DE69434173T2 - Herstellung von trehalose in pflanzen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Modifizierung des pflanzlichen Kohlehydratstoffwechsels unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, rekombinante DNA zur Verwendung darin, sowie Pflanzen und Teile von Pflanzen mit einem modifizierten genetischen Aufbau. Die Pflanzen können zur Extraktion spezifischer Kohlehydratverbindungen verwendet werden, oder alternativ können sie als Lebensmittel, Futter oder Bestandteile davon mit verbesserten Eigenschaften aufgrund der Gegenwart der Kohlehydratverbindung, z. B. während der Verarbeitung, verarbeitet werden.
  • Stand der Technik
  • Trehalose ist ein allgemeiner Name, der D-Glucosyl-D-glucosiden gegeben wird, die Disaccharide auf Basis von zwei α-, α,β- und β,β-verknüpften Gucosemolekülen umfassen. Trehalose und speziell α-Trehalose (1-(O-α-D-Glucopyranosyl)-1'-O-α-D-glucopyranose) ist ein weit verbreitetes natürlich vorkommendes Disaccharid.
  • Die chemische Synthese von Trehalose ist schwierig (Schutzgruppen erforderlich) und ineffizient. Derzeitige natürliche Quellen für Trehalose sind Pilze und die Hefe Saccharomyces cerevisiae, die mehr als 10% Trockengewicht als Trehalose anreichern kann. Jedoch wird die Erzeugung durch eine hohe Trehalaseaktivität behindert, die eine schnelle Metabolisierung von Trehalose verursacht. A. D. Elbein (1974, Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem. 30, 227–256) liefert eine Übersicht über das Auftreten und den Metabolismus des Disaccharids Trehalose, insbesondere α,α-Trehalose, in lebenden Organismen. In Pflanzen wurde die Gegenwart von Trehalose in einigen niederen Pflanzenarten berichtet, sowie in einer Anzahl von höheren Pflanzenarten, die zu den Spermatophyten gehören; Echinops persicus, Carex brunescens; Fagus silvaticus. Jedoch wurden diese Ergebnisse nie fest durch andere Autoren bestätigt (z. B. Kendall et al., 1990, Phytochemistry 29, Nr. 8, 2525–2528). Zum Beispiel geben Kendall et al. (s. o.), die sich auf das Auftreten von Trehalose in Spermatophyten bezogen, an, dass seine Gegenwart nur fest für Kümmelsamen (Carum carvi) dokumentiert wurde. Ein Bericht über die Gegenwart von Trehalose in der Sonnenblume von Cegla et al. (1977, J. Am. Oil Chem. Soc. 59, 150 ff.) wurde von Kandler et al. in Frage gestellt ("The Biochemistry of Plants", Band 3, "Carbohydrates, Structure and Function"; J. Preiss, Hrsg., S. 228. Academic Press) gemäß Kendall et al., 1990 (s. o.). Berichte über Trehalose in der Buche (Fagus sylvaticus) und im Kohl konnten durch andere Autoren nicht verifiziert werden (Kendall et al., 1990, s. o., und Verweise darin).
  • Trotz der offensichtlichen Seltenheit von Tehalose in höheren Pflanzen wurde die Gegenwart von Trehalose-abbauenden Aktivitäten für eine signifikante Anzahl der untersuchten Pflanzenfamilien berichtet. Stabile hohe Trehalaseaktivität wurde in drei Weizenlinien, Strauchkiefer und Selaginella lepidophylla gefunden. Stabile niedrige Trehalaseaktivität wurde in Luzerne, im schwarzen mexikanischen Zuckermais und in der Weißfichte gefunden. Labile moderate Aktivitäten wurden in zwei unterschiedlichen Suspensionen von Canola gefunden, aber diese konnten wahrscheinlich nicht einer spezifischen Trehalaseaktivität zugeschrieben werden. Es wurde berichtet, dass Gerste, Trespe, Soja und Schwarzfichte überhaupt keine Trehalaseaktivität enthalten (Kendall, 1990, s. o.).
  • In Organismen, die sie produzieren können, wird angenommen, dass Trehalose als 6-Phosphat biosynthetisiert wird, wohingegen die Speicherform der freie Zucker ist. Es wird deshalb angenommen, dass Organismen, die Trehalose erzeugen und/oder speichern, eine Phosphatase enthalten, die Trehalose-6-phosphat spalten kann (Elbein, 1974, s. o.). Wenig ist über die Gegenwart spezifischer Trehalosephosphatphosphatasen in höheren Pflanzen bekannt.
  • WO93/17093 A1, veröffentlicht am 02. September 1993, beschreibt die Produktion von Trehalose in Hefe, die transgen für Hefegene ist, die für Trehalosephosphatsynthase kodieren. Es wurde nahegelegt, dass Trehalose auch in höheren Pflanzen unter Verwendung dieser Hefegene hergestellt werden kann, aber es gibt keine tatsächliche Offenbarung der Trehaloseerzeugung in einer Pflanze. Es ist anzumerken, dass WO93/17093 vor dem Einreichungstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, aber nach ihrem Prioritätsdatum.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose in einem pflanzlichen Wirt aufgrund der Gegenwart, in dem pflanzlichen Wirt, eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens vor, das in Reihe umfasst:
    • (a) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (b) eine DNA-Sequenz, die eine Trehalosephosphatsynthase kodiert, die durch die als SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz dargestellt wird, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist.
  • Ferner offenbart wird die Herstellung von Trehalose in einem pflanzlichen Wirt aufgrund der Gegenwart, in dem pflanzlichen Wirt, eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens, das in Reihe umfasst:
    • (d) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (e) eine DNA-Sequenz, die Trehalosephosphatsynthaseaktivität kodiert, und gegebenenfalls
    • (f) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist, und
    eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens, das in Reihe umfasst:
    • (a) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (b) eine DNA-Sequenz, die eine RNA-Sequenz kodiert, die wenigstens teilweise komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die ein natürlich im pflanzlichen Wirt vorkommendes Saccharosephosphatsynthaseenzym (SPS) kodiert, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist.
  • Ferner offenbart wird die Herstellung von Trehalose in einem pflanzlichen Wirt aufgrund der Gegenwart, im pflanzlichen Wirt, eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens, das in Reihe umfasst:
    • (d) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (e) eine DNA-Sequenz, die Trehalosephosphatsynthaseaktivität kodiert, und gegebenenfalls
    • (f) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist, und
    eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens, das in Reihe umfasst:
    • (a) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (b) eine DNA-Sequenz, die eine RNA-Sequenz kodiert, die wenigstens teilweise komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die ein natürlich im pflanzlichen Wirt vorkommendes ADP-Glucosepyrophosphorylaseenzym kodiert, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist.
  • Ferner offenbart wird die Herstellung von Trehalose in einem pflanzlichen Wirt aufgrund der Gegenwart, im pflanzlichen Wirt, eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens, das in Reihe umfasst:
    • (a) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (b) eine DNA-Sequenz, die Trehalosephosphatsynthaseaktivität kodiert, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    und eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens, das in Reihe umfasst:
    • (d) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (e) eine DNA-Sequenz, die eine RNA-Sequenz kodiert, die wenigstens teilweise komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die ein natürlich im pflanzlichen Wirt vorkommendes Saccharosephosphatsynthaseenzym kodiert, und gegebenenfalls
    • (f) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    und eines in einer Pflanze exprimierbaren Gens, das in Reihe umfasst:
    • (g) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (h) eine DNA-Sequenz, die eine RNA-Sequenz kodiert, die wenigstens teilweise komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die ein im pflanzlichen Wirt natürlich vorkommendes ADP-Glucosepyrophosphorylaseenzym kodiert, und gegebenenfalls
    • (i) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf die in einer Pflanze exprimierbaren Gene, die im Verfahren zur Herstellung von Trehalose verwendet werden, sowie auf die Kombination der in einer Pflanze exprimierbaren Gene, sowie auf klonierende Plasmide, Transformationsvektoren, Mikroorganismen, individuelle Pflanzenzellen, die erfindungsgemäße, in einer Pflanze exprimierbare Gene beherbergen.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein rekombinantes pflanzliches DNA-Genom bereit, das ein in einer Pflanze exprimierbares Trehalosephosphatsynthasegen enthält, das darin nicht natürlich vorhanden ist. Weiter offenbart wird ein rekombinantes pflanzliches DNA-Genom, das ein in einer Pflanze exprimierbares Trehalosephosphatsynthasegen, das darin nicht natürlich vorhanden ist, und zusätzlich ein in einer Pflanze exprimierbares Gen, das die Biosynthese einer SPS-Aktivität inhibieren kann, und/oder ein in einer Pflanze exprimierbares Gen umfasst, das die Biosynthese einer AGPase-Aktivität inhibieren kann.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalt einer Pflanze bereit, die Trehalose herstellen kann, umfassend die folgenden Schritte:
    • (1) Einführen, in eine Empfängerzelle, ein in einer Pflanze exprimierbares Gen, das in Reihe umfasst:
    • (a) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (b) eine DNA-Sequenz, die Trehalosephosphatsynthaseaktivität kodiert,
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist, und ein in einer Pflanze exprimierbares Gen, das in Reihe umfasst:
    • (d) eine Transkriptionsstartregion, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (e) eine DNA-Sequenz, die ein selektierbares Markergen kodiert, das funktionell im pflanzlichen Wirt ist, und gegebenenfalls
    • (f) eine Transkriptionsterminationssequenz, die funktionell im pflanzlichen Wirt ist,
    • (2) Erzeugen einer Pflanze aus einer transformierten Zelle unter Bedingungen, die die Selektion auf die Gegenwart des selektierbaren Markergens erlaubt.
  • Die Erfindung umfasst ebenfalls Pflanzen, die (erhöhte Mengen von) Trehalose als Ergebnis einer genetischen Modifikation erzeugen.
  • Die Erfindung umfasst ferner Pflanzen mit einem rekombinanten DNA-Genom, das ein erfindungsgemäßes, in einer Pflanze exprimierbares Gen enthält.
  • Die Erfindung umfasst ebenfalls Pflanzen mit einem rekombinanten DNA-Genom, das ein in einer Pflanze exprimierbares erfindungsgemäßes Gen enthält, und wobei die Pflanzen Trehalose erzeugen.
  • Ferner offenbart werden Pflanzen mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Genom, die eine erhöhte Dürreresistenz aufweisen.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf Teile von erfindungsgemäßen Pflanzen, wie Zellen oder Protoplasten oder Kulturen daraus, Blüten, Früchte, Blätter, Pollen, Wurzeln (einschließlich Haarwurzelkulturen), Samen, Strünke, Knollen (einschließlich sogenannter Mikroknollen) und dergleichen.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Konservierung von Pflanzen oder Pflanzenteilen in Gegenwart von Tehalose, umfassend die folgenden Schritte:
    • (1) Züchten einer erfindungsgemäßen Pflanze, die Trehalose erzeugt,
    • (2) Ernten der Pflanze oder Pflanzenteile, die Trehalose enthalten, und
    • (3) Lufttrocknen der Pflanzen oder Pflanzenteile oder alternativ
    • (4) Gefriertrocknen der Pflanzen oder Pflanzenteile.
  • Die Erfindung umfasst ferner die Pflanzen und Pflanzenteile, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren konserviert wurden.
  • Die Erfindung schließt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose ein, umfassend die folgenden Schritte:
    • (1) Züchten einer Pflanze, die aufgrund eines rekombinanten Pflanzen-DNA-Genoms (erhöhte Mengen von) Trehalose erzeugen kann,
    • (2) Ernten der Pflanze oder des Pflanzenteils,
    • (3) Isolieren der Trehalose aus der Pflanze oder des Pflanzenteils.
  • Die Erfindung schließt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose ein, umfassend die folgenden Schritte:
    • (1) Züchten von Pflanzenzellen in Kultur, die aufgrund eines rekombinanten pflanzlichen DNA-Genoms (erhöhte Mengen von) Trehalose erzeugen können,
    • (2) Isolieren der Trehalose aus der Pflanzenzellkultur.
  • Die Erfindung stellt ferner eine isolierte Nukleinsäuresequenz bereit, die eine Trehalosephosphatsynthaseaktivität kodieren kann. Eine bevorzugte isolierte Nukleinsäuresequenz ist eine aus E. coli erhaltene, noch mehr bevorzugt ist es die in SEQ ID NO: 2 dargestellte isolierte Nukleinsäuresequenz. Eine andere bevorzugte Ausführungsform umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 3 kodiert.
  • Die folgenden Figuren erläutern die Erfindung weiter.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1. Schematische Darstellung von Teilen des Saccharose- und Stärke-Biosynthesestoffwechsels in pflanzlichen Sink-Geweben. Die Figur zeigt, dass das im Blatt durch Photosynthese erzeugte Kohlehydrat über das Phloemgewebe in Form von Saccharose transportiert wird. Bei Eintritt in das Sink wird es durch eine membrangebundene Invertaseaktivität entladen, wodurch die Monozucker Glucose und Fructose geliefert werden. Durch die Wirkung einer Anzahl von enzymatischen Schritten werden diese Monozucker zu Stärke und/oder Saccharose umgewandelt, wie hier grob gezeigt. Es wird angenommen, dass die Glucosemetaboliten G6P und UDPG als Substrate für das TPS-Enzym verwendet werden, das in die Pflanze durch Einführung des pflanzenexprimierbaren otsA-Gens manipuliert wird. Die Figur zeigt, wie die als Substrat verfügbare Menge von UDPG und G6P durch Reduzieren der Mengen der Enzyme SPS und AGPase erhöht wird. Ihre Inhibierung ist mit einem Kreuz markiert.
  • 2. Schematische Karte des EMBL4-Klons 7F11 von Kohara et al. (1987), der das otsBA-Operon aus E. coli enthält. Das 18,8 kb-Insert wurde schraffiert. Die Restriktionsorte für die Enzyme EcoRV und HindIII, die zur Klonierung des otsA-Gens verwendet werden, sind angegeben sowie ihr Abstand in kb in Bezug auf die linke Seite des Inserts. Die otsA- und -B-Gene sind angegeben, die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription (siehe 8, erweiterte Karte).
  • 3. Sequenz der klonierten Kartoffel-SPS-cDNA. Unterstrichen: Mais-SPS-cDNA-Sequenzen, die als Oligonukleotide in der PCR-Amplifikationsreaktion verwendet werden.
  • 4. Schematische Darstellung des binären Vektors pMOG664.
  • 5. Restriktionskarte eines Teils von pTiB6, die zwei in pMOG579 klonierte Fragmente zeigt.
  • 6. Schematische Darstellung von pMOG579, das zur Konstruktion des Helferplasmids ohne T-Region im Agrobacterium-Stamm MOG101 verwendet wird.
  • 7. Schematische Darstellung des Expressionsvektors pMOG180.
  • 8. Erweiterte Karte des EMBL4-Klons 7F11 von Kohara et al. (1987), der das otsBA-Operon aus E. coli enthält. Der Ort des offenen Leserasters (ORF) von TPS ist angegeben (*: HindIII-Orte nicht in der Karte von Kohara et al., s. o., vorhanden).
  • 9. Schematische Darstellung des binären Vektors pMOG799.
  • 10. Schematische Darstellung des binären Vektors pMOG801.
  • 11. Schematische Darstellung des binären Vektors pMOG802.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Kartoffelpflanze, die Trehalose in Knollen aufgrund der Gegenwart eines pflanzenexprimierbaren Gens in der Kartoffelpflanze erzeugen kann, das in Reihe umfasst:
    • (a) eine aus der 35S-RNA von CaMV stammende Transkriptionsstartregion, flankiert stromaufwärts von einem Doppelverstärker,
    • (b) eine DNA-Sequenz, die Trehalosephosphatsynthase kodiert, die die kodierende Region des im otsBR-Operon von E. coli befindlichen otsA-Gens ist,
    • (c) eine aus dem Nopalinsynthase-(nos)-Gen von Agrobacterium stammende Transkriptionsterminationssequenz. Knollen von transgenen Pflanzen, die das pflanzenexprimierbare TPS-Gen enthalten, erzeugten Trehalose, wohingegen Kontrollpflanzen, denen dieses Gen fehlte, das nicht taten. Offensichtlich wird das Trehalosephosphat, das durch die transgenen Knollen erzeugt wird, zu Trehalose umgewandelt. Offensichtlich ist es nicht erforderlich, eine Trehalosephosphatphosphataseaktivität vorzusehen, da sie in der Kartoffel vorhanden zu sein scheint.
  • Ebenfalls veranschaulicht in 1 ist ein Ansatz zur Verbesserung der Substratverfügbarkeit für TPS. Zu diesem Zweck zwei Gene, die die Verfügbarkeit von Glucose-6-phosphat (G6P) und UDPG beeinflussen, an die ein antisense-SPS-Gen und eine antisense-APGase unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors zur Expression in pflanzlichen Wirten kloniert wurden. Falls in einen pflanzlichen Wirt eingeführt, der ein erfindungsgemäßes pflanzenexprimierbares TPS-Gen enthält, wird dies die Substratverfügbarkeit für TPS und deshalb die Trehalosesynthese erhöhen. Es wird einem Fachmann leicht auffallen, dass ebenfalls andere antisense-Gene zur Blockierung der Synthese von Saccharose oder Stärke verwendet werden können, um die Substratverfügbarkeit zu verbessern.
  • Obwohl die Erfindung im Detail für Kartoffelpflanzen beschrieben wird, die ein pflanzenexprimierbares Trehalosephosphatsynthasegen aus E. coli unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors als Transkriptionsstartregion exprimieren, wird es den Fachleuten klar sein, dass andere spermatophytische pflanzliche Wirte gleichfalls zur Erzeugung von Trehalose geeignet sind. Bevorzugte pflanzliche Wirte unter den Spermatophyten sind die Angiospermen, insbesondere die Dicotyledoneae, die u. a. die Solanaceae als eine repräsentative Familie umfassen, und die Monocotyledoneae, die u. a. die Gramineae als eine repräsentative Familie umfassen. Geeignete Wirtspflanzen, wie im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung definiert, schließen Pflanzen (sowie Teile und Zellen der Pflanzen) und ihre Abkömmlinge ein, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken genetisch modifiziert wurden, um die Erzeugung von Trehalose von Interesse in der gewünschten Pflanze oder im gewünschten Pflanzenorgan zu verursachen oder zu erhöhen; diese Pflanzen können direkt verwendet werden (z. B. die Pflanzenarten, die essbare Teile erzeugen) oder nachdem die Trehalose aus dem Wirt gereinigt wurde (sei es von essbaren als auch von unessbaren pflanzlichen Wirten). Erfindungsgemäße Anbauten mit essbaren Teilen schließen diejenigen ein, die Blüten haben, wie Blumenkohl (Brassica oleracea), Artischocke (Cynara scolymus), Früchte, wie Apfel (Malus, z. B. domesticus), Banane (Musa, z. B. acuminata), Beeren (wie die Johannisbeere, Ribes, z. B. rubrum), Kirschen (wie die Süßkirsche, Prunus, z. B. avium), Gurke (Cucumis, z. B. sativus), Weintraube (Vitis, z. B. vinifera), Zitrone (Citrus limon), Melone (Cucumis melo), Nüsse (wie die Walnuss, Juglans, z. B. regia; Erdnuss, Arachis hypogeae), Orange (Citrus, z. B. maxima), Pfirsich (Prunus, z. B. persica), Birne (Pyra, z. B. communis), Pfeffer (Solanum, z. B. capsicum), Pflaume (Prunus, z. B. domestica), Erdbeere (Fragaria, z. B. moschata), Tomate (Lycopersicon, z. B. esculentum), Gräser, wie Luzerne (Medicago sativa), Kohlarten (wie Brassica oleracea), Endivie (Cichoreum, z. B. endivia), Lauch (Allium porrum), Salat (Lactuca sativa), Spinat (Spinacia oleraceae), Tabak (Nicotiana tabacum), Wurzeln, wie Pfeilwurz (Maranta arundinacea), Rübe (Beta vulgaris), Karotte (Daucus carota), Maniok (Manihot esculenta), Steckrübe (Brassica rapa), Rettich (Raphanus sativus), Yamswurzel (Dioscorea esculenta), Süßkartoffel (Ipomoea batatas) und Samen, wie Bohne (Phaseolus vulgaris), Erbse (Pisum sativum), Sojabohne (Glycin max), Weizen (Triticum aestivum), Gerste (Hordeum vulgare), Mais (Zea mays), Reis (Oryza sativa), Knollen, wie Kohlrabi (Brassica oleraceae), Kartoffel (Solanum tuberosum), und dergleichen. Die essbaren Teile können durch Trocknen in Gegenwart von erhöhten, darin erzeugten Trehalosemengen aufgrund der Gegenwart eines pflanzenexprimierbaren Trehalosephosphatsynthasegens konserviert werden. Es kann vorteilhaft sein, erhöhte Mengen von Trehalose zu erzeugen, indem man die DNA, die die TPS-Aktivität kodiert, unter die Kontrolle eines pflanzengewebe- oder gewebespezifischen Promotors stellt; dessen Wahl kann leicht durch die Fachleute bestimmt werden.
  • Jedes Trahalosephosphatsynthasegen unter der Kontrolle regulatorischer Elemente, die zur Expression von DNA in Pflanzenzellen notwendig sind, entweder spezifisch oder konstitutiv, kann verwendet werden, solange es eine aktive Trehalosephosphatsynthaseaktivität erzeugen kann. Die in SEQ ID NO: 2 dargestellte in Nukleinsäuresequenz, tatsächlich jedes offene Leseraster, das eine Trehalosephosphatsynthaseaktivität gemäß der Erfindung kodiert, kann ohne notwendigerweise Verändern der Aminosäuresequenz des dadurch kodierten Proteins verändert werden. Diese Tatsache wird durch die Entartung des genetischen Codes verursacht. So kann das offene Leseraster, das die Trehalosephosphatsynthaseaktivität kodiert, an die Kodonenverwendung in der Wirtspflanze der Wahl angepasst werden.
  • Auch die durch SEQ ID NO: 2 dargestellte isolierte Nukleinsäuresequenz kann zur Identifizierung von Trehalosephosphatsynthaseaktivitäten in anderen Organismen und anschließende Isolierung durch Hybridisieren von DNA aus anderen Quellen mit einem aus dem E. coli-Gen erhältlichen DNA- oder RNA-Fragment verwendet werden. Bevorzugt werden solche DNA-Sequenzen durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen (wie Temperatur und Ionenstärke der Hybridisierungsmischung) durchmustert. Ob Bedingungen stringent sind oder nicht, hängt ebenfalls von der Natur der Hybridisierung ab, d. h. DNA : DNA, DNA : RNA, RNA : RNA, sowie von der Länge des kürzesten hybridisierenden Fragments. Die Fachleute können leicht ein stringentes Hybridisierungsschema einrichten.
  • Quellen zur Isolierung von Trehalosephosphatsynthaseaktivitäten schließen Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Hefe, Pilze), Pflanzen, Tiere und dergleichen ein. Isolierte DNA-Sequenzen, die Trehalosephosphataktivität kodieren, aus anderen Quellen können gleichsam in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Trehalose verwendet werden.
  • Die Erfindung umfasst ebenfalls Nukleinsäuresequenzen, die durch Modifizieren der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz erhalten wurden, indem ein oder mehrere Kodonen mutiert wurden, so dass dies zu Aminosäureveränderungen im kodierten Protein führt, solange die Mutation der Aminosäuresequenz nicht völlig die Trehalosephosphatsynthaseaktivität aufhebt.
  • Prinzipiell ist jeder pflanzliche Wirt geeignet in Kombinationen mit einem beliebigen pflanzenexprimierbaren Trehalosephosphatsynthasegen. Wenn Trehalosegene aus anderen Quellen verfügbar werden, können sie in einer ähnlichen Weise verwendet werden, um eine pflanzenexprimierbare Trehalosephosphatsynthasegenkombination wie hier beschrieben zu erhalten.
  • Die Inhibierung endogener Gene zur Steigerung der an Substratverfügbarkeit für die Trehalosephosphatsynthase, wie es hier mit der Inhibierung des endogenen Saccharosephosphatsynthasegens und des ADP-Glucosepyrophosphorylasegens exemplarisch dargestellt wird, kann in einer Anzahl von Wegen durchgeführt werden, deren Wahl nicht kritisch für die Erfindung ist. Bevorzugt wird die Geninhibierung durch den sogenannten "antisense-Ansatz" erreicht. Hierin wird eine DNA-Sequenz exprimiert, die eine RNA erzeugt, die wenigstens teilweise komplementär mit der RNA ist, die die enzymatische Aktivität kodiert, die blockiert werden soll (z. B. AGP-ase oder SPS in den Beispielen). Es ist bevorzugt, homologe antisense-Gene zu verwenden, da diese wirksamer als heterologe Gene sind. Die Isolierung eines antisense-SPS-Gens aus der Kartoffel unter Verwendung einer Mais-SPS-Gensequenz als Sonde dient zur Veranschaulichung der Durchführbarkeit dieser Strategie. Dies soll nicht bedeuten, dass zur Durchführung der Erfindung die Verwendung homologer antisense-Fragmente erforderlich ist. Ein alternatives Verfahren zur Blockierung der Synthese ungewünschter enzymatischer Aktivitäten ist die Einführung, in das Genom des pflanzlichen Wirts, einer zusätzlichen Kopie eines endogenen Gens, das im pflanzlichen Wirt vorhanden ist. Es wird häufig beobachtet, dass eine solche zusätzliche Kopie eines Gens das endogene Gen zum Schweigen bringt: diese Wirkung wird in der Literatur als kosuppressive Wirkung oder Kosuppression bezeichnet.
  • Prinzipiell können sowohl zweikeimblättrige als auch einkeimblättrige Pflanzen, die der Transformation zugänglich sind, durch Einführen eines pflanzenexprimierbaren Gens gemäß der Erfindung in eine Empfängerzelle und Züchten einer neuen Pflanze, die das pflanzenexprimierbare Gen beherbergt und exprimiert, modifiziert werden. Bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind diejenigen, die Trehalosephosphat zu Trehalose umwandeln können, und die keine oder wenig Trehaloseabbauaktivität enthalten. Es versteht sich, dass Pflanzen, denen die Fähigkeit zur Umwandlung des Trehalosephosphats zu Trehalose fehlt, ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Diese Pflanzen können weiter durch Einführen zusätzlicher Gene modifiziert werden, die Phosphatasen kodieren, die Trehalosephosphat zu Trehalose umwandeln können. Prinzipiell werden auch Pflanzen vorgesehen, die Trehalasen enthalten, da diese Pflanzen zur Herstellung von Trehalose geeignet gemacht werden können, indem die Aktivität solcher Enzyme inhibiert wird, z. B. durch Inhibierung der Expression der Gene, die solche Enzyme kodieren, unter Verwendung des antisense-Ansatzes.
  • Das Verfahren zur Einführung des pflanzenexprimierbaren Trehalosephosphatsynthasegens in eine Empfängerpflanzenzelle ist nicht entscheidend, solange das Gen stabil in das Genom in der Pflanzenzelle eingeführt wird. Zusätzlich zur Verwendung von Stämmen der Gattung Agrobacterium sind verschiedene andere Techniken zur Einführung von DNA in Pflanzenzellen verfügbar, wie die Transformation von Protoplasten unter Verwendung des Calcium/Polyethylenglykolverfahrens, die Elektroporation und die Mikroinjektion oder Bombardierung mit (umhüllten) Partikeln (Potrykus, 1990, Bio/Technol. 8, 535–542).
  • Zusätzlich zu diesen sogenannten direkten DNA-Transformationsverfahren sind Transformationssysteme weithin verfügbar, die Vektoren beinhalten, wie virale Vektoren (z. B. aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)) und bakterielle Vektoren (z. B. aus der Gattung Agrobacterium) (Potrykus, 1990, Bio/Technol. 8, 535–542). Nach Selektion und/oder Durchmusterung können die Protoplasten, Zellen oder Pflanzenteile, die transformiert wurden, zu ganzen Pflanzen unter Verwendung von fachbekannten Verfahren regeneriert werden (Horsch et al., 1985, Science 225, 1229–1231).
  • Es wurde gezeigt, dass einkeimblättrige Pflanzen der Transformation zugänglich sind, und das fruchtbare transgene Pflanzen aus transformierten Zellen regeneriert werden können. Die Entwicklung von reproduzierbaren Gewebekultursystemen für diese Anbauten zusammen mit den mächtigen Verfahren zur Einführung von genetischem Material in Pflanzenzellen hat die Transformation erleichtert. Derzeit sind bevorzugte Verfahren zur Transformation von Monokotyledonen die Mikroprojektilbombardierung von Explantaten oder Suspensionszellen und die direkte DNA-Aufnahme oder Elektroporation (Shimamoto et al., 1989, Nature 338, 274–276). Transgene Maispflanzen wurden durch Einführen des Streptomyces hygroscopicus bar-Gens, das Phosphinothricinacetyltransferase kodiert (ein Enzym, das das Herbizid Phosphinothricin inaktiviert), in embryogene Zellen einer Maissuspensionskultur durch Mikroprojektilbombardierung erhalten (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2, 603–618). Die Einführung von genetischem Material in Aleuronprotoplasten anderer einkeimblättriger Anbauten, wie Weizen und Gerste, wurde berichtet (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21–30). Weizenpflanzen wurden aus embroyogener Suspensionskultur durch Selektieren nur des gealteten Kompakts und der knötchenförmigen embryogenen Kallusgewebe zur Einrichtung der embryogenen Suspensionskulturen regeneriert (Vasil, 1990 Bio/Technol. 8, 429–434). Die Kombination mit Transformationssystemen für diese Anbauten ermöglicht die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf Monokotyledonen. Diese Verfahren können ebenfalls zur Transformation und Regeneration von Dikotyledonen angewendet werden.
  • Einkeimblättrige Pflanzen, einschließlich kommerziell wichtiger Anbauten, wie Mais, sind dem DNA-Transfer durch Agrobacterium-Stämme zugänglich (europäisches Patent 0 159 418 B1; J. Gould, D. Michael, O. Hasegawa, EC. Ulian, G. Peterson, RH. Smith (1991), Plant. Physiol. 95, 426–434).
  • Bezüglich der Wahl der Wirtspflanze ist es bevorzugt, Pflanzenarten mit wenig oder keiner Trehaloseabbauaktivität auszuwählen. Jedoch sind Pflanzen, die Trehalaseaktivität aufweisen, nicht davon ausgeschlossen, eine geeignete Wirtspflanze zur Herstellung von Trehalose zu sein, obwohl es notwendig sein kann, die Inhibierung der Trehalaseaktivität vorzusehen, falls diese die Anreicherung von Trehalose insgesamt verhindert. Eine solche Inhibierung kann unter Verwendung des antisense-Ansatzes, der allgemein fachbekannt ist, erreicht werden und wird für andere Zwecke in dieser Beschreibung veranschaulicht.
  • Es versteht sich ebenfalls, dass die Erfindung nicht auf die Verwendung des CaMV 35S-Promotors als Transkriptionsregion beschränkt ist. Geeignete DNA-Sequenzen zur Kontrolle von Expression der pflanzenexprimierbaren Gene, einschließlich Markergene, wie Transkriptionsstartregionen, Enhancer, nicht-transkribierte Leitsequenzen und dgl., können aus jedem Gen abgeleitet werden, das in einer Pflanzenzelle exprimiert wird, wie endogene Pflanzengene, Gene, die natürlich in Pflanzenzellen exprimiert werden, wie diejenigen, die sich auf T-DNA vom Wildtyp von Agrobacterium befinden, Gene von Pflanzenviren sowie andere eukaryontische Gene, die eine Transkriptionsstartregion einschließen, die mit der Konsensussequenz für den eukaryontischen Transkriptionsstart übereinstimmen. Ebenfalls beabsichtigt sind Hybridpromotoren, die funktionelle Teile verschiedener Promotoren oder synthetische Äquivalente davon kombinieren. Neben konstitutiven Promotoren können induzierbare Promotoren oder Promotoren, die ansonsten in ihrem Expressionsmuster reguliert werden, z. B. entwicklungsspezifisch oder zelltypspezifisch, zur Steuerung der Expression der erfindungsgemäßen pflanzenexprimierbaren Gene verwendet werden, solange sie in Pflanzenteilen epxrimiert werden, die Substrat für TPS enthalten.
  • Zur Selektion oder Durchmusterung auf transformierte Zellen ist es bevorzugt, ein Markergen einzuschließen, das an das erfindungsgemäße und auf eine Pflanzenzelle zu übertragende pflanzenexprimierbare Gen gebunden sind. Die Wahl eines geeigneten Markergens in der Pflanzentransformation ist allgemein im Umfang des Durchschnittstechnikers; einige Beispiele für routinemäßig verwendete Markergene sind die Neomycinphosphotransferasegene, die Resistenz gegen Kanamycin verleihen (EP-B 0 131 623), das Glutathion-S-transferasegen aus Rattenleber, das Resistenz gegen aus Glutathion stammende Herbizide verleiht (EP-A 0 256 223), Glutaminsynthetase, die Überexpressionsresistenz gegenüber Glutaminsynthetaseinhibitoren verleiht, wie Phosphinothricin (WO 87/05327), das Acetyltransferasegen aus Streptomyces viridochromogenes, das Resistenz gegen das selektive Mittel Phosphinothricin verleiht (EP-A 0 275 957), das Gen, das eine 5-Enolshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) kodiert, die Toleranz gegen N-Phosphonomethylglycin verleiht, das bar-Gen, das Resistenz gegen Bialaphos verleiht (z. B. WO 91/02071) und dergleichen. Die tatsächliche Wahl des Markers ist nicht wesentlich, solange er funktionell (d. h. selektiv) in Kombination mit den Pflanzenzellen der Wahl ist.
  • Das Markergen und das interessierende Gen müssen nicht verbunden sein, da die Kotransformation unverbundener Gene ( US-PS 4,399,216 ) ebenfalls ein wirksames Verfahren in der Pflanzentransformation ist.
  • Bevorzugtes Pflanzenmaterial zur Transformation, speziell für zweikeimblättrige Anbauten, sind Blattscheiben, die leicht transformiert werden können und eine gute regenerative Fähigkeit besitzen (R. B. Horsch et al. (1985), Science 227, 1229–1231).
  • Obwohl die Herstellung von Trehalose mit dem pflanzenexprimierbaren Trehalosephosphatsynthasegen als einziges kohlehydratmodifizierendes Gen erreicht werden kann, wird die Erfindung weiter mit Beispielen für zusätzliche pflanzenexprimierbare antisense-Gene veranschaulicht, die eine Zunahme der Verfügbarkeit des Substrats zur Trehalosephosphatsynthase bewirken können. Spezifische Beispiele für solche Gene sind die pflanzenexprimierbaren antisense-Gene für SPS aus Mais und Kartoffel und AGPase aus Kartoffel. Die Abregulation von kohlehydratmodifizierenden Enzymen unter Verwendung des antisense-Ansatzes wird nicht durch die spezifischen Beispielen beschränkt. Zum Beispiel können teilweise komplementäre pflanzenexprimierbare antisense-Gene verwendet werden, um die Expression eines Zielgens zu inhibieren, solange das pflanzenexprimierbare antisense-Gen ein Transkript erzeugt, das ausreichend komplementär zum Transkript des Zielgens ist und ausreichend lang, um die Expression des Zielgens zu inhibieren.
  • Es ist unwesentlich für die Erfindung, wie die Gegenwart von zwei oder mehr Genen in der gleichen Pflanze bewirkt wird. Dies kann unter anderem durch eines der folgenden Verfahren erreicht werden:
    • (a) Transformation der Pflanzenlinie mit einem Multigenkonstrukt, das mehr als ein einzuführendes Gen enthält,
    • (b) Kotransformation unterschiedlicher Konstrukte auf die gleiche Pflanzenlinie gleichzeitig,
    • (c) anschließende Runden der Transformation der gleichen Pflanze mit den einzuführenden Genen,
    • (d) Kreuzen von zwei Pflanzen, die jeweils ein unterschiedliches, in die gleiche Pflanze einzuführendes Gen enthalten.
  • Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt sowohl in der Landwirtschaft als auch im Gartenbau, z. B. aufgrund verbesserter Eigenschaften der modifizierten Pflanzen als solche, sowie in jeder Form von Industrie, in der Trehalose eingesetzt wird oder werden wird. Trehalosephosphat und Trehalose können als solche verwendet werden, z. B. in gereinigter Form oder in Gemischen, oder in Form eines Speicherprodukts in Pflanzenteilen. Pflanzenteile, die (erhöhte Mengen von) Trehalosephosphat oder Trehalose beherbergen, können als solche verwendet oder ohne Notwendigkeit zur Hinzufügung von Trehalose verarbeitet werden.
  • Ebenfalls kann Trehalose aus den Pflanzen oder Pflanzenteilen, die sie erzeugen, gereinigt und anschließend in einem Industrieverfahren verwendet werden. In den Lebensmittelindustrien kann Trehalose durch Zugeben von Trehalose zu Lebensmitteln vor dem Trockenen eingesetzt werden. Das Trocknen von Lebensmitteln ist ein wichtiges Konservierungsverfahren in der Industrie. Trehalose scheint besonders nützlich zur Konservierung von Lebensmittelprodukten durch die herkömmliche Lufttrocknung zu sein und eine schnelle Rekonstituierung bei Zugabe von Wasser für ein hochqualitatives Produkt zu erlauben (Roser et al., Juli 1991, Trends in Food Science and Technology, S. 166–169). Die Vorteile schließen die Retention natürlicher Geschmacksstoffe/Duftstoffe, des Geschmacks des frischen Produkts und des Nährwerts (Proteine und Vitamine) ein. Es wurde gezeigt, dass Trehalose die Fähigkeit zur Stabilisierung von Proteinen und Membranen und zur Bildung eines chemisch inerten, stabilen Glases hat. Die geringe Wasseraktivität solcher sorgfältig getrockneten Lebensmittelsprodukte verhindert chemische Reaktionen, die ein Verderben verursachen könnten.
  • Feldfrüchte, wie Mais, Maniok, Kartoffel, Zuckerrübe und Zuckerrohr, werden seit langem als natürliche Quelle für die Massekohlehydraterzeugung (Stärken und Saccharose) verwendet. Die Herstellung von Trehalose in solchen Anbauten, erleichtert durch Genmanipulation des Trehalose-Biosynthesestoffwechsels in diesen Pflanzenarten, würde die Ausnutzung solcher manipulierter Anbauten für die Trehaloseerzeugung erlauben.
  • Alle in dieser Beschreibung zitierten Verweise sind indikativ für den Grad des Fachmanns, auf den sich die Erfindung richtet. Alle Veröffentlichungen, ob Patente oder anders, die zuvor oder später in dieser Beschreibung bezeichnet werden, werden hier durch Verweis eingeführt, als ob jedes davon individuell durch Verweis eingeführt wäre.
  • Die nachfolgend angegebenen Beispiele werden nur für Zwecke der Ausführbarkeit angegeben und sind nicht zur Beschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt.
  • Experimenteller Teil
  • DNA-Manipulationen
  • Alle DNA-Verfahren (DNA-Isolierung von E. coli, Restriktion, Ligierung, Transformation, etc.) werden gemäß Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York).
  • Stämme
  • In allen Beispielen wird der E. coli K-12-Stamm DH5α zur Klonierung verwendet. Der für Pflanzentransformationsexperimente verwendete Stamm von Agrobacterium tumefaciens ist im MOG101, das ein nicht-onkogener Helferstamm vom Octopintyp ist, abgeleitet aus LBA1010 (Koekman et al. (1982), Plasmid 7, 119) durch Substitution der T-DNA mit einem Spectinomycinresistenzmarker.
  • Konstruktion von Agrobacterium-Stamm MOG101
  • Ein binäres Vektorsystem (A. Hoekema, P. R. Hirsch, P. J. J. Hooykaas und R. A. Schilperoort, Nature 303, 179 (1983)) wird zur Übertragung von Genkonstrukten in Kartoffel- und Tabakpflanzen verwendet. Das Helferplasmid, das die Agrobacterium tumefaciens-Virulenzfunktionen überträgt, stammt aus dem Octopin-Ti-Plasmid pTiB6. MOG101 ist ein Agrobacterium tumefaciens-Stamm, der ein nicht-onkogenes Ti-Plasmid trägt (Koekman et al., 1982, s. o.), aus dem die gesamte T-Region deletiert und durch einen bakteriellen Spectinomycinresistenzmarker aus Transposon Tn1831 substituiert ist (Hooykaas et al., Plasmid 4, 64–75 (1980)).
  • Das Ti-Plasmid pTiB6 enthält zwei benachbarte T-Regionen, TL (T-links) und TR (T-rechts). Zum Erhalt eines Derivats, dem die TL- und TR-Regionen fehlen, konstruierten wir den intermediären Vektor pMOG579. Das Plasmid pMOG579 ist ein pBR322-Derivat, das 2 Ti-Plasmidfragmente enthält, die homolog zu den Fragmenten sind, die sich links und rechts außerhalb der T-Regionen von pTiB6 befinden (schattiert in 5 und 6). Die 2 Fragmente sind in pMOG579 durch ein 2,5 kb BamHI–HindIII-Fragment aus Transposon Tn1831 getrennt (Hooykaas et al., Plasmid 4, 64–75 (1980)), das den Spectinomycinresistenzmarker trägt (6). Das Plasmid wird in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA1010 [C58-C9 (pTiB6) = ein geheilter C58-Stamm, in den pTiB6 eingeführt ist (Koekman et al. (1982), s. o.)] durch triparentale Paarung aus E. coli unter Verwendung von HB101 8pRK2013 als Helfer eingeführt. Transkonjuganten werden auf Resistenz gegen Rifampicin (20 mg/l) und Spectinomycin (250 mg/l) selektiert. Eine Doppelrekombination zwischen pMOG579 und pTiB6 führte zu einem Verlust an Carbenicillinresistenz (der pBR322-Marker) und zu Deletion der gesamten T-Region. Von 5.000 spectinomycinresistenten Transkonjuganten, die auf Carbenicillin (100 mg/l) Replika-plattiert wurden, werden 2 als empfindlich festgestellt. Southern-Analyse (nicht gezeigt) zeigte, dass ein doppeltes Crossing-over-Ereignis die gesamte T-Region deletiert hatte. Der resultierende Stamm wird MOG101 genannt. Dieser Stamm und seine Konstruktion sind analog zu Stamm GV2260 (Deblaere et al., Nucl. Acid Res. 13, 4777–4788 (1985)).
  • Ein alternativer Helferstamm für MOG101 ist z. B. LBA4404; dieser Stamm kann ebenfalls geeignet zur Einführung eines binären Plasmids, wie pMOG799, und anschließende Pflanzentransformation verwendet werden. Andere geeignete Helferstämme sind leicht verfügbar.
  • Konstruktion des Expressionsvektors pMOG180
  • Der Expressionsvektor pMOG180 ist ein Derivat von pMOG18 ( EP 0 479 359 A1 , Beispiel 2b), worin das für GUS kodierende Gen entfernt ist und andere Gene zwischen die AlMV-RNA4-Leitsequenz und den 3' nos-Terminator als ein BamHI-Fragment inseriert werden können.
  • Für diesen Zweck wird das EcoRI/NcoI-Fragment aus pMOG18, das den 35S-Promotor und AlMV-RNA4-Leitsequenzen enthält, unter Verwendung der PCR-Technik mit den Primersätzen 5' GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA 3' und 5' CAGCTATGACCATGATTACG 3' synthetisiert, wodurch der NcoI-Ort in einen BamHI-Ort mutiert wird. Der pMOG18-Vektor wird dann mit EcoRI und BamHI ausgeschnitten, worauf das neu synthetisierte EcoRI/BamHI-Fragment zwischen diese Restriktionsorte ligiert werden kann. Zur Verhinderung von PCR-induzierten statistischen Mutationen in den Promotorsequenzen wird das EcoRI/EcoRV-Fragment im PCR-synthetisierten EcoRI/BamHI-Fragment durch Wildtypfrequenzen von pMOG18 ersetzt. Das kurze EcoRV/BamHI wird auf Mutationen durch Sequenzierung überprüft. Der resultierende Expressionsvektor ist das Plasmid pMOG180 (7).
  • Triparentale Paarungen
  • Die binären Vektoren werden in triparentalen Paarungen mit dem E. coli-Stamm HB101, der das Plasmid pRK2013 enthält (G. Ditta, S. Stanfield, D. Corbin und D. R. Helinski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347 (1980)) in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm MOG101 mobilisiert und zur Transformation verwendet.
  • Transformation von Tabak (Nicotiana tabacum SR1)
  • Tabak wird durch Kokultivierung von Pflanzengewebe mit Agrobacterium tumefaciens-Stamm MOG101 (Hoekema et al., Nature 303, 179–180, 1983), der den interessierenden binären Vektor wie beschrieben enthält, transformiert. Die Transformation wird unter Verwendung der Kokultivierung von Tabakblattscheiben (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) wie von Horsch et al. beschrieben (1985, Science 227, 1229–1231) durchgeführt. Transgene Pflanzen werden aus Schösslingen regeneriert, die auf Selektionsmedium wachsen, das entweder Kanamycin oder Hygromycin enthält, abhängig von dem im binären Plasmid vorhandenen Resistenzgen, bewurzelt und in Erde überführt.
  • Transformation von Kartoffel
  • Kartoffel (Solanum tuberosum cv. Désiree) wird mit dem Agrobacterium tumefaciens-Stamm MOG101, der den interessierenden binären Vektor wie beschrieben enthält, transformiert (A. Hoekema, M. J. Huisman, L. Molendijk, P. J. M. Van den Elzen und B. J. C. Cornelissen, Bio/Technology 7, 273 (1989)). Das Grundkulturmedium ist MS30R30, das aus MS-Medium (T. Murashige und F. Skoog, Physiol. Plan. 14, 473 (1962)) besteht, ergänzt mit 30 g/l Saccharose, R3-Vitaminen (G. Ooms et al., M. M. Burrell, A. Karp, M. Bevan und J. Hille, Theor. Appl. Genet. 73, 744 (1987)), 5 μm Zeatinribosid (ZR) und 0,3 μM Indolessigsäure (IAA). Die Medien werden nach Bedarf mit 0,7 g/l Daichin-Agar verfestigt.
  • Knollen von Solanum tuberosum cv. Désiree werden gehäutet und für 20 Minuten in 0,6%iger Hypochloritlösung obenflächensterilisiert, die 0,1% Tween-20 enthält. Die Kartoffeln werden sorgfältig in großen Volumina von sterilem Wasser für wenigstens 2 Stunden gewaschen. Scheiben von ca. 2 mm Dicke werden aus Zylindern aus Knollengewebe geschnitten, die mit einem Korkbohrer hergestellt wurden. Die Scheiben werden für 20 Minuten in einer Suspension inkubiert, die aus dem MS30R3-Medium ohne ZR und IAA besteht und 106–107 Bakterien/ml von Agrobacterium MOG101 enthält, das den binären Vektor enthält. Die Scheiben werden anschließend auf sterilem Filterpapier trocken getupft und auf festes MS30R3-Medium mit ZR und IAA überführt. Die Scheiben werden auf frisches Medium mit 100 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Vancomycin nach 2 Tagen überführt. Eine Woche später werden die Scheiben wieder auf das gleiche Medium überführt, aber diesmal mit 100 mg/l Kanamycin zur Selektion auf transgene Schösslinge. Nach 4 bis 8 Wochen werden Schösslinge, die aus den Scheiben aufgehen, ausgeschnitten und auf Bewurzelungsmedium gegeben (MS30R3-Medium ohne ZR und IAA, aber mit 100 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin. Die Schösslinge werden keimfrei durch Meristemschnitte vermehrt und auf Erde nach Wurzelentwicklung überführt. Nach Bedarf werden 10 mg/l Hygromycin zur Selektion anstelle von 100 mg/l Kanamycin verwendet.
  • Die Transformation von Kartoffel cv. Kardal wurde im wesentlichen wie für cv. Désiree durchgeführt, ausgenommen die folgenden Modifikationen:
    Phytohormone in Grundkulturmedium: Zeatinreibosid 3,5 mg/l; IAA (Indolessigsäure) 0,03 mg/l. Die in der Transformation verwendete Agrobacterium-Suspension enthält 105 bis 106 Bakterien pro ml. Die Konzentration von Kanamycin im Bewurzelungsmedium betrug 50 mg/l.
  • Trehalosetests
  • Trehalose wird im wesentlichen wie von Hottiger et al. beschrieben bestimmt (Hottiger et al, J. Bact. 169, 5518 (1987)). Kartoffelknollengewebe wird in flüssigem Stickstoff eingefroren, mit Mörser und Pistill anschließend für 60 min bei Raumtemperatur in ca. 3 Volumina von 500 mM Trichloressigsäure extrahiert. Nach Zentrifugieren wird das Pellet ein weiteres Mal in der gleichen Weise extrahiert. Die kombinierten Überstände aus den zwei Extraktionen werden auf anthronpositives Material getestet (R. G. Spiro, Meth. Enzymol. 8, 3 (1966)). Trehalose wird qualitativ durch DC bestimmt. Die Extrakte werden entionisiert (Merck, Ionenaustauscher V) und auf Kieselgel 60-Platten (Merck) geladen. Nach dem Entwickeln der Chromatographieplatten mit n-Butanol-Pyridin-Wasser (15 : 3 : 2, V/V) werden Flecken durch Besprühen mit 5 mg/ml Vanillin in konzentriertem H2SO4 und Erwärmen auf 130°C sichtbar gemacht. Handelsübliche Trehalose (Sigma) wurde als Standard verwendet.
  • Alternativ wurde Trehalose quantitativ durch Anionenaustauscherchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion bestimmt. Extrakte wurden durch Zugabe von 1 ml siedendem Wasser auf 1 g gefrorenes Material hergestellt, das anschließend für 15' auf 100°C erwärmt wurde. Proben (25 μl) wurden an einem Dionex DX-300-Flüssigchromatograph analysiert, ausgerüstet mit einer 4 × 250 mm Dionex 35391 Carbopac PA-1-Säule und einer 4 × 50 mm Dionex 43096 Carbopac PA-1-Vorsäule. Die Elution erfolgte mit 100 mM NaOH mit 1 ml/min. Zucker wurden mit einem gepulsten amperometrischen Detektor (Dionex, PAD-2) detektiert. Handelsübliche Trehalose (Sigma) wurde als Standard verwendet.
  • Enzymtests
  • In allen Bestimmungen wurde nicht-transgenes Knollenmaterial oder nicht-transgenes Tabakmaterial als Kontrolle verwendet. Der Proteingehalt in allen Proben wird wie von Bradford beschrieben bestimmt (Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)). Für Tests an Knollenextrakten werden gefrorene Kartoffelknollenscheiben von ca. 100 mg in 100 μl 20 mM HEPES pH 7,4 homogenisiert und zentrifugiert (Eppendorf, 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit). Der Überstand wird für die Aktivitätstests verwendet. SPS-Aktivität – Die SPS-Aktivität wurde im wesentlichen wie von J. Amir und J. Preiss beschrieben bestimmt (Plant Physiol. 69, 1027–1030 (1982)). Durch Veränderung der Zusammensetzung der Reaktionsmischung können zwei unterschiedliche Formen von Aktivität von SPS bestimmt werden; Vmax und Vsel. Die Vmax-Reaktionsmischung enthielt 3,2 mM UDP-Glucose, 81 μM [14C]-UDP-Glucose, 3,2 mM Fructose-6-phosphat, 16 mM Glucose-6-phosphat, 100 mM Hepes pH 7,4, 20 mM MgCl2 und 5 mM EDTA in einem Gesamtvolumen von 50 μl. In der Vsel-Reaktionsmischung ist die Konzentration an Fructose-6-phosphat und Glucose-6-phosphat halbiert, und 5 mM anorganisches Phosphat wird hinzugegeben. Als Kontrolle wird die SPS-Aktivität in der Vmax-Reaktionsmischung ohne Fructose-6-phosphat und Glucose-6-phosphat gemessen. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 30' durchgeführt und durch Erwärmen der Mischung auf 95°C für 5' angehalten. Die Produkte der Reaktion werden mit alkalischer Phosphatase behandelt, und die resultierende [14C]-Saccharose wird von den Substraten durch Ionenaustauscherchromatographie getrennt. Die Menge an radiomarkierter Saccharose, die in der Reaktion gebildet wird, wird in einem Szintillationszähler gemessen. TPS-Aktivität – Die TPS-Aktivität wurde in einer ähnlichen Weise wie für SPS beschrieben gemessen. Nach Ionenaustauscherchromatographie enthielten die Proben dephosphorylierte Saccharose sowie Trehalose. Zur Bestimmung, welcher Anteil der gebildeten Produkte Trehalose ist, wurden Proben durch DC wie beschrieben getrennt. Die Extrakte wurden entionisiert (Merck, Ionenaustauscher V) und auf Kieselgel 60-Platten (Merck) geladen. Nach Chromatographie wurden Flecken, die [14C]-Saccharose und [14C]-Trehalose enthielten, abgeschabt und in einem Szintillationszähler gemessen.
  • AGPase-Aktivität – Die AGPase-Aktivität wird wie von Müller-Röber et al. beschrieben bestimmt (B. Müller-Röber, U. Sonnewald und L. Willmitzer, EMBO J. 11, 1229 (1992)). Die Erzeugung von Glucose-1-phosphat aus ADP-Glucose wird in einem NAD-gebundenen Glucose-6-phosphat-dehydrogenasesystem bestimmt. Der Reaktionstest enthielt 80 mM HEPES pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM ADP-glucose, 0,6 mM NAD, 10 μM Glucose-1,6-diphosphat, 3 mM DTT, 0,02% Rinderserumalbumin, 1 E Phosphoglucomutase aus Kaninchenmuskel (Sigma), 2,5 E NAD-gebundene Glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus Leuconostoc mesenteroides und Knollenextrakt. Die Reaktion wird durch Zugabe von Natriumpyrophosphat auf eine Endkonzentration von 2 mM gestartet. Die NAD-Reduktion wird spektrophotometrisch bei 340 nm und 30°C gemessen. Eine Einheit von AGPase-Aktivität wird als nmol Glucose-1-phosphat definiert, erzeugt pro min bei 30°C.
  • Beispiel I
  • Klonierung eines E. coli-otsA-Gens voller Länge
  • In E. coli wird Trehalosephosphatsynthase (TPS) durch das otsA-Gen kodiert, das sich im Operon otsBA befindet. Der Ort und die Richtung der Transkription dieses Operons auf dem E. coli-Chromosom sind bekannt (I. Kaasen, P. Falkenberg, O. B. Styrvold und A. R. Ström, J. Bact. 174, 889 (1992)). Das otsA-Gen befindet sich bei 42' und ist gemäß Kaasen et al. beschränkt auf ein 18,8 kb-Fragment, das im genomischen EMBL4-Klon vorhanden ist, der mit 7F11 auf der Karte von Kohara et al. bezeichnet wird (Y. Kohara, K. Akiyama und K. Isono, Cell 50, 495 (1987)). DNA wurde aus einem Lysat aus lambda-Klon 7F11 hergestellt und mit HindIII verdaut. Das isolierte 2,9 kb HindIII-Fragment (der "rechte" HindIII-Ort bei 14,3 kb im Insert wurde auf der Karte von Kohara et al. ausgelassen, wie schon von Kaasen et al. bemerkt) wird in mit HindIII linearisiertes pUC18 kloniert. Das 2,9 kb HindIII-Insert aus dem resultierenden Plasmid, das als pMOG674 bezeichnet wird, wird sequenziert. Es wird festgestellt, dass die Sequenz ein Teil des araH-Gens des Arabinosetransportoperons enthält (J. B. Scripture, C. Voelker, S. Miller, R. T. O'Donnell, L. Polgar, J. Rade, B. F. Horazdovsky und R. W. Hogg, J. Mol. Biol. 197, 37 (1987)), das otsB-Gen, das TPP kodiert, wie von Kaasen et al. lokalisiert, und einen Teil des otsA-Gens, das TPS kodiert. Es wird festgestellt, dass das otsA nicht auf das 2,9 kb HindIII-Fragment beschränkt ist, wie von Kaasen et al. beschrieben. Zur Vervollständigung der Sequenz wird ein überlappendes BamHI/EcoRI-Fragment isoliert und teilweise sequenziert. Die vollständige TPS-kodierende Sequenz des otsA-Gens ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die Position des otsA-Gens auf Klon 7F11 mit den verwendeten Restriktionsenzymorten ist in 8 gezeigt. Ein zusätzlicher HindIII-Ort, der nicht auf der von Kohara et al. veröffentlichten Karte vorhanden ist, wird auf dem "linken" Ort des 2,9 kb HindIII-Fragments gefunden.
  • Der HindIII-Ort in pMOG180 wird durch einen SstI-Ort ausgetauscht, indem der Oligonukleotidduplex:
    Figure 00220001
    in mit HindIII geschnittenes pMOG180 kloniert wird. Der resultierende Vektor wird als pMOG746 bezeichnet. Der Oligonukleotidduplex:
    Figure 00220002
    wird in den mit BamHI linearisierten Vektor pMOG746 kloniert. Der Vektor mit dem Oligonukleotidduplex in der gewünschten Orientierung (überprüft durch Restriktionsenzymverdau) wird als pMOG747 bezeichnet. Das 2,9 kb HindIII-Fragment von Plasmid pMOG674 wird in als HindIII linearisiertes pMOG747 kloniert, was zum Vektor pMOG748 führt. Die ca. 2,4 kb EcoRV/Sst- und ca. 3,5 kb SstI/SmaI-Fragmente von pMOG748 werden isoliert, ligiert und in E. coli transformiert, wodurch das 3'-Ende des 2,9 kb HindIII-Fragments deletiert wird. Das resultierende Plasmid wird als pMOG749 bezeichnet. Das 5'-Ende des otsA-Gens wird durch PCR unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide TPS1 und TPS2 mit pMOG749 als Matrize synthetisiert.
  • Figure 00220003
  • Durch Sequenzierung wird bestätigt, dass das 0,4 kb PCR-Fragment die richtige Sequenz hat. Das 1 kb BamHI/HindIII-Fragment von pMOG749 wird zusammen mit dem 0,4 kb XmaI/BamHI-PCR-Fragment mit XmaI und HindIII linearisiertes pMOG747 kloniert. In das resultierende Plasmid, verdaut mit HindIII und SstI, wird der synthetische Oligonukleotidduplex TPS6/7 kloniert, der die drei C-terminalen Aminosäuren von TPS kodiert.
  • Figure 00220004
  • In das resultierende Plasmid, das mit HindIII und SstI verdaut wird, wird das 0,25 kb HindIII/SstI-Fragment von Plasmid pMOG749 kloniert, das den Terminator aus dem Agrobacterium tumefaciens-Nopalinsynthase-(NOS)-Gen umfasst, was zu Plasmid pMOG798 führt. Dieses Plasmid enthält das E. coli otsA-Gen in der korrekten Orientierung unter der Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus-(CaMV)-35S-Promotors mit Doppelverstärker (Guilley et al., Cell 30, 763 (1982)), die Luzernemosaikvirus(AMV)-RNA4-Leitsequenz (Brederode et al., Nucl. Acids Res. 8, 2213 (1980)) und die Nolalinsynthasetranskriptionsterminatorsequenz aus Agrobacterium tumefaciens. Die gesamte Expressionskassette wird als 2,5 kb EcoRI/SstI-Fragment in den mit EcoRI und SstI linearisierten binären Vektor pMOG23 kloniert. Der resultierende binäre Vektor, pMOG799 (9), wird zur Transformation von Kartoffel und Tabak verwendet. (Ein pMOG799 beherbergender E. coli-Stamm wurde hinterlegt beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Phabagen Collections, Padualaan 8, Utrecht, Niederlande, am 23. August 1993, Hinterlegungsnummer CBS 430.93; pMOG23 wurde bei CBS am 29. Juni 1990 mit der Hinterlegungsnummer CBS 102.90 hinterlegt.)
  • Beispiel II
  • Trehaloseerzeugung in mit pMOG799 transformiertem Tabak
  • Tabakblattscheiben werden mit dem binären Vektor pMOG799 unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens transformiert. Ein Anzahl von 20 unabhängigen transgenen Schösslingen werden auf Trehalosephosphatsynthase-(TPS)-Aktivität analysiert. Es wurde festgestellt, dass einige in vitro gezüchtete Tabakpflanzen im Vergleich mit untransformierten Pflanzen extrem dicke Wurzeln haben. Die Analyse der Wurzeln dieser transgenen Tabakpflanzen zeigte erhöhte Mengen von Trehalose im Vergleich mit nicht-transgenen Kontrollpflanzen.
  • Beispiel III
  • Trehaloseproduktion in mit pMOG799 transformierten Kartoffeln
  • Kartoffelknollenscheiben werden mit dem binären Vektor pMOG799 unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens transformiert. Transgene Schösslinge werden auf Kanamycin selektiert. Eine Anzahl von 20 unabhängigen transgenen Schösslingen werden auf Trehalosephosphatsynthase-(TPS)-Aktivität analysiert. Schösslinge, für die festgestellt wird, dass sie das Enzym enthalten, werden zu reifen Pflanzen herangezogen. Analysen von reifen Knollen dieser transgenen Kartoffelpflanzen zeigen erhöhte Mengen von Trehalose im Vergleich mit nicht-transgenen Kontrollpflanzen. Die transgene Pflanzenlinie MOG799.1 wird zur weiteren Arbeit vermehrt.
  • Beispiel IV
  • Konstruktion von pMOG664
  • Die Oligonukleotide, die der cDNA-Sequenz der kleinen Untereinheit von ADP-Glucosepyrophosphorylase (AGPaseB) aus Kartoffelknollen cv. Désiree entsprechen (B. Müller-Röber, J. Kossmann, L. C. Hannah, L. Willmitzer und U. Sonnewand, Mol. Gen. Genet. 229, 136–146 (1990)), werden synthetisiert:
  • Figure 00240001
  • Die Oligonukleotide werden geschaffen, so dass sie geeignete Restriktionsorte (BamHI und NcoI, unterstrichen) an ihren Termini enthalten, um den Zusammenbau in einer Expressionskassette in einer antisense-Orientierung nach Verdau mit diesen Enzymen erlauben. Ein Fragment von ca. 1 kb wird mit diesen Oligonukleotiden unter Verwendung von DNA amplifiziert, die aus einer cDNA-Bibliothek aus Kartoffel cv. Désiree isoliert wurde, hergestellt aus 2 Monate altem Blattgewebe (Clontech) als Matrize. Durch Sequenzierung wird gezeigt, dass das Fragment identisch mit der AGPase B-Sequenz aus Kartoffel cv. Désiree ist (B. Müller-Röber, J. Kossmann, L. C. Hannah, L. Willmitzer und U. Sonnewald, Mol. Gen. Genet. 224, 136–146 (1990)). Im Anschluss an Verdauung mit BamHI und NcoI wird das Fragment in mit BamHI und NcoI linearisiertes pMOG18 kloniert. Aus dem resultierenden Plasmid werden das 1,85 kb EcoRI/BamHI-Fragment (das den CaMV 35S-Promotor, die AMV RNA4-Leitsequenz und das AGPase-Fragment in einer antisense-Orientierung enthält) sowie das BamHI/HindIII-Fragment, das den Terminator aus dem Nopalinsynthase-(NOS)-Gen aus Agrobacterium tumefaciens enthält, in eine Dreiwegeligation im mit EcoRI und HindIII linearisierten binären Vektor pMOG22 kloniert. Der binäre Vektor pMOG22 enthält ein pflanzenexprimierbares HPTII-Gen zur Hygromycinselektion in transgenen Pflanzen (pMOG22 wurde beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures am 29. Januar 1990 unter der Eingangsnummer 101.90 hinterlegt). Der resultierende binäre Vektor pMOG664 (4) wird zur Kartoffeltransformation verwendet.
  • Beispiel 5
  • Konstruktion von pMOG801
  • Ein Satz von Oligonukleotiden, die komplementär zur Sequenz der Maissaccharosephosphatsynthase-(SPS)-cDNA sind (A. C. Worrell, J-M. Bruneau, K. Summerfalt, M. Boersig und T. A. Voelker, Plant Cell 3, 1121 (1991)), wird synthetisiert. Deren Sequenzen sind wie folgt:
  • Figure 00250001
  • Diese Oligonukleotide werden zur PCR-Amplifikation eines DNA-Fragments von 370 bp unter Verwendung von DNA verwendet, die aus einer Kartoffel cv. Désiree cDNA-Bibliothek isoliert wurde, die aus zwei Monate altem Blattgewebe (Clontech) als Matrize hergestellt wurde. Durch Sequenzierung dieses Fragments wird gezeigt, dass es homolog mit der SPS-Sequenz von Mais ist (siehe 3 und Worrell et al. (1991)). Das PCR-Fragment wird zur Durchmusterung einer lambda-gt10-Biobliothek von Kartoffel cv. Désiree cDNA-Bibliothek verwendet, hergestellt aus zwei Monate altem Blattgewebe (Clontech). Das Insert eines positiv hybridisierenden Klons wird sequenziert. Es wird festgestellt, dass die Sequenz des 654 bp DNA-Fragments zu 65% identisch mit dem entsprechenden Teil der Mais SPS-Sequenz ist (ausgehend von Nukleotid Nummer 349 in 11 in Worrell et al. (1991)). Das EcoRI-Insert dieses Klons wird in mit BamHI verdautes pMOG180 in einer Dreiwegeligation mit dem folgenden synthetischen Oligonukleotidduplex kloniert:
  • Figure 00250002
  • Das Plasmid mit dem SPS-Fragment in der antisense-Orientierung in Bezug auf den CaMV 35S-Promotor wird als pMOG787 bezeichnet. Das EcoRI/HindIII-Fragment von Plasmid pMOG787 wird in einer Dreiwegeligation mit einem synthetischen Linker:
    Figure 00250003
    in den mit EcoRI linearisierten binären Vektor pMOG22 kloniert. Der binäre Vektor pMOG22 enthält ein pflanzenexprimierbares HPTII-Gen zur Hygromycinselektion in transgenen Pflanzen (pMOG22 wurde beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures am 29. Januar 1990 unter der Eingangsnummer 101.90 hinterlegt). Der resultierende binäre Vektor pMOG801 (10) wird zur Kartoffeltransformation verwendet.
  • Beispiel VI
  • Konstruktion von pMOG802
  • Das EcoRI-Fragment von Plasmid pMOG801, das die antisense-SPS-Expressionskassette enthält, wird in den binären Vektor pMOG664 (der die antisense-AGPase-Kassette enthält) kloniert, linearisiert mit EcoRI. Der resultierende binäre Vektor wird als pMOG802 bezeichnet (11).
  • Beispiel VII
  • Trehaloseproduktion in mit pMOG799 und pMOG664 transformierter Kartoffel
  • Kartoffelknollenscheiben der kanamycinresistenten Pflanzenlinie MOG799.1, die TPS exprimiert (Beispiel IX), werden mit dem binären Vektor pMOG664 transformiert, der die antisense-AGPase-Expressionskassette enthält. Transgene Schösslinge, selektiert auf 10 mg/l Hygromycin, werden auf Gegenwart der TPS- und antisense-AGPase-Sequenzen durch PCR analysiert. Transgene Pflanzen, die beide enthalten, werden auf TPS- und AGPase-Aktivität analysiert.
  • Durch Analyse transgener Knollen auf AGPase-Aktivität wird gezeigt, dass Reduzierungen der Aktivitätswerte in individuellen transgenen Linien im Vergleich mit nicht-transgenen Kontrollen auftreten. Durch Northern Blots wird gezeigt, dass mRNA-Werte für AGPase in den transgenen Pflanzen im Vergleich mit denjenigen in nicht-transgenen Kontrollpflanzen reduziert sind. Trehalosemengen in Knollen von transgenen Kartoffelpflanzen, von denen gefunden wird, dass sie TPS-Aktivität aufweisen, und mit reduzierten Mengen von AGPase, zeigen eine Zunahme im Vergleich mit dem in Knollen der transgenen Pflanzenlinie MOG799.1 gefundenen Mengen.
  • Beispiel VIII
  • Trehaloseproduktion in mit pMOG799 und pMOG801 transformierter Kartoffel
  • Kartoffelknollenscheiben der kanamycinresistenten Pflanzenlinie MOG799.1, die TPS exprimiert (Beispiel IX), werden mit dem binären Vektor pMOG801 transformiert, der die antisense-SPS-Expressionskassette enthält. Transgene Schösslinge, die auf 10 mg/l Hygromycin selektiert wurden, werden auf Gegenwart der TPS- und antisense-SPS-Sequenzen durch PCR analysiert. Transgene Pflanzen, die beide enthalten, werden auf TPS- und SPS-Aktivität analysiert.
  • Durch Analyse transgener Knollen auf SPS-Aktivität wird gezeigt, dass Reduzierungen der Aktivitätswerte in individuellen transgenen Linien im Vergleich mit nicht-transgenen Kontrollen auftreten. Durch Northern Blots wird gezeigt, dass mRNA-Mengen für SPS in den transgenen Pflanzen im Vergleich mit denjenigen in nicht-transgenen Kontrollpflanzen reduziert sind. Trehalosemengen in Knollen von transgenen Kartoffelpflanzen, von denen gefunden wird, dass sie TPS-Aktivität aufweisen, und mit reduzierten Mengen von SPS, zeigen eine Zunahme im Vergleich mit den in Knollen der transgenen Pflanzenlinie MOG799.1 gefundenen Mengen.
  • Beispiel IX
  • Trehaloseproduktion in mit pMOG799 und pMOG802 transformierter Kartoffel
  • Kartoffelknollenscheiben der kanamycinresistenten Pflanzenlinie MOG799.1, die TPS exprimiert (Beispiel IX), werden mit dem binären Vektor pMOG802 transformiert, der die antisense-SPS- und AGPase-Expressionskassetten enthält. Transgene Schösslinge, die auf 10 mg/l Hygromycin selektiert sind, werden auf Gegenwart der TPS-, antisense-AGPase- und antisense-SPS-Sequenzen durch PCR analysiert. Transgene Pflanzen, die alle drei Konstrukte enthalten, werden auf TPS-, AGPase- und SPS-Aktivität analysiert.
  • Durch Analyse transgener Knollen auf AGPase- und SPS-Aktivität wird gezeigt, dass Reduzierungen der Aktivitätswerte für beide Enzyme in individuellen transgenen Linien im Vergleich mit nicht-transgenen Kontrollen auftreten. Durch Northern Blots wird gezeigt, dass mRNA-Werte für AGPase und SPS in den transgenen Pflanzen im Vergleich zu denjenigen in nicht-transgenen Kontrollpflanzen reduziert sind. Trehalosemengen in Knollen von transgenen Kartoffelpflanzen, von denen festgestellt wird, dass sie TPS-Aktivität aufweisen, und mit reduzierten Mengen von SPS, zeigen eine Zunahme im Vergleich mit den in Knollen der transgenen Pflanzenlinie MOG799.1 gefundenen Mengen. Hinterlegte Stämme
    pMOG22; Hinterlegungsnummer CBS 101.90 (Seite 23, Zeilen 18–21; Seite 24, Zeilen 21–23
    pMOG23; Hinterlegungsnummer CBS 102.90 (Seite 22, Zeile 10)
    pMOG799; Hinterlegungsnummer CBS 430.93 (Seite 22, Zeile 6)
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001

Claims (11)

  1. Nukleinsäure, die bei Expression in eine Pflanze oder Pflanzenzelle den Trehalosegehalt der Pflanze oder Pflanzenzelle erhöht, wobei die Nukleinsäure in Reihe umfaßt: (a) eine Transkriptionsstartregion, die in der Pflanze oder Pflanzenzelle funktionell ist; und (b) eine DNA-Sequenz, die eine E. coli-Trehalosephosphatsynthase codiert, die durch die als SEQ ID NO: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz dargestellt wird; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsregion, die in der Pflanze oder Pflanzenzelle funktionell ist.
  2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz durch die als SEQ ID NO: 2 wiedergegebene Nukleotidsequenz dargestellt wird.
  3. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz eine E. coli-Trehalosephosphatsynthase codiert, die das offene Leseraster des otsA-Gens von E. coli umfaßt, wie es in pMOG799 vorhanden ist, hinterlegt im Centraal Bureau voor Schimmelcultures mit der Hinterlegungs-Nr. 430.93.
  4. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Transkriptionsstartort eine Promotorregion der 35S-RNA-codierenden DNA des Blumenkohlmosaikvirus und die Transkriptionsterminatorregion des Nopalinsynthase-Gens von Agrobacterium tumefaciens umfaßt.
  5. Klonierungsvektor, der eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt, worin der Klonierungsvektor ein binärer Vektor ist.
  6. Mikroorganismus, der einen Vektor gemäß Anspruch 5 umfaßt, worin der Mikroorganismus aus der Gattung Agrobacterium ist.
  7. Verfahren zum Erhalt einer Pflanze mit erhöhter Fähigkeit zur Erzeugung von Trehalose, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt aus: a) Einführen, in eine Empfängerzelle einer Pflanze, einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Klonierungsvektors gemäß Anspruch 5; und eine DNA-Sequenz, die ein selektierbares Markergen codiert, das in der Pflanze funktionell ist; und b) Erzeugen einer Pflanze aus einer transformierten Zelle unter Bedingungen, die die Selektion auf Gegenwart des selektierbaren Markergens erlauben.
  8. Rekombinantes pflanzliches DNA-Genom, das eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
  9. Pflanzenzelle mit einem rekombinanten pflanzlichen DNA-Genom gemäß Anspruch 8.
  10. Pflanzenzellkultur, die eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 9 umfaßt.
  11. Pflanze, die eine Zelle gemäß Anspruch 9 enthält.
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