaczono pMOG747. Fragment Hindlll o wielkości 2,9 kb z plazmidu pMOG674 sklonowano w pMOG747 przeprowadzonym w formę linową enzymem HindUI, w rezultacie czego powstał wektor pMOG748. Z plazmidu pMOG748 izolowano fragmenty EcoRV/SstO o wielkości ok. 2,4 kb i Sstl/Smal o wielkości ok. 3,5 kb, poddawano ligacji i transformowano do E. coli, usuwając w ten sposób koniec 3' fragmentu Hindlll 2,9 kb. Powstały w rezultacie plazmid oznaczono pMOG749. Koniec 5' genu otsA syntetyzowano techniką PCR, używając syntetyczne oligonukleoty TPS1 i TPS2 oraz pMOG749 jako matrycę.

TPS1 5’ GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3’ (SEK. NR ID.: 12)

TPS2 5' GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 3' (SEK. NR ID.: 13)

Poprzez sekwencjonowanie potwierdzono, że fragment PCR o wielkości 0,4 kb ma sekwencję prawidłową. Fragment BamHI/Hindlll o wielkości 1 kb z pMOG749 klonowano razem z fragmentem PCR XmaI/BamHI o wielkości 0,4 kb w pMOG747 przeprowadzonym w formę liniową enzymami Xmal i Hindlll. W powstałym w rezultacie plazmidzie, trawionym Hindin i Sstl, sklonowano syntetyczny dupleks oligonukleotydowy TPS6/7, kodujący trzy C-końcowe aminokwasy TPS.

179 629

LysLeuAla Stop

TPS 6/7 5’ AGCTGGCGTGAGGAGCGGTTAATAAGCTTGAGCT 3'

3' CCGCACTCCTCGCCAATTATTCGAAC 5'

W powstałym w rezultacie plazmidzie, trawionym Hindlll i Sstl, sklonowano fragment Hindlll/Sstl o wielkości 0,25 kb z plazmidu pMOG749, obejmujący terminator genu syntetazy nopaliny (NOS) z Agrobacterium tumefaciens, uzyskując plazmid pMOG798. Plazmid ten zawiera gen otsA E. coli w prawidłowej orientacji pod kontrolą promotora 35S z podwójnym wzmacniaczem z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) (Guilley i wsp., (1982) Cel 30,763), sekwencję liderowąRNA4 z wirusa mozaiki lucerny (AMV) (Brederode i wsp. (1980) Nuci. Acids Res. 8, 2213) i sekwencję transkrypcyjnego terminatora syntazy nopaliny z Agrobacterium tumefaciens. Pełną kasetę ekspresyjną sklonowano jako fragment EcoRI/Sstl o wielkości 2,5 kb w binarnym wektorze pMOG23 przeprowadzonym w formę liniową EcoRI i Sst. W rezultacie binarny wektor pMOG799 (fig. 9) użyto do transformacji ziemniaka i tytoniu (Szczep E. coli niosący pMOG799 został zdeponowany w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures, Phabagen collections, Padualaan 8, Ultrecht, Holandia, 23 sierpnia, 1993, numer depozytu CBS 430.93; pMOG23 został zdeponowany w CBS 289 czerwca, 1990, numer depozytu CBS 102.90).

Przykład II. Wytwarzanie trehalozy w tytoniu stansformowanym pMOG799.

Krążki liściowe tytoniu transformowano wektorem binarnym pMOG799 przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Aktywność syntazy fosforanu trehalozy (TPS) analizowano w 20 niezależnie otrzymanych transgenicznych pędach. U niektórych roślin tytoniu hodowanych in vitro stwierdzono niezmiernie grube korzenie w porównaniu z roślinami nietransformowanymi. Analiza korzeni tych transgenicznych roślin tytoniu wykazała wzrost poziomu trehalozy w porównaniu z nietransgenicznymi roślinami kontrolnymi.

Przykład III. Wytwarzanie trehalozy w ziemniakach transformowanych pMOG799.

Krążki bulw ziemniaka transformowano wektorem binarnym pMOG799 przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Transgeniczne pędy selekcjonowano na kanamycynie. Aktywność syntazy fosforanu trehalozy (TPS) analizowano w 20 niezależnie otrzymanych transgenicznych pędach. Pędy, w których znaleziono enzym hodowano, otrzymując dorosłe rośliny. Analiza dojrzałych bulw tych transgenicznych roślin ziemniaka wykazała wzrost poziomu trehalozy w porównaniu z nietransgenicznymi roślinami kontrolnymi. Linię MOG799.1 transgenicznej rośliny namnażano dla dalszych prac.

Przykład IV. Konstrukcja pMOG664.

Zsyntetyzowano dwa oligonukleotydy odpowiadające sekwencji cDNA małej podjednostki pirofosforylazy ADP-glukozy (AGPazaB) z bulw ziemniaka cv. Desiree (Muller-Rober B., Kossmann J., Hannah L.C., Willmitzer L. i Sonnewald U. (1990) Mol. Gen. Genet. 224, 136-146);

5' TCCCCATGGAATCAAAGCATCC 3' (SEK. NR ID.: 4)

5' GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3' (SEK. NR ID.: 5)

Oligonukleoty zaprojektowano tak, aby zawierały na końcach odpowiednie miejsca restrykcyjne (BamHI i Ncol, podkreślone) dla umożliwienia dołączenia kasety ekspresyjnej w antysensownej orientacji po trawieniu tymi enzymami restrykcyjnymi. Fragment o wielkości około 1 kb amplifikowano w reakcji PCR przy użyciu tych oligonukleotydów, stosując jako matrycę DNA izolowany z biblioteki cDNA z ziemniaka cv. Desiree, otrzymanej z dwumiesięcznej tkanki liściowej (Clontech). Poprzez sekwencj ono wanie wykazano, że fragment jest identyczny z sekwencją AGPazyB ziemniaka cv. Desiree (Muller-Rober B., Kossmann J., Hannah L.C., WillmitzerL. i SonnewaldU. (1990)Mol. Gen. Gent. 224, 136-146). Po strawieniu BamHI i Ncol, fragment klonowano w pMOGl 8 przeprowadzonym w formę liniową BamHI i Ncol. Z otrzymanego plazmidu sklonowano fragment EcoRI/BamHI o wielkości 1,85 kb

179 629 (zawierający promotor 35S CaMV, lider RNA4 AMV i fragment AGPazy w antysensownej orientacji), jak również fragment BamHI/Hindm zawierający terminator z genu syntazy nopaliny (NOS) z Agrobacterium tumefaciens w wektorze binarnym pMOG22 przeprowadzonym w formę liniową EcoRI i Hindffl w trzech etapach ligacji. Wektor binarny pMOG22 zawiera roślinny gen ekspresyjny HPTII do selekcji transgenicznych roślin na higromycynie (pMOG22 został zdeponowany 29 stycznia 1990 w Centraal Bureau voor Schimmelcultures pod numerem dostępu 101.90). Otrzymany wektor binarny pMOG664 (fig.4) używa się do transformacji ziemniaka.

Przykład V. Konstrukcja pMOG801.

Zsyntetyzowano zestaw oligonukleotydów komplementarnych do sekwencji cDNA syntazy fosforanu sacharozy (SPS) z kukurydzy (Worrell, A.C., Bruneau J-M., Summerfalt K., Boersin M. i Voelker T.A. (1991) Plant Celi 3, 1121). Ich sekwencje są następujące:

5' CTAGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTG 3' (SEK. NR ID : 6)

5’ CAGCATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC 3' (SEK. NR ID.: 7)

Oligonukleotydy te użyto do amplifikacji w reakcji PCR fragmentu DNA o wielkości 370 bp, stosując jako matrycę DNA wyizolowany z biblioteki cDNA ziemniaka cv. Desiree, otrzymanej z dwumiesięcznej tkanki liściowej (Clontech). Poprzez sekwencjonowanie tego fragmentu wykazano, że jest on homologiczny do sekwencji SPS z kukurydzy (patrz fig. 3 i Worrell i wsp., 1991). Fragment PCR użyto do przeszukania biblioteki lambda gtlO z biblioteki cDNA ziemniaka cv. Desiree otrzymanej z dwumiesięcznej tkanki liściowej (Clontech). Wstawkę z jednego pozytywnie hybrydyzującego klonu zsekwencjonowano. Sekwencja tego fragmentu DNA o wielkości 654 bp była w 65% identyczna z odpowiadającą częścią sekwencji SPS z kukurydzy (licząc od nukleotydu o nr 349 na fig. 11 u Worrell i wsp., (1991). Wstawkę EcoRI z tego klonu sklonowane w pMOG180 strawionym BamHI w trzyetapowej ligacji z następującym syntetycznym dupleksem oligonukleotydów.

5' GATCGTCAGATCTAGC 3' (SEK. NR ID.: 14)

5' CAGTCTAGATCGTTAA 5' (SEK. NR ID.: 15)

Plazmid zawierający fragment SPS w antysensownej orientacji w stosunku do promotora 35S CaMV oznaczono pMOG787. Fragment EcoRI/HindlH z plazmidu pMOG787 sklonowane w trzyetapowej ligacji z syntetycznym linkerem:

5' AGCTTCCCCCCCG 3' (SEK. NR ID.: 16)

3' AGGGGGGGCTTAA 5' (SEK. NR ID.: 17) w binarnym wektorze pMOG22, przeprowadzonym w formę liniową EcoRI. Binarny wektor pMOG22 zawiera roślinny gen ekspresyjny HPTII do selekcji na higromycynie w roślinach transgenicznych (pMOG22 został zdeponowany 29 stycznia 1990 w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures, pod nr dostępu 101.90). Otrzymany wektor binarny pMOG801 (fig. 10) używano do transformacji ziemniaka.

Przykład VI. Konstrukcja pMOG802.

Fragment EcoRI z plazmidu pMOG801, zawierający antysensowną kasetę ekspresyjną SPS, sklonowano w wektorze binarnympMOG664 (zawierającym antysensowny zestaw AGPazy) przeprowadzonym w formie liniową EcoRI. Powstały w rezultacie binarny wektor nazwano pMIG802 (fig. 11).

Przykład VII. Wytwarzanie trehalozy w ziemniaku stransformowanym pMOG799 i pMOG664.

Krążki z bulw ziemniaczanych linii roślinnej MOG799.1 opornej na kanamycynę, wyrażającej TPS (przykład IX), transformowano binarnym wektorem pMOG664, zawierającym ekspresyjną kasetę z antysensowną AGPazą. Transgeniczne pędy, selekcjonowane na 10 mg/1 higromycyny, analizowano pod kątem aktywności TPS i AGPazy.

Poprzez analizę transgenicznych bulw pod kątem aktywności AGPazy wykazano obniżenie poziomu aktywności w poszczególnych liniach transgenicznych w porównaniu z nietransge

179 629 niczną kontrolą. Poprzez analizę filtrów metodą Northern wykazano, że poziom mRNA dla AGPazy jest obniżony w transgenicznych roślinach w porównaniu z poziomem w nietransgenicznych roślinach kontrolnych. Poziom trehalozy w bulwach transgenicznych ziemniaków, dla których stwierdzono aktywność TPS i które miały zredukowany poziom AGPazy, wykazywał wzrost w porównaniu z poziomem znajdywanych w bulwach transgenicznej linii roślinnej MOG799.1.

Przykład VIII. Wytwarzanie trehalozy w ziemniaku stransformowanym pMOG799 i pMOG801. ......

Krążki z bulw ziemniaczanych linii roślinnej MOG799.1 opornej na kanamycynę, wyrażającej TPS (przykład IX), transformowano binarnym wektorem pMOG801, zawierającym ekspresyjną kasetę z antysensownym SPS. Transgeniczne pędy, selekcjonowane na 10 mg/1 higromycyny, analizowano pod kątem aktywności TPS i antysensownej sekwencji SPS poprzez PCR. Rośliny transgeniczne zawierające obie sekwencje, analizowano pod kątem aktywności TPS i SPS. Poprzez analizę transgenicznych bulw pod kątem aktywności SPS wykazano obniżenie poziomu aktywności w poszczególnych liniach transgenicznych w porównaniu z nietransgeniczną kontrolą. Poprzez analizę filtrów metodą Northern wykazano, że poziom mRNA dla SPS jest obniżony w transgenicznych roślinach w porównaniu z poziomem w nietransgenicznych roślinach kontrolnych. Poziom trehalozy w bulwach transgenicznych ziemniaków, dla których stwierdzono aktywność TPS i które miały zredukowany poziom SPS, wykazywał wzrost w porównaniu z poziomem znajdywanym w bulwach transgenicznej linii roślinnej MOG799.1.

Przykład IX. Wytwarzanie trehalozy w ziemniaku stransformowanym pMOG799 i pMOG802.

Krążki z bulw ziemniaczanych linii roślinnej MOG799.1 opornej na kanamycynę, wyrażającej TPS (przykład IX), transformowano binarnym wektorem pMOG802, zawierającym ekspresyjne kasety z antysensownymi SPS i AGPazą. Transgeniczne pędy, selekcjonowane na 10 mg/1 higromycyny, analizowano pod kątem obecności TPS, antysensownej sekwencji AGPazy i antysensownej sekwencji SPS poprzez PCR. Rośliny transgeniczne zawierające obie sekwencje, analizowano pod katem aktywności TPS, AGPazy i SPS.

Poprzez analizę transgenicznych bulw pod kątem aktywności AGPazy i SPS wykazano obniżenie poziomu aktywności w poszczególnych liniach transgenicznych w porównaniu z nietransgeniczną kontrolą. Poprzez analizę filtrów metodą Northern wykazano, że poziom mRNA dla AGPazy i SPS jest obniżony w transgenicznych roślinach w porównaniu z poziomem w nietransgenicznych roślinach kontrolnych. Poziom trehalozy w bulwach transgenicznych ziemniaków, dla których stwierdzono aktywność TPS i które miały zredukowany poziom SPS, wykazywał wzrost w porównaniu z poziomem znajdywanych w bulwach transgenicznej linii roślinnej MOG799.1.

Zdeponowane szczepy pMOG22; nr depozytu CBS 101.90 (strona 23, wiersz 18-21; strona 24; wiersz 21-23) pMOG23; nr depozytu CBS 102.90 (strona 22, wiersz 10) pMOG799; nr depozytu CBS 430.93 (strona 22, wiersz 6)

Lista sekwencji

Informacje ogólne (i) Składający wniosek:

(A) Nazwa: MOGEN International N. V.

(B) Ulica: Einsteinweg 97 (C) Miasto: Leiden (D) Stan: Południowa Holandia (E) Państwo: Holandia (F) Kod pocztowy: NL-2333 CB (G) Telefon: (31).(71).258282 (H) Telefax: (31).(71).221471 (ii) Tytuł wynalazku: Wytwarzanie trehalozy w roślinach (iii) Liczba sekwencji: 17 (iv) Wymagania komputerowe:

(A) Typ podłoża: dysk miękki (B) Komputer: zgodny z IBM PC

179 629 (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Relasae # 1,0, Wersja # 1,25 (EPO) (v) Dane dotyczące bieżącego zgłoszenia

Numer zgłoszenia WO PCT/EP93/02290 (2) Informacja dotycząca SEK. NR ID: 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 370 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: dwuniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA na mRNA (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Naturalne źródło:

(A) Organizm: Solanum tuberosum (B) Szczep: Desiree (F) Typ tkanki: Liść (xi) Opis sekwencji: SEK. NR ID: 1:

CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTGAAGTATG TAGTAGAGCT TGCTCGAGCA60

CTTGCAAACA TGAAAGGAGT TCACCGAGTT GATCTCTTGA CTCGGCAGAT CACATCCCCA120

GAGGTTGATT CTAGCTATGG TGAGCCAATT GAGATGCTCT CATGCCCATC TGATGCTTTG180

GCTGCTGTGG TGCCTACTAT TCGGATCCCT GCGGACCAGG TGACAAGATA TTCCAAAAGA240

ATTTACATAC CAGAATTTGT TGATGGAGCA TTAAGCCACA TTGTGAATAT GGCAAGGGCT300

ATAGGGGAGC AAGTCAATGC TGGAAAAGCA GTGTGGCCTT ACGTGATACA TGGGCACTAT360

GCCGATGCTG370 (2) Informacja dotycząca SEK. NR ID: 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1446 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: dwuniciowa (D) Topologi: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Naturalne źródło:

(A) Organizm: Escherichia coli (vii) Źródło pośrednie:

(B) Klon 7F11 (viii) Pozycja w genomie:

(B) Pozycja mapowa: 41-42' (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Kod: CDS (B) Lokalizacja: 19..1446 (D) Pozostałe informacje: /produkt = “syntaza fosforanu trehalozy”/ gen = “otsA” (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 2:

179 629

GAGAAAATAA CAGGAGTG ATG ACT ATG AGT CGT TTA GTC GTA GTA TCT AAC51

Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn ¹ 510

CGG ATT GCA CCA CCA GAC GAG CAC GCC GCC AGT GCC GGT GGC CTT GCC99

Arg Ile Ala Pro Pro Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala ¹⁵ 2025

GTT GGC ATA CTG GGG GCA CTG AAA GCC GCA GGC GGA CTG TGG TTT GGC147

Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly

3540

TGG AGT GGT GAA ACA GGG AAT GAG GAT CAG CCG CTA AAA AAG GTG AAA195

Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn Glu Asp Gin Pro Leu Lys Lys Val Lys

5055

AAA GGT AAC ATT ACG TGG GCC TCT TTT AAC CTC AGC GAA CAG GAC CTT243

Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gin AspLeu

65 7075

GAC GAA TAC TAC AAC CAA TTC TCC AAT GCC GTT CTC TGG CCC GCT TTT291

Asp Glu Tyr Tyr Asn Gin Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro AlaPhe

8590

CAT TAT CGG CTC GAT CTG GTG CAA TTT CAG CGT CCT GCC TGG GAC GGC339

His Tyr Arg Leu Asp Leu Val Gin Phe Gin Arg Pro Ala Trp AspGly

100105

TAT CTA CGC GTA AAT GCG TTG CTG GCA GAT AAA TTA CTG CCG CTG TTG387

Tyr Leu Arg Val Asn Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro LeuLeu

110 115120

CAA GAC GAT GAC ATT ATC TGG ATC CAC GAT TAT CAC CTG TTG CCA TTT435

Gin Asp Asp Asp Ile Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu ProPhe

125 130135

GCG CAT GAA TTA CGC AAA CGG GGA GTG AAT AAT CGC ATT GGT TTC TTT483

Ala His Glu Leu Arg Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly PhePhe

140 145 150155

CTG CAT ATT CCT TTC CCG ACA CCG GAA ATC TTC AAC GCG CTG CCG ACA531

Leu His Ile Pro Phe Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu ProThr

160 165170

TAT GAC ACC TTG CTT GAA CAG CTT TGT GAT TAT GAT TTG CTG GGT TTC579

Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gin Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu GlyPhe

175 180185

CAG ACA GAA AAC GAT CGT CTG GCG TTC CTG GAT TGT CTT TCT AAC CTG627

Gin Thr Glu Asn Asp Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser AsnLeu

190 195200

ACC CGC GTC ACG ACA CGT AGC GCA AAA AGC CAT ACA GCC TGG GGC AAA675

Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp GlyLys

205 210215

179 629

GCA Ala 220	ITT Phe	CGA Arg	ACA Thr	GAA Glu	GTC Val 225	TAC Tyr	CCG Pro	ATC Ile	GGC ATT GAA CCG AAA GAA ATA Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile 230 235	723
GCC	AAA	CAG	GCT	GCC	GGG	CCA	CTG	CCG	CCA AAA CTG GCG CAA CTT AAA	771
Ala	Lys	Gin	Ala	Ala 240	Gly	Pro	Leu	Pro	Pro Lys Leu Ala Gin Leu Lys 245 250
GCG	GAA	CTG	AAA	AAC	GTA	CAA	AAT	ATC	TTT TCT GTC GAA CGG CTG GAT	819
Ala	Glu	Leu	Lys 255	Asn	Val	Gin	Asn	Ile 260	Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp 265
TAT	TCC	AAA	GGT	TTG	CCA	GAG	CGT	TTT	CTC GCC TAT GAA GCG TTG CTG	867
Tyr	Ser	Lys 270	Gly	Leu	Pro	Glu	Arg 275	Phe	Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu 280
GAA	AAA	TAT	CCG	CAG	CAT	CAT	GGT	AAA	ATT CGT TAT ACC CAG ATT GCA	915
Glu	Lys 285	Tyr	Pro	Gin	His	His 290	Gly	Lys	Ile Arg Tyr Thr Gin Ile Ala 295
CCA	ACG	TCG	CGT	GGT	GAT	GTG	CAA	GCC	TAT CAG GAT ATT CGT CAT CAG	963
Pro 300	Thr	Ser	Arg	Gly	Asp 305	Val	Gin	Ala	Tyr Gin Asp Ile Arg His Gin 310 315
CTC	GAA	AAT	GAA	GCT	GGA	CGA	ATT	AAT	GGT AAA TAC GGG CAA TTA GGC	1011
Leu	Glu	Asn	Glu	Ala 320	Gly	Arg	Ile	Asn	Gly Lys Tyr Gly Gin Leu Gly 325 330
TGG	ACG	CCG	CTT	TAT	TAT	TTG	AAT	CAG	CAT TTT GAC CGT AAA TTA CTG	1059
Trp	Thr	Pro	Leu 335	Tyr	Tyr	Leu	Asn	Gin 340	His Phe Asp Arg Lys Leu Leu 345
ATG	AAA	ATA	TTC	CGC	TAC	TCT	GAC	GTG	GGC TTA GTG ACG CCA CTG CGT	1107
Met	Lys	Ile 350	Phe	Arg	Tyr	Ser	Asp 355	Val	Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg 360
GAC	GGG	ATG	AAC	CTG	GTA	GCA	AAA	GAG	TAT GTT GCT GCT CAG GAC CCA	1155
Asp	Gly 365	Met	Asn	Leu	Val	Ala 370	Lys	Glu	Tyr Val Ala Ala Gin Asp Pro 375
GCC	AAT	CCG	GGC	GTT	CTT	GTT	CTT	TCG	CAA TTT GCG GGA GCG GCA AAC	1203
Ala 380	Asn	Pro	Gly	Val	Leu 385	Val	Leu	Ser	Gin Phe Ala Gly Ala Ala Asn 390 395
GAG	TTA	ACG	TCG	GCG	TTA	ATT	GTT	AAC	CCC TAC GAT CGT GAC GAA GTT	1251
Glu	Leu	Thr	Ser	Ala 400	Leu	Ile	Val	Asn	Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val 405 410
GCA	GCT	GCG	CTG	GAT	CGT	GCA	TTG	ACT	ATG TCG CTG GCG GAA CGT ATT	1299
Ala	Ala	Ala	Leu 415	Asp	Arg	Ala	Leu	Thr 420	Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile 425
TCC	CGT	CAT	GCA	GAA	ATG	CTG	GAC	GTT	ATC GTG AAA AAC GAT ATT AAC	1347
Ser	Arg	His 430	Ala	Glu	Met	Leu	Asp 435	Val	Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn 440
CAC	TGG	CAG	GAG	TGC	TTC	ATT	AGC	GAC	CTA AAG CAG ATA GTT CCG CGA	1395
His	Trp 445	Gin	Glu	Cys	Phe	ile 450	Ser	Asp	Leu Lys Gin Ile Val Pro Arg 455

179 629

AGC GCG GAA AGC CAG CAG CGC GAT AAA	GTT GCT ACC TTT CCA AAG CTT	1443
Ser Ala Glu Ser Gin Gin Arg Asp Lys 460 465	Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu 470 475

1446

GCG

Ala (2) Informacja dotycząca SEK. NR ID: 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 476 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEK. NR ID: 3:

Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val 15

Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly 20

Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu 3540

Gly Asn Glu Asp Gin Pro Leu Lys 5055

Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu 6570

Gin Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp 85

Leu Val Gin Phe Gin Arg Pro Ala 100

Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu 115120

Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu 130135

Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile 145150

Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala 165

Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro 1015

Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly 2530

Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr 45

Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr 60

Gin Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn 7580

Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp 9095

Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val Asn 105110

Pro Leu Leu Gin Asp Asp Asp Ile 125

Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg 140

Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe 155 160

Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu 170 175

Glu Gin Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu

180 185

Gly Phe Gin Thr Glu Asn Asp 190

179 629

Arg

Leu

Ala 195

Phe

Leu

Asp

Cys

Leu 200

Ser

Asn

Leu

Thr

Arg 205

Val

Thr

Thr

Arg

Ser 210

Ala

Lys

Ser

His

Thr 215

Ala

Trp

Gly

Lys

Ala 220

Phe

Arg

Thr

Glu

Val 225

Tyr

Pro

Ile

Gly

Ile 230

Glu

Pro

Lys

Glu

Ile 235

Ala

Lys

Gin

Ala

Ala 240

Gly

Pro

Leu

Pro

Pro 245

Lys

Leu

Ala

Gin

Leu 250

Lys

Ala

Glu

Leu

Lys 255

Asn

Val

Gin

Asn

Ile 260

Phe

Ser

Val

Glu

Arg 265

Leu

Asp

Tyr

Ser

Lys 270

Gly

Leu

Pro

Glu

Arg 275

Phe

Leu

Ala

Tyr

Glu 280

Ala

Leu

Leu

Glu

Lys 285

Tyr

Pro

Gin

His

His 290

Gly

Lys

Ile

Arg

Tyr 295

Thr

Gin

Ile

Ala

Pro 300

Thr

Ser

Arg

Gly

Asp 305

Val

Gin

Ala

Tyr

Gin 310

Asp

Ile

Arg

His

Gin 315

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala 320

Gly Arg Tyr Leu

Ile Asn

Asn Gin 340

Gly 325 His

Lys Phe

Tyr Asp

Gly Arg

Gin Lys 345

Leu 330 Leu

Gly Leu

Trp Met

Thr Lys

Pro Ile 350

Leu 335 Phe

Tyr Arg

Tyr

Ser

Asp 355

Val

Gly

Leu

Val

Thr 360

Pro

Leu

Arg

Asp

Gly 365

Met

Asn

Leu

Val

Ala 370

Lye

Glu

Tyr

Val

Ala 375

Ala

Gin

Asp

Pro

Ala 380

Asn

Pro

Gly

Val

Leu 385

Val

Leu

Ser

Gin

Phe 390

Ala

Gly

Ala

Ala

Asn 395

Glu

Leu

Thr

Ser

Ala 400

Leu

Ile

Val

Asn

Pro 405

Tyr

Asp

Arg

Asp

Glu 410

Val

Ala

Ala

Ala

Leu 415

Asp

Arg

Ala

Leu

Thr 420

Met

Ser

Leu

Ala

Glu 425

Arg

Ile

Ser

Arg

His 430

Ala

Glu

Met

Leu

Asp 435

Val

Ile

Val

Lys

Asn 440

Asp

Ile

Asn

His

Trp 445

Gin

Glu

Cys

Phe

Ile 450

Ser

Asp

Leu

Lys

Gin 455

Ile

Val

Pro

Arg

Ser 460

Ala

Glu

Ser

Gin

Gin 465

Arg

Asp

Lys

Val

Ala 470

Thr

Phe

Pro

Lys

Leu 475

Alą

179 629 (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 4:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 4: TCCCCATGGA ATCAAAGCAT CC (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 5:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 5: GATTGGATCC AGGGCGGC TG (2) Informacja dotycząca SEK. NR ID: 6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 6: CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTG (2) Informacja dotycząca SEK. NR ID: 7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 35 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 7: CAGCATCGGC ATAGTGCCCA TGTATCACGT AAGGC (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak

179 629 (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 8: AGCTCACGAG CTCTCAGG (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 9:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednomciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 9: GTGCTCGAGA GTCCTCGA (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 10:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 10: GATCCCCCGG GGCATGCAAG CTTG (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 11: GGGGCCCCGT ACGTTCGAAC CTAG (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 12:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 23 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 12: GAGAAAATAC CCGGGGTGAT GAC (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 13:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 25 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

179 629 (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 13 GATAATCGTG GATCCAGATA ATGTC (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 14:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 16 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 14: GATCGTCAGA TCTAGC (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 15:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 16 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ED NR: 15: CAGTCTAGAT CGTTAA (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 16:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 16: AGCTTCCCCC CCG (2) Informacja dotycząca SEK. NR. ID: 17:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj cząsteczki: jednoniciowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczna: tak (xi) Opis sekwencji: SEK ID NR: 17: AGGGGGGGCT TAA

179 629

UZYSKANIE PRODUKCJI TREHALOZY W ROŚLINACH

ENGINEERING OF TREHALOSE-PRODUCT1ON IN PLANTS część podziemna sink.

produkty fotosyntezy z liści photosynduite from leąf

Fig. 1

179 629

Fig. 2

179 629 cO

CN

CN co 0 0

0 o 0

Ul u 0

Ul u 0 0 0 u u 0 0

0 0 0 co

Ci

CN co

CN

Fig. 3

179 629

Fig. 4

179 629

Fig. 5

179 629

Spc

HindlH

Fig. 6

pM0G18Q

Fig. 7

179 629

Fig-8

179 629

SON

ω (D fig. 9

179 629

Km

ΗΡΤ

LB NOS

pMOGOOI

NOS

ECORI

Fig. 10

PROMOTOR 353 CAMV

CaMV 35S PROMOTER

ECORI

CaMV 35S PROMOTER +AMVLEADER

PROMOTOR 35S CaMV + LIDER AMV

ANTISENSESPS FRAGMENT

FRAGMENT ANTYSENSOWNEJ SPS

179 629

Fig- 11

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (20)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kwas nukleinowy, który, gdy jest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy, i który zawiera sekwencję DNA kodującą syntazę trehalozofosforanową obejmującą otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną z SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93.
2. 2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, w którym region inicjacji transkrypcji zawiera region promotorowy DNA kodującego 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora i region terminacji transkrypcji z genu dla syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens.
3. 3. Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca gen mogący podlegać ekspresji w roślinie, która obejmuje w kolejności:

   (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej, która obejmuje otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93; oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w gospodarzu roślinnym, oraz

   A. gen mogący podlegać ekspresji w roślinie, zawierający w kolejności:

   (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującąRNA, którajest co najmniej częściowo komplementarna do sekwencji RNA kodującej enzym syntazę sacharozofosforanową (SPS) naturalnie występujący w tym gospodarzu roślinnym, oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, którajest funkcjonalna w gospodarzu roślinnym, lub B. gen mogący podlegać ekspresji w roślinach, zawierający w kolejności:

   (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w tym gospodarzu roślinnym (b) sekwencję DNA kodującąRNA, którajest co najmniej częściowo komplementarna do sekwencji RNA kodującej enzym pirofosforylazę ADP-glukozową naturalnie występujący w gospodarzu roślinnym, oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, którajest funkcjonalna w gospodarzu roślinnym, lub zarówno A i B.
4. 4. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 3, w której region inicjacji transkrypcji zawiera region promotorowy DNA, kodującego 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora i region terminacji transkrypcji z genu dla syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens.
5. 5. Wektor do klonowania, zawierający kwas nukleinowy który, gdyjest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy, i który zawiera w kolejności:

   (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej, która obejmuje otwartąramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleino-

   179 629 wy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93; oraz ewentualnie (c ) sekwencję tenninacji transkrypcji, przy czym wektor korzystnie jest wektorem binarnym.
6. 6. Wektor według zastrz. 5, znamienny tym, że region inicjacji transkrypcji zawiera region promotorowy DNA kodującego 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora i region terminacji transkrypcji z genu dla syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens.
7. 7. Wektor do klonowania według zastrz. 5, znamienny tym, że jest binarnym wektorem pMOG799, który jest zdeponowany w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr CBS 430.93, przy czym ten binarny wektor zawiera gen syntazy trehalozofosforanowej E. coli jak przedstawiony w SEKW. NR ID: 2.
8. 8. Mikroorganizm zawierający wektor, który zawiera w kolejności:

   (a) region inicjacji transkrypcji, który jest fiankcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej, która obejmuje otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93; oraz ewentualnie

   c) sekwencję terminacji transkrypcji, przy czym wektor korzystnie jest wektorem binarnym, a mikroorganizm jest najkorzystniej z rodzaju Agrobacterium.
9. 9. Sposób otrzymywania rośliny lub komórki roślinnej ze zwiększoną zdolnością do wytwarzania trehalozy, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

   (1) wprowadzenie do roślinnej komórki biorcy kwasu nukleinowego mogącego podlegać ekspresji w roślinie, który, jeżeli jest wyrażony w roślinie lub komórce roślinnej, zwiększa zawartość trehalozy w roślinie lub komórce roślinnej, który zawiera sekwencję DNA kodującąsyntazę trehalozofosforanową obejmującą otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93, oraz gen mogący podlegać ekspresji w roślinie, który zawiera w kolejności:

   (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą marker selekcyjny, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, oraz ewentualnie (c) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w gospodarzu roślinnym, (2) wytworzenie rośliny ze stransformowanych komórek w warunkach, które umożliwiają selekcję na obecność markera selekcyjnego.
10. 10. Zrekombinowany roślinny genomowy DNA, zawierający kwas nukleinowy, który, gdy jest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy i który zawiera w kolejności;

    (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej przedstawionej przez sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2, korzystnie DNA kodujący syntazę trehalozofosforanową, który obejmuje otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93 i (c) sekwencję terminacji transkrypcji.
11. 11. Zrekombinowany roślinny genomowy DNA według zastrz. 10, znamienny tym, że zawiera dodatkowo gen mogący podlegać ekspresji w roślinie zdolny do hamowania biosyntezy aktywności syntazy sacharozofosforanowej lub aktywności pirofosforylazy ADP-glukozowej lub obu aktywności.
12. 12. Komórka roślinna zawierająca zrekombinowany genomowy DNA roślinny, który zawiera kwas nukleinowy, który, gdy jest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy, i który zawiera w kolejności:

    (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym,

    179 629 (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej, która obejmuje otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawionąw SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Vbor Schimmelcultures pod nr 430.93; i (c) sekwencję terminacji transkrypcji, która jest funkcjonalna w gospodarzu roślinnym.
13. 13. Komórka roślinna według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera jeszcze gen mogący podlegać ekspresji w roślinie zdolny do hamowania biosyntezy aktywności syntazy sacharozofosforanowej lub aktywności pirofosforylazy ADP-glukozowej lub obu aktywności.
14. 14. Kultura komórek roślinnych obejmująca komórki roślinne zawierające zrekombinowany roślinny genomowy DNA, który zawiera kwas nukleinowy który, gdy jest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy i który zawiera w kolejności:

    (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej przedstawionej przez sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2, korzystnie DNA kodujący syntazę trehalozofosforanową, obejmujący otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93 i (c) sekwencję terminacji transkrypcji.
15. 15. Kultura komórek roślinnych obejmująca komórki roślinne zawierające zrekombinowany roślinny genomowy DNA, który zawiera kwas nukleinowy, który, gdy jest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy i który zawiera w kolejności:

    (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej przedstawionej przez sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2, korzystnie DNA kodujący syntazę trehalozofosforanową który obejmuje otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93 i (c) sekwencję terminacji transkrypcji, przy czym zrekombinowany genomowy DNA zawiera jeszcze gen mogący podlegać ekspresji w roślinie zdolny do hamowania biosyntezy aktywności syntazy sacharozofosforanowej lub aktywności pirofosforylazy ADP-glukozowej lub obu aktywności.
16. 16. Sposób konserwowania rośliny lub części rośliny w obecności trehalozy, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (1) hodowanie rośliny zawierającej zrekombinowany genomowy roślinny DNA, który zawiera kwas nukleinowy, który, gdy jest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy i który zawiera w kolejności:

    (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej przedstawionej przez sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2, korzystnie DNA kodujący syntezę trehalozo fosforanową który obejmuje otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawionąw ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawionąw SEKW. NR ID.: 2 lub kwas nukleinowy, jak obecny w pMOG799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93 i (c) sekwencję terminacji transkrypcji, (2) zbieranie rośliny lub części rośliny, która zawiera trehalozę, oraz (3) suszenie powietrzem rośliny lub części rośliny lub alternatywnie, (4) suszenie w stanie zamrożenia rośliny lub części rośliny.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że hoduje się roślinę zawierającązrekombinowany genomowy roślinny DNA, który zawiera dodatkowo gen mogący podlegać ekspresji w roślinie zdolny do hamowania biosyntezy aktywności syntazy sacharozofosforanowej lub aktywności pirofosforylazy ADP-glukozowej lub obu aktywności.

    179 629
18. 18. Sposób wytwarzania trehalozy, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (1) hodowanie rośliny lub jej części zawierającej zawierającej zrekombinowany genomowy roślinny DNA, zawierający kwas nukleinowy, który, gdy jest wyrażony w roślinie lub w komórce roślinnej, zwiększa w nich zawartość trehalozy i który zawiera w kolejności:

    (a) region inicjacji transkrypcji, który jest funkcjonalny w gospodarzu roślinnym, (b) sekwencję DNA kodującą aktywność syntazy trehalozofosforanowej przedstawionej przez sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2, korzystnie DNA kodujący syntazę trehalozofosforanową, który obejmuje otwartą ramkę odczytu genu otsA z E. coli przedstawioną w SEKW. NR.: 2 lub kwas nukleinowy, j ak obecny w pM0G799 zdeponowanym w Centraal Bureau Voor Schimmelcultures pod nr 430.93; i (c) sekwencję terminacji transkrypcji, (2) zbieranie rośliny lub jej części, (3) izolowanie trehalozy z rośliny lub jej części.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że hoduje się roślinę zawierającązrekombinowany genomowy roślinny DNA, który zawiera jeszcze gen mogący podlegać ekspresji w roślinie zdolny do hamowania biosyntezy aktywności syntazy sacharozofosforanowej lub aktywności pirofosforylazy ADP-glukozowej lub obu aktywności.
20. 20. Wyizolowana sekwencja DNA kodująca aktywność syntazy trehalozofosforanowej E. coli pełnej długości o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID: 3 lub jej funkcjonalną pochodną korzystnie sekwencja DNA przedstawiona w SEKW. NR ID:2.

    * * *