DE69932343T2

DE69932343T2 - Spezifische genetische modifikation der aktivität von trehalose-6-phosphat synthase und expression in homologer und heterologer umgebung

Info

Publication number: DE69932343T2
Application number: DE69932343T
Authority: DE
Inventors: Gabriel Cuernavaca ITURRIAGA DE LA FUENTE; Johan M. Thevelein; Patrick Van Dijck; Jose Oscar Cuernavaca MASCORRO-GALLARDO; Christophe Van Vaeck
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; INST DE BIOTECNOLOGIA UNAM; INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA-UNAM CUERNAVACA
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2019-10-16
Also published as: US6872870B1; WO2000022141A3; ES2268902T3; EP1121445A2; US7781646B2; IL142516A; US20140317785A1; IL142516A0; JP2002537759A; AU780477B2; WO2000022141A2; ATE332975T1; CA2346877A1; DE69932343D1; EP1002867A1; AU1152700A; US8796505B2; JP4948704B2; US20050283852A1; US20110296554A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten eukaryotischer Organismen, d.h. Pflanzen, Tiere oder Pilze, mit erhöhter Aktivität und/oder geänderter Regulationsleistung der Trehalose-6-phosphatsynthase. Die Erfindung betrifft außerdem spezifisch modifizierte Allele der Trehalose-6-phosphatsynthasegene, die unerwartete Änderungen der katalytischen Aktivität und/oder Regulationsleistung zeigen, und die transformierten Pflanzen oder andere eukaryotische Organismen, welche diese Konstrukte enthalten. Die Erfindung betrifft außerdem neuartige Verfahren zur Messung des Pegels von Trehalose-6-phosphat und der Aktivität von Trehalose-6-phosphatsynthase.
Die Biosynthese von Trehalose besteht aus zwei enzymatischen Schritten, die durch Trehalose-6-phosphatsynthase (TPS), die Trehalose-6-phosphat synthetisiert, und durch Trehalose-6-phosphatphosphatase (TPP), die Trehalose bildet, katalysiert sind. Die Gene des Trehalosemetabolismus sind zuerst in Hefe und in Bakterien entdeckt worden, Organismen, von denen seit langem bekannt war, dass sie Trehalose akkumulieren. Kürzliche sind Homologe dieser Gene ebenfalls in höheren Pflanzen und in Tieren gefunden worden, in denen merkliche Pegel an Trehalose niemals entdeckt worden waren. Bisher ist es jedoch nicht möglich gewesen, enzymatische Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität dieser TPS-Genprodukte in irgendeinem in-vitro-System zu zeigen. Ihre Expression in heterologen Systemen führt ebenfalls nicht zu einer starken Trehaloseakkumulation. Es ist keine erfolgreiche Verwendung dieser pflanzlichen oder tierischen TPS-Gene zur Verbesserung kommerziell wichtiger Eigenschaften in homologen oder heterologen Systemen berichtet worden.
Zusätzlich zu seiner klassischen Rolle in der Speicherzuckerakkumulation ist bekannt, dass der Trehalosemetabolismus wichtige Rollen bei der Stressresistenz, der Steuerung von Glucoseeinstrom in Glykolyse und glucoseinduzierter Signalisierung spielt. Wie unten kurz dargestellt wird, sind diese phänotypischen Eigenschaften von großer gewerblicher Bedeutung.
Ein erstaunliches Vermögen zur Anpassung an das Überleben unter starker oder sogar vollständiger Dehydration ist in Hefezellen, Pilzsporen, bestimmten wirbelosen Arten und Auferstehungspflanzen, die ihre Vitalfunktionen wieder aufnehmen, sobald sie sich wieder in Kontakt mit Wasser befinden, vorhanden. Diese anhydrobiotischen Organismen widerstehen auch Einfrieren, starkem Vakuum, hohen Dosen ionisierender Strahlung, hohem Druck und extremen Temperaturen ohne Schaden zu erleiden, und viele von Ihnen akkumulieren das nichtreduzierende Disaccharid Trehalose als Protein- und Membranschutzmittel.
Die Schutzmittelfunktion von Trehalose ist auch in in-vitro gezeigt worden. Die Zugabe von Trehalose zu Zellen, Organellen, Enzymen, Antikörpern und Nahrungsmitteln erhält sie unter vollständiger Dehydration für lange Zeiträume. Sie schützt sie auch gegen eine Vielzahl anderer Stressbedingungen, wie etwa hohe Temperatur, hohen Druck und Einfrieren.
Bei Gefäßpflanzen sind sehr wenige Arten bekannt, bei welchen die Gegenwart von Trehalose in einer überzeugenden Weise gezeigt worden ist. In der so genannten Wüstenauferstehungspflanze Selaginella lepidophylla ist ein hoher Trehalosepegel vorhanden. Diese Pflanze kann erfolgreich vollständiger Dehydration widerstehen, im Gegensatz zu allen anderen höheren Pflanzen einschließlich Nutzpflanzen.
Deletionsmutanten im TPS-Gen in Bakterien und Hefen sind nicht in der Lage, Trehalose zu synthetisieren, und sie verlieren Osmotoleranz, Thermotoleranz und Toleranz gegenüber hohem Druck. Dies weist darauf hin, dass das TPS-Gen an verschiedenen Formen von Toleranz beteiligt ist.
Es wäre sehr wünschenswert, in der Lage zu sein, Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität in Pflanzen, Tieren, Mikroorganismen oder spezifischen Teilen davon zu exprimieren, um sie gegenüber Stress tolerant zu machen. Auf diese Weise könnten Nutzpflanzen in Gegenden angebaut werden, die gelegentlich oder ständig unter Hitze, Düne oder Frost leiden. Verderbliche Nahrungsmittel, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs könnten durch einfache Dehydration konserviert werden, was eine Lagerung für verlängerte Zeiträume und einen Transport über große Entfernungen ermöglichen würde.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es zum ersten Mal, eine starke Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität und starke Akkumulation von Trehalose in Organismen zu erhalten, bei denen Trehalose normalerweise nicht in merklichen Pegeln hergestellt oder akkumuliert wird, wie etwa den meisten höheren Pflanzen und Tieren. Daher ermöglicht sie zum ersten Mal die hocheffiziente und kontrollierte Verwendung der Trehaloseakkumulation in höheren Pflanzen und Tieren, um die Stressresistenz zu erhöhen.
Dies wird in der Erfindung mittels eines Verfahrens zur Herstellung eines eukaryotischen Organismus, z.B. ausgewählt aus Pflanzen, Tieren und Pilzen, der eine konstitutive, induzierbare und/oder organspezifische Expression eines spezifisch modifizierten TPS-Gens zeigt, erreicht, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Vorsehen eines pflanzlichen TPS-Gens;
b) Entwerfen einer geeigneten Modifikation des TPS-Gens durch Abgleichen des Gens mit dem entsprechenden Gen von Hefe und Ermittlung, welcher Teil des Gens sich über den 5'-Terminus des Hefegens hinaus erstreckt;
c) Entfernen oder Inaktivieren eines Teils des N-terminalen Bereichs des TPS-Gens, der sich über den 5'-Terminus des Hefegens hinaus erstreckt, bevorzugt des vollständigen darüber hinaus erstreckenden Teils, um eine erhöhte Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität des Gens zu erreichen;
d) Klonieren des so modifizierten Gens in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle eines konstitutiven, induzierbaren und/oder organspezifischen Promotors;
e) Transformieren einer pflanzlichen Zelle oder Gewebes mit dem so erhaltenen Expressionsvektors; und
f) Regenerieren einer kompletten Pflanze aus der transformierten pflanzlichen Zelle oder dem Gewebe.

Die Inaktivierung des Teils des N-terminalen Bereichs des TPS-Gens, der sich über den 5'-Terminus des Hefegens hinaus erstreckt, kann durch Mutagenese erreicht werden.
Erfindungsgemäß ist herausgefunden worden, dass das Abschneiden verschiedener Gene, die von Pflanzen stammen, ihre Funktionalität erhöhen kann, wenn sie in Hefe exprimiert werden. Eine erhöhte Akkumulation von Trehalose und eine hohe Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität im Vergleich mit dem nichtabgeschnittenen Gen wurden beobachtet. Durch die Verwendung eines konstitutiven, induzierbaren oder organspezifischen Promotors kann die Expression auf unterschiedliche Arten modifiziert und kontrolliert werden. Die Induktion kann gewebespezifisch sein, z.B. für Früchte, zeitspezifisch oder durch Veränderungen in den Umgebungsbedingungen induziert werden. Die letztere Kategorie kann Hitzeinduktion, Dürreinduktion usw. einschließen.
Die Funktionalität des modifizierten TPS-Gens zum Folgern von Hitzeresistenz kann in dem folgenden Testsystem geprüft werden. Trehalose wird für den Erwerb von Hitzeresistenz in Hefe benötigt. Die tps1Δ- und tps1Δtps2Δ-Hefedeletionsmutanten sind hitzeempfindlich und der Phänotyp wird durch Komplementierung mit dem entsprechenden homologen Gen wieder hergestellt. Um zu bestimmten, ob pflanzliches oder tierisches TPS Hefe-TPS1 funktionell ähnlich ist, werden tps1Δ- und tps1Δtps2Δ-Hefemutanten, die mit einem Plasmid, welches das gewünschte Gen beherbergt, transformiert wurden, auf den Erwerb von Hitzresistenz getestet. Die Fähigkeit der Zellen, Hitzeresistenz zu erwerben, wird durch einen tödlichen Hitzeschock gemessen.
In Hefe ist der Trehalosemetabolismus für das Wachstum auf Glucose essentiell. Die Deletion des TPS-Gens verursacht einen unkontrollierten Einstrom von Glucose in Glykolyse, was zu einer Hyperakkumulation von Zuckerphosphaten und einem Verlust von freiem Phosphat und ATP führt. Trehalose-6-phosphat ist dafür bekannt, Hexokinaseaktivität in vitro zu hemmen, und daher denkt man, dass das TPS-Enzym diese Regelung auch in vivo durch Beschränkung der Hexokinaseaktivität ausübt.
Glucoseinduzierte Signalisierung, und ebenfalls direkt oder indirekt durch verwandte Zucker wie etwa Saccharose induzierte Signalisierung, spielt in vielen Organismen für die richtige Reaktion auf die Verfügbarkeit von externem Zucker eine wichtige Rolle, wie etwa in Hefe, oder auf die interne Produktion von Zucker, wie etwa in photosynthetischen Pflanzen oder im Verdauungssystem von Tieren. In Hefe löst die Gegenwart von externer Glucose oder verwandten Zuckern verschiedene Signalwege aus, was die schnelle Anpassung des Metabolismus an die maximale Produktion von Ethanol und an schnelles Wachstum bewirkt. In photosynthetischen Pflanzen regelt die zuckerinduzierte Signalisierung die photosynthetische Aktivität und die Verteilung des Zuckers zwischen den Quellen- (photosynthetische Teile) und Senkenorganen (nicht-photosynthetische Teile, insbesondere Wurzeln, Samen und Früchte). In Tieren regelt die zuckerinduzierte Signalisierung die Aufnahmegeschwindigkeit des Zuckers vom Blut durch die Speicherorgane, z.B. regelt sie in Säugetieren die Aufnahmegeschwindigkeit der Blutzuckerglucose durch die Leber.
TPS-Mutanten der Hefe sind bei der glucoseinduzierten Signalisierung unzureichend, ein Mangel, von dem man denkt, dass er auf die Abwesenheit von Trehalose-6-Phosphatinhibition der Hexokinaseaktivität zurückzuführen ist. In höheren Pflanzen, bei denen Trehalose nicht in merklichen Mengen akkumuliert wird, ist die Funktion der Trehalosemetabolismusgene nicht gut verstanden. Pflanzen, in welchen heterologe TPS- oder TPP-Gene exprimiert worden sind, zeigen eine veränderte photosynthetische Aktivität und Quellen-Senken-Verteilung von Zucker, was auf mögliche Wirkungen auf zuckerinduzierte Signalwege hindeutet. Man glaubt, dass dies auf Änderungen im Trehalose-6-Phosphatpegel zurückzuführen ist, die durch die Expression der TPS- oder TPP-Gene verursacht sind (Patentanmeldung Zeneca-Mogen 6047 PCT).
In der vorliegenden Erfindung wird die unerwartete Situation gezeigt, dass das Abschneiden des N-terminalen Bereichs von pflanzlichen TPS-Genen ihre katalytische Aktivität erhöht und daher wahrscheinlich ihre Regulationsleistung. Daher erlaubt die vorliegende Erfindung die Veränderung von zuckerinduzierter Signalisierung in höheren Pflanzen und möglicherweise Tieren auf eine effizientere Weise. Darüber hinaus erlaubt sie, dies durch homologe genetische Modifikationen prinzipiell in jeder pflanzlichen und tierischen Art, d.h. durch die Expression einer trunkierten Form des homologen TPS-Enzyms, zu erreichen.
In der vorliegenden Erfindung wird diese Veränderung in der zuckerinduzierten Signalisierung durch die gleichen Schritte erreicht, die oben für die Verbesserung der Stressresistenz beschrieben worden sind.
Die Funktionalität der modifizierten Gene für die Wiederherstellung der Regelung des Glucoseeinstroms in die Glykolyse und die Wiederherstellung der glucoseinduzierten Signalisierung kann in dem folgenden Testsystem überprüft werden. TPS-Mutanten von Hefe sind nicht in der Lage, auf Glucose zu wachsen, da sie in der Regelung des Glucoseeinstroms in die Glykolyse und der glucoseinduzierten Signalisierung mangelhaft sind. Erfindungsgemäß wird gezeigt, dass die Expression modifizierter TPS-Gene in dem tps1Δ-Hefestamm das Wachstum auf Glucose wiederherstellt, was auf eine Wiederherstellung der zum Wachstum erforderlichen zugehörigen Glucosesignalisierungsregelungen hindeutet.
Die vorliegende Erfindung sieht gemäß einem weiteren Aspekt ein neuartiges Verfahren zur Messung von Trehalose-6-phosphat und Trehalose-6-phosphatsynthase vor. Dieses Verfahren ist ein hochzuverlässiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Trehalose-6-phosphat. Der Pegel an Trehalose-6-phosphat ist in allen Organismen, in denen er bisher gemessen worden ist, sehr niedrig, im Bereich von 100-200 μM. Diese niedrige Konzentration macht eine genaue Quantifizierung durch klassische Verfahren, z.B. HPLC, schwierig und nicht sehr zuverlässig. Chromatographische Verfahren sind außerdem langwierig, da die Proben nur eine nach der anderen gemessen werden können. Andere Forschungsgruppen haben die Inhibierung von Hefe-Hexokinase durch Trehalose-6-phosphat als einen indirekten Weg zur Schätzung der Konzentration von Trehalose-6-phosphat, die in Zellextrakten vorhanden ist, verwendet (Blazquez M.A., Lagunas R., Gancedo C. und Gancedo J.M., 1993, FEBS Lett. 329, 51-54). Im Allgemeinen neigen solche Tests jedoch leicht zu Wechselwirkungen mit weiteren Verbindungen, die im Zellextrakt vorhanden sind, besonders wenn sie von Organismen wie Pflanzen und Tieren stammen, die viele Verbindungen enthalten, die in Hefe nicht vorhanden sind.
In der vorliegenden Erfindung wird eine präzise quantitative Messung des Trehalose-6-phosphatpegels durch einen neuartigen enzymatischen Test erreicht, der Gebrauch von dem gereinigten Phosphotrehalaseenzym, bevorzugt von Bacillus subtilis, macht. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a) Extraktion von zu analysierenden Zellen mit einem Extraktionsmedium, bevorzugt einer starken Säure, das jegliche enzymatische Aktivität zerstört, aber Trehalose-6-phosphat nicht zersetzt;
b) Neutralisierung des Extrakts;
c) Zentrifugierung des Extrakts;
d) Trennung der sauren Verbindungen, einschließlich Trehalose-6-phosphat, die im Überstand vorhanden sind, von alkalischen und neutralen Verbindungen, bevorzugt mittels einer Anionenaustauschsäule;
e) Behandlung der Fraktion, welche die sauren Verbindungen enthält, mit gereinigter Phosphotrehalase aus Bacillus subtilis, um Trehalose-6-phosphat quantitativ zu Glucose-6-phosphat und Glucose abzubauen;
f) Trennung der in Schritt e) hergestellten Glucose von dem hergestelltem Glucose-6-phosphat und von den verbleibenden vorhandenen Zuckerphosphaten, bevorzugt mittels einer zweiten Anionenaustauschsäule;
g) Bestimmung der vorhandenen Glucose, bevorzugt mittels eines Glucoseoxidase- und Peroxidasetests.

Der gemessene Glucosepegel ist mit dem ursprünglich im Zellextrakt vorhandenen Trehalose-6-phosphatpegel identisch.
Das für die Messung von Trehalose-6-phosphat eingerichtete Verfahren kann auf die Messung von Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität erweitert werden. Bisher ist kein Verfahren verfügbar, das die Messung von Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität direkt auf der Geschwindigkeit der Trehalose-6-phosphatbildung basierend erlaubt. Trehalose-6-phosphatsynthase katalysiert die Synthese von Trehalose-6-phosphat und UDP aus den Substraten Glucose-6-phosphat und UDP-Glucose.
Das klassische Verfahren zur Bestimmung der Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität, das universell verwendet wird, misst die Bildung des zweiten Produkts des Enzyms, UDP (Hottinger, T., Schmutz, P, und Wiemken, A., 1987, J. Bacteriol. 169: 5518-5522). In Zellextrakten sind jedoch andere Enzyme, z.B. Glykogensynthase, vorhanden, die UDP herstellen können. Daher neigt dieses Verfahren zu Störungen durch andere enzymatische Reaktionen. Ein Verfahren, das direkt die Bildung von Trehalose-6-phosphat misst, ist sehr viel mehr zu bevorzugen. Außerdem erlaubt das genannte Verfahren nicht die kontinuierliche Messung der Enzymaktivität als eine Funktion der Zeit, da eine Beendigung der Reaktion notwendig ist, bevor UDP gemessen werden kann.
Erfindungsgemäß wird nun gezeigt, dass die Verwendung des gereinigten Phosphotrehalaseenzyms es ermöglicht, beide Ziele auf einmal zu erreichen. Zu diesem Zweck ist ein gekoppelter Test entwickelt worden, in welchem Trehalose-6-phosphat direkt und kontinuierlich mittels gereinigter Phosphotrehalase in Glucose umgewandelt wird und die hergestellte Glucose kontinuierlich unter Verwendung des Glucoseoxidase-/Peroxidase-Verfahrens gemessen wird. In diesem Test sind Phosphotrehalase, Glucoseoxidase und Peroxidase im Überschuss vorhanden, während die Trehalose-6-phosphatsynthase im Zellextrakt der limitierende Faktor bei der Bildung des farbigen Produkts ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen und andere eukaryotische Organismen, die eine konstitutive, induzierbare und/oder organspezifische Expression eines spezifisch modifizierten TPS-Gens zeigen, wobei die Pflanzen oder anderen eukaryotischen Organismen mittels des Verfahrens der Erfindung erhältlich sind. Die Erfindung betrifft außerdem Samen jener Pflanzen oder vegetativ reproduzierbare Strukturen dieser Pflanzen, wie etwa Stecklinge, somatische Embryonen, Protoplasten, sowie die weiteren Generationen der Nachkommenschaft, die von jenen Samen und Strukturen stammt. Die Erfindung betrifft außerdem die weitere Nachkommenschaft der anderen eukaryotischen Organismen.
Das TPS-Gen kann von verschiedenen Quellen, wie etwa Pflanzen, insbesondere Selaginella lepidophylla, Arabidopsis thaliana, Reis, Apfel, Zuckerrübe, Sonnenblume Helianthus annuus), Tabak (Nicotiana tabacum), Sojabohne (Glycine max), stammen. Die verschiedenen Gene können in homologen und heterologen Umgebungen exprimiert werden.
Der zu transformierende eukaryotische Organismus kann somit eine Pflanze sein, entweder die Pflanze, von der das Gen erhalten wird und nun so modifiziert wird, dass eine Modifikation in der Aktivität der TPS-Aktivität erhalten wird, oder eine heterologe Pflanze. Besonders bevorzugte Wirte für das modifizierte Gen sind Nutzpflanzen, insbesondere Pflanzen, die nicht von Natur aus stressresistent sind, aber durch das Verfahren der Erfindung stressresistent gemacht werden können. Als Alternative kann das Ziel der Modifikation eine erhöhte photosynthetische Produktivität und/oder verbesserte Kohlenstoffverteilung in der gesamten Pflanze oder in spezifischen Pflanzenteilen sein.
Andere zu transformierende eukaryotische Organismen sind Pilze und Tiere oder tierische Zellen. Beispiele für Pilze, für die eine Zunahme der TPS-Aktivität nützlich sein kann, sind Aspergillus niger, Agaricus bisporus, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis und methylotrophe Hefen. Ein Beispiel für eine Hefe ist Saccharomyces cerevisiae. Tierische Zellen sind z.B. Säugetier- und Wirbellosen-Zellkulturen, die zur Herstellung von Proteinen und kleinen Molekülen verwendet werden, Wirbellosen-Zellen, die zur Baculovirus-Expression verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die nicht beschränkend sein sollen, weiter erläutert.
Beispiele
Allgemeine Materialien und Verfahren
Reagenzien
Reagenzien von Baker oder Sigma von analytischer Reinheit wurden verwendet. Die Restriktions- und Modifikationsenzyme waren von Boehringer-Mannheim. Das ZAP cDNA-Synthesekit, der Uni-ZAP XR Vektor und die Gigapack II Gold Verpackungsextrakte wurde von Stratagene Cloning Systems (USA) erhalten. Das Sequenase Version 2.0-Kit zum Bestimmen der Nukleotidsequenz wurde von der United States Biochemical Corporation (USA) erworben.
Die Auferstehungspflanze Selaginella lepidophylla (Hook. & Grev. Spring.) wurde in getrockneter Form von den felsigen Böden der ariden Zonen der Staaten von Morelos und Oaxaca in Mexiko gesammelt. Sie wurde anschließend unter geregelten Bedingungen (24°C und 16 Stunden Licht mit einem Durchschnitt von 50% Feuchtigkeit) in Conviron-Wachstumskammern oder einem Gewächshaus kultiviert. Die Pflanzen wurden alle zwei Tage mit 20 ml Wasser für 2 L Blumentöpfe gewässert. Um S. lepidophylla mit Dehydrationsstress zu behandeln, wurde die komplette Pflanze oder Mikrophyllwedel durch Legen auf Whatman 3MM Filterpapier luftgetrocknet. Von diesem Moment an wurde die Dehydrationszeit bestimmt.
Stämme
Die cDNA-Bank wurde in dem E. coli-Stamm XL1-Blue MRF' plattiert und der Stamm SOLR wurde verwendet, um das pBluescript aus dem Lambdaphagen auszuschneiden, gemäß den Anweisungen in dem "ZAP-cDNA-Synthese-Kit" (Strategene Cloning Systems, Calif. USA; Katalog # 200400, 200401 und 2004029). Der E. coli DH5-Alphastamm wurde zum Subklonieren und Herstellen von Konstrukten verwendet. Der A. tumefaciens LBA4404-Stamm wurde verwendet, um Tabak zu transformieren, und der E. coli HB101- Stamm, der das Plasmid pRK2013 (Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721) trug, wurde verwendet, um das Plasmid pIBT36 von E. coli auf A. tumefasciens mittels triparentaler Konjugation, wie zuvor beschrieben (Bevan, M. (1984), a.a.O.), zu transferieren.
DNA Manipulation
Rekombinante DNA-Techniken, wie etwa bakterielle Transformation, Isolation von DNA aus Plasmid und Lambdabakteriophage wurden nach Standardvorschriften (Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, New York) durchgeführt. Die Markierung radioaktiver Fragmente wurde durch die "Zufalls-Druck"-Technik mit Oligonukleotiden durchgeführt (Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6.130).
Konstrukte
Der Expressionsvektor pBN35 ist ein Derivat von pBin19 (Bevan M. (1984), a.a.O.), das durch Subklonieren der 850 bp des Blumenkohlvirus CaMV 35S-Promotors (Guilley, H., Dudley, K., Jonard, G., Richards, K. & Hirth, L. (1982) Cell 21: 285-294) zwischen den HindIII und SalI-Stellen von pBin19 und des 260 bp-Fragments, das das Polyadenylierungssignal des T-DNA Nopalinsynthetasegens ausmacht (Bevan, M., Barnes, W. & Chilton, M.D. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 369-385), in den SacI- und EcoRI-Stellen desselben Vektors konstruiert (4).
Das Plasmid (pIBT36 (5) wurde durch Subklonieren der sl-tps/p cDNA in den BamHI- und KpnI-Stellen des Expressionsvektors pBN35 konstruiert.
Konstruktion der cDNA-Bank aus S. lepidophylla
Um die cDNA-Klone zu isolieren, wurde eine Expressionsbank mit mRNA, die aus S. lepidophylla-Mikrophyllen isoliert wurde, die für 2,5 Stunden getrocknet wurden, unter Verwendung des ZAP cDNA-Synthesekits, des Uni-ZAP XR Vektors und der Gigapack II Gold-Verpackungsextrakte hergestellt. Das "ZAP-cDNA Synthesekit"-Laborhandbuch, das vom Hersteller (Stratagene Cloning Systems, Calif., USA; Katalog # 200400, 200401 und 2004029) bereitgestellt wurde, wurde Schritt für Schritt befolgt. PolyA⁺-RNA wurde aus den Mikrophyllen von S. lepidophylla extrahiert, für 2,5 Stunden getrocknet, gemäß einem bekannten Verfahren (Chomczyniski, P. & Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159). Der Anfangstiter der Bank betrug 2 × 10⁶ Plaques aus Bakteriophagen/ml und nach Amplifikation 1,5 × 10¹¹ Plaques aus Bakteriophagen/ml.
Das Plasmid pBluescript SK (-) wurde aus dem Bakteriophagen mittels der "Zapping"-Technik gemäß dem Laborhandbuch "ZAP-cDNA Synthesekit" (Stratagene Cloning Systems, Calif. USA; Katalog # 200400, 200401 und 2004029) ausgeschnitten.
DNA-Sequenzierung
Verschachtelte Deletionen der Einfügung wurden mit den Enzymen ExoIII und Nukleare Sl aus dem selektierten Klon erzeugt (Henikoff, S. (1984) Gene 28: 351-359), um anschließend ihre Nukleotidsequenz unter Verwendung des Kettenabbruch-Verfahrens mit Dideoxynukleotiden zu bestimmen (Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Softwarepakets der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) analysiert (Devereux, J. Haeberli, P. & Smithies, O. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 387-395). Hydrophobizitätsplots wurden unter Verwendung eines bekannten Programms (Kyte, J. & Doolittle, R. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132) und Proteinsequenzähnlichkeitsvergleichen mit dem BESTFIT-Programm, das in dem UWGCG-Paket enthalten ist, erhalten.
Hybridisierung der Nukleinsäuren
Um die Bank zu überprüfen, wurden die Bakteriophagenplaques auf eine Hybond N⁺-Nylonmembran (Amersham Life Sciences) transferiert, die gemäß dem herkömmlichen Verfahren zur Denaturierung von DNA behandelt wurde (Sambrook, J. et al., a.a.O.).
Zweite Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Das Filter wurde mit Oligonukleotiden hybridisiert, mit dem ³²P-Isotop mittels Polynukleotidkinase markiert, unter Verwendung von 6 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat) bei 37°C. Das Filter wurde dreimal gewaschen, 10 Minuten pro Waschen bei derselben Temperatur und unter den folgenden Bedingungen: 6 × SSC; 4 × SSC; und 2 × SSC.
Southern und Northern Gelblot-Techniken wurden gemäß Standardprotokollen (Sambrook, J. et al., a.a.O.) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. Für den genomischen Southern wurde die DNA auf einem 0,8% Agarosegel in TBE-Puffer fraktioniert und auf eine Hybond N⁺-Nylonmembran (Amersham Life Sciences) überführt. Das Filter wurde unter Verwendung von sl-tps/p cDNA, die mit ³²P-Isotop als Sonde markiert war, hybridisiert unter Verwendung von 2 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat) bei 65°C. Das Filter wurde dreimal gewaschen, zwanzig Minuten pro Waschen bei derselben Temperatur und den folgenden Bedingungen: 2 × SSC; 1 × SSC; und 0,5 × SSC. Für den Northern wurde 1,2% Agarosegel in einem MOPS-Formaldehyd-Puffer verwendet, und es wurde ebenfalls eine Hybond N⁺-Nylonmembran für die Übertragung verwendet. Die Hybridisierungsbedingungen waren in 50% Formamid und 2 × SSC bei 42°C. Das dreimalige aufeinander folgende Waschen des Filters wurde mit 2 × SSC, 2 × SSC und 1 × SSC bei jeweils 55°C durchgeführt.
Transformation von Tabak
Die Transformation von Tabak (Nicotiana tabacum var. SR1) wurde mittels des Blattscheibenverfahrens (Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R.T. (1985) Science 227: 1229-1231) unter Verwendung von Agrobacterium tumefasciens LBA4404, welches das Plasmid pIBT36 enthielt, durchgeführt. Die Blattscheiben wurden in Petrischalen kultiviert, die MS-Medium mit Vitaminen (Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Pysiol. Plant. 15: 473-497), Hormone (0,1 ppm NAA und 1 ppm BAP) und Antibiotika (100 μg/ml Kanamycin und 200 μg/ml Carbenicillin) enthielten, um Schößlinge in 4 bis 6 Wochen zu regenerieren. Die Schößlinge wurden in Magentatöpfe transferiert, die Ms-Medium mit Antibiotika (100 μg/ml Kanamycin und 200 μg/ml Carbenicillin) und ohne Hormone oder Vitamine enthielten, um innerhalb von 2 bis 3 Wochen später Wurzeln zu regenerieren. Die regenerierten Pflanzen wurden in Töpfe mit Boden überführt und in Wachstumskammern (bei 24°C mit 16 Stunden Licht) kultiviert, um innerhalb von 4 bis 6 Wochen fertile Pflanzen zu erhalten.
Trehalosebestimmung
Trehalose wurde durch das Abbauverfahren mit Trehalase bestimmt (Araujo, P.S.:, Panek, A.C., Ferreira, R. & Panek, A.D. (1989) Anal. Biochem. 176: 432-436). Um lösliche Zucker zu erhalten, wurden 500 mg frisches Gewebe oder 50 mg trockenes Gewebe (in flüssigen Stickstoff gefroren) in 0,5 ml 100 mM PBS-Puffer, pH 7,0, in einem Homogenisator für Mikrozentrifugenröhrchen zerkleinert. Vier Volumen absoluter Alkohol wurden zugegeben und die Proben für 10 Minuten in Röhrchen mit Schraubkappen gekocht, um Verdampfung zu vermeiden. Anschließend wurden sie in Mikrozentrifugenröhrchen für 2 Minuten bei 13.000 U/Min. zentrifugiert und der Überstand wurde wiedergewonnen. Die Proben wurden erneut mit dem gleichen Volumen 80% Ethanol extrahiert, und das Pellet wurde vakuumgetrocknet. Die Proben wurden in 0,250 ml 50 mM PBS, pH 6,5 resuspendiert.
Für die Trehalosebestimmung wurden 4 μl (ca. 15 mU) Trehalase (Sigma Katalog Nr. T-8778) zu 10 bis 30 μl des Extrakts zugegeben, und es wurde 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Als negative Kontrolle wurde ein Röhrchen mit einem Extrakt, aber ohne Trehalose verwendet, und als positive Kontrolle wurde ein Röhrchen mit reiner Trehalose (Sigma Katalog Nr.: T-3663) verwendet. Das Volumen wurde mit 50 mM PBS, pH 7,0 auf 0,5 ml gebracht, und 0,5 μl Glucoseoxidase und Peroxidase aus dem Sigma-Kit, Katalog-Nr. 510-A wurden zugegeben, um Glucose zu bestimmen. Inkubation erfolgte für 40 Min. bei 37°C und die optische Dichte bei 425 nm wurde unverzüglich bestimmt. Um die Glucosekonzentration zu berechnen, wurde eine Standardglucosekurve mit Werten zwischen 0 und 75 mM verwendet. Die Werte der Röhrchen ohne Trehalase wurden von jenen, die mit diesem Enzym behandelt waren, subtrahiert, um die Trehalosemenge zu berechnen, wobei berücksichtigt wurde, dass 1 mol Glucose ½ mol Trehalose ist.
Bestimmung der enzymatischen Aktivität
Um die Aktivität der Trehalose-6-phosphatsynthase zu bestimmen, wurde einem berichteten Verfahren gefolgt (Londesborough, J. & Vuorio. O (1991) J. Gen. Microbiol. 137: 323-330), das im Wesentlichen aus einem gekoppelten Test besteht, der die molare Extinktion von NADH bei 340 nm misst. Die Reaktion wurde in einem Volumen 100 μl ausgeführt, das 40 mM HEPES/KOH pH 6,8-Puffer, 10 mM Glucose-6-phosphat, 5 mM UDP-Glucose, 10 mM MGCl₂ und 1 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt. Die Reaktion wurde für 10 Min. bei 30°C inkubiert und durch Kochen für 2 Min. gestoppt. Nach Abkühlen des Röhrchens wurden 900 μl zugegeben, die 40 mM HEPES/KOH pH 6,8-Puffer, 10 mM MgCl₂, 2,5 μg/ml Phosphoenolpyruvat, 0,24 mM NADH, 3,5 Einheiten Pyruvatkinase und 5 Einheiten Laktatdehydrogenase (Sigma Kat.-Nr. P-0294) enthielten. Das Verschwinden von NADH bei 340 nm, unter denselben Bedingungen wie oben erwähnt inkubiert, wurde spektrophotometrisch gemessen. Um die spezifische Aktivität von Trehalose-6-phosphatsynthase zu bestimmen, wurde die Proteinkonzentration mittels des Bradford-Verfahrens gemessen (Bradford, m.m (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254).
Beispiel 1
Selektion von TPS-Genen.
Ein geeignetes TPS-Gen kann auf verschiedene Weisen selektiert werden. Es gibt zwei Hauptmöglichkeiten, um pflanzliche TPS-Gene zu isolieren. Zunächst einmal ist die funktionelle Komplementation von Saccharomyces cerevisiae-Zellen, die für das TPS1-Gen deletiert sind, eine gradlinige Herangehensweise. Die Deletion dieses Genes bewirkt in Hefe einen pleiotropen Phänotyp (Van Aelst et al., 1993, Mol. Microbiol. 8, 927-943). Einer dieser Phänotypen besteht darin, dass solche Zellen nicht auf Glucose wachsen können. Die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken aus interessanten Pflanzen in Hefeexpressionsplasmiden kann verwendet werden, um einen Hefestamm zu transformieren, der für TPS1 deletiert ist. Die Transformanten können dann hinsichtlich der Wiederherstellung des Wachstums auf Glucose überprüft werden. Andererseits kann die Synthese von Trehalose in den Transformanten ebenfalls gemessen werden. Wenn Transformanten gefunden werden, die das Wachstum auf Glucosemedium wiederherstellen oder erneut Trehalose produzieren, kann die Plasmid-DNA isoliert werden und die Einfügungen sequenziert werden. Gestützt auf die Sequenz kann dann darauf geschlossen werden, ob ein echtes TPS-Homolog oder ein Suppressor isoliert worden ist.
Zweitens kann ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von Trehalose-6-phosphatsynthase, der von berichteten Nukleotidsequenzen abgeleitet ist, vorgenommen werden. Die verwendeten Sequenzen kommen von E. coli, EC-otsA [Kaasen, I., McDougall, J., Strom, A.R. (1994) Gene 145: 9-15]; Schizosaccharomyces pombe, SP-TPS1 [Blazquez, M.A., Stucka, R., Feldman, H. & Gancedo, C. (1994) J. Bacteriol. 176: 3895-3902]; Aspergillus niger, AN-TPS1 [Wolschek, M.F. & Kubicek, C.P. (1994) NCBI: Seq. ID 551471; unveröffentlicht]; Saccharomyces cerevisiae, SC-TPS1 [McDougall, J., Kaasen, Y. & Strom, A.R. (1993) FEMS Microbiol. Let. 107: 25-30]; Kluyveromyces lactis, KL-GGS1 [Luyten, K., de Koning W., Tesseur, Y., Ruiz, M.C., Ramos, J., Cobbaert, P., Thevelein, J.M., Hohmann, S. (1993) Eur. J. Biochem. 217: 701-713].
Als Beispiel für die Isolierung eines Pflanzenhomologen wird im Folgenden die Isolierung der cDNA von Sl-TPS beschrieben.
Getrocknete Auferstehungspflanzen, Selaginella lepidophylla, wurden von felsigen Böden in ariden Zonen der Staaten Morelos und Oaxaca in Mexiko gesammelt. Sie wurden anschließend in 2 L Blumentöpfen bei 24°C mit 16 Stunden Licht und 50% durchschnittlicher Feuchtigkeit in Conviron-Wachstumskammern kultiviert. Die Pflanzen wurden jeden zweiten Tag mit 20 ml Wasser gewässert.
Um die cDNA-Klone zu isolieren, wurde eine Expressionsbank unter Verwendung von 5 μg mRNA hergestellt, die aus 50 g S. lepidophylla Mikrophyllen isoliert wurde, die für 2,5 Stunden getrocknet wurden. Nach Synthese der cDNA wurde sie unter Verwendung von 1 μg UNI-ZAP XR Vektor kloniert. Die Bakteriophagen wurden in vitro verpackt und anschließend mit einer Mischung aus degenerierten Oligonukleotiden überprüft, die für Konsensusbereiche in Trehalose-6-phosphatsynthase der berichteten Sequenzen von E. coli und Hefe kodieren. Einer der isolierten Klone entspricht einer cDNA (sl-tps) mit einem vollständigen Kodierungsbereich (Seq. ID Nr. 1).
Eine Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz ergab 53% Identität für Trehalose-6-phosphatsynthase und 29% für Trehalose-6-phosphatphosphatase, verglichen mit berichteten Sequenzen von Trehalose-6-phosphatsynthase aus Bakterien und verschiedenen Hefen.
Die Homologie des Proteins, das durch sl-tps kodiert ist, SL-TPS genannt, zu Trehalose-6-phosphatsynthase liegt auf dem N-terminalen Bereich der Ersteren und die Homologie der SL-TPS zu Trehalose-6-phosphatphosphatase kann über die gesamte Sequenz hinweg gefunden werden.
Das für S. lepidophylla beschriebene Isolationsverfahren kann für jede andere Pflanze, bevorzugt Monokolyten und Dikolyten, verwendet werden. Dieses Verfahren ist von allgemeiner Anwendbarkeit, da die degenerierten Oligos, die zum Fischen von Selaginella TPS verwendet wurden, erfolgreich in Arabidopsis thaliana getestet wurden. Unter Verwendung einer PCR-Reaktion konnte ein Fragment des A. thaliana TPS-Gens isoliert werden. Gestützt auf dieses Fragment wurde das vollständige A. thaliana TPS-Gen isoliert (Seq. ID Nr. 2).
Beispiel 2
Herstellung von Konstrukten
1. Konstruktion von Hefeexpressionvektoren, die pflanzliche TPS-Gene enthalten.
Ein 3.1-kb-Fragment, dass das SlTPS1-Gen in voller Länge enthielt, wurde nach Amplifikation durch PCR (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 50°C, 1 Min., 72°C, 2 Min., 40 Zyklen; 72°C, 10 Min. 1 Zyklus) unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA- Polymerase (Boehringer) erhalten. Als Oligonukleotide wurden SLTPS-S1 (5'-CATGCCATGGCTATGCCTCAGCCTTACC-3', fett bedeutet Initiationskodon und unterstrichen NcoI-Stelle) und universelle (5'-GTAAACGACGGCCAGT-3')-Starter mit Sl-TPS1 cDNA, die in pBluescript SK kloniert wurde, als Templat verwendet. Das PCR-Fragment wurde mit NcoI und KpnI verdaut und pSAL4 kloniert. Hefe tps1Δ und tps1Δ tps2Δ-Mutantenstämme wurden transformiert und auf SDGal(-ura)-Platten selektiert. Die Komplementation wurde in SDGlc(-ura Minimalmedium plus 100 μM CuSO₄) getestet.
Für die Konstruktion des N-terminalen Deletionskonstrukts wurden die folgenden Oligonukleotide verwendet:
Oligo 5 'SLTPS-100 5'-CATGCCATGGGTCGAGGCCAGCGGTTGC-3',
fett bedeutet Initiationskodon und unterstrichen NcoI-Stelle
Oligo 3' Universal 5'-GTAAACGACGGCCAGT-3'.
Ein 2,8-kb-Fragment wurde nach Amplifikation durch PCR (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 50°C, 1 Min. 72°C, 2 Min., 40 Zyklen; 72°C, 10 Min. 1 Zyklus) unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA-Polymerase (Boehringer) mit Oligos SLTPS-100 und universell und Sl-TPS1 cDNA, in pBluescript SK kloniert, als Templat erhalten. Das PCR-Fragment wurde mit NcoI und KpnI verdaut und in pSAL4 kloniert. Hefe tps1Δ und tps1Δ tps2Δ-Mutantenstämme wurden transformiert und in SDGal (-ura) selektiert. Die Komplementation wurde in SDGlc (-ura Minimalmedium plus 100 μM CuSO₄) getestet.
Für die Konstruktion von Hefeexpressionsvektoren, die das A. thaliana TPS-Gen enthalten, wurde RT-PCR verwendet.
Vollständige RNA (5 μg), die aus Arabidopsis thaliana cv. Columbia Keimlingen extrahiert wurde, die für 2 Wochen in flüssigem MS-Medium, das 100 mM NaCl enthielt, gezogen wurden, wurde unter Verwendung von SuperScript II (GIBCO) unter Verwendung eines Oligo dT (25 mer) Starters revers transkribiert. Eine PCR-Reaktion (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 50°C, 1 Min., 72°C, 2 Min., 40 Zyklen; 72°C, 10 Min. 1 Zyklus) wurde unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA-Polymerase (Boehringer) durchgeführt, um AtTPS1 unter Verwendung von Oligos Ath/TPS-5' (5'-CATGCCATGGCTATGCCTGGAAATAAGTACAACTGC-3', fett bedeutet Initiationskodon, unterstrichen ist die NcoI-Stelle) und Ath/TPS-3' (5'-ATAGTTTTGCGGCCGCTTAAGGTGAGGAAGTGGTGTCAG-3'; fett bedeutet Terminationskodon, unterstrichen NotI-Stelle) zu amplifizieren. Ein 2,8-kb-Fragment wurde entsprechend der erwarteten Größe erhalten, mit NcoI und NotI verdaut und in pSAL6 kloniert. Hefe tps1Δ- und tps1Δ tps2Δ-Mutantenstämme wurden transformiert. Die Transformanten wurden in SDGal (-his Minimalmedium) kultiviert. Die Komplementation wurde in SDGlc (-his Minimalmedium plus 100 μM CuSO₄) getestet.
Für die Konstruktion der N-terminalen Deletionskonstrukte wurden die folgenden Oligonukleotide verwendet:
Oligo Ath/TPS-ΔN5'
5'-CATGCCATGGCTTATAATAGGCAACGACTACTTGTAGTG-3', fett bedeutet Initiationskodon und unterstrichen NcoI-Stelle.
Oligo Ath/TPS-3'
5'-ATAGTTTTGCGGCCGCTTAAGGTGAGGAAGTGGTGTCAG-3'; fett bedeutet Terminationskodon, unterstrichen NotI-Stelle.
Vollständige RNA (5 μg), die aus Arabidopsis thaliana cv. Columbia Keimlingen, die für 2 Wochen in flüssigem MS-Medium, das 100 mM NaCl enthielt, kultiviert worden waren, extrahiert wurde, wurde unter Verwendung von SuperScript II (GIBCO) und einem Oligo dT (25 mer) Starter revers transskribiert. Eine PCR-Reaktion (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 50°C, 1 Min. 72°C, 2 Min., 40 Zyklen; 72°C, 10 Min. 1 Zyklus) wurde unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA-Polymerase (Boehringer) durchgeführt, um AtTPS1 unter Verwendung von Oligos Ath/TPS-?N5' und Ath/TPS-3' zu amplifizieren. Ein 2,6-kb-Fragment wurde entsprechend der erwarteten Größe erhalten, mit NcoI und NotI verdaut und in pSAL6 kloniert. Hefe tps1Δ und tps1Δtps2Δ-Mutantenstämme wurden transformiert. Die Transformanten wurden in SDGal (-his Minimalmedium) kultiviert.
Die Komplementation wurde in SDGlu (-his Minimalmedium) getestet.
2. Konstruktion von Pflanzenexpressionsvektoren, die pflanzliche TPS-Gene enthalten.
Um in Pflanzen Expressionsvektoren zu klonieren, wurden zunächst pflanzliche Trehalose-6-phosphatsynthasegene in einem Hefe tps1Δ-Mutanten getestet und anschließend in geeigneten pflanzlichen Transformationsvektoren subkloniert. Die 2,9-kb AtTPS1 und 2,6-kb ΔNAtTPS1 kodierenden Bereiche wurden nach Verdauung aus Plasmiden pSAL6::AtTPS1 und pSAL6::ΔNAtTPS1 mit NcoI- und KpnI-Enzymen isoliert. Diese letztere Stelle ist stromabwärts der NotI-Stelle in pSAL6.
Die 3,1-kb SlTPS1 und 2,8-kb ΔNSlTPS1 kodierenden Bereiche wurden ebenfalls nach Verdauung der Plasmide pSAL4.SlTPS1 und pSAL4.dNSlTPS1 mit NcoI- und KpnI-Enzymen isoliert. Alle DNA-Fragmente wurden mit einem 57-bp-Fragment ligiert, das AtTPS1 5' Vorsequenz, XbaI- und NcoI-Stellen enthielt. Dieses Fragment wurde nach Annealing der Oligonukleotide NA4 (5'-CTAGAGCGGCCGCCAGTGTGAGTAATTTAGTTTTGGTTCGTTTTGGTGTGAGCGTC-3' und NA5 (5'-CATGGACGCTCACACCAAAACAGAACCAAAACTAAATTATCACACTGGCGGCCGCT-3') erhalten.
Jede ligierte Vorsequenz-Kodierungsbereich-Kassette wurde weiter mit dem Expressionsvektor pBN35 ligiert, verdaut mit XbaI und KpnI (1), was zu Plasmiden pIBT101 enthaltend AtTPS1 (2), pIBT102 enthaltend ΔNAtTPS1 (3), pIBT103 enthaltend SlTPS1 (4) und pIBT104 enthaltend ΔNSlTPS1 (5) führte. Der Vektor pBN35 erlaubt die Expression eines beliebigen Gens unter der Steuerung des Blumenkohlvirus (CaMV) 35S-Promotors (Guilley, H., et al., Cell 21: 285-294 (1982)), der ein starker und konstitutiver Promotor ist.
Diese Plasmide wurden verwendet, um transgene Pflanzen zu erhalten, die mittels des Agrobacterium-Systems transformiert wurden, die, wenn sie regeneriert wurden, in der Lage waren, Trehalose zu erzeugen. Diese Konstrukte können in jeder Pflanze exprimiert werden, die unter Verwendung des Agrobacterium-Systems oder durch irgendein anderes im Stand der Technik bekanntes Verfahren transformiert werden können.
Der Expressionsvektor pBN35 ist ein Derivat von pBin19 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721 (1984)), der durch Subklonieren der 850 bp des Blumenkohlvirus CaMV 35S Promotors (Guilley, H. et al., a.a.O.) zwischen HindIII und SalI-Stellen von pBin19 und dem 260 bp-Fragment, das das Polyadenylierungssignal des T-DNA-Nopalinsynthethasegens bildet (Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 11: 369-385 (1983)), in den SacI und EcoRI-Stellen desselben Vektors (1) konstruiert wurde.
3. Konstruktion von HA-markierten Sl TPS1, At TPS1, ΔN Sl TPS1 und ΔN At TPS1-Allelen.
Um zu bestimmen, ob die Aktivitätsdifferenz zwischen den pflanzlichen TPS1-Genen voller Länge und den N-terminal deletierten Allelen durch die Tatsache verursacht wird, dass die Ersteren nicht dazu in der Lage sind, einen korrekten TPS-Komplex zu bilden, wenn sie in Hefezellen exprimiert werden, haben wir markierte Versionen dieser Gene hergestellt. Das in 9 gezeigte Schema wurde verwendet, um diese Konstrukte herzustellen. 10 zeigt die erhaltenen Plasmide.
Das Plasmid, welches die pflanzlichen TPS-Gene enthält, wird mit zwei einzigartigen Restriktionsstellen verdaut, wobei die eine genau hinter dem Gen (R1) schneidet und die zweite nahe dem 3' des Gens (R2). Das Fragment, das durch die kombinierte Verwendung von R1 und R2 entfernt wird, wird durch ein Fragment ersetzt, das durch PCR erhalten wurde, das ebenfalls mit R1 und R2 verdaut wird. Die R2-Stelle ist innerhalb des PCR-Produkts angeordnet, während die R1-Stelle Teil des reversen Starters (rev) ist. Der Aufbau des reversen Starters ist wie folgt.
5' R1-STOP-HAtag-Kodons für 6 Aminosäuren des relevanten Gens-3'
Tabelle 1 zeigt die Starter, die wir verwendet haben: Die Starter können sowohl für die Gene voller Länger als auch für die ΔN-Allele verwendet werden. Tabelle 1
In Tabelle 2 sind die unterschiedlichen Vektoren und Restriktionsenzyme, die verwendet wurden, angegeben. Tabelle 2
Beispiel 3
Funktionelle Komplementation von Hefe-tps-Mutanten mit modifizierten pflanzlichen TPS-Genen
1. Komplementation des Wachstumsdefekts von tps1Δ und tps1Δtps2Δ-Stämmen.
Tps1Δ und tps1Δtps2Δ-Stämme wurden mit Hefeexpressionsvektoren transformiert, die entweder vollständige oder N-terminal deletierte S. lepidophylla oder A. thaliana TPS-Gene enthielten. Als Kontrollen wurden Wildtyp-, tps1Δ oder tps1Δtps2Δ-Stämme mit einem leeren Plasmid transformiert oder mit einem Plasmid, welches das Hefe-TPS1-Gen enthielt. Die Transformanten wurden hinsichtlich Wachstum auf glucose- und fructosehaltigem Medium getestet. 6 zeigt das Wachstum auf glucose- und fructosehaltigem Medium von Wildtyp- und tps1Δ-Stämmen, die mit einem Hefeexpressionsvektor transformiert wurden, der ein komplettes oder das trunkierte S. lepidophylla TPS-Gen enthält. Die Spuren sind wie folgt: 1. WT, 2. tps1Δ, 3. tps1Δ + ΔNTPS1 Sl, 4. tps1Δ + TPS1 Sl, 5. tps1Δ + TPS1 Sc 6. tps1Δtps2Δ, 7. tps1Δtps2Δ + ΔNTPS1 Sl, 8. tps1Δtps2Δ + TPS1 Sl, 9. tps1Δtps2Δ + TPS1 Sc, 10. tps1Δtps2Δ + TPS2 Sc.
Der Klon ganzer Länge kann nur den tps1Δtps2Δ-Stamm komplementieren. Er kann nicht den Wachstumsdefekt eines tps1Δ-Stamms auf Glucose oder Fructose komplementieren. Wenn jedoch der N-terminale Teil deletiert ist, kann das von dem Cu-induzierbaren Promotor exprimierte S. lepidophylla-Gen den Wachstumsdefekt in einem tps1Δ-Stamm komplementieren. Dies zeigt deutlich den nutzbringenden Effekt der N-terminalen Deletion.
Wenn das Pflanzengen unter der Regulation eines starken Promotors exprimiert wird, kann auch der Klon vollständiger Länge den tps1Δ-Stamm für Wachstum auf Glucose oder Fructose komplementieren (nicht gezeigt).
2. Wiederherstellung von Trehalosepegeln in tps1Δ-Stämmen
Trehalose wurde in Hefezellen unter Verwendung des Verfahrens von Neves et al. gemessen (Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994)). In diesem Verfahren wird Trehalose durch Trehalase abgebaut, und die gebildete Glucose wird durch das Glucoseoxidase-/Peroxidase-Verfahren gemessen. In Kürze beschrieben, wurden Zellen auf einem Filter mit 0,22 oder 0,45 μm Poren auf einem Vakuumkolben gesammelt und mit Wasser gewaschen. Die Zellen wurden gesammelt, das Gewicht wurde bestimmt, und sie wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Extraktion der Trehalose wurde Na₂CO₃ (0,25 M) zu den Zellen gegeben (1 ml pro 50 mg Zellen), und sie wurden für zwanzig Minuten gekocht. Nach Zentrifugierung wurden 10 μl des Überstandes verwendet, um den Trehalosegehalt zu messen. Jede Probe wurde durch Zugabe von 5 μl einer 1M-Essigsäurelösung neutralisiert. Zu jeder Probe wurden 5 μl Puffer T1 (300 mM NaAc + 30 mM CaCl₂ pH 5,5) und 20 μl Trehalaselösung (aus dem Pilz Humicola grisea isoliert) zugegeben. Die Proben wurden bei 40°C für 45 Min. inkubiert. In diesem Schritt wird Trehalose zu Glucose abgebaut. Parallel zu den Proben wurden ebenfalls Trehalosestandards und Kontrollproben gemessen. Nach dieser Inkubation wurden die Proben kurz zentrifugiert, und 30 μl des Überstands wurden zur Glucosebestimmung verwendet.
Zu jeder Probe wurde 1 ml Glucose-Oxidase-/Peroxidaselösung, die o-Dianisidin (0,1 mg/ml) enthielt, zugegeben, und die Mischung wurde für 1 Std. bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 56% (v/v) Schwefelsäure beendet. Für jede Probe wurde die Extinktion bei 546 nm gemessen.
Die Trehalosepegel wurden in S. cerevisiae tps1Δ-Stämmen gemessen, die mit Plasmiden transformiert wurden, welche die SlTPS1, ΔNSlTPS1, AtTPS1 oder ΔNAtTPS1-Gene unter der Kontrolle eines Cu-induzierbaren Promotors enthielten. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse dreier unabhängiger Experimente. Die Abkürzung 1Δ steht für tps1Δ. Tabelle 3
Die Ergebnisse in dieser Tabelle bestätigen die Ergebnisse, die in 6 gezeigt sind. Die Klone voller Länge können den Wachstumsdefekt eines tps1Δ-Stamms auf glucose- oder fructosehaltigem Medium nicht komplementieren. Außerdem sind diese Klone voller Länge auf Galactose nicht dazu in der Lage, Trehalose in tps1Δ-Stämmen herzustellen. Wenn jedoch der N-terminale Teil entweder des S. lepidophylla- oder des A. thaliana-TPS-Gens deletiert wurde und die tps1Δ-Stämme mit Plasmiden, welche diese Gene enthalten, transformiert wurden, können diese Stämme auf Glucose oder Fructose wachsen, und diese Stämme erzeugen auch hohe Pegel Trehalose. ("-" bedeutet, dass keine Messung vorgenommen werden konnte, da die Zellen unter dieser Bedingung nicht in der Lage sind zu wachsen, "ND" bedeutet nicht detektierbar).
3. Deletion des N-Terminus ist notwendig, um TPS-Aktivität in einem in vitro-Test zu erhalten.
Die Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität wurde durch einen gekoppelten Enzymtest gemessen, wie er von Hottiger et al. (J. Bacteriol., 169: 5518-5522 (1987)) beschrieben wurde. Rohextrakte wurden auf einer Sephadex G-25-Säule mit einem Schüttungsvolumen von 2 ml entsalzt, mit 50 mM Tricinpuffer pH 7,0 voräquilibriert. Die Testmischung enthielt 50 mM Tricin/KCl (pH 7,0), 12,5 mM MgCl₂, 5 mM UDP-Glucose, 10 mM Glucose-6-phosphat, Enzymprobe und Wasser in einem Gesamtvolumen von 240 μl. In den Kontrollen wurde Glucose-6-phosphat weggelassen und durch Wasser ersetzt. Die Testmischungen wurden bei 30°C 30 Min. inkubiert. Die Reaktion wurde durch Kochen für 5 Min. beendet. Nach dem Abkühlen wurden die Testmischungen bei 13.000 U/min. für 10 Min. zentrifugiert. Das in dem Überstand gebildete UDP wurde enzymatisch gemessen. Die Testmischung enthielt 66 mM Tricin/KCl (pH 7,6), 1,86 M Phosphoenolpyruvat, 0,3 mM NADH, 5U Laktatdehydrogenase und 60 μl Probe in einem Gesamtvolumen von 990 μl. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl Pyruvatkinase gestartet und bei 37°C für 30 Min. inkubiert. Die Abnahme der Absorbanz bei 340 nm wurde aufgezeichnet und verwendet, um die Enzymaktivität zu berechnen.

1 kat = 6 × 10⁷ Einheiten.

Die Ergebnisse der TPS-Aktivitätsmessungen sind in Tabelle 3 gezeigt. Sie deuten darauf hin, dass nur die N-terminal deletierten TPS-Gene, und nicht die Klone voller Länge, zu einer hohen Aktivität der Trehalose-6-phosphatsynthase führen, wenn sie in Hefe exprimiert werden.

Nach der Konstruktion der HA-markierten Allele wurden diese Allele in tps1∆ und s1∆tps2∆-Stämme eingeführt. Die folgenden Stämme wurden erhalten:

PVD164:	ein leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 + tps1Δ::TRP1 + pSAL4/Sl TPS1 HAtag (URA3)
PVD165:	ein leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ad2-1 can1-100 GAL SUC2 + tps1Δ::TRP1 + pSAL4/?N Sl TPS1 HAtag (URA3)
PVD179:	ein leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 + tps1Δ::TRP1 tps2Δ::LEU2 + pSAL4/Sl TPS1 HAtag (URA3)
PVD181:	ein leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 + tps1Δ::TRP1 tps2Δ::LEU2 + pSAL4/ΔN Sl TPS1 HAtag (URA3)

Die Gegenwart der HA-Markierung beeinträchtigte zunächst nicht die Funktion der pflanzlichen Gene. Die Expression vom CUP1-Promotor (pSal-Vektoren) der pflanzlichen Allele voller Länge stellte den Wachstumsdefekt auf Glucose eines tps1∆-Stammes nicht wieder her. Die Expression der N-terminal deletierten Allele stellte das Wachstum auf Glucose wieder her, wie wir es für die nicht-HA-markierten Allele gesehen haben.
Die Expression der vollständigen und N-terminal deletierten HA-markierten Sl TPS1-Gene wurde sowohl im tps1∆ als auch tps1∆tps2∆-Stamm getestet.
Die Stämme PVD164 (tps1∆ + Sl TPS1-HA), PVD165 (tps1∆ + ΔN Sl TPS1 HA), PVD179 (tps1∆tps2∆ + Sl TPS1-HA) und PVD181 (tps1∆tps2∆ + ΔN Sl TPS1-HA) wurden bis zur stationären Phase in SDgal-URA (+ CuSO₄) kultiviert. Die Zellen wurden in Extraktionspuffer (für 1 Liter: 10,7 g Na₂HPO₄·2H₂O, 5,5 g NaH₂PO₄·H₂O, 0,75 g KCl, 246 mg MgSO₄·7H₂O, 1 mM PMSF, pH 7,0) gewaschen und in 500 μl Extraktionspuffer resuspendiert. Die Extrakte wurden durch zweimaliges Vortexen für 1 Min. in Gegenwart von Glasperlen hergestellt. Die Extrakte wurden durch 20 minütige Zentrifugierung geklärt.
10 μg der Extrakte ließ man auf einem 7,5% PAGE-Gel laufen. Nach dem Blotten wurden die Nitrocellulosemembranen für 1 Stunde in TBST inkubiert, das 2% BSA (5 × TBS: 6 g Tris + 45 g NaCl, pH 7,4; TBST = 1 × TBS + 0,05% Tween20) enthielt. Die Filter wurden dann für 1 Stunde mit Anti-HA-Antikörpern (Anti-HA hohe Affinität, monoklonaler Rattenantikörperklon 3F10, Boehringer Mannheim), in TBST, das 2% BSA enthält, 1:1.000 verdünnt, inkubiert. Die Filter wurden 3 × 5 Min. in TBST gewaschen und anschließend für 45 Min. mit dem sekundären Antikörper (Sigma A-6066; Anti-Ratte), in TBST, das 2% BSA enthielt, 1:20.000 verdünnt, inkubiert. Die Filter wurden dann 3 × 5 Min. in TBST gewaschen. Danach wurden die Filter 5 Min. in TBS gewaschen. Die alkalische Phosphataseentwicklungsmischung (10 ml 100 mM Tris, pH 9,5; 50 mM MgCl₂; 100 mM NaCl, 37,5 μl X-Phosphat und 50 μl Nitroblautetrazolium (NBT)) wurde zu den Filtern gegeben, und als die Banden sichtbar wurden, wurde die Reaktion durch Zugabe von H₂O gestoppt. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
Das berechnete Molekulargewicht des vollständigen Sl Tps1-Proteins (ohne die HA-Markierung) beträgt 109.353, während das ΔN Sl Tps1-Protein ein Molekulargewicht von 99.453 aufweist.
Um herauszufinden, ob der Unterschied im Komplementationsvermögen zwischen dem vollständigen TPS1-Gen und dem N-terminal deletierten TPS1-Gen durch die Tatsache verursacht wird, dass das vollständige Protein keinen korrekten TPS-Komplex bilden kann, wurde eine FPLC-Analyse von Hefeextrakten, die aus tps1Δ-Stämmen hergestellt wurden, die entweder mit dem vollständigen Sl TPS1- oder dem ΔN Sl TPS1-Gen transformiert worden waren, durchgeführt. Die Extrakte wurden auf einer Gelfiltrationssäule (Superdex 200 HR 10/30) aufgetrennt und Fraktionen von 750 μl wurden gesammelt, wie von Bell et al., beschrieben (J. Biol. Chem., 373, 33311-33319, 1998). Die erste Fraktion, die Proteine enthält, ist Fraktion 10. Basierend auf den Säuleneigenschaften und basierend auf Kalibrierungsexperimenten entsprechen die Proteine in Fraktion 10-14 sehr großen Proteinkomplexen, die von 800.000 bis 400.000 Dalton reichen.
11 zeigt das Ergebnis des Westernblots unter Verwendung von Anti-HA-Antikörpern. Hier zeigen wir nur die Fraktionen 10 bis 15. Das freie TPS1-Protein ist in Fraktionen 25-27 vorhanden (nicht gezeigt). Sehr wichtig ist die Tatsache, dass sowohl die vollständigen als auch die ΔN Sl TPS1-Allele in der Lage sind, Komplexe mit den anderen Untereinheiten des TPS-Komplexes zu bilden. Dies könnte darauf hinweisen, dass der N-terminale Bereich selbst eine inhibierende Funktion direkt auf den Rest des pflanzlichen Tps1-Proteins ausübt.
Die Tatsache, das TPS1-Allele voller Länge zu keiner Trehalosesynthese in höheren Pflanzen führen, kann durch die inhibierende Wirkung des N-Terminus verursacht sein. Die Konstruktion von transgenen Pflanzen mit diesen N-terminal deletierten Konstrukten kann zu Pflanzen mit höheren Trehalosepegeln und besserer Stressresistenz führen.
Beispiel 4
Konstruktion von transgenen Pflanzen von Arabidopsis thaliana, die Trehalose herstellen.
Die Transformation von Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia wird mittels des Vakuuminfiltrationsverfahrens ausgeführt (Bechtold, N. et al., C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199 (1993); Bent, A. et al., Science 265: 1856-1860 (1994)), wobei ein Agrobacterium tumefasciens C58C1-Stamm verwendet wird, der das Hilfsplasmid pMP90 beherbergt und das geeignete Plasmidkonstrukt, und wird vom E. coli-Stamm DH5-alpha durch Dreielternpaarung unter Verwendung des E. coli-Stamms HB101, der das Plasmid pRK2013 als einen Helfer beherbergt, mobilisiert.
In Kürze beschrieben, werden A. thaliana-Pflanzen bei 22-20°C unter 16 Std. Licht für 4-6 Wochen kultiviert, bis Blüten zu erscheinen beginnen. Nach Gießen einer Agrobacteriumkultur in das Innere eines Vakuumexsikkators, werden Töpfe, die Arabidopsis-Pflanzen enthalten, umgekehrt eingesetzt und für 5 Min. vakuuminfiltriert. Man läßt die Pflanzen unter den oben beschriebenen Bedingungen wachsen. Die Samen werden geerntet und in Petrischalen selektiert, die 4,4 g/L MS-Salze, 1% Saccharose, 0,5 g/L MES-Puffer pH 5,7 (KOH), 0,8% Phytagar und 30 mg/L Kanamycin enthalten, um Transformanten zu selektieren. 500 mg/L Carbenicillin werden ebenfalls zugegeben, um Bakterienwachstum zu stoppen. Nach 5-7 Tagen sind Transformanten als grüne Pflanzen sichtbar und werden in das gleiche Medium wie oben, aber mit 1,5% Phytagar überführt. Nach 6-10 Tagen werden Pflanzen mit echten Blättern in Boden überführt.
Eine Analyse der transgenen Pflanzen wird durchgeführt, um die Genintegration in das Pflanzengenom und die Genkopiezahl durch Southernblot zu bestimmen und eine Transkription des Transgens wird durch Northernblot mit Standardtechniken durchgeführt (Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)). Ein Antikörper gegen Sl-TPS1 wird verwendet, um die korrekte Translation des Transgens unter Verwendung eines Westernblots zu bestätigen. (Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4353 (1979)). Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität (De Virgilio, C. et al., FEBS Lett. 273: 107-110 (1990)) und Trehalosegehalt (Neves, MJ. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994)) wurden durch bekannte Verfahren gemessen.
Tabelle 4 zeigt die Phänotypen transgener Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die das Trehalose-6-P-Synthasegen überexprimieren.
Beispiel 5
Massensynthese von Trehalose in transgenen Kartoffel-, Zuckerrüben- und Zuckerrohrpflanzen
Die Gentechnik hat es möglich gemacht, beinahe jedes Gen in einem heterologen Organismus zu exprimieren. Transgene Pflanzen können als Bioreaktoren zur Produktion von Verbindungen von kommerziellen Interesse im großen Maßstab verwendet werden, die normalerweise nur in beschränkten Mengen erhalten werden, wie etwa biologisch abbaubare Kunststoffe, verschiedene Kohlenhydrate, Polypeptide für die pharmazeutische Verwendung und Enzyme für die industrielle Verwendung (Goodijin, O.J.M. and Pen, J., Trends Biotech. 13: 379-387 (1995)). Unterschiedliche Verfahren sind für die Transformation höherer Pflanzen berichtet worden, einschließlich Nutzpflanzen von großer wirtschaftlicher Bedeutung (Walden, R. and Wengender, R., Trends Biotech. 13: 324-331 (1995)). Die Transformation von Tabak (Horsch, R.B. et al., Science 227: 1229-1231 (1995)) und Kartoffel (Sheerman, S. and Bevan, M.W., Plant Cell Rep. 7: 13-16 (1988)) werden unter Verwendung des Agrobacterium tumefasciens-Systems effizient durchgeführt, und diese Technik kann in einem Labor durch Personen eingerichtet werden, die den Stand der Technik beherrschen. Die Konstrukte für die Expression eines beliebigen pflanzlichen Trehalose-6-phosphatsynthasegens, bevorzugt SlTPS1, das frei von seinem N-terminalen Bereich ist, kann in einem Vektor erfolgen, der von dem Ti-Plasmid stammt, dem die tumorinduzierenden T-DNA-Gene fehlen und das einen Selektionsmarker für transformierte Pflanzen enthält, der z.B. Resistenz gegen Kanamycin mit sich bringt (Bevan, M., 1984, Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721). Außerdem muss ein geeigneter Promotor abhängig von der Verwendung ausgewählt werden, die der transgenen Pflanze gegeben wird. Das Polyadenylierungssignal aus dem Nopalinsynthetasegen in der T-DNA kann verwendet werden (Bevan, M., Barnes, W. and Chilton, M.-D., 1983, Nucl. Acids. Res. 11: 369-385).
Um Trehalose zur industriellen Verwendung überzuproduzieren, können Pflanzen wie etwa Kartoffel, Zuckerrohr oder Zuckerrübe verwendet werden. Zum Beispiel speichert Kartof fel große Mengen an Kohlenhydraten in der Knolle. In Einheiten der Pflanzenbiomasse stellt die Kartoffel eine der produktivsten Nutzpflanzen pro Flächeneinheit dar (Johnson, V.A. and Lay, C.L., 1974, Agric. Food Chem. 22: 558-566). Es gibt starke knollenspezifische Promotoren, wie etwa den Klasse 1-Promotor des Patatingens (Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 14: 4625-4638 (1986); Jefferson, R. et al., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990)), der verwendet werden könnte, um große Mengen Trehalose zu erzeugen. Der Vorteil der Verwendung von Kartoffel, Zuckerrübe oder Zuckerrohr als Systeme zur Überproduktion von Trehalose besteht darin, dass diese Pflanzen menschliche Nahrungsmittel sind, und daher aus diesen isolierte Trehalose leicht von Konsumenten akzeptiert würde. Die durch Überexpression in Pflanzen erhaltene Trehalose könnte verwendet werden, um Biomoleküle zur industriellen Verwendung, wie etwa Restriktions- und Modifikationsenzyme (Colaco, C. et al., Bio/Technology 10: 1007-1111 (1992)), Impfstoffe oder verarbeitete Nahrungsmittel zu konservieren.
Beispiel 6
Transgene Getreidepflanzen, die gegen Umweltstress resistent sind
Getreide machen die Grundnahrung für die Welternährung aus und könnten unter ungünstigen Wetterbedingungen angebaut werden, wenn sie Trehalose als Antwort auf Kälte, Hitze, Salzgehalt oder Dürre produzieren könnten. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, ein beliebiges pflanzliches Trehalose-6-phosphatsynthasegen, bevorzugt Sl-TPS1, ohne dessen N-terminalen Bereich unter der Regulierung von Promotoren zu exprimieren, die durch einen dieser Umweltfaktoren induziert werden (Baker, S.S. et al., Plant Mol. Biol. 24: 701-713 (1994); Takahashi, T. et al., Plant J. 2: 751-761 (1992); Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K., Plant Cell 6: 251-264 (1994)). Die Synthese von Trehalose nur unter Stressbedingungen würde die ständige Produktion von Trehalose (unter Verwendung eines konstitutiven Promotors) vermeiden, die den Kohlenhydratmetabolismus umleitet und als Folge die Qualität und Produktivität der Körner verringern könnte. Es gibt Berichte über die Transformation von Mais (D'Halluin, K. et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992)), Gerste (Wan, Y. and Lemaux, P.G., Plant Physiol. 104: 37-48 (1994)), Weizen (Vasil, V. et al., Bio/Technology 10: 667-674 (1992)) und Reis (Shimamoto, K. et al., Nature 338: 274-276 (1989)). Diese Methodik kann durch eine Person, die mit dem Stand der Technik vertraut ist, angewendet werden.
Beispiel 7
Früchte transgener Pflanzen mit längerer Haltbarkeit
Unterschiedliche Arten von Früchten, wie etwa Tomate, Mango und Banane, reifen schnell und neigen dazu zu verderben, bevor sie die Verbraucher erreichen. Traditionell ist die frühe Ernte von Früchten und ihre Lagerung unter Kühlung oder in Kammern mit kontrollierter Umgebung verwendet worden, um dieses Problem zu vermeiden. Diese Verfahren sind jedoch teuer, besonders wenn die Früchte zu entfernten Orten transportiert werden. Um die Haltbarkeit von Tomate zu erhöhen, ist eine Reifungsverzögerung durch Verwendung transgener Pflanzen berichtet worden, die das Polygalacturonasegen, das an der Fruchtreifung beteiligt ist, in Antisense exprimieren. Trotz dieser Reifungsverzögerung gibt es immer noch das Problem, dass dieser Vorgang nach einer gewissen Zeit ausgeführt worden ist, ohne dass das Produkt notwendigerweise den Verbraucher in einem guten Zustand erreicht.
Als Alternative zu diesem Verfahren wird hier vorgeschlagen, Trehalose in transgenen Tomaten-, Mango- und Bananenpflanzen zu produzieren. Zum Beispiel könnte unter Verwendung eines spezifischen Promotors der Tomatenfrucht (Bird, C.R. et al., Plant Mol. Biol. 11: 651-662 (1988)), ein beliebiges pflanzliches Trehalose-6-phosphatsynthasegen, bevorzugt Sl-TPS1, ohne seinen N-terminalen Bereich überexprimiert werden, so dass sich Trehalose spezifisch in diesem Organ ansammelt. Das Verfahren der Transformation und Regeneration für Tomatenpflanzen (wie beschrieben von McCormick, S. et al., Plant Cell Rep. 5: 81-84 (1986)) kann durch jede Person ausgeführt werden, die den Stand der Technik kennt. Tomaten und andere Arten von Früchten könnten reif geerntet werden und dann als Ganzes oder in Teilen einer Trocknung unterzogen werden und für lange Zeiträume ohne die Notwendigkeit der Kühlung konserviert werden. Wenn sie rehydratisiert wird, hätte die Frucht die normalen sensorischen Eigenschaften, die der Verbraucher verlangt. Im Prinzip kann die oben beschriebene Strategie für andere Arten von Früchten umgesetzt werden, vorausgesetzt, dass ein Regenerations- und Transformationssystem für die fragliche Pflanze verfügbar ist und dass es einen geeigneten fruchtspezifischen Promotor gibt.
Beispiel 8
Steigerung der Vermehrungsfähigkeit von Zellen, Organen oder Pflanzenteilen, die an der sexuellen oder asexuellen Vermehrung beteiligt sind
Die Herstellung von Pollen mit verlängerter Vermehrungsfähigkeit wäre von großer Hilfe bei Pflanzenzuchtprogrammen und bei der Aufbewahrung von Keimplasma. In ähnlicher Weise wird die Möglichkeit einer Lagerung für lange Zeiträume und eine Zunahme der Vermehrungsfähigkeit von Samen, Zwiebeln, Knollen, Stecklingen für Pfropfungen, Zweigen und Blumen eine große Bedeutung für die Pflanzenzucht und die Aufbewahrung von Keimplasma haben. Die Gegenwart von Trehalose in einem Gewebe, Organ oder Teil der transformierten Pflanze wird es möglich machen, dieses Gewebe, Organ oder Teil bei Raumtemperatur in einem getrockneten Zustand für signifikant längere Zeiträume als ohne Trehalose aufzubewahren. Um dieses Ziel zu verwirklichen, ist es notwendig, ein beliebiges pflanzliches Trehalose-6-phosphatsynthasegen, bevorzugt Sl-TPS1, ohne seinen N-terminalen Bereich in einen pflanzlichen Expressionsvektor unter einem gewebespezifischen oder organspezifischen Promotor zu klonieren und die fragliche Pflanze mit diesem Konstrukt durch ein beliebiges beschriebenes Verfahren, das jemandem, der mit dem Stand der Technik vertraut ist, bekannt ist, zu transformieren. Es gibt Berichte über pollenspezifische Promotoren (Guerrero, F.D. et al., Mol. Gen. Genet. 224: 161-168 (1990), knollenspezifischen Promotoren (Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 14: 4625-4638 (1986); Jefferson, R., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990)) und samenspezifischen Promotoren (Colot, V. et al., EMBO J. 7: 297-302 (1988)), die zur Konstruktion hybrider Gene für die Expression von Trehalose in Pflanzen verwendet werden könnten.
Beispiel 9
Testung verschiedener Stressbedingungen
Die Toleranz der transgenen Pflanzen gegen verschiedene Stressbedingungen wurde auf die folgende Weise getestet.
1. Kälte
Transgene Pflanzen, die Sl-TPS1 unter Regulierung des konstitutiven 35S-Promotors überexprimieren, wurden durch Southernblot analysiert, um die korrekte Transgeninsertion in das Pflanzengenom zu überprüfen. Die Sl-TPS1-Genexpression wurde durch Northernblot bestätigt. Transgene wurden auf die Ansammlung von Trehalose überprüft und nicht in Kontrollpflanzen detektiert, die nur mit dem Vektor transformiert wurden. Transgene Arabidopsis T2-Generationspflanzen (20 Tage alt) wurden in Töpfen, die Boden/Vermiculit enthielten, unter 16 Std. Licht/8 Std. Dunkelheit bei 24°C in einer Wachstumskammer unter gut gewässerten Bedingungen kultiviert. Kontroll- und trehalosesynthetisierende Pflanzen wurden in eine Wachstumskammer bei 4°C für 10 Tage bei konstantem Licht überführt und für 2 Tage wieder zu 24°C zurückgebracht. Andere Pflanzengruppen wurden bei 24°C belassen. Der Schaden an kältebehandelten Pflanzen wurde visuell beurteilt (Chlorose, Blattschädigung und Tod) und durch die Messung der Photoinhibition der Photosynthese (Murata, N. et al., Nature 356: 710-713 (1992)), wozu ein IRGA (Infrarotgasanalysator) Gerät verwendet wurde. Ebenfalls wurde die Wachstumshemmung an der Blattgröße und Pflanzengröße nach einem Vergleich von kältebehandelten Pflanzen gegenüber nichtbehandelten Pflanzen gemessen.
2. Einfrieren
Die Einfriertoleranz wurde an kältebehandelten Kontroll- und trehalosesynthetisierenden Pflanzen, die wie zuvor beschrieben erhalten wurden, durch den Elektrolytverlusttest bestimmt. Abgelöste Blätter wurden auf veschiedene Temperaturen unter Null eingefroren, und nach dem Auftauen wurde der Zellschaden durch Membranbeschädigungen durch eine Messung des Ionenverlusts aus den Geweben unter Verwendung eines Leitfähigkeits-Messgeräts abgeschätzt (Jaglo-Ottosen, K.R. et al., Science 280: 104-106 (1998).
3. Hitze
Transgene Arabidopsis T2-Generationspflanzen (20 Tage alt), Kontrolle und trehalosesynthetisierend, wurden in Töpfen, die Boden/Vermiculit enthielten, unter 16 Std. Licht/8 Std. Dunkelheit bei 24°C in einer Wachstumskammer unter gut gewasserten Bedingungen kultiviert. Die Pflanzen wurden nach Inkubation für 2 Stunden bei 35°C vorbehandelt und dann 1 Stunde Hitzestress bei verschiedenen Temperaturen, die von 46-56°C für jede unabhängige Behandlung reichten, unterworfen. Die Pflanzen wurden für 5 Tage zu 24°C zurückgebracht. Der Schaden wurde visuell beurteilt (Chlorose, Blattschädigung und Tod). Ähnliche Tests können unter Verwendung von Jungpflanzen durchgeführt werden, die für 7 Tage bei 24°C auf angefeuchtetem Filterpapier im Inneren von Petrischalen kultiviert worden sind (Lee, J.H. et al., Plant J. 8: 603-612 (1995)).
4. Trocknung
Transgene Arabidopsis T2-Generationspflanzen (20 Tage alt), Kontrolle und trehalosesynthetisierend, wurden in Töpfen, die Boden/Vermiculit enthielten, unter 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit bei 24°C in einer Wachstumskammer unter gut gewässerten Bedinungen kultiviert. Dürrestress wurde durch Beenden des Wässerns für mehrere Tage, bis die Blätter verwelkt waren, auferlegt, und dann wurden die Pflanzen wieder gewässert. Die Kontrollpflanzen erholten sich nicht, während die trehaloseproduzierenden Pflanzen normal weiter wuchsen. Auch abgelöste Blätter wurden bei 20% relativer Luftfeuchtigkeit luftgetrocknet. Das Frischegewicht wurde über einen Zeitraum von 48 Stunden gemessen. Trehaloseproduzierende Pflanzen verloren weniger Gewicht (Holmstrom, K.-O. et al., Nature 379: 683-684 (1996)).
5. Osmotischer Stress
Transgene Arabidopsis T2-Generationspflanzen (20 Tage alt), Kontrolle und trehalosesynthetisierend, wurden in Töpfen, die Boden/Vermiculit enthielten, unter 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit bei 24°C in einer Wachstumskammer unter gut gewässerten Bedingungen kultiviert. Unabhängige Pflanzengruppen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an NaCl (100-300 mM) oder PEG (5 oder 10%) während 1-3 Wochen bewässert. Das Pflanzenwachstum wurde durch Messung der prozentualen Änderung der Höhe und des Frischgewichts gemessen (Tarczynski, M.C. et al., Science 259: 508-510 (1993)).
6. Lagerung
Das pflanzliche TPS-Gen wird unter der Regulierung von z.B. dem tomatenfruchtspezifischen E8-Promotor, der durch Ethylen induziert wird, und seine maximale Aktivität wird in reifen Früchten erreicht (Lincoln, J.E. & Fischer, R.L., Mol. Gen. Genet. 212: 71-75 (1988); Good, X. et al., Plant Mol. Biol. 26: 781-790 (1994); Tieman, D. et al., Plant Cell 4: 667-679 (1992)) in einem pBIN19-Vektor, der ein NOSpA 3'-Ende enthält (Guilley, H., et al., Cell 21: 285-294 (1982)) und (Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 11: 369-385 (1983)) kloniert werden. Die Vektoren werden durch Drei-Eltern-Paarung zu Agrobacterium tumefaciens mobilisiert werden. Die Tomatentransformation wird durch gängige Protokolle durchgeführt werden (Tieman, D. et al., Plant Cell 4: 667-679 (1992)). Die transgene Fruchtanalyse wird unter Verwendung unterschiedlicher Techniken ausgeführt werden. Bestimmung der Sl-TPS1 cDNA-Integration im Pflanzengenom durch genomische Southern-Gels. Bestimmung der Sl-TPS1-Transskription durch Northern-Blotting und Sl-TPS1-Proteinexpression durch Western-Blotting. Messung der Sl-TPS1-Enzymaktivität und des Trehalosegehalts wird durch Standardtechniken durchgeführt werden (De Virgilio, C. et al., FEBS Lett. 273: 107-110 (1990) und (Neves, MJ. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994)). Die Haltbarkeit wird bei Kontroll- und trehaloseproduzierenden Tomaten unter Berücksichtigung verschiedener Reifungsparameter analysiert, wie etwa: Erweichungsverhältnis, Ethylenproduktion und Fruchtqualität (Textur, Farbe, Zuckergehalt, Größe) über einen Zeitraum von mehreren Wochen.
Beispiel 10
Trehalose-6-phosphat-Test
1.1 Bestehende Trehalose-6-phosphat-Tests
Um die Bedeutung von Tps1 und insbesondere dessen Produktes Trehalose-6-phosphat zu untersuchen, ist es notwendig, in der Lage zu sein, die Tre6P-Pegel zu messen, die im Zytosol effektiv vorhanden sind. Bisher sind drei Verfahren beschrieben worden, um Tre6P-Pegel zu messen. In einem ersten Verfahren (Meleiro et al., 1993, Analytical Biochemistry 213, 171-2) wurde Tre6P durch eine Kombination aus TCA-Extraktion, gefolgt durch Ether-Extraktionen, Bariumacetatfällungen und Anionenaustauschchromatographie, extrahiert. Das Tre6P wurde durch alkalische Phosphatase dephosphoryliert, durch Trehalase in zwei Glucosemoleküle hydrolisiert und schließlich wurde die Glucose durch das Glukoseoxidase-Peroxidase-Verfahren detektiert. Dieses Verfahren ist entwickelt worden, um ein Verfahren zum Herstellen und Reinigen großer Mengen Tre6P zu beurteilen. Da die berichteten Tre6P-Pegel in Hefezellen niedriger sind als die Glucose-, Trehalose- und Glu6P-Pegel, würde dieses Verfahren einen ernormen Hintergrund und einen Mangel an Empfindlichkeit aufweisen.
Ein zweites Verfahren verwendet Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), um Tre6P zu detektieren und quantifizieren (De Virgilio et al., 1993, Eur J Biochem 212, 315-23). Mit diesem Verfahren war es möglich, hohe Tre6P-Pegel in tps2∆-Mutanten nach einem Hitzeschock zu quantifizieren (Reinders et al., 1997, Mol Microbiol 24, 687-95) und einen vorübergehenden Anstieg der Tre6P-Pegel nach der Zugabe von Glucose zu derepremierten Wildtyp-Hefezellen zu detektieren (Hohmann et al., 1996, Mol Microbiol 20, 981-91). Es wies eine Detektionsgrenze von ungefähr 200 μM Tre6P auf. Dies liegt im Bereich der Pegel im stationären Zustand, die bei Zellen in exponentiellem Wachstum und der stationä ren Phase berichtet worden sind (Blazquez et al., 1993, FEBS Lett 329, 51-4). Die Empfindlichkeit des Verfahrens erlaubt keine zuverlässige Quantifizierung von Konzentrationen, die in normalen Hefestämmen oder in Hefestämmen, die in der Tre6P-Synthese beeinträchtigt sind, vorhanden sind.
Ein drittes Verfahren beruht auf der Beobachtung, dass Tre6P die Hefe-Hexokinaseaktivität in vitro hemmt (Blazquez et al., 1994, FEMS Microbiol Lett 121, 223-7). Der Pegel dieser Inhibierung dient als Maß für den Tre6P-Gehalt der Extrakte. Die Hexokinaseaktivität wird durch Bestimmung der Bildungsgeschwindigkeit eines ihrer Produkte, Fructose-6-phosphat (Fru6P), gemessen. Es wurde geschätzt, dass das intrazelluläre Tre6P in stationären und exponentiell wachsenden Zellen ungefähr 200 μM beträgt. Die Autoren haben ebenfalls beobachtet, dass dieser inhibierende Effekt von Tre6P auf die Hexokinaseaktivität durch die Gegenwart von Glucose unterdrückt wurde. Da unter bestimmten Bedingungen hohe Konzentrationen von Glucose und allgemein weitere störende Verbindungen in den Extrakten vorhanden sein können, ist dieses Verfahren ebenfalls nicht geeignet.
1.2 Grundlagen des neuartigen Verfahrens
Das Verfahren der Erfindung hat die Hauptaufgabe, empfindlicher und zuverlässiger als die bestehenden Verfahren zu sein. Es beruht auf dem Bacillus subtilis Phosphotrehalaseenzym, welches durch das treA-Gen kodiert ist. Dieses Enzym ist funktionell mit dem bakteriellen PTS-System verwandt und hydrolisiert Tre6P in Glucose und Glu6P (Helfert et al., 1995, Mol Microbiol 16, 111-120; Rimmele & Boos, 1994, J Bacteriol 176, 5654-64). Durch Messung der Glucose, die in dieser Reaktion produziert wird, kann die Ausgangsmenge an Tre6P berechnet werden. Glu6P wird zu diesem Zweck nicht verwendet, da diese Verbindung häufig in großen Mengen in Hefezellen vorhanden ist. Es ist schwierig, sie von Tre6P abzutrennen, während die ursprünglich in den Extrakten vorhandene Glucose durch Anionenaustauschchromatographie leicht von den Zuckerphosphaten abgetrennt werden kann (16).
1.3 Reinigung des B. subtilis Phosphotrehalaseenzyms
Das Phosphotrehalaseenzym ist durch die Gruppe von M.K. Dahl (Gotsche & Dahl, 1995, J Bacteriol 177, 2721-6; (Helfert, et al., 1995, supra)) gereinigt und charakterisiert worden. Diese Gruppe hat das pSG2-Plasmid bereitgestellt, bei dem das treA-Gen konstitutiv hinter dem starken B. subtilis degO36-Promotor exprimiert ist.
Um eine starke stabile Expression zu erhalten, wurde das Gen im pCYB1-Vektor (New England Biolabs) hinter dem starken IPTG- induzierbaren tac-Promotor kloniert. Das treA-Gen wurde mit den Startern CVV5 (TGGTGGAT'TA,ATATGAAAACAGAACAAACGCCATGGTGG) und CVV6 (TTAACAGCTCTTCC'GCA, AACGATAAACAATGGACTCATATGGGCG), die jeweils eine AseI- und SapI-Restriktionsstelle an jedem Ende des PCR-Produkts einführen, PCR-amplifiziert und im pCYB1-Plasmid kloniert und pCW1 genannt (7). ' und, geben die Stellen an, an denen das Restriktionsenzym spleißt.
Ein Vergleich der Phosphotrehalaseaktivität der mit dem ursprünglichen pSG2-Plasmid (EcVV1) oder dem neuen pCVV1 (EcVV3) transformierten Stämme zeigte, dass der letztere Stamm 10 mal mehr Aktivität enthielt als der Stamm mit dem pSG2-Plasmid (17).
Diese EcVV3-Zellen wurden über Nacht in 4 ml LB-Ampicilin-Medium kultiviert. Am nächsten Tag wurde diese Kultur verwendet, um 100 ml LB-Ampicilin zu impfen und wurde erneut für 3 Stunden zum Wachsen stehen gelassen, wonach mit IPTG (0,5 mM) Expression induziert wurde und die Kultur für weitere 3 Stunden bei 37°C inkubiert wurde.
Die Zellen wurden 10 Minuten bei 4.000 U/Min. zentrifugiert und in 30 ml Puffer A (25 mM Bis-Tris pH 7, 10 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂) resuspendiert. Die Zellen wurden durch zweimaliges Hindurchleiten der resuspendierten Zellen durch eine French-Presse zerstört. Der Rohextrakt wurde dann durch Ultrazentrifugierung für 30 Minuten bei 35.000 U/Min. geklärt, und der Überstand wurde durch ein 0,22 μm Filter durchgeleitet.
Die Anionenaustauschchromotogaphie wurde mit einem linearen Gradienten von 100% Puffer A auf 50% Puffer B (25 mM Bis-Tris pH 7, 10 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1M NaCl) in 20 Säulenvolumen auf einer Mono-Q HRS/5-Säule durchgeführt. Fraktionen von 500 μl wurden gesammelt. Die PNPG-hydrolisierende Aktivität jeder Fraktion wurde gemessen, und die zwei Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden vereinigt und vor der Gelfiltration mit einer Vivaspin-Säule (Vivascience) auf 200 μl konzentriert. Für die Gelfiltration wurde eine isokrate Elution mit 10% Puffer B auf einer Superdex75-Säule verwendet. Die zwei 500 μl-Franktionen mit der höchsten Aktivität wurden vereinigt und erneut auf 400 μl konzentriert und in aliquoten Teilen bei –30°C aufbewahrt. Beide Säulen wurden mit einem ÄKTA-FPLC-System (Pharmacia) betrieben.
Die auf diese Weise durchgeführte Reinigung ergab eine 4,5-fache Steigerung der spezifischen Aktivität bei einer Ausbeute von 34%. SDS-PAGE-Analyse mit Coomassie-Blau-Anfärbung zeigte bereits eine große Überexpressions-Proteinbande der erwarteten Größe. Keine weiteren Banden waren in den endgereinigten Fraktionen mit 10 μg Protein pro Spur sichtbar.
1.4 Probenahme aus der Hefekultur
Proben wurden durch Sprühen von 3 ml einer Zellsuspension in 10 ml 60%-iges Methanol bei –40°C genommen. Dies hält den Zellmetabolismus sofort an und ermöglicht eine Bestimmung der intrazellulären Metabolite als Funktion der Zeit nach einer experimentellen Manipulation, z.B. Zugabe von Glucose zu dereprimierten Zellen (de Koning & van Dam, 1992, Anal Biochem 204, 118-23).
1.5 Extraktion von Metaboliten
Die Extraktion von Metaboliten der gefrorenen Zellen wurde unter Verwendung von Perchlorsäureextraktion durchgeführt.
1.6 Die erste Anionenaustauschchromotographie
Um die Glucose und Trehalose von dem Tre6P, das in den Zellextrakten vorhanden ist, zu trennen, wurde der schwache NH2-SPE-Anionenaustauscher (International Sorbent Technology, UK) ausgewählt.
Die Säulen wurden mit 500 mg Sorptionsmittel, das in 3 ml 100%-igem Methanol resuspendiert war, gefüllt und mit 3 ml 100%-igem Methanol gespült. Ein schwaches Anion wurde durch Äquilibrieren der Säule mit 0,5 M Essigsäure daran gebunden und der Überschuss der Säure in der Säule wurde mit zweimal 3 ml MilliQ-Wasser weggespült. Die Probe wurde aufgebracht und die gebundene Probe wurde mit 3 ml 20%-igem Methanol gespült, um unspezifische Bindungen zu eliminieren. Die Anionen wurden mit einer 2,5 M Ammoniaklösung pH 12,5 eluiert. Wenn 250 mg Sorptionsmittel pro 100 mg extrahierter Zellen verwendet wurden, gab es kein Risiko einer Überladung der Säule. Das Salz beeinträchtigte die Glucosebestimmung nicht wesentlich. Die eluierten Extrakte wurden ohne Verlust an Tre6P eingedampft.
1.7 Die Phosphotrehalase-Reaktionsbedingungen
Da das Enzym bei dem berichteten pH-Optimum von 4,5 instabil war, wurde ein physiologischerer pH-Wert von 7 ausgewählt, um die Inkubierung durchzuführen. Der Inkubationspuffer war ein 50 mM Bis-Tris-Puffer pH7. Die Inkubationstemperatur betrug 37°C. 2.000 U Phosphotrehalase wurden hinzugegeben, und die Proben wurden bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Eine Einheit war die Menge an Enzymen, die 1 nmol Tre6P pro Minute unter den erwähnten Bedingungen hydrolisierte.
1.8 Die zweite Anionenaustauschchromatographie
Um die Glucose, die in der Phosphotrehalasereaktion gebildet wurde, von den anderen anionischen Zellverbindungen abzutrennen, wurde eine zweite Anionenaustauschchromatographie auf die gleiche Weise wie die erste durchgeführt. Dieses Mal wurde der Durch fluss, der nicht an die Säule bindet und der die Glucose enthält, wiedergewonnen und durch Vakuumtrocknung konzentriert.
1.9 Der Glucosetest
Die getrockneten Glucoseproben wurden in 250 μl 50 mM Bis-Tris-Puffer pH7 erneut gelöst. Von jeder Probe wurde die Glucosekonzentration in 204 μl unverdünnter Probe und in 1/5- und 1/25-Verdünnung bestimmt. In einer Mikrotiterplatte wurden zu einem Probenvolumen von 200 μl 20 μl einer Reaktionsmischung, die 15 Einheiten Glucoseoxidase, 10 Einheiten Peroxidase und 100 μg Ortho-Dianisidin enthielt, zugegeben. Diese Platte wurde bei 37°C für 45 Minuten inkubiert, und dann wurden die Reaktionen durch Zugabe von 40 μl 56%-iger Schwefelsäure gestoppt. Die Absorbanz wurde bei einer Wellenlänge von 530 nm gemessen.
1.10 Ausbeute und Reproduzierbarkeit
Die Ausbeute des Perchlorsäureextraktionsverfahrens beträgt 57%. Die Ausbeute des vollständigen Tre6P-Tests beträgt 25%. Die Detektionsgrenze des Verfahrens betrugt 100 μM, und die Tre6P-Standardgeraden sind im physiologisch relevanten Bereich linear (8). Die Tre6P-Standards wurden durch Zugabe bekannter Mengen Tre6P zu Zellen des tps1∆-Stamms, dem die Tre6P-Synthase fehlt, vor der Perchlorsäureextraktion hergestellt. Der Standardfehler der Steigung und des Achsenabschnitts von vier unabhängigen Standardgeraden betrugt jeweils 2 und 9%.
Die Trehalose-6-phosphatkonzentrationen wurden in Hefestämmen gemessen, welche die pflanzlichen TPS1-Allele voller Länge und N-terminal deletiert enthielten. Die Stämme wurden entweder bis zur exponentiellen Phase oder bis zur stationären Phase entweder in galactose- oder glucoseenthaltendem Minimalmedium kultiviert. Für dieses Experiment wurden tps1Δtps2Δ-Hintergründe verwendet, da die Pegel von Trehalose-6-P in tps1Δ-Hintergründen zu niedrig sind, um gemessen zu werden. Die verwendeten Stämme waren:

"1Δ" steht für "tps1Δ", "2Δ" steht für "tps2Δ".

Nach dem Sammeln der Hefezellen wurden Extrakte wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt, und die Trehalose-6-P-Konzentrationen wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt.
Es ist viermal weniger Trehalose-6-phosphat in den Extrakten, die aus den Stämmen hergestellt wurden, welche die pflanzlichen TPS1-Gene enthielten, verglichen mit den Kontrollstämmen, die das Hefe-TPS1-Gen überexprimieren. Dieser niedrigere Trehalose-6-phosphatpegel könnte erklären, warum es weiterhin eine Deregulation des Glucoseeinstroms in Glykolyse in diesen Stämmen gibt (Beispiel 12). Diese Deregulation des Glucoseeinstroms war bei Stämmen, die entweder die vollständigen oder die N-terminal deletierten pflanzlichen TPS-Allele enthielten, ähnlich, und dies stimmt mit den Ergebnissen, die wir hier erhalten haben, überein. Es gibt keinen Unteschied der Trehalose-6-phosphatpegel zwischen Stämmen, welche die vollständigen oder die N-terminal deletierten Allele enthielten.
Beispiel 11
Chimäre Fusionen von TPS- und TPP-Domänen
Um einen effizienteren enzymatischen Weg, der an der Trehalosebiosynthese beteiligt ist, zu erzeugen, wurde eine Reihe von chimären Enzymfusionen zwischen TPS- und TPP-Domänen von TPS1 und TPS2 entweder von A. thaliana oder S. cerevisiae erzeugt. Wie in 13 gezeigt, bestehen diese vier Fusionen aus: einem 1337 bp-DNA-Fragment von AtTPS1 (ΔNAtTPS1), das für ein N-terminal trunkiertes Protein (dem seine ersten 100 Aminosäuren fehlen) aus 442 Aminosäuren kodiert, das durch PCR (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 52°C, 1 Min., 72°C, 1,5 Min, 40 Zyklen; 72°C, 10 Min., 1 Zyklus) unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA-Polymerase (Boehringer) mit Oligonukleotiden (5'-CATG-CCATGGCTTAT-AATAGGCAACGAC-TACTTGTAGTG-3', NcoI-Stelle unterstrichen und Initiationskodon fett) und (5'-CGGGATCCAGCTGTCATGTTTAGGGC-TTGTCC-3', BamHI-Stelle unterstrichen) erhalten wurde, verbunden mit einem 1138 bp-DNA-Fragment von AtTPPB, das für das vollständige Protein aus 374 Aminosäuren kodiert, das durch PCR (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 52°C, 1 Min., 72°C, 1,5 Min., 40 Zyklen; 72°C, 10 Min., 1 Zyklus) unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA-Polymerase (Boehringer) mit Oligonukleotiden (5'-CGGGATCCACTAACCAGAATGTCATCG-3', BamHI-Stelle unterstrichen) und (5'-GGGGTACCTCACTCTTCTCCCACTGTCTTCC-3', KpnI-Ste11e unterstrichen und Stoppkodon fett) erhalten wurde.
Eine zweite Fusion besteht aus ΔNAtTPS1, das mit einem 1358 bp-DNA-Fragment von ScTPS2 verbunden wurde, das für 397 Aminosäuren von seinem C-Terminus kodiert, das durch PCR (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 50°C, 1 Min., 72°C, 1,5 Min., 40 Zyklen; 72°C, 10 Min., 1 Zyklus) unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA-Polymerase (Boehringer) mit Oligonukleotiden (5'-CGGGATCCGCTAAATCTATTAACATGG-3', BamHI-Stelle unterstrichen) und (5'-CGGGGTACCATGGTGGGTTGAGAC-3', KpnI-Stelle unterstrichen) erhalten wurde.
Ein drittes Konstrukt führte zu einer Fusion zwischen einem 1531 bp-DNA-Fragment von ScTPS1, das für ein 492 Aminosäurenprotein kodiert, das durch PCR (94°C, 3 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 52°C, 1 Min., 72°C, 1,5 Min., 40 Zyklen; 72°C, 10 Min., 1 Zyklus) unter Verwendung von Expand High-fidelity DNA-Polymerase (Boehringer) mit Oli gonukleotiden (5'-CCGCTCGAGGGTACTC-ACATACAGAC-3', XhoI-Stelle unterstrichen) und (5'-CGGGATCCGGTGGCA-GAGGAGCTTGTTGAGC-3', BamHI-Stelle unterstrichen) erhalten wurde, und AtTTPB.
Die letzte Fusion wurde zwischen ScTPS1- und ScTPS2-DNA-Fragementen hergestellt, die wie oben beschrieben erhalten wurden.
Die PCR-Fragmente wurden mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut (13) und im pRS6-Vektor subkloniert. Hefe tps1Δ-, tps2Δ- und tps1Δtps2Δ-Mutantenstämme wurden transformiert und in SDGal (-his) selektiert. Komplementation wurde in SDGlc (-his Minimalmedium) und Kultivierung bei 38,3°C getestet.
Beispiel 12
Expression von N-terminal deletierten pflanzlichen TPS1-Genen in Hefe-tps1∆-Stämmen stellt das Wachstum auf Glucose wieder her unterdrückt jedoch nicht die Überakkumulation von Zuckerphosphaten
Die Deletion von TPS1 in S. cerevisiae führt zu einem pleiotropen Phänotyp (Van Aelst et al., Mol. Microbiol., 8, 927-943, 1993). Einer der Phänotypen besteht darin, dass ein solcher Stamm nicht mehr auf schnellfermentierbaren Zuckern wachsen kann. Warum tps1Δ-Stämme nicht auf Glucose wachsen können, ist noch nicht geklärt. Drei unterschiedliche Hypothesen sind vorgeschlagen worden (Hohmann und Thevelein, Trends in Biol. Sciences, 20, 3-10, 1995). Wenn tps1Δ-Stämme von einem glycerin- zu einem glucosehaltigem Medium verschoben werden, gibt es eine schnelle Akkumulation von Zuckerphosphaten und einen schnellen Abfall der ATP-Konzentration. Anscheinend hat das TPS1-Gen eine Funktion bei der Regulierung des Glucoseeinstroms in die Glykolyse. Da der Transport und die Phosphorylierung gekoppelt sind, wird der gesamte Zucker, die in die Zelle kommt, phosphoryliert. Eine Reduktion der Nxk2-Aktivität kann den Wachstumsdefektphänotyp von tps1Δ-Stämmen auf Glucose und Fructose unterdrücken (Hohmann et al., Current genetics 23, 281-289, 1993). In vitro-Studien haben deutlich darauf hingewiesen, dass das Produkt des Tps1-Proteins, Trehalose-6-phosphat, die Aktivität von Hxk2 hemmt und als solche die Regulierung des Einstroms von Glucose in Glykolyse regulieren könnte.
Als das S. lepidophylla-Homolog von TPS1 in Hefe exprimiert wurde, wurde ein deutlicher Unterschied im Wachstum auf glucosehaltigem Medium zwischen dem Klon voller Länge und dem N-terminalen Deletionskonstrukt beobachtet. Tps1Δ-Stämme, die mit Sl TPS1 voller Länger unter der Regulierung des CUP1-Promotors transformiert wurden, wachsen nicht auf Glucose. Die Expression in einem tps1Δ-Stamm eines Konstrukts, bei welchem die ersten 300 bp, die für die ersten 100 Aminosäuren des Sl TPS-Proteins kodieren, deletiert sind, führt zu Wachstum auf Glucose. So kann anscheinend der Klon voller Länge das Glucoseeinstromproblem nicht lösen, während die N-terminale Deletion in der Lage ist, den Glucoseeinstrom zu regulieren.
Um dies zu testen, wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem die Konzentration der ersten Metaboliten in der Glykolyse gemessen wurde. Die folgenden Stämme wurden verwendet:
Für die Bestimmung der glykolytischen Metaboliten wurden Zellen auf SDGlycerin-Medium bis zur exponentiellen Phase kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung geerntet. Das Pellet wurde einmal gewaschen, resuspendiert und dann in YP-Medium bei 30°C inkubiert. Glucose wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben und CuSO₄ wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 μM zugegeben.
Vor und nach der Zugabe von Glucose wurden Proben in den angegebenen Zeitintervallen genommen und sofort in 60%-igem Methanol bei –40°C abgeschreckt.
Die Bestimmung der glykolytischen Metaboliten wurde an diesen Proben im Wesentlichen durchgeführt, wie von de Koning und van Dam beschrieben (Anal. Biochem. 204, 118-123, 1992). Unter Verwendung der Gesamtmenge an Protein in der Probe, bestimmt nach Lowrey et al (J. Biol. Chem. 193, 265-275, 1951), und der Annahme eines Hefe-Zytosolvolumens von 12 μl pro mg Protein, wurden Zytosolkonzentrationen in mM berechnet. 14 zeigt das Ergebnis eines repräsentativen Experiments.
Die Ergebnisse weisen klar darauf hin, dass es in diesem kurzen Zeitraum nach der Zugabe von Glucose keinen Unterschied zwischen den Metabolitkonzentrationen des vollständigen und des N-terminal deletierten S. lepidophylla TPS1-Gens gibt. Es gibt eine klare Überakkumulation von Zuckerphosphaten nach der Zugabe von Glucose, was dem ähnlich ist, was bei dem tps1∆-Stamm gesehen werden kann.
Diese Ergebnisse mit den N-terminalen Deletionskonstrukten zeigen, dass die Ansammlung von Zuckerphosphaten nichts mit der Tatsache zu tun hat, dass Hefezellen auf Glucose wachsen können oder nicht wachsen können. Dies bedeutet, dass der N-terminale Teil für die Regulierung von Glucoseeinstrom in die Glykolyse wichtig ist. Es deutet außerdem darauf hin, dass ein tps1∆-Stamm, der die ΔN Sl- oder ΔN At TPS1-Gene enthält, als Werkzeug verwendet werden kann, um den Gesamtfluss durch die Glykolyse zu steigern. Dieser Stamm wächst perfekt auf Glucose, aber es ist weiterhin eine Überakkumulation von Metaboliten im oberen Teil der Glykolyse zu sehen. Eine Überexpression der Enzyme stromabwärts in der Glykolyse führt zu einem höheren Durchfluss.
Da die Metabolitenkonzentration nur über einen kurzen Zeitraum nach der Zugabe von Glucose gemessen wurde, wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, bei welchem die Metabolitenkonzentration während des exponentiellen Wachstums und während der stationären Phase gemessen wurde. Diese Ergebnisse sind in 15 gezeigt.
Diese Daten bestätigen die Ergebnisse, die im ersten Experiment erhalten wurden. Es gibt eine Überakkumulation von Zuckerphosphaten in dem tps1∆-Stamm, der mit dem N-terminalen Deletionskonstrukt transformiert wurde. Aus den 14 und 15 folgt, dass die Differenz zwischen dem tps1∆-Stamm und dem tps1∆-Stamm, der das ΔN Sl TPS1-Expressionsplasmid enthält, der ATP-Pegel ist. Während der ATP-Pegel in dem tps1Δ-Stamm auf 0 fällt, ist dies bei den anderen Stämmen nicht der Fall. Der ATP-Pegel, der übrig bleibt, ist anscheinend genug, um auf Glucose zu wachsen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines nichtmenschlichen eukaryotischen Organismus, der eine erhöhte Trehalose-6-phospatsynthase (TPS)-Aktivität relativ zu dem entsprechenden eukaryotischen Wildtyp-Organismus aufweist, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: a. Vorsehen eines pflanzlichen TPS-Proteins; b. Abgleichen des TPS-Proteins mit einem entsprechenden Protein aus Hefe, um die Domäne des TPS-Proteins zu bestimmen, die mit einer inhibierenden Wirkung auf die TPS-Aktivität assoziiert ist, wobei die inhibierende Domäne dem Teil des TPS-Proteins entspricht, der sich über den N-Terminus des Hefeproteins hinaus erstreckt; c. Unterdrücken der Wirkung der inhibierenden Domäne durch Mutagenisieren oder Abschneiden des N-terminalen Teils des TPS-Proteins; d. Klonieren eines Gens, das dem derart modifizierten Protein entspricht, in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle eines konstitutiven, induzierbaren und/oder organspezifischen Promotors; und e. Transformieren von einer eukaryotischen Zelle oder Gewebe eines eukaryotischen Organismus mit dem derart erhaltenen Expressionsvektor.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei mindestens die gesamte inhibierende Domäne aus dem TPS-Protein entfernt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die eukaryotische Zelle oder das Gewebe eine Pflanzenzelle oder -gewebe ist, und wobei das Transformieren von Regenerieren einer kompletten Pflanze aus der transformierten pflanzlichen Zelle oder dem Gewebe gefolgt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Pflanze aus der Gruppe aus Reis, Apfel, Zuckerrübe, Sonnenblume (Helianthus Annuus), Tabak (Nicotiana tabacum) und Sojabohne (Glycine max) ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der eukaryotische Organismus ein Pilz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Pilz aus der Gruppe aus Aspergillus niger, Agaricus bisporis, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis und methylotrophen Hefen ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der nichtmenschliche eukaryotische Organismus aus Säuger- und Wirbellosen-Zellkulturen ausgewählt ist, die zur Herstellung von Proteinen und kleinen Molekülen verwendet werden, aus Wirbellosen-Zellen, die zur Baculovirus-Expression verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der eukaryotische Organismus eine erhöhte Trehalosesyntheseaktivität relativ zu entsprechenden eukaryotischen Organismen aufweist, die nicht das modifizierte TPS aufweisen.
Verfahren zum Herstellen eines modifizierten Trehalosephosphatsynthase (TPS)-Proteins, das die Schritte umfasst: a. Vorsehen eines pflanzlichen TPS-Proteins; b. Abgleichen des TPS-Proteins mit einem entsprechenden Protein aus Hefe, um die Domäne des TPS-Proteins zu bestimmen, die mit einer inhibierenden Wirkung auf die TPS-Aktivität assoziiert ist, wobei die inhibierende Domäne dem Teil des TPS-Proteins entspricht, der sich über den N-Terminus des Hefeproteins hinaus erstreckt; c. Unterdrücken der Wirkung der inhibierenden Domäne durch Mutagenisieren oder Abschneiden des N-terminalen Teils des TPS-Proteins; bevorzugt durch Entfernen mindestens der vollständigen inhibierenden Domäne.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das TPS-Protein aus einer Pflanze stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Pflanze aus der Gruppe aus Selaginella lepidophylla, Arabidopsis thaliana, Reis, Apfel, Zuckerrübe, Sonnenblume (Helianthus annuus), Tabak (Nicotiana tabacum) und Sojabohne (Glycine max) ausgewählt wird.
Eukaryotischer Organismus, der durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 erhältlich ist, wobei der eukaryotische Organismus einen Expressionsvektor umfasst, der ein Gen umfasst, das für ein TPS-Protein, das eine unterdrückte inhibierende Domäne gemäß Anspruch 1 aufweist, kodiert, und wobei der eukaryotische Organismus eine erhöhte katalytische Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität aufweist.
Isoliertes Trehalose-6-phosphatsynthase (TPS)-Protein mit einer unterdrückten inhibierenden Domäne gemäß Anspruch 1 und wahlweise zusätzlich einer C-terminalen Trunkierung, wobei das TPS-Protein eine erhöhte katalytische Aktivität relativ zu dem TPS-Protein ohne eine unterdrückte inhibierende Domäne gemäß Anspruch 1 aufweist.
Chimärische Fusion eines TPS- und eines TPP-Proteins, wobei die Fusion vorliegt zwischen: (i) einer TPS-Domäne mit einer unterdrückten inhibierenden Domäne gemäß Anspruch 1 und einem TPP-Protein voller Länge; (ii) einer TPS-Domäne mit einer unterdrückten inhibierenden Domäne gemäß Anspruch 1 und einer TPP-Domäne; (iii) einem TPS-Protein voller Länge mit einer unterdrückten inhibierenden Domäne gemäß Anspruch 1 und einem TPP-Protein voller Länge; oder (iv) einem TPS-Protein voller Länge mit einer unterdrückten inhibierenden Domäne gemäß Anspruch 1 und einer TPP-Domäne.
Pflanzen, die eine erhöhte Stresstoleranz und/oder erhöhte photosynthetische Produktivität und/oder eine verbesserten Kohlenstoffverteilung in der gesamten Pflanze oder in spezifischen Pflanzenteilen und/oder eine morphologische oder Entwicklungs-Änderung aufweisen und in ihrem Genom ein spezifisch modifiziertes TPS-Gen beherbergen, das für ein Protein gemäß Anspruch 14 kodiert.
Pflanze gemäß Anspruch 16, die durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 erhältlich ist.
Samen aus einer Pflanze gemäß Anspruch 16 oder 17, die in ihrem Genom ein spezifisch modifiziertes TPS-Gen beherbergen, das für ein Protein gemäß Anspruch 14 kodiert.
Pflanzen, die aus Samen gemäß Anspruch 18 erhalten werden, die in ihrem Genom ein spezifisch modifiziertes TPS-Gen beherbergen, das für ein Protein gemäß Anspruch 14 kodiert.
Nachkommen der Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 16, 17 oder 19, die in ihrem Genom ein spezifisch modifiziertes TPS-Gen beherbergen, das für ein Protein gemäß Anspruch 14 kodiert.
Pilze, die ein verbessertes Fermentationsvermögen aufweisen und in ihrem Genom ein spezifisch modifiziertes TPS-Gen beherbergen, das für ein Protein gemäß Anspruch 14 kodiert.
Pilze, die ein verbessertes Fermentationsvermögen aufweisen und in ihrem Genom ein spezifisch modifiziertes TPS-Gen beherbergen, das für ein Protein gemäß Anspruch 14 kodiert.