ES2268902T3 - Modificacion genetica especifica de la actividad de la trehalosa-6-fosfato sintasa y expresion en un entorno o heterologo. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un organismo eucariota no humano que tiene actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS) aumentada con relación al organismo eucariota de tipo natural correspondiente, cuyo método comprende las etapas de: a. proporcionar una proteína de TPS de plantas; b. alinear la proteína de TPS con una proteína de levadura correspondiente pa- ra determinar el dominio de la proteína de TPS asociado con una acción in- hibidora en la actividad de TPS, en el que dicho dominio inhibidor corres- ponde a la parte de la proteína de TPS que se extiende más allá del término N de la proteína de levadura; c. suprimir la acción del dominio inhibidor mutagenizando o truncando la par- te N-terminal de la proteína de TPS; d. clonar un gen correspondiente a la proteína modificada así en un vector de expresión bajo el control de un promotor constitutivo, inducible y/o especí- fico para el órgano; y e. transformar una célula o tejido eucariota de un organismo eucariota con el vector de expresión obtenido así.

Description

Modificación genética específica de la actividad de la trehalosa-6-fosfato sintasa y expresión en un entorno homólogo o heterólogo.

La presente invención se refiere a un método para obtener organismos eucariotas, es decir, plantas, animales u hongos, con actividad elevada y/o capacidad reguladora alterada de trehalosa-6-fosfato sintasa. La invención se refiere también a alelos especialmente modificados de los genes de trehalosa-6-fosfato sintasa que muestran cambios inesperados de actividad catalítica y/o capacidad reguladora, y a las plantas transformadas, u otros organismos eucariotas que contienen estas construcciones. La invención también está relacionada con nuevos métodos para medir el nivel de trehalosa-6-fosfato y la actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa.

La biosíntesis de trehalosa consiste en dos etapas enzimáticas catalizadas por trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS), que sintetiza trehalosa-6-fosfato, y por trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP), que forma trehalosa. Los genes del metabolismo de trehalosa se han descubierto primero en levadura y en bacterias, organismos de los que se sabe desde hace mucho tiempo que acumulan trehalosa. Recientemente, se han encontrado también homólogos de estos genes en plantas superiores y animales en los que no se habían detectado nunca niveles apreciables de trehalosa. Sin embargo, no ha sido posible hasta ahora demostrar actividad enzimática de trehalosa-6-fosfato sintasa de estos productos génicos de TPS en ningún sistema in vitro. Su expresión en sistemas heterólogos tampoco produce alta acumulación de trehalosa. No se ha informado de una utilización con éxito de estos genes de TPS de plantas o animales para mejorar propiedades importantes comercialmente en sistemas homólogos o heterólogos.

Además de su papel clásico en la acumulación de azúcar de almacenamiento, se sabe que el metabolismo de trehalosa juega papeles importantes en resistencia al estrés, control del aflujo de glucosa a glicólisis y señalización inducida por glucosa. Como se indica después, estas propiedades fenotípicas son de alta importancia industrial.

Está presente una capacidad asombrosa de adaptación para sobrevivir bajo deshidratación fuerte o incluso completa en células de levadura, esporas de hongos, especies de invertebrados y plantas de resurrección, que reanudan sus funciones vitales tan pronto como están de nuevo en contacto con agua. Estos organismos anhidrobióticos resisten también congelación, intenso vacío, altas dosis de radiación ionizante, alta presión y temperaturas extremas sin experimentar daño, y muchos de ellos acumulan el disacárido no reductor trehalosa como una proteína y protector de membrana.

También se ha demostrado in vitro la función protectora de trehalosa. La adición de trehalosa a células, orgánulos, enzimas, anticuerpos y alimentos los conserva bajo deshidratación total durante largos períodos. También los protege contra una variedad de condiciones de estrés, tales como alta temperatura, alta presión y congelación.

En plantas vasculares, se conocen muy pocas especies en las que se haya demostrado de manera convincente la presencia de trehalosa. Sin embargo, en la denominada planta de resurrección del desierto Selaginella lepidophylla está presente un alto nivel de trehalosa. Esta planta es capaz de resistir con éxito una deshidratación completa, en oposición a todas las demás plantas superiores, incluyendo plantas de cultivo.

Mutantes de supresión en el gen de TPS en bacterias y levadura son incapaces de sintetizar trehalosa y pierden osmotolerancia, termotolerancia y tolerancia a alta presión. Esto sugiere que el gen de TPS está implicado en diversas formas de tolerancia.

Sería altamente deseable ser capaces de expresar actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa en plantas, animales, microorganismos o partes específicos de ellos para hacerlos tolerantes a estrés. De esta forma, podrían cultivarse plantas de cultivo en regiones que padecen ocasional o continuamente calor, sequía o congelación. Podrían conservarse alimentos perecederos de origen en plantas o animales por simple deshidratación, permitiendo el almacenamiento durante un período prolongado de tiempo y el transporte a largas distancias.

La presente invención permite por primera vez obtener alta actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa y alta acumulación de trehalosa en organismos en los que no se produce normalmente trehalosa o no se acumula hasta niveles apreciables, tal como muchas plantas superiores y animales. Por ello, permite por primera vez un uso altamente eficaz y controlado de la acumulación de trehalosa en plantas superiores y animales para aumentar la resistencia al
estrés.

Esto se consigue en la invención mediante un método para preparar un organismo eucariota, seleccionado por ejemplo de plantas, animales y hongos, que muestre expresión constitutiva, inducible y/o específica del órgano de un gen de TPS modificado específicamente, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un gen de TPS de plantas;

b) diseñar una modificación adecuada del gen de TPS alineando el gen con el gen correspondiente de levadura y estableciendo qué parte del gen se extienda más allá del término 5' del gen de levadura;

\newpage

c) suprimir o inactivar una parte de la región N-terminal del gen de TPS que se extiende más allá del término 5' del gen de levadura, preferiblemente la parte del mismo que se extiende completa, con el fin de conseguir una actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa aumentada del gen;

d) clonar el gen modificado así en un vector de expresión bajo el control de un promotor constitutivo, inducible y/o específico del órgano;

e) transformar una célula o tejido de planta con el vector de expresión obtenido así; y

f) regenerar una planta completa a partir de la célula o tejido de planta transformados.

La inactivación de la parte de la región N-terminal del gen de TPS que se extiende más allá del término 5' del gen de levadura puede conseguirse por mutagénesis.

Se ha encontrado según la invención que truncar diversos genes que se originan en plantas puede aumentar su funcionalidad cuando se expresan en levadura. Se observó una acumulación aumentada de trehalosa y alta actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa en comparación con el gen no truncado. Usando un promotor constitutivo, inducible o específico del órgano, puede modificarse la expresión y controlarse de diferentes formas. La inducción puede ser específica para el tejido, por ejemplo, para frutos, específica en tiempo, o inducida por cambio en las condiciones ambientales. En esta última categoría pueden incluirse la inducción por calor, la inducción por sequía, etc.

La funcionalidad del gen de TPS modificado para inferir termotolerancia puede comprobarse en el siguiente sistema de ensayo. Se requiere trehalosa para la adquisición de termotolerancia en levadura. Los mutantes de supresión de levadura tps1\Delta y tps1\Delta tps2\Delta son termosensibles y se restaura el fenotipo complementando con el correspondiente gen homólogo. Para determinar si TPS de planta o animal es similar funcionalmente a TPS1, tps1\Delta y tps1\Deltatps2\Delta de levadura, se ensaya en mutantes de levadura transformados con un plásmido que alberga el gen deseado la adquisición de termotolerancia. La capacidad de las células para adquirir termotolerancia se mide mediante un choque por calor letal.

En levadura, el metabolismo de trehalosa es esencial para crecimiento en glucosa. La supresión del gen de TPS causa un aflujo incontrolado de glucosa a glicolisis, produciendo hiperacumulación de azúcar fosfatos y pérdida de fosfato libre y ATP. Se sabe que trehalosa-6-fosfato inhibe la actividad de hexoquinasa in vitro y se piensa por tanto que la enzima TPS ejerce este control también in vivo restringiendo la actividad de hexoquinasa.

La señalización inducida por glucosa, y también la señalización inducida directa o indirectamente por azúcares relacionadas, tales como sacarosa, juega un papel importante en muchos organismos para reacción apropiada a la disponibilidad de azúcar externo, tal como en levadura, o a la producción interna de azúcar, tal como en plantas fotosintéticas o en el sistema digestivo de animales. En levadura, la presencia de glucosa externa, o azúcares relacionados, desencadena varios trayectos de señalización que causan una adaptación rápida del metabolismo a la producción máxima de etanol y a crecimiento rápido. En plantas fotosintéticas, la señalización inducida por azúcar controla la actividad fotosintética y la repartición del azúcar entre la fuente (partes fotosintéticas) y órganos receptores (partes no fotosintéticas, en particular raíces, semillas y frutos). En animales, la señalización inducida por azúcar controla la proporción de absorción del azúcar de la sangre por los órganos de almacenamiento, por ejemplo en mamíferos controla la proporción de absorción del azúcar de la sangre glucosa por el hígado.

Los mutantes de TPS de levadura son deficitarios en señalización inducida por glucosa, una deficiencia que se cree debida a la ausencia de inhibición de trehalosa-6-fosfato de la actividad de hexoquinasa. En plantas superiores, en las que no se acumula trehalosa en cantidades apreciables, no se entiende bien la función de los genes del metabolismo de trehalosa. Las plantas en las que se han expresado genes de TPS o TPP heterólogos muestran una actividad fotosintética alterada y repartición fuente-receptor de azúcar que indica efectos posibles en trayectos de señalización inducidos por azúcar. Esto se cree debido a cambios en el nivel de trehalosa-6-fosfato causados por la expresión de los genes de TPS o TPP (Solicitud de Patente Zeneca-Mogen 6047 PCT).

En la presente invención, se demuestra la situación inesperada de que truncar la parte N-terminal de los genes de TPS de plantas aumenta su actividad catalítica y probablemente por tanto su capacidad reguladora. Por ello, la presente invención permite la alteración de la señalización inducida por azúcar de manera más eficaz en plantas superiores y posiblemente animales. Además, permite conseguir esto por modificación genética homóloga en principio en cualquier especie de planta y animal, es decir, mediante la expresión de una forma truncada de la enzima TPS homóloga.

En la presente invención, esta alteración en la señalización inducida por azúcar se consigue mediante las mismas etapas descritas anteriormente para la mejora de la resistencia al estrés.

La funcionalidad de los genes modificados para restaurar el control del aflujo de glucosa a glicólisis y restaurar la señalización inducida por glucosa puede comprobarse en el siguiente sistema de ensayo. Los mutantes de TPS de levadura no son capaces de crecer en glucosa porque son defectuosos en el control de aflujo de glucosa a glicolisis y la señalización inducida por glucosa. Se muestra según la invención que la expresión de genes de TPS modificados en la cepa de levadura tps1\Delta restaura el crecimiento en glucosa, indicando que se restauran los controles de señalización por glucosa apropiados requeridos para crecimiento.

La presente invención según un aspecto adicional de la misma proporciona un nuevo método para la medición de trehalosa-6-fosfato y trehalosa-6-fosfato sintasa. Este método es un método altamente seguro para la determinación cuantitativa de trehalosa-6-fosfato. El nivel de trehalosa-6-fosfato en todos los organismos en los que se ha medido hasta ahora es muy bajo, en el intervalo de 100-200 \muM. Esta baja concentración hace difícil y no muy segura una cuantificación precisa por métodos clásicos, por ejemplo por HPLC. Los métodos cromatográficos también son pesados porque sólo pueden medirse las muestras una cada vez. Otros grupos de investigación han usado la inhibición de hexoquinasa de levadura por trehalosa-6-fosfato como una manera indirecta para estimar la concentración de trehalosa-6-fosfato presente en extractos de células (Blazquez, M.A., Lagunas R., Gancedo C. y Gancedo J.M., 1993, FEBS Lett. 329, 51-54). Sin embargo, en general, tales ensayos son propensos fácilmente a interferencia con otros compuestos presentes en el extracto de células, especialmente cuando se derivan de organismos como plantas o animales que contienen muchos compuestos no presentes en levadura.

En la presente invención, se consigue una medición cuantitativa precisa del nivel de trehalosa-6-fosfato por un nuevo ensayo enzimático que utiliza la enzima fosfotrehalasa purificada, preferiblemente de Bacillus subtilis. El método comprende las siguientes etapas:

a) extracción de células a analizar con un medio de extracción, preferiblemente un ácido fuerte, que destruye toda la actividad enzimática pero no degrada trehalosa-6-fosfato;

b) neutralización del extracto;

c) centrifugación del extracto;

d) separación de los compuestos ácidos, incluyendo trehalosa-6-fosfato, presentes en el sobrenadante, de compuestos alcalinos y neutros, preferiblemente por medio de una columna de intercambio aniónico;

e) tratamiento de la fracción que contiene los compuestos ácidos con fosfotrehalasa prificada de Bacillus subtilis para degradar cuantitativamente trehalosa-6-fosfato en glucosa-6-fosfato y glucosa;

f) separación de la glucosa producida en la etapa e) de glucosa-6-fosfato producido y de los azúcar fosfatos ressantes presentes, preferiblemente mediante una segunda columna de intercambio aniónico;

g) determinación de la glucosa presente, preferiblemente por medio de un ensayo de glucosa oxidasa y peroxidasa.

El nivel de glucosa medido es idéntico al nivel de trehalosa-6-fosfato presente originalmente en el extracto de células.

El método establecido para la medición de trehalosa-6-fosfato puede extenderse a la medición de la actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa. Hasta ahora no hay un método disponible que permita la medición de la actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa basado directamente en la velocidad de formación de trehalosa-6-fosfato. La trehalosa-6-fosfato sintasa cataliza la síntesis de trehalosa-6-fosfato y UDP de los sustratos glucosa-6-fosfato y UDP-glucosa.

El método clásico para determinar la actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa que se usa universalmente mide la formación del segundo producto de la enzima, UDP (Hottiger, T., Schmutz, P. y Wiemken, A., 1987, J. Bacteriol. 169: 5518-5522). Sin embargo, en extractos de células están presentes otras enzimas, por ejemplo, glicógeno sintasa, que son capaces de producir UDP. Por tanto, este método es propenso a interferencia de otras reacciones enzimáticas. Es mucho más preferible un método que mida directamente la formación de trehalosa-6-fosfato. Además, dicho método no permite la medición continua de la actividad de la enzima en función del tiempo, porque es necesaria la terminación de la reacción antes de que pueda medirse UDP.

Se ha mostrado ahora según la invención que la utilización de la enzima fosfotrehalasa purificada permite conseguir ambos objetivos a la vez. Para este fin, se ha desarrollado un ensayo acoplado en el que se convierte directa y continuamente trehalosa-6-fosfato en glucosa mediante fosfotrehalasa purificada y se mide la glucosa producida continuamente usando el método de glucosa oxidasa/peroxidasa. En este ensayo, están presentes en exceso fosfotrehalasa, glucosa oxidasa y peroxidasa, mientras que la trehalosa-6-fosfato sintasa del extracto de células es el factor limitante en la formación del producto coloreado.

La presente invención se refiere además a plantas y otros organismos eucariotas que muestran expresión constitutiva, inducible y/o específica del órgano de un gen de TPS modificado específicamente, cuyas plantas u otros organismos eucariotas son obtenibles mediante el método de la invención. La invención se refiere además a semillas de esas plantas o estructuras reproducibles vegetativamente de esas plantas, tales como esquejes, embriones somáticos, protoplastos, así como las generaciones adicionales de progenie derivadas de esas semillas y estructuras. La invención se refiere también a la progenie adicional de los otros organismos eucariotas.

El gen de TPS puede derivarse de diversas fuentes, tales como plantas, en particular Selaginella lepidophylla, Arabidopsis thaliana, arroz, manzana, remolacha azucarera, girasol (Helianthus annuus), tabaco (Nicotiana tabacum), soja (Glycine max). Los diversos genes pueden expresarse en ambientes homólogos y heterólogos.

El organismo eucariota a transformar puede ser así una planta, la planta de la que se deriva el gen y modificada ahora de tal modo que se obtiene una modificación de la actividad de TPS, o una planta heteróloga. Son hospedantes especialmente preferidos para el gen modificado plantas de cultivo, en particular plantas que no son resistentes al estrés inherentemente, pero que pueden hacerse resistentes al estrés por el método de la invención. Como alternativa, el objetivo de la modificación puede ser una productividad fotosintética aumentada y/o una repartición de carbono mejorada en la planta total o en partes de la planta específicas.

Otros organismos eucariotas a transformar son hongos y animales o células de animales. Son ejemplos de hongos para los que puede ser beneficioso un aumento de la actividad de TPS Aspergillus niger, Agaricus bisporus, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis y levaduras metilotróficas. Un ejemplo de una levadura es Saccharomyces cerevisiae. Las células de animales son por ejemplo cultivos de células de mamíferos e invertebrados usadas para producir proteínas y pequeñas moléculas, células de invertebrados usadas para expresión de baculovirus.

La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes Ejemplos, que no pretenden ser limitativos.

Ejemplos Materiales y métodos generales Reactivos

Se usaron reactivos de Baker o Sigma de calidad analítica. Las enzimas de restricción y modificación fueron de Boehringer-Mannheim. El juego de síntesis de cADN ZAP, el vector Uni-ZAP XR y los extractos de empaquetado Gigapack II Gold se obtuvieron de Stratagene Cloning Systems (EE.UU.). El juego Sequenase Version 2.0 para determinar la secuencia de nucleótidos se compró de la United States Biochemical Corporation (EE.UU.).

La planta de resurrección Selaginella lepidophylla (Hook. & Grev. Spring.) se recogió en forma deshidratada del terreno rocoso de las zonas áridas de los Estados de Morelos y Oaxaca de Méjico. Se cultivó a continuación en condiciones controladas (24ºC y 16 horas de luz con una media del 50% de humedad) en cámaras de crecimiento Conviron o en un invernadero. Las plantas se regaron cada dos días con 20 ml de agua para macetas de flores de 2 l. Con el fin de tratar S. lepidophylla a estrés de deshidratación, se secaron al aire la planta completa o frondas microfílicas poniéndolas en papel de filtro Whatman 3MM. A partir de ese momento, se determinó el tiempo de deshidratación.

Cepas

El banco de cADN se puso en placa en la cepa de E. coli XL1-Blue MRF' y se usó la cepa SOLR para cortar el pBluescript del fago lambda, siguiendo las instrucciones dadas en el "ZAP-cADN Synthesis Kit" (Strategene Cloning Systems, Calif. EE.UU.; catálogo 200400, 200401 y 2004029). Se usó la cepa DH5 alfa de E. coli para subclonar y hacer construcciones. Se usó la cepa LBA4404 de A. tumefaciens para transformar tabaco y la cepa HB101 de E. coli, que lleva el plásmido pRK2013 (Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721), se usó para transferir plásmido pIBT36 de E. coli a A. tumefaciens mediante conjugación triparental como se ha descrito previamente (Bevan, M. (1984), supra).

Manipulación de ADN

Se realizaron técnicas de ADN recombinante tales como transformación bacteriana, aislamiento de ADN de plásmido y bacteriófago lambda según procedimientos estándares (Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. Segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory press, Nueva York). El marcado de fragmentos radioactivos se realizó por la técnica de "impresión aleatoria" con oligonucleótidos (Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6.130).

Construcciones

El vector de expresión pBN35 es un derivado de pBin19 (Bevan, M. (1984), supra) que se construyó subclonando las 850 pb del promotor del virus de la coliflor CaMV 35S (Guilley, H., Dudley, K., Jonard, G, Richards, K. & Hirth, L. (1982) Cell 21: 285-294) entre los lugares de HindIII y SalI de pBin19 y el fragmento de 260 pb que constituye la señal de poliadenilación del gen de T-ADN nopalina sintasa (Bevan, M., Barnes, W. y Chilton, M.D. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 369-385) en los lugares de SacI y EcoRI del mismo vector (Figura 4).

El plásmido pIBT36 (Figura 5) se construyó subclonando el cADN de sl-tps/p en los lugares de BamHI y KpnI del vector de expresión pBN35.

Construcción del banco de cADN de S. lepidophylla

Con el fin de aislar los clones de cADN, se preparó un banco de expresión con mARN aislado de microfilas de S. lepidophylla deshidratadas durante 2,5 horas, usando el juego de síntesis de cADN ZAP, el vector Uni-ZAP XR y los extractos de empaquetado Gigapack II Gold. Se siguió paso a paso el manual de laboratorio del "juego de síntesis de cADN ZAP" proporcionado por el fabricante (Stratagene Cloning Systems, Calif. EE.UU.; catálogo 200400, 200401 y 2004029). Se extrajo PolyA^{+} ARN de microfilas de S. lepidophylla, deshidratadas durante 2,5 horas, según un método conocido (Chomczyniski, P. & Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159). El título inicial del banco fue 2 x 10^{6} placas de bacteriófago/ml y de 1,5 x 10^{11} placas de bacteriófago/ml después de multiplicar.

El plásmido pBluescript SK (-) se cortó del bacteriófago mediante la técnica de "zapping" según el manual de laboratorio "juego de síntesis de ZAP-cADN" (Stratagene Cloning Systems, Calif. EE.UU.; catálogo 200400, 200401 y 2004029).

Determinación de secuencia de ADN

Se crearon supresiones en serie del inserto con enzimas ExoIII y Nucleasa Sl del clon seleccionado (Henikoff, S. (1984) Gene 28: 351-359), con el fin de determinar a continuación su secuencia de nucleótidos usando el método de terminación de cadena con didesoxinucleótidos (Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Se analizó la secuencia de ADN usando el paquete de software del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) (Devereux, J., Haeberli, P. & Smithies, O. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 387-395). Se obtuvieron gráficos de hidrofibicidad usando un programa conocido (Kyte, J. & Doolittle, R. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132) y los alineamientos de secuencia de proteínas con el programa BESTFIT incluido en el paquete UWGCG.

Hibridación de los ácidos nucleicos

Con el fin de examinar el banco, las placas de bacteriófago se transfirieron a una membrana de nylon Hybond N^{+} (Amersham Life Sciences) que se trató según el método convencional para desnaturalizar ADN (Sambrook, J. et al., supra). Segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York. El filtro se hibridó con oligonucleótidos, se marcó con el isótopo ^{32}P mediante quinasa de polinucleótido, usando 6 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,015 M) a 37ºC. El filtro se lavó tres veces, 10 minutos cada lavado, a la misma temperatura y bajo las siguientes condiciones: 6 x SSC; 4 x SSC; y 2 x SSC.

Se realizaron técnicas de manchas en gel de Southern y Northern según métodos estándares (Sambrook, J. et al., supra) con las siguientes modificaciones. Para el Southern genómico, se fraccionó el ADN en un gel de agarosa del 0,8% en tampón TBE y se transfirió a una membrana de nylon Hybond N^{+} (Amersham Life Sciences). Se hibridó el filtro usando sl-tps/p cADN marcado con isótopo ^{32}P como sonda, usando 2 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,015 M) a 65ºC. Se lavó el filtro tres veces, veinte minutos cada lavado, a la misma temperatura y bajo las siguientes condiciones: 2 x SSC; 1 x SSC; y 0,5 x SSC. Para el Northern, se usó gel de agarosa del 1,2% en un tampón de MOPS-formaldehído y se usó también para la transferencia una membrana de nylon Hybond N^{+}. Las condiciones de hibridación fueron en formamida del 50% y 2 x SSC a 42ºC. Los tres lavados sucesivos del filtro fueron realizados con 2 x SSC, 2 x SSC y 1 x SSC, respectivamente a 55ºC.

Transformación de tabaco

La transformación de tabaco (Nicotania tabacum var. SR1) se realizó mediante el método de disco de hojas (Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R.T. (1985) Science 227: 1229-1231) usando Agrobacterium tumefasciens LBA4404 que contenía el plásmido pIBT36. Los discos de hojas se cultivaron en placas de Petri que contenían medio MS con vitaminas (Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497), hormonas (0,1 ppm de NAA y 1 ppm de BAP) y antibióticos (100 \mug/ml de canamicina y 200 \mug/ml de carbenicilina), para regenerar retoños en 4 a 6 semanas. Las retoños se transfirieron a macetas Magenta que contenían medio Ms con antibióticos (100 \mug/ml de canamicina y 200 \mug/ml de carbenicilina ) y si horminas ni vitaminas, con el fin de regenerar raíces en 2 a 3 semanas más tarde. Las plantas regeneradas se transfirieron a macetas con tierra y se cultivaron en cámaras de crecimiento (a 24ºC con 16 horas de luz) con el fin de obtener plantas fértiles en 4 a 6
semanas.

Determinación de trehalosa

Se determinó trehalosa por el método degradativo con trehalasa (Araujo, P.S., Panek, A.C., Ferreira, R. & Panek, A.D. (1989) Anal. Biochem. 176: 432-436). Con el fin de obtener azúcares solubles, se molieron 500 mg de tejido reciente o 50 mg de tejido seco (congelado en nitrógeno líquido) en 0,5 ml de tampón PBS 100 mM, pH 7,0, en un homogeneizador para tubos de microcentrífuga. Se añadieron cuatro volúmenes de etanol absoluto y se hirvieron las muestras durante 10 minutos en tubos con tapón roscado para evitar evaporación. A continuación, se centrifugaron en tubos de microcentrífuga durante 2 minutos a 13.000 rpm y se recuperó el sobrenadante. Se reextrajeron muestras de nuevo con el mismo volumen de etanol del 80% y el glóbulo se secó bajo vacío. Las muestras se resuspendieron en 0,250 ml de PBS 50 mM, pH 6,5.

Para la determinación de trehalosa, se añadieron 4 \mul (aprox. 15 mU) de trehalasa (cat. de Sigma nº T-8778) a 10 a 30 \mul del extracto, y se incubó durante 2 horas a 30ºC. Como testigo negativo, se usó un tubo con un extracto pero sin trehalasa y como testigo positivo un tubo con trehalosa pura (cat. de Sigma nº T-3663). El volumen se llevó a 0,5 ml con PBS 50 mM, pH 7,0 y se añadieron 0,5 \mul de glucosa oxidasa y peroxidasa del juego de Sigma, nº de cat. 510-A con el fin de determinar glucosa. La incubación fue durante 40 min a 37ºC y se determinó inmediatamente la densidad óptica a 425 nm. Para calcular la concentración de glucosa, se usó una curva de glucosa estándar con valores entre 0 y 75 mM. Los valores de los tubos sin trehalasa se sustrajeron de los tratados con esta enzima con el fin de calcular la cantidad de trehalosa, teniendo en cuenta que 1 mol de glucosa es ½ mol de trehalosa.

Determinación de la actividad enzimática

Para determinar la actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa, se siguió un método presentado (Londesborough, J. & Vuorio, O. (1991) J. Gen. Microbiol. 137: 323-330), que consiste esencialmente en un ensayo acoplado que mide la extinción molar de NADH a 340 nm. La reacción se efectuó en un volumen de 100 \mul que contenía tampón HEPES/KOH 40 mM pH 6,8, glucosa-6-fosfato 10 mM, UDP-glucosa 5 mM, MgCl_{2} 10 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino. La reacción se incubó durante 10 min a 30ºC y se paró por ebullición durante 2 min. Después de enfriar el tubo, se añadieron 900 \mul que contenían tampón HEPES/KOH 40 mM pH 6,8, MgCl_{2} 10 mM, 2,5 \mug/ml de fosfoenolpiruvato, NADH 0,24 mM, 3,5 unidades de piruvato quinasa y 5 unidades de lactato deshidrogenasa (cat. de Sigma nº P-0294). Se midió espectrofotométricamente la desaparición de NADH a 340 nm, incubando en las mismas condiciones mencionadas antes. Con el fin de determinar la actividad específica de trehalosa-6-fosfato sintasa, se midió la concentración de proteína mediante el método Bradford (Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254).

Ejemplo 1 Selección de genes de TPS

Puede seleccionarse un gen de TPS adecuado de diversas maneras. Hay dos posibilidades principales para aislar genes de TPS de plantas. En primer lugar, un método simple es la complementación funcional de células de Saccharomyces cerevisiae suprimidas del gen de TPS1. La supresión de este gen causa un fenotipo pleiotrópico en levadura (Van Aelst et al., 1993, Mol. Microbiol. 8, 927-943). Uno de los fenotipos es que tales células no pueden crecer en glucosa. Puede usarse la construcción de genotecas de cADN de plantas interesantes en plásmidos de expresión de levadura para transformar una cepa de levadura suprimida para TPS1. Puede comprobarse después en transformantes la restauración del crecimiento en glucosa. Por otra parte, puede medirse también la síntesis de trehalosa en los transformantes. Si se encuentran transformantes que restauran el crecimiento en medio de glucosa o que producen de nuevo trehalosa, puede aislarse el ADN plásmido y determinarse la secuencia de los insertos. En base a la secuencia, puede concluirse si se ha aislado un homólogo de TPS auténtico o un supresor.

En segundo lugar, puede hacerse una comparación de las secuencias de aminoácidos de trehalosa-6-fosfato sintasa, deducida de las secuencias de nucleótidos presentadas. Las secuencias usadas vienen de E. coli, EC-otsA (Kaasen, I., McDougall, J., Strom, A.R. (1994) Gene 145: 9-151; Schizosaccharomyces pombe, SP-TPS1 [Blazquez, M.A., Stucka, R., Feldman, H. & Gancedo, C. (1994) J. Bacteriol. 176: 3895-3902]; Aspergillus niger, AN-TPS1 [Wolschek, M.F. & Kubicek, C.P. (1994) NCBI: Seq. ID 551471; no publicado]; Saccharomyces cerevisiae, SC-TPS1 [McDougall, J., Kaasen, Y. & Strom, A.R. (1993) FEMS Microbiol. Let. 107: 25-30]; Kluyveromyces lactis, KL-GGS1 [Luyten, K., de Koning, W., Tesseur, Y., Ruiz, M.C., Ramos, J., Cobbaert, P., Thevelein, J.M., Hohmann, S. (1993) Eur. J. Biochem. 217: 701-713].

Como ejemplo del aislamiento de un homólogo de planta, se describirá ahora el aislamiento del cADN de Sl-TPS.

Se recogieron plantas de resurrección deshidratadas, Selaginella lepidophylla, de terreno rocoso de zonas áridas de los Estados de Morelos y Oaxaca de Méjico. Se cultivaron a continuación en macetas de flores de 2 l a 24ºC con 16 horas de luz y una humedad media del 50% en cámaras de crecimiento Conviron. Las plantas se regaron cada dos días con 20 ml de agua.

Con el fin de aislar los clones de cADN, se preparó un banco de expresión usando 5 \mug de mARN aislado de 50 g de microfilas de S. lepidophylla, deshidratadas durante 2,5 horas. Después de sintetizar el cADN, se clonó usando 1 \mug de vector Uni-ZAP XR. Los bacteriófagos se empaquetaron in vitro y se examinaron seguidamente con una mezcla de oligonucleótidos degenerados que codifican regiones de consenso en trehalosa-6-fosfato sintasa de las secuencias informadas de E. coli y levadura. Uno de los clones aislados corresponde a un cADN (sl-tps) con una región de codificación completa (Seq. ID no. 1).

El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida produjo 53% de identidad para trehalosa-6-fosfato sintasa y 29% para trehalosa-6-fosfato fosfatasa, en comparación con las secuencias informadas de trehalosa-6-fosfato sintasa de bacterias y diversas levaduras.

La homología de la proteína codificada por sl-tps, denominada SL-TPS, a trehalosa-6-fosfato sintasa, mapas en la región N-terminal de la primera y la homología de SL-TPS a trehalosa-6-fosfato fosfatasa pueden encontrarse por toda la secuencia completa.

El procedimiento de aislamiento como se ha descrito para S. lepidophylla puede usarse para cualquier otra planta, preferiblemente monocotiledóneas y dicotiledóneas. Este método es de aplicación general porque los oligos degenerados que se usaron para obtener Selaginella TPS se ensayaron con éxito en Arabidopsis thaliana. Usando una reacción PCR podía sislarse un fragmento del gen de A. thaliana TPS. En base a este fragmento, se aisló el gen de A. thaliana TPS completo (Seq. ID no. 2).

Ejemplo 2 Preparación de construcciones 1. Construcción de vectores de expresión de levadura que contienen genes de TPS de plantas

Se obtuvo un fragmento de 3,1 kb que contenía el gen de SlTPS1 de longitud completa después de multiplicar por PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 1 min, 50ºC, 1 min, 72ºC, 2 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer). Como oligonucleótidos, se usaron SLTPS-S1 (5'-CATGCC ATG GCTATGCCTCAGCCTTACC-3', negrilla indica codón de iniciación y subrayado lugar de NcoI) y cebadores universales (5'-GTAAACGACGGCCAGT-3') con cADN de Sl-TPS1 clonado en pBluescript SK como plantilla. El fragmento de PCR se digirió con NcoI y KpnI y se clonó en pSAL4. Se transformaron cepas mutantes de tps1\Delta y tps1\Delta tps2\Delta de levadura y se seleccionaron en placas SDGal (-ura). Se ensayó complementación en SDGlc (medio mínimo -ura más CuSO_{4} 100 \muM).

Para construir la construcción de supresión N-terminal, se usaron los siguientes oligonucleótidos: oligo 5' SLTPS-100 5'-CATGCC ATG GGTCGAGGCCAGCGGTTGC-3', negrilla indica codón de iniciación y subrayado lugar de NcoI. oligo 3' universal 5'-GTAAACGACGGCCAGT-3'.

Se obtuvo un fragmento de 2,8 kb después de multiplicar por PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 1 min, 50ºC, 1 min, 72ºC, 2 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer) con oligos SLTPS-100 y universal, y se clonó cADN de Sl-TPS1 en pBluescript SK como plantilla. El fragmento de PCR se digirió con NcoI y KpnI y se clonó en pSAL4. Se transformaron cepas mutantes de tps1\Delta y tps1\Delta tps2\Delta de levadura y seleccionaron en SDGal (-ura). Se ensayó complementación en SDGlc (medio mínimo -ura más CuSO_{4} 100 \muM).

Para la construcción de vectores de expresión de levadura que contienen el gen de A. thaliana TPS, se usó RT-PCR.

ARN total (5 \mug) extraído de plantones de Arabidopsis thaliana cv. Columbia, desarrollados durante 2 semanas en medio MS líquido que contenía NaCl 100 mM, se sometió a transcripción inversa usando SuperScript II (GIBCO) usando un cebador oligo dT (25 meros). Se hizo una reacción PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 94ºC, 1 min, 50ºC, 1 min, 72ºC, 2 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer) para multiplicar AtTPS1 usando oligos Ath/TPS-5' (5'-CATCC ATG GCTATGCCTGGAAATAAGTACAACTGC-3'; negrilla indica codón de iniciación, subrayado es lugar de NcoI) y Ath/TPS-'(5'-ATAGTTTTGCGGCCGC TTAAGGTG
AGGAAGTGGTGTCAG-3'; negrilla indica codón de iniciación, subrayado lugar de NotI). Se obtuvo un fragmento de 2,8 kb correspondiente al tamaño esperado, se digirió con NcoI y NotI y se clonó en pSAL6. Se transformaron cepas mutantes de tps1\Delta y tps1\Delta tps2\Delta de levadura. Los transformantes se desarrollaron en SDGal (medio mínimo -his). Se ensayó complementación en SDGlc (medio mínimo -his más CuSO_{4} 100 \muM).

Para construir la construcción la supresión N-terminal, se usaron los siguientes oligonucleótidos: oligo Ath/TPS-\DeltaN5'

5'-CATGCC ATG GCTTATAATAGGCAACGACTACTTGTAGTG-3', negrilla indica codón de iniciación y subrayado lugar de NcoI. oligo Ath/TPS-3'

5'-ATAGTTTTGCGGCCGC TTAAGGTGAGGAAGTGGTGTCAG-3'; negrilla indica codón de terminación, subrayado lugar de NotI.

ARN total (5 \mug) extraído de plantones de Arabidopsis thaliana cv. Columbia, desarrollados durante 2 semanas en medio MS líquido que contenía NaCl 100 mM, se sometió a transcripción inversa usando SuperScript II (GIBCO) y un cebador oligo dT (25 meros). Se hizo una reacción PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 1 min, 50ºC, 1 min, 72ºC, 2 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer) para multiplicar AtTPS1 usando oligos Ath/TPS-5' y Ath/TPS-3'. Se obtuvo un fragmento de 2,6 kb correspondiente al tamaño esperado, se digirió con NcoI y NotI y se clonó en pSAL6. Se transformaron cepas mutantes de tps1\Delta y tps1\Delta tps2\Delta de levadura. Los transformantes se desarrollaron en SDGal (medio mínimo -his).

Se ensayó complementación en SDGlu (medio mínimo -his).

2. Construcción de vectores de expresión de plantas que contienen genes de TPS de plantas

Para clonar en vectores de expresión de plantas, se ensayaron primero genes de trehalosa-6-fosfato sintasa de plantas en un mutante de tps1\Delta de levadura y se subclonaron a continuación en vectores de transformación de plantas apropiados. Las regiones de codificación de AtTPS1 de 2,9 kb y de \DeltaNAtTPS1 de 2,6 kb se aislaron después de digerir los plásmidos pSAL6::AtTPS1 y pSAL6::\DeltaNAtTPS1 con enzimas de NcoI y KpnI. Este último lugar está aguas abajo del lugar NotI en pSAL6.

Se aislaron las regiones de codificación de SlTPS1 de 3,1 kb y de \DeltaNSlTPS1 de 2,8 kb después de digerir los plásmidos pSAL4.SlTPS1 y pSAL4.dNSlTPS1 con enzimas de NcoI y KpnI, también. Todos los fragmentos de ADN se ligaron a un fragmento de 57 pb que contenía lugares de 5' líder de AtTPS1, XbaI y NcoI. Este fragmento se obtuvo después de reasociar oligonucleótidos NA4 (5'-CTAGAGCGGCCGCCAAGTGTGAGTAATTTAGTTTT
GGTTCGTTTTGGTGTGAGCGTC-3') y NA5 (5'-CATGGACGCTCACACCAAAACAGAACCAAAACTAAATT
ATCACACTGGCGGCCGCT-3').

Cada cassette de región de codificación líder ligada se ligó adicionalmente al vector de expresión pBN35 digerido con XbaI y KpnI (Figura 1) conduciendo a plásmidos pIBT101 que contiene AtTPS1 (Figura 2), pIBT102 que contiene \DeltaNAtTPS1 (Figura 3), pIBT103 que contiene SlTPS1 (Figura 4) y pIBT104 que contiene \DeltaNSlTPS1 (Figura 5). El vector pBN35 permite la expresión de cualquier gen bajo el control del promotor 35S del virus de la coliflor (CaMV) (Guilley, H. et al., Cell 21: 285-294 (1982)) que es un promotor fuerte y constitutivo.

Estos plásmidos se usaron para obtener plantas transgénicas, transfomadas mediante el sistema de Agrobacterium, que, cuando se regeneran, son capaces de producir trehlosa. Estas construcciones pueden expresarse en cualquier planta que pueda transformarse usando el sistema de Agrobacterium o mediante cualquier otro método conocido en el estado actual de la técnica.

El vector de expresión pBN35 es un derivado de pBin19 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721 (1984)), que se construyó subclonando las 850 pb del promotor 35S del virus de la coliflor CaMV (Guilley, H. et al., supra) entre los lugares de HindIII y SalI de pBin19 y el fragmento de 260 pb que constituye la señal de poliadenilación del gen de T-ADN nopalina sintetasa (Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 11: 369-385 (1983)) en los lugares de SacI y EcoRI del mismo vector (Figura 1).

3. Construcción de los alelos Sl TPS1, At TPS1, \DeltaN Sl TPS1 y \DeltaN At TPS1 etiquetados con HA

Con el fin de determinar si la diferencia de actividad entre los genes de TPS1 de plantas de longitud completa y los alelos con supresión N-terminal es causada por el hecho de que los primeros no son capaces de formar un complejo de TPS correcto cuando se expresan en células de levadura, se hicieron versiones etiquetadas de estos genes. Se usó para hacer estas construcciones el esquema como se muestra en la Figura 9. La Figura 10 muestra los plásmidos
resultantes.

El plásmido que contiene los genes de TPS de plantas se digiere con dos lugares de restricción únicos, uno cortando inmediatamente después del gen (R1) y el segundo cortando próximo al 3' del gen (R2). El fragmento que se separó por el uso combinado de R1 y R2 se sustituye por un fragmento obtenido por PCR que se digiere también con R1 y R2. El lugar de R2 está situado dentro del producto de PCR mientras que el lugar de R1 es pare del cebador inverso (rev). La constitución del cebador inverso es como sigue:

5' R1-STOP-HAtag-Codones para 6 aminoácidos de gen relevante-3'

La Tabla 1 muestra los cebadores que se han usado:

Los cebadores pueden usarse para los genes de longitud completa así como para los alelos \DeltaN.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

\newpage

En la Tabla 2 se indican los difeentes vectores y enzimas de restricción que se usaron.

TABLA 2

2

Ejemplo 3 Complementación funcional de mutantes de tps de levadura con genes de TPS de plantas modificados 1. Complementación del defecto de crecimiento de cepas de tps1\Delta y tps1\Deltatps2\Delta

Se transformaron cepas de tps1\Delta y tps1\Deltatps2\Delta con vectores de expresión de levadura que contienen genes de TPS de S. lepidophylla o de A. thalians de longitud completa o con supresión N-terminal. Como testigos, se transformaron cepas de tps1\Delta y tps1\Deltatps2\Delta de tipo natural (WT) con un plásmido vacío, o con un plásmido que contenía el gen de TPS1 de levadura. Se ensayó en los transformantes el crecimiento en medio que contenía glucosa y fructosa. La Figura 6 muestra el crecimiento en medio que contenía glucosa y fructosa de cepas de tipo natural y de tps1\Delta transformadas con un vector de expresión de levadura que contenía un gen de TPS de S. lepidophylla completo o truncado. Las pistas son como sigue: 1. WT, 2. tps1\Delta, 3. tps1\Delta + \DeltaNTPS1 Sl, 4. tps1\Delta + TPS1 Sl, 5. tps1\Delta + TPS1 Sc, 6. tps1\Deltatps2\Delta, 7. tps1\Deltatps2\Delta + \DeltaNTPS1 Sl, 8. tps1\Deltatps2\Delta + TPS1 Sl, 9. tps1\Deltatps2\Delta + TPS1 Sc, 10. tps1\Deltatps2\Delta + TPS2 Sc.

El clon de longitud completa sólo puede complementar la cepa de tps1\Deltatps2\Delta. No puede complementar el defecto de crecimiento de una cepa de tps1\Delta en glucosa o fructosa. Sin embargo, si se suprime la parte N-terminal, el gen de S. lepidophylla expresado desde el promotor Cu-inducible puede complementar el defecto de crecimiento en una cepa de tps1\Delta. Esto ilustra claramente el efecto beneficioso de la supresión N-terminal.

Si el gen de planta se expresa bajo el congtrol de un promotor más fuerte, también el clon de longitud completa puede complementar la cepa de tps1\Delta para crecimiento en glucosa o fructosa (no mostrado).

2. Restauración de niveles de trehalosa en cepas de tps1\Delta

Se midió trehalosa en células de levadura usando el método de Neves et al. (Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994)). En este método, se degrada trehalosa mediante trehalasa y se mide la glucosa que se forma por el método de glucosa oxidasa/peroxidasa. Brevemente, se recogieron células en un filtro, con poros de 0,22 o 0,45 \mum, en un matraz de vacío y se lavaron con agua. Se recogieron las células, se determinó el peso y se congelaron en nitrógeno líquido. Para extracción de la trehalosa, se añadió a las células Na_{2}CO_{3} (0,25 M) (1 ml por 50 mg de células) y se hirvieron durante 20 min. Después de centrifugar, se usaron 10 \mul del sobrenadante para medir el contenido de trehalosa. Se neutralizó cada muestra añadiendo 5 \mul de una solución de ácido acético 1 M. Se añadieron a cada muestra 5 \mul de tampón T1 (NaAc 300 mM + CaCl_{2} 30 mM pH 5,5) y 20 \mul de solución de trehalosa (aislada del hongo Humicola grisea). Se incubaron las muestras a 40ºC durante 45 min. En esta etapa, se descompuso trehalosa en glucosa. En paralelo con las muestras, se midieron también patrones de trehalosa y muestras testigo. Después de esta incubación, se centrifugaron brevemente los tubos y se usaron 30 \mul del sobrenadante para determinación de glucosa.

Se añadió a cada muestra 1 ml de solución de glucosa oxidasa/peroxidasa que contenía o-dianisidina (0,1 mg/ml) y se incubó la mezcla durante 1 h a 30ºC. Se detuvo la reacción por adición de ácido sulfúrico del 56% (v/v). Se midió para cada muestra la extinción a 546 nm.

Se midieron los niveles de trehalosa en cepas de S. cerevisiae tps1\Delta transformadas con plásmidos que contenían los genes de SlTPS1, \DeltaNSlTPS1, AtTPS1 o \DeltaNAtTPS1 bajo el control de un promotor Cu-inducible. La Tabla 3 muestra los resultados de tres experimentos independientes. La abreviatura 1\Delta significa tps1\Delta.

TABLA 3

3

Los resultados de esta Tabla confirman los resultados mostrados en la Figura 6. Los clones de longitud completa no pueden complementar el defecto de crecimiento de una cepa de tps1\Delta en medio que contiene glucosa o fructosa. Además, en galactosa estos clones de longitud completa no son capaces de producir trehalosa en cepas de tps1\Delta. Sin embargo, si se suprime la parte N-terminal del gen de S. lepidophylla o A. thalians de TPS y se transforman las cepas de tps1\Delta con plásmidos que contienen estos genes, estas cepas son capaces de crecer en glucosa o fructosa y estas cepas producen también altos niveles de trehalosa. ("-" significa que no podía hacerse medición porque las células eran incapaces de crecer en esta condición; "ND" significa no detectable).

3. La supresión del término N es necesaria para obtener actividad de TPS en un ensayo in vitro

Se midió la actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa mediante un ensayo de enzimas acoplado como se describe por Hottiger et al. (J. Bacteriol., 169: 5518-5522 (1987)). Se desalaron extractos crudos en una columna Sephadex G-25 con un volumen de lecho de 2 ml, preequilibrado con tampón de Tricina 50 mM pH 7,0. La mezcla de ensayo contenía Tricina/KCl 50 mM (pH 7,0), MgCl_{2} 12,5 mM, UDP-glucosa 5 mM, glucosa-6-fosfato 10 mM, muestra de enzima y agua en un volumen total de 240 \mul. En los trstigos, se omitió glucosa-6-fosfato y se sustituyó por agua. Las mezclas de ensayo se incubaron a 30ºC durante 30 min. La reacción se detuvo hirviendo durante 5 min. Después de enfriar, se centrifugaron las mezclas de ensayo a 13000 rpm durante 10 min. El UDP formado en el sobrenadante se midió enzimáticamente. La mezcla de ensayo contenía Tricina/KCl 66 mM (pH 7,6), fosfoenolpiruvato 1,86 M, NADH 0,3 mM, 5 U de deshidrogenasa láctica y 60 \mul de muestra en un volumen total de 990 \mul. La reacción se inició por adición de 10 \mul de piruvato quinasa y se incubó a 37ºC durante 30 min. Se registró la disminución de absorbancia a 340 nm y se usó para calcular la actividad de la enzima.

actividad de la enzima (\mukat/g de prot.) = \frac{\Delta OD_{340} \ x \ 240 \ \mu l \ x \ 10^{12}}{60 \ \mu l \ x \ 6,22 \ x \ 10^{6} \ x \ 30 \ min \ x \ 60 \ s/min \ x \ 30 \ \mu l \ x \ mg/ml \ de \ prote\text{í}na}

1 kat = 6 x 10^{7} unidades.

Los resultados de las mediciones de actividad de TPS se muestran en la Tabla 3.

Indican que sólo los genes de TPS con supresión N-terminal, y no los clones de longitud completa, producen alta actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa cuando se expresa en levadura.

Después de construir los alelos etiquetados con HA, estos alelos se introdujeron en cepas de tps1\Delta y tps1\Delta tps2\Delta. Se obtuvieron las siguientes cepas:

PVD164:

a leu2-3/112 ura3-1 trp-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 + tps1\Delta::TRP1 + pSAL4/Sl TPS1 etiquetaHA (URA 3)

PVD165:

a leu2-3/112 ura3-1 trp-1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 + tps1\Delta::TRP1 + pSAL4/?N Sl TPS1 etiquetaHA (URA 3)

PVD179:

a leu2-3/112 ura3-1 trpl-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 + tps1\Delta::TRP1 tps2\Delta::LEU2 + pSAL4/Sl TPS1 etiquetaHA (URA 3)

PVD181:

a leu2-3/112 ura3-1 trpl-1 his3-11/15 ade2-1 canl-100 GAL SUC2 + tps1\Delta::TRP1 tps2\Delta::LEU2 + pSAL4/\DeltaN Sl TPS1 etiquetaHA (URA 3).

La presencia de la etiqueta HA no interfirió con la función de los genes de la planta. La expresión del promotor CUP1 (vectores pSal) de los alelos de planta de longitud completa no restauró el defecto de crecimiento en glucosa de una cepa de tps1\Delta. La expresión de los alelos con supresión N-terminal restauró el crecimiento en glucosa como se ha visto para los alelos no etiquetados con HA.

Se ensayó la expresión de los genes de Sl TPS1 etiquetados con HA de longitud completa y con supresión N-terminal en la cepa de tps1\Delta y de tps1\Delta tps2\Delta.

Las cepas PVD164 (tps1\Delta + Sl TPS1-HA), PVD165 (tps1\Delta + \DeltaN Sl TPS1 HA), PVD179 (tps1\Delta tps2\Delta + Sl TPS1-HA) y PVD181 (tps1\Delta tps2\Delta + \DeltaN Sl TPS1-HA) se han desarrollado hasta fase estacionaria en SDgal-URA (+ CuSO_{4}). Las células se lavaron en tampón de extracción (para 1 litro: 10,7 g de Na_{2}HPO_{4}. 2H_{2}O, 5,5 g de NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O, 0,75 g de KCl, 246 mg de MgSO_{4}.7H_{2}O, PMSF 1 mM, pH 7,0) y se resuspendieron en 500 \mul de tampón de extracción. Se hicieron extractos sometiendo a torbellino 2 veces durante 1 min en presencia de perlas de vidrio. Los extractos se limpiaron por centrifugación durante 20 min.

Se hicieron pasar 10 \mug de los extractos sobre un gel PAGE del 7,5%. Después de producir manchas, las membranas de nitrocelulosa se incubaron durante 1 h en TBST que contenía 2% de BSA (5 x TBS: 6 g de Tris + 45 g de NaCl, pH 7,4; TBST = 1 x TBS + 0,05% de Tween 20). Se incubaron después los filtros durante 1 h con anticuerpos anti-HA (alta afinidad anti-HA, clon de anticuerpo monoclonal de rata 3F10, Boehringer Mannheim) diluidos 1:1000 en TBST que contenía 2% de BSA. Los filtros se lavaron 3 x 5 min en TBST y se incubaron a continuación durante 45 min con el anticuerpo secundario (Sigma A-6066; anti-rata) diluido 1:20000 en TBST que contenía 2% de BSA). Los filtros se lavaron después 3 x 5 min en TBST. Posteriormente, se lavaron los filtros durante 5 min en TBS. Se añadió a los filtros la mezcla de revelado de fosfatasa alcalina (10 ml de Tris 100 mM, pH 9,5; MgCl_{2} 50 mM; NaCl 100 mM, 37,5 \mul de X-fosfato y 50 \mul de nitro azul tetrazolio (NBT)) y, cuando se hicieron visibles las bandas, se detuvo la reacción añadiendo H_{2}O. Los resultados se presentan en la Figura 11.

El peso molecular calculado de la proteína de Sl Tps1 (sin la etiqueta HA) de longitud completa es 109353, mientras que la proteína de \DeltaN Sl Tps1 tiene un peso molecular de 99453.

Con el fin de averiguar si la diferencia de capacidad de complementación entre el gen de TPS1 de longitud completa y el gen de TPS1 con supresión N-terminal es causada por el hecho de que la proteína de longitud completa no puede hacer un complejo de TPS correcto, se realizó un análisis d FPLC de extractos de levadura preparados a partir de cepas de tps1\Delta transformadas con el gen de Sl TPS1 de longitud completa o el de \DeltaN Sl TPS1. Los extractos se separaron en una columna de filtración con gel (Superdex 200 HR 10/30) y se recogieron fracciones de 750 \mul como se describe por Bell et al., (J. Biol. Chem., 373, 33311-33319, 1998). La primera fracción que contiene proteína es la fracción 10. En base a las características de la columna y en base a experimentos de calibración, las proteínas de la fracción 10-14 corresponden a complejos de proteínas muy grandes, variables de 800.000 a 400.000 daltons.

La Figura 11 da el resultado de las manchas de western usando anticuerpos anti-HA. Aquí sólo se muestran las fracciones 10 a 15. La proteína de TPS1 libre está presente en las fracciones 25 a 27 (no mostradas). Es muy importante el hecho de que los alelos de longitud completa y de \DeltaN Sl TPS1 son capaces de formar complejos con las otras subunidades del complejo de TPS. Esto podría indicar que la propia región N-terminal puede ejercer una función inhibidora directamente sobre el resto de la proteína de Tps1 de plantas.

El hecho de que alelos de TPS1 de longitud completa no producen ninguna síntesis de trehalosa en plantas superiores puede ser causado por el efecto inhibidor del término N. La construcción de plantas transgénicas con estas construcciones suprimidas N-terminalmente puede producir plantas con mayores niveles de trehalosa y mejor resistencia al estrés.

Ejemplo 4 Construcción de plantas transgénicas de Arabidopis thaliana, que producen trehalosa

La transformación de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia se realiza por medio del método de infiltración bajo vacío (Bechtold, N. et al., C. R. Acad. Sci. París 316: 1194-1199 (1993); Bent, A. et al., Science 265: 1856-1860 (1994)), usando cepa C58C1 de Agrobacterium tumefaciens que alberga el plásmido auxiliar pMP90 y la construcción de plásmido apropiado, y se moviliza de E. coli cepa DH5-alfa por acoplamiento triparental usando E. coli cepa HB101 que alberga plásmido pRK2013 como auxiliar.

Brevemente, se desarrollan plantas de A. thaliana a 22-20ºC, bajo 16 horas de luz, durante 4-6 semanas, hasta que comienzan a aparecer inflorescencias. Después de verter un cultivo de Agrobacterium dentro de un desecador de vacío, se ponen macetas que contienen plantas de Arabidopsis al revés y se infiltran bajo vacío durante 5 min. Se permite crecer a las plantas bajo las condiciones descritas antes. Se cosechan semillas y se seleccionan en placas Petri que contienen 4,4 g/l de sales MS, 1% de sacarosa, 0,5 g/l de tampón MES pH 5,7 (KOH), 0,8% de fitagar y 30 mg/l de canamicina para seleccionar transformantes. Se añaden también 500 mg/l de carbenicilina para detener el crecimiento bacteriano. Después de 5-7 días, son visibles transformantes como plantas verdes y se transfieren al mismo medio de antes pero con 1,5% de fitagar. Después de 6-10 días, se transfieren a tierra plantas con hojas verdaderas.

Se realiza análisis de plantas transgénicas para determinar integración de genes en el genoma de la planta y número de copias de genes por manchas de Southern, y se realiza transcripción de transgen por manchas de Northern mediante técnicas estándares (Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual. Segunda Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989)). Se usa un anticuerpo contra Sl-TPS1 para confirmar la traducción de transgen correcta usando manchas de Western (Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4353 (1979)). Se midió por métodos conocidos la actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa (De Virgilio, C. et al., FEBS Lett. 273: 107-110 (1990)) y el contenido de trehalosa (Neves, MJ. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994)).

La Tabla 4 muestra los fenotipos de Arabidopsis thaliana transgénica que sobreexpresan gen de trehalosa-6-P sintasa de plantas.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

4

Ejemplo 5 Síntesis en masa de trewhalosa en plantas transgénicas de patata, remolacha azucarera y caña de azúcar

La ingeniería genética ha hecho posible expresar casi cualquier gen en un organismo heterólogo. Pueden usarse plantas transgénicas como biorreactores para la producción a gran escala de compuestos de interés comercial, que sólo se obtienen normalmente en cantidades limitadas, tales como plásticos biodegradables, diferentes hidratos de carbono, polipéptidos para uso farmacéutico y enzimas para uso industrial (Goddijn, O.J.M. y Pen, J., Trends Biotech. 13: 379-387 (1995)). Se ha informado de diferentes métodos para la transformación de plantas superiores, incluyendo cultivos de gran importancia económica (Walden, R. y Wengender, R., Trends Biotech. 13: 324-331 (1995)). La transformación de tabaco (Horsch, R.B. et al., Science 227: 1229-1231 (1995)) y patata (Sheerman, S. y Bevan, M.W., Plant Cell Rep. 7:13-16 (1998)) se efectúan eficazmente usando el sistema de Agrobacterium tumefaciens y dicha técnica puede establecerse en un laboratorio por personas que dominen el estado actual de la técnica. Las construcciones para la expresión en plantas de algún gen de trehalosa-6-osfato_sintasa de plantas, preferiblemente SlTPS1, exento de su región N-terminal, pueden hacerse en un vector derivado del plásmido Ti que carezca de los genes tumorígenos de T-ADN y que contenga un marcador de selección para plantas transformadas que, por ejemplo, confiera resistencia a canamicina (Bevan, M., 1984, Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721). Además, debe escogerse un promotor apropiado dependiendo del uso que se dé a las plantas transgénicas. Puede usarse la señal de poliadenilación del gen de nopalina sintetasa en el T-ADN (Bevan, M., Barnes, W. y Chilton, M.-D., 1983, Nucl. Acids Res. 11: 369-385).

Para sobreproducir trehalosa para uso industrial, pueden usarse plantas tales como patata, caña de azúcar o remolacha azucarera. Por ejemplo, la patata almacena grandes cantidades de hidratos de carbono en el tubérculo. En términos de la biomasa de la planta, la patata representa uno de los cultivos más productivos por unidad de superficie (Johnson, V.A. y Lay, C.L., 1974, Agric. Food Chem. 22: 558-566). Hay fuertes promotores específicos para tubérculos, tales como el promotor clase-1 del gen de patatina (Bevan, M. et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4625-4638 (1986); Jefferson, R. et al., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990)) que podrían usarse para producir grandes cantidades de trehalosa. La conveniencia de usar patata, remolacha o caña de azúcar como sistemas para sobreproducir trehalosa es que estas plantas son alimento humano y, por tanto, la trehalosa aislada de ellas sería aceptada fácilmente por los consumidores. La trehalosa obtenida por sobreexpresión en plantas podría usarse para conservar biomoléculas para uso industrial, tal como enzimas de restricción y modificación (Colaço, C. et al., Bio/Technology 10: 1007-1111 (1992)), vacunas o alimentos elaborados.

Ejemplo 6 Plantas de cereales transgénicas resistentes a estrés ambiental

Los cereales constituyen el alimento básico para la nutrición mundial y podrían cultivarse en condiciones climatológicas desfavorables si pudieran producir trehalosa en respuesta al frío, calor, salinidad o sequía. Con el fin de conseguir esto, se requiere expresar algún gen de trehalosa-6-fosfato_sintasa de plantas, preferiblemente Sl-TPS1, exento de su región N-terminal bajo el control de promotores que sean inducidos por cualquiera de estos factores ambientales (Baker, S.S. et al., Plant Mol. Biol. 24: 701-713 (1994); Takahashi, T. et al., Plant J. 2: 751-761 (1992); Yamaguchi-Shinozaki, K. y Shinozaki, K., Plant Cell 6: 251-264 (1994)). La síntesis de trehalosa sólo bajo condiciones de estrés evitaría la producción continua de trehalosa (usando un promotor constitutivo) que desvíe el metabolismo de hidratos de carbono y como consecuencia podría disminuir la calidad y productividad de cereales. Hay informes sobre transformación de maíz (D'Halluin, K. et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992)), cebada (Wan, Y. y Lemaux, P.G., Plant Physiol. 104: 37-48 (1994)), trigo (Vasil, V. et al., Bio/Technology 10: 667-674 (1992)) y arroz (Shimamoto, K. et al., Nature 338: 274-276 (1989)). Esta metodología puede implementarse por una persona familiarizada con el estado actual de la técnica.

Ejemplo 7 Frutos de plantas transgénicas con una duración de almacenamiento más larga

Diferentes tipos de frutos tales como tomate, mango y plátano maduran rápidamente y tienden a pudrirse antes de llegar a los consumidores. La cosecha anticipada de frutos y su almacenamiento en refrigeración o en cámaras con un ambiente controlado se han usado tradicionalmente para evitar este problema. Sin embargo, estos métodos son caros, especialmente si los frutos serán transportados a lugares distantes. Con el fin de aumentar la duración de almacenamiento de tomate, se ha informado de un retraso de maduración usando plantas transgénicas que expresan en antisentido el gen de poligalacturonasa, que está implicado en maduración de frutos. A pesar de este retraso de maduración, existe aún el problema de que, después de un cierto tiempo, este proceso se realiza sin llegar el producto necesariamente al consumidor en buen estado.

Como alternativa a este método, se propone aquí producir trehalosa en plantas de tomate, mango y plátano transgénicas. Por ejemplo, usando un promotor específico del fruto del tomate (Bird, C.R. et al., Plant Mol. Biol. 11: 651-662 (1988)), cualquier gen de trehalosa-6-fosfato sintasa de plantas, preferiblemente Sl-TPS1, exento de su región N-terminal podría sobreexpresarse de modo que se acumule específicamente trehalosa en ese órgano. El método de transformación y regeneración para plantas de tomate (como se describe por McCormick, S. et al., Plant Cell Rep. 5: 81-84 (1986)) puede realizarse por cualquier persona que conozca el estado actual de la técnica. El tomate y otros tipos de frutos podrían cosecharse maduros y someterse después totalmente o en partes a desecación, y conservarse durante largos períodos, sin necesidad de refrigeración. Cuando se rehidrate, el fruto tendría las propiedades organolépticas normales que demanda el consumidor. En principio, la estrategia descrita antes puede implementarse para otros tipos de frutos siempre que esté disponible un sistema de regeneración y transformación para la planta en cuestión y que haya un promotor específico para el fruto adecuado.

Ejemplo 8 Aumento de la viabilidad de células, órganos o partes de la planta implicados en reproducción sexual o asexual

La producción de polen con viabilidad prolongada sería de gran ayuda en programas de crianza de plantas y en la conservación de germoplasma. De modo similar, la posibiludad de almacenamiento durante largos períodos y un aumento de la viabilidad de semillas, bulbos, tubérculos, esquejes para injertos, varas y flores tendrá un gran impacto en la crianza de plantas y la conservación de germoplasma. La presencia de trehalosa en un tejido, órgano o parte de la planta transformada hará posible conservar dicho tejido, órgano o parte a temperatura ambiente en estado deshidratado durante períodos significativamente mayores que sin trehalosa. Con el fin de conseguir este objetivo, es necesario clonar algún gen de trehalosa-6-fosfato_sintasa de plantas, preferiblemente Sl-TPS1, exento de su región N-terminal, en un vector de expresión de plantas bajo un promotor específico para el tejido o específico para el órgano y transformar la planta en cuestión con esta construcción por cualquiera de los métodos presentados conocidos por alguién familiarizado con el estado actual de la técnica. Hay informes de promotores específicos para polen (Guerrero, F.D. et al., Mol. Gen. Genet. 224: 161-168 (1990), promotores específicos para tubérculos (Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 14: 4625-4638 (1986); Jefferson, R., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990)) y promotores específicos para semillas (Colot, V. et al., EMBO J. 7: 297-302 (1988)) que podrían usarse para construir genes híbridos para la expresión de trehalosa en plantas.

Ejemplo 9 Ensayo de diferentes condiciones de estrés

Se ensayó de la siguiente manera la tolerancia de las plantas transgénicas frente a diversas condiciones de estrés.

1. Frío

Se analizaron por manchas de Southern plantas transgénicas que sobreexpresan Sl-TPS1 bajo control del promotor 35S constitutivo para verificar la inserción transgénica correcta en el genoma de la planta. La expresión del gen de Sl-TPS1 se corroboró por manchas de Northern. Se comprobó en transgénicas acumular trehalosa y no detectarse en plantas testigo, transformadas sólo con el vector. Se desarrollaron plantas de generación T2 de Arabidopsis (20 días de edad) transgénicas en macetas que contenían tierra/vermiculita, bajo 16 horas de luz/8 horas de oscuridad a 24ºC en una cámara de crecimiento bajo condiciones de buen riego. Las plantas testigo y que sintetizaban trehalosa se transfirieron a una cámara de crecimiento a 4ºC durante 10 días con luz constante y se volvieron a 24ºC durante 2 días. Otros grupos de plantas se dejaron a 24ºC. Se estimó visualmente el daño en plantas tratadas con frío (clorosis, deterioro de hojas y muerte) y midiendo la fotoinhibición de la fotosíntesis (Murata, N. et al., Nature 356: 710-713 (1992)) usando un aparato IRGA (analizador de gas infrarrojo). También se midió el retardo en el crecimiento en el tamaño de hojas y la altura de la planta después de comparar las plantas tratadas con frío con las no tratadas.

2. Congelación

Se determinó la tolerancia a la congelación en plantas testigo tratadas con frío y que sintetizan trehalosa, obtenidas como se ha descrito previamente, por el ensayo de pérdida de electrólito. Se congelaron a diversas temperaturas subcero hojas cortadas y, después de descongelar, se estimó el daño celular debido a lesiones de membrana midiendo la pérdida de iones de los tejidos usando un medidor de conductividad (Jaglo-Ottosen, K.R. et al., Science 280: 104-106 (1998).

3. Calor

Se desarrollaron plantas de generación T2 de Arabidopsis (20 días de edad) transgénicas, testigo y que sintetizan trehalosa en macetas que contenían tierra/vermiculita, bajo 16 horas de luz/8 horas de oscuridad a 24ºC en una cámara de crecimiento bajo condiciones de buen riego. Se preacondicionaron plantas después de incubar durante dos horas a 35ºC y se sometieron después a 1 hora de estrés por calor a diversas temperaturas variables de 46 a 56ºC para cada tratamiento independiente. Se devolvieron las plantas a 24ºC durante 5 días. Se determinó visualmente el daño (clorosis, deterioro de hojas y muerte). Pueden realizarse ensayos similares usando plántulas desarrolladas durante 7 días a 24ºC en papel de filtro humedecido dentro de placas Petri (Lee, J.H. et al., Plant J. 8: 603-612 (1995)).

4. Desecación

Se desarrollaron plantas de generación T2 de Arabidopsis (20 días de edad) transgénicas, testigo y que sintetizan trehalosa en macetas que contenían tierra/vermiculita, bajo 16 horas de luz/8 horas de oscuridad a 24ºC en una cámara de crecimiento bajo condiciones de buen riego. Se impuso estrés por sequía parando el riego durante varios días hasta que se marchitaron las hojas, y se volvieron a regar después las plantas. Las testigo no se recuperaron, mientras que las plantas que producían trehalosa continuaron creciendo normalmente. Se secaron al aire también hojas cortadas con una humedad relativa del 20%. Se midió el peso fresco durante un período de 48 horas. Las plantas que producen trehalosa pierden menos peso (Holmstrom, K.-O. et al., Nature 379: 683-684 (1996)).

5. Estrés osmótico

Se desarrollaron plantas de generación T2 de Arabidopsis (20 días de edad) transgénicas, testigo y que sintetizan trehalosa en macetas que contenían tierra/vermiculita, bajo 16 horas de luz/8 horas de oscuridad a 24ºC en una cámara de crecimiento bajo condiciones de buen riego. Se irrigaron grupos independientes de plantas con diversas concentraciones de NaCl (100-300 mM) o PEG (5 o 10%) durante 1-3 semanas. Se evaluó el crecimiento de las plantas midiendo el porcentaje de cambio de altura y peso fresco (Tarczynski, M.C. et al., Science 259: 508-510 (1993)).

6. Almacenamiento

El gen de TPS de plantas se clonará bajo el control de, por ejemplo, el promotor E8 específico para fruto del tomate, que es inducido por etileno, y se alcanza su máxima actividad en frutos maduros (Lincoln, J.E. & Fischer, R.L., Mol. Gen. Genet. 212: 71-75 (1988); Good, X. et al., Plant Mol. Biol. 26: 781-790 (1994); Tieman, D. et al., Plant Cell 4: 667-679 (1992)) en vector pBIN19 que contiene un extremo 3' NOSpA (Guilley, H. et al., Cell 21: 285-294 (1982)) y (Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 11: 369-385 (1983)). Los vectores se movilizarán a Agrobacterium tumefaciens mediante conjugación triparental. La transformación del tomate se realizará por métodos bien establecidos (Tieman, D. et al., Plant Cell 4: 667-679 (1992)). El análisis de frutos transgénicos se realizará usando técnicas diferentes. Determinación de integración de cADN de Sl-TPS1 en el genoma de plantas por geles de Southern genómicos. Determinación de la transcripción de Sl-TPS1 por manchas de Northern y expresión de proteína de Sl-TPS1 por manchas de Western. La medición de la actividad de la enzima Sl-TPS1 y el contenido de trehalosa se realizarán por técnicas estándares (De Virgilio, C. et al., FEBS Lett. 273: 107-110 (1990) y (Neves, MJ. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994)). Se analiza la duración de almacenamiento en tomates testigo y que producen trehalosa considerando varios parámetros de maduración, tales como: relación de ablandamiento, producción de etileno y calidad del fruto (textura, color, contenido de azúcar, tamaño) durante un período de varias semanas.

Ejemplo 10 Ensayo de trehalosa-6-fosfato 1.1 Ensayos de trehalosa-6-fosfato existente

Para estudiar la importancia de Tps1 y más específicamente de su producto trehalosa-6-fosfato, es esencial ser capaces de medir los niveles de Tre6P que están presentes efectivamente en el citosol. Se han descrito hasta ahora tres métodos para determinar niveles de Tre6P. En un primer método (Meleiro et al., 1993, Analytical Biochemistry 213, 171-2) se extrajo Tre6P mediante una combinación de extracción con TCA, seguido por extracciones con éter, precipitaciones con acetato de bario y cromatografía de intercambio aniónico. El Tre6P se desfosforiló mediante fosfatasa alcalina, se hidrolizó en dos moléculas de glucosa por trehalasa y se detectó finalmente la glucosa por el método de glucosa oxidasa-peroxidasa. Este método se ha desarrollado para evaluar un procedimiento para producir y purificar grandes cantidades de Tre6P. Puesto que los niveles de Tre6P presentados en células de levadura son más bajos que los niveles de glucosa, trehalosa y Glu6P, este método tendría un efecto de fondo enorme y falta de sensibilidad.

Un segundo método usa cromatografía líquida a alta presión (HPLC) para detectar y cuantificar Tre6P (De Virgilio et al., 1993, Eur J Biochem 212, 315-23). Con este método era posible cuantificar altos niveles de Tre6P en mutantes de tps2\Delta después de un choque térmico (Reinders et al., 1997, Mol Microbiol 24, 687-95) y detectar un aumento transitorio de los niveles de Tre6P después de la adición de glucosa a células de levadura de tipo natural desreprimidas (Hohmann et al., 1996, Mol Microbiol 20, 981-91). Tenía un límite de detección de alrededor de Tre6P 200 \muM. Éste es aproximadamente el nivel de estado de régimen que se ha indicado en células en crecimiento exponencial y en fase estacionaria (Blazquez et al., 1993, FEBS Lett 329, 51-4). La sensibilidad de este método no permite una cuantificación fiable de las concentraciones presentes en cepas de levadura normales o cepas afectadas en síntesis de Tre6P.

Un tercer método se basa en la observación de que Tre6P inhibe la actividad de hexoquinasa de levadura in vitro (Blazquez et al., 1994, FEMS Microbiol Lett 121, 223-7). El nivel de esta inhibición sirve como medida del contenido de Tre6P de los extractos. La actividad de hexoquinasa se mide determinando la velocidad de formación de uno de sus productos, fructosa-6-fosfato (Fru6P). El Tre6P intracelular en células estacionarias y que crecen exponencialmente se estimó que era aproximadamente 200 \muM. Los autores observaron también que este efecto inhibidor de Tre6P en la actividad de hexoquinasa era suprimido por la presencia de glucosa. Puesto que en ciertas condiciones pueden estar presentes en los extractos altas concentraciones de glucosa y en general otros compuestos que interfieren, este método tampoco es adecuado.

1.2 Principios del nuevo método

El método de la invención tiene como objetivo principal ser más sensible y más fiable que los métodos existentes. Se basa en la enzima fosfotrehalasa de Bacillus subtilis que se codifica por el gen de treA. Esta enzima está relacionada funcionalmente con el sistema de PTS bacteriano, e hidroliza Tre6P en glucosa y Glu6P (Helfert et al., 1995, Mol Microbiol 16, 111-120; Rimmele & Boos, 1994, J Bacteriol 176, 5654-64). Midiendo la glucosa producida en esta reacción, puede calcularse la cantidad inicial de Tre6P. No se usa Glu6P para este propósito porque este compuesto está presente a menudo en grandes cantidades en células de levadura. Es difícil separarlo de Tre6P, mientras que la glucosa presente originalmente en los extractos puede separarse fácilmente de los azúcar fosfatos por cromatografía de intercambio aniónico (Figura 16).

1.3 Purificación de la enzima fosfotrehalasa de B. subtilis

La enzima fosfotrehalasa se ha purificado y caracterizado por el grupo de M.K. Dahl (Gotsche & Dahl, 1995, J Bacteriol 177, 2721-6; (Helfert et al., 1995, supra). Este grupo proporcionó el plásmido pSG2 con el gen de treA expresado constitutivamente detrás del promotor fuerte degO36 de B. subtilis.

Para obtener alta expresión estable, el gen se clonó en el vector pCYB1 (New England Biolabs) detrás del promotor fuere de tac inducible de IPTG. El gen de treA se multiplicó por PCR con los cebadores CVV5

(TGGTGGGAT'TA,AT ATGAAAACAGAACAAACGCCATGGTGG) y CVV6

(TTAACA GCTCTTCC'GCA,AACGATAAACAATGGACTCATATGGGCG), introduciendo respectivamente un lugar de restricción de AseI y uno de SapI en cada extremo del producto de PCR y se clonó en el plásmido pCYB1 y denominó pCVV1 (Figura 7). ' y , indican el lugar en el que se empalma la enzima de restricción.

Una comparación de la actividad de fosfotrehalasa de las cepas transformadas con el plásmido original pSG2 (EcVV1) o el nuevo pCVV1 (EcVV3) mostró que esta última cepa contenía 10 vreces más actividad que la cepa con el plásmido pSG2 (Figura 17).

Estas células EcVV3 se desarrollaron durante la noche en 4 ml de medio LB-ampicilina. Al día siguiente, este cultivo se usó para inocular 100 ml de LB ampicilina y se dejó crecer de nuevo durante 3 horas, tras lo que se indujo expresión con IPTG (0,5 mM) y se incubó el cultivo durante otras 3 horas a 37ºC.

Se centrifugaron las células 10 minutos a 4000 rpm y se resuspendieron en 30 ml de tampón A (Bis-Tris 25 mM pH 7, KCl 10 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM). Se rompieron las células haciendo pasar las células resuspendidas dos veces a través de una prensa francesa. Se aclaró después el extracto crudo por ultracentrifugación durante 30 minutos a 35.000 rpm, y se hizo pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 \mum.

La cromatografía de intercambio aniónico se realizó con un gradiente lineal de 100% de tampón A a 50% de tampón B (Bis-Tris 25 mM pH 7, KCl 10 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 1 M) en 20 volúmenes de columna en una columna MonoQ HR5/5. Se recogieron fracciones de 500 \mul. Se midió la actividad hidrolizante de PNPG de cada fracción y las dos fracciones con la mayor actividad se agruparon y concentraron hasta 200 \mul antes de la filtración en gel con una columna Vivaspin (Vivascience). Para la filtración en gel, se usó una solución isocrática con 10% de tampón B en una columna Superdex75. Se agruparon las dos fracciones de 500 \mul con la mayor actividad y se concentraron nuevamente hasta 400 \mul y se guardaron en partes alícuotas a -30ºC. Ambas columnas se hicieron funcionar en un sistema ÄKTA-FPLC (Pharmacia).

La purificación realizada de esta manera dio un aumento de 4,5 veces de la actividad específica con una recuperación del 34%. El análisis de SDS-PAGE con coloración de azul Coomassie mostró ya una banda de proteína de sobreexpresión enorme del tamaño esperado. No eran visibles otras bandas en las fracciones purificadas finales con 10 \mug de proteína por pista.

1.4 Muestreo del cultivo de levadura

Se tomaron muestras pulverizando 3 ml de una suspensión de células en 10m ml de metanol del 60% a -40ºC. Esto detiene inmediatamente el metabolismo celular y permite la determinación de los metabolitos intracelulares en función del tiempo tras una manipulación experimental, por ejemplo, añadiendo glucosa a células desreprimidas (de Koning & van Dam, 1992, Anal Biochem 204, 118-23).

1.5 Extracción de metabolitos

La extracción de metabolitos de las células congeladas se realizó usando extracción con ácido perclórico.

1.6 La primera cromatografía de intercambio aniónico

Para separar la glucosa y trehalosa del Tre6P presente en los extractos de células, se seleccionó el intercambiador de aniones NH2-SPE débiles (International Sorbent Technology, R.U.).

Las columnas se llenaron con 500 mg de sorbente resuspendidos en 3 ml de metanol del 100% y se enjuagaron con 3 ml de metanol del 100%. Se unió a ello un anión débil equilibrando la columna con ácido acético 0,5 M y se retiró por enjuague el exceso de ácido de la columna con 2 veces 3 ml de agua MilliQ. Se aplicó la muestra y se enjuagó la muestra unida con 3 ml de metanol del 20% para eliminar la unión no específica. Se eluyeron los aniones con una solución de amoníaco 2,5 M pH 12,5. Cuando se usaron 250 mg de sorbente por 100 mg de células extraídas no hubo riesgo de sobrebargar la columna. La sal no interfirió significativamente con la determinación de glucosa. Los extractos eluidos se evaporaron sin pérdida de Tre6P.

1.7 Las condiciones de reacción de fosfotrehalasa

Puesto que la enzima era inestable al pH óptimo indicado de 4,5, se escogió un pH de 7 más fisiológico para realizar la incubación. El tampón de incubación era un tampón Bis-Tris 50 mM pH 7. La temperatura de incubación fue 37ºC. Se añadieron 2000 U de fosfotrehalasa y se incubaron las muestras a 37ºC durante 2 horas. Una unidad era la cantidad de enzima que hidrolizaba 1 nmol de Tre6P por minuto en las condiciones mencionadas.

1.8 La segunda cromatografía de intercambio aniónico

Para separar la glucosa que se produjo en la reacción de fosfotrehalasa de los otros compuestos celulares aniónicos, se realizó una segunda cromatografía de intercambio aniónico de la misma forma que la primera. Esta vez el flujo a través que no se une a la columna y que contiene glucosa se recuperó y concentró por secado bajo vacío.

1.9 El ensayo de glucosa

Las muestras de glucosa secas se redisolvieron en 250 \mul de tampón Bis-Tris 50 mM pH 7. Se determinó la concentración de glucosa de cada muestra en 200 \mul de muestra no diluida y en una dilución de 1/5 y 1/25. En una placa de microtitulación, se añadieron a un volumen de muestra de 200 \mul, 20 \mul de una mezcla de reacción que contiene 15 unidades de glucosa oxidasa, 10 unidades de peroxidasa y 100 \mug de orto-dianisidina. Esta placa se incubó a 37ºC durante 45 minutos y se detuvieron después las reacciones añadiendo 40 \mul de ácido sulfúrico del 56%. Se midió la absorbancia con una longitud de onda de 530 nm.

1.10 Recuperación y reproducibilidad

La recuperación del procedimiento de extracción con ácido perclórico es el 57%. La recuperación del ensayo de Tre6P completo es el 25%. El límite de detección del método era 100 \muM y las líneas estándares de Tre6P son lineales en el intervalo relevante fisiológicamente (Figura 8). Los estándares de Tre6P se hicieron añadiendo cantidades conocidas de Tre6P a células de la cepa de tps1\Delta que carece de la Tre6P sintasa, antes de la extracción con ácido perclórico. El error típico en la pendiente y ordenada en el orígen de 4 líneas estándares independientes era respectivamente 2 y 9%.

Las concentraciones de trehalosa-6-fosfato se midieron en cepas de levadura que contenían los alelos de TPS1 de plantas de longitud completa y con supresión N-terminal. Las cepas se desarrollaron hasta fase exponencial o hasta fase estacionaria en medio mínimo que contenía galactosa o glucosa. Para este xperimento, se usaron fondos de tps1\Deltatps2\Delta porque el nivel de trehalosa-6-P en fondos de tps1\Delta es demasiado bajo para ser medido. Las cepas que se usaron fueron:

JT6308

1\Delta2\Delta + pSAL4

PVD44

1\Delta2\Delta + pSAL4/Sc TPS1

JY6309

1\Delta2\Delta + pSAL4/Sl TPS1

PVD43

1\Delta2\Delta + pSAL4/\DeltaN Sl TPS1

PVD138

1\Delta2\Delta + pSAL6/At TPS1

JT20050

1\Delta2\Delta + pSAL6/\DeltaN At TPS1

PVD150

2\Delta + pRS6 (plásmido vacío con marcador HIS3)

"1\Delta" significa "tps1\Delta", "2\Delta" significa "tps2\Delta".

Después de recoger las células de levadura, se hicieron extractos como se describe en el Ejemplo 10 y se midieron las concentraciones de trehalosa-6-P. Los resultados se muestran en la Figura 18.

Hay cuatro veces menos trehalosa-6-fosfato en los extractos preparados a partir de las cepas que contienen los genes de TPS1 de plantas en comparación con la cepa testigo que sobreexpresa el gen de TPS1 de levadura. Este nivel más bajo de trehalosa-6-fosfato podría explicar por qué hay aún desregulación de la afluencia de glucosa en glicólisis en estas cepas (ejemplo 12). Esta desregulación de la afluencia de glucosa era similar para cepas que contienen los alelos de TPS de plantas de longitud completa o con supresión N-terminal., y esto se corresponde con los resultados que se han obtenido aquí. No hay diferencia de niveles de trehalosa-6-fosfato entre cepas que contienen los alelos de longitud completa o con supresión N-terminal.

Ejemplo 11 Fusiones quiméricas de dominios de TPS y TPP

Para generar una trayectoria enzimática más eficaz implicada en la biosíntesis de trehalosa, se creó una serie de fusiones de enzimas quiméricas entre dominios de TPS y TPP de TPS1 y TPS2 de A. thaliana o S. cerevisiae. Como se muestra en la Figura 13, estas cuatro fusiones consisten en: un fragmento de ADN de 1337 pb de AtTPS1 (\DeltaNAtTPS1) que codifica una proteína truncada en el término N (carente de sus primeros 100 aminoácidos) de 442 aminoácidos, obtenida por PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 1 min, 52ºC, 1 min, 72ºC, 1,5 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer) con oligonucleótidos (5'-CATGCC ATG GCTTAT-AATAGGCAACGAC-TACTTGTAGTG-3', subrayado lugar de NcoI y negrilla codón de iniciación) y (5'-CGGGATCCAGCTGTCATGTTTAGGGCTTGTCC-3', subrayado lugar de BamHI), fusionados a un fragmento de ADN de 1138 pb de AtTPPB que codifica la proteína de longitud completa de 374 aminoácidos obtenida por PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 1 min, 52ºC, 1 min, 72ºC, 1,5 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer) con oligonucleótidos (5'-CGGGATCCACTAACCAGAATGTCA
TCG-3', subrayado lugar de BamHI) y(5'-GGGGTACC TCACTCTTCTCCCACTGTCTTCC-3', subrayado lugar de KpnI y negrilla codón de detención).

Una segunda fusión consiste en \DeltaNAtTPS1 fusionado a un fragmento de ADN de 1358 pb de ScTPS2 que codifica 397 aminoácidos de su término C, obtenido por PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 1 min, 50ºC, 1 min, 72ºC, 1,5 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer) con oligonucleótidos (5'-CGGGATCCGCTAAATCT-ATTAACATGG-3', subrayado lugar de BamHI) y (5'-CGGGGTACCATGG-TGGGTTGAGAC-3', subrayado lugar de KpnI).

Una tercera construcción condujo a una fusión entre un fragmento de ADN de 1531 pb de ScTPS1 que codifica una proteína de 492 aminoácidos, obtenida por PCR (94ºC, 3 min, 1 ciclo; 94ºC, 1 min, 52ºC, 1 min, 72ºC, 1,5 min, 40 ciclos; 72ºC, 10 min, 1 ciclo) usando polimerasa de ADN Expand High-fidelity (Boehringer) con oligonucleótidos (5'-CCGCTCGAGGGTACTC-ACATACAGAC-3', subrayado lugar de XhoI) y (5'-CGGGATCCGGTGGCA-GAGGAG
CTTGTTGAGC-3', subrayado lugar de BamHI) y AtTTPB.

La última fusión se hizo entre fragmentos de ADN de ScTPS1 y ScTPS2 obtenidos como se ha descrito antes.

Los fragmentos de PCR se digirieron con enzimas de restricción apropiadas (Figura 13) y se subclonaron en vector pRS6. Se transformaron cepas mutantes de tps1\Delta, tps2\Delta y tps1\Delta tps2\Delta de levadura y seleccionaron en SDGal (-his). Se ensayó complementación en SDGlc (medio mínimo -his) y crecimiento a 38,3ºC.

Ejemplo 12 La expresión en cepas de tps1\Delta de levadura, de genes de TPS1 de plantas con supresión N-terminal, restaura el crecimiento en glucosa pero no suprime hiperacumulación de azúcar fosfatos

La supresión de TPS1 en S. cerevisiae produce un fenotipo pleiotrópico (Van Aelst et al., Mol. Microbiol., 8, 927-943, 1993). Uno de los fenotipos es que tal cepa no puede crecer más en azúcares fermentables rápidamente. No se ha clarificado aún por qué cepas de tps1\Delta no pueden crecer en glucosa. Se han propuesto tres hipótesis diferentes (Hohmann y Thevelein, Trends in Biol. Sciences, 20, 3-10, 1995). Cuando se cambian cepas de tps1\Delta de un medio que contiene glicerol a uno con glucosa, hay una acumulación rápida de azúcar fosfatos y una caída rápida de la concentración de ATP. Aparentemente, el gen de TPS1 tiene una función en el control de la afluencia de glucosa a glicólisis. Puesto que el transporte y la fosforilación están acoplados, todo el azúcar que entra en la célula es fosforilado. Reducir la actividad de Hxk2 puede suprimir el fenotipo de defecto de crecimiento de cepas de tps1\Delta en glucosa y fructosa (Hohmann et al., Current genetics 23, 281-289, 1993). Estudios in vitro han indicado claramente que el producto de la proteína de Tps1, trehalosa-6-fosfato, inhibe la actividad de Hxk2 y, como tal, podría controlar el flujo de glucosa a glicólisis.

Cuando el homólogo de S. lepidophylla de TPS1 se expresó en levadura, se ve una clara diferencia de crecimiento en medio que contiene glucosa entre el clon de longitud completa y la construcción con supresión N-terminal. Las cepas de tps1\Delta transformadas con el Sl TPS1 de longitud completa bajo el control de promotor CUP1 no crecen en glucosa. La expresión en una cepa de tps1\Delta de una construcción en la que las primeras 300 pb que codifican los primeros 100 aminoácidos de la proteína de Sl TPS1 están suprimidas produce crecimiento en glucosa. Así, aparentemente, el clon de longitud completa no puede resolver el problema de afluencia de glucosa, mientras que la supresión N-terminal es capaz de controlar la afluencia de glucosa.

Para ensayar esto, se realizó un experimento en el que se midió la concentración de los primeros metabolitos en glicólisis. Se usaron las siguientes cepas:

PVD72

Tps1\Delta + pSAL4

PVD14

Tps1\Delta + pSAL4/Sc TPS1

PVD73

Tps1\Delta + pSAL4/Sl TPS1

PVD15

Tps1\Delta + pSAL4/\DeltaN Sl TPS1

Para la determinación de los metabolitos glicolíticos, se desarrollaron células en medio SDglicerol hasta fase exponencial. Se cosecharon células por centrifugación. El glóbulo se lavó una vez, se resuspendió y se incubó después en medio YP a 30ºC. Se añadió glucosa hasta una concentración final de 100 mM y se añadió CuSO_{4} hasta una concentración final de 100 \muM.

Antes y después de la adición de glucosa, se tomaron muestras a los intervalos de tiempo indicados y se apagaron inmediatamente en metanol del 60% a -40ºC.

La determinación de los metabolitos glicolíticos se realizó en estas muestras esencialmente como se ha descrito por de Koning y van Dam (Anal. Biochem. 204, 118-123, 1992). Usando la cantidad total de proteína de la muestra como se determina según Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193, 265-275, 1951), y la presunción de un volumen citosólico de levadura de 12 \mul por mg de proteína, se calcularon las concentraciones citosólicas en mM. La Figura 14 muestra el resultado de un experimento representativo.

Los resultados indican claramente que en este corto período tras la adición de glucosa, no hay diferencias entre las concentraciones de metabolitos del gen de TPS1 de S. lepidophylla de longitud completa y con supresión N-terminal. Hay una clara hiperacumulación de azúcar fosfatos tras la adición de glucosa, que es similar a la que puede verse para la cepa de tps1\Delta.

Estos resultados con las construcciones con supresión N-terminal muestran que la acumulación de azúcar fosfatos no está relacionada con el hecho de que las células de levadura puedan o no crecer en glucosa. Esto significa que la parte N-terminal es importante para el control de la afluencia de glucosa a glicólisis. Implica también que puede usarse una cepa de tps1\Delta que contenga los genes de \DeltaN Sl o \DeltaN At TPS1 como herramienta para aumentar el flujo total a través de glicólisis. Esta cepa crece perfectamente en glicólisis, pero se ve todavía una hiperacumulación de metabolitos en la parte superior de la glicólisis. La sobreexpresión de las enzimas aguas abajo en glicólisis produce un flujo más alto.

Puesto que la concentración de metabolitos se midió sólo durante un corto período de tiempo tras la adición de glucosa, se hizo otro experimento en el que se midió la concentración de metabolitos durante el crecimiento exponencial y durante la fase estacionaria. Estos resultados se muestran en la Figura 15.

Estos datos confirman los resultados obtenidos en el primer experimento. Hay una hiperacumulación de azúcar fosfatos en la cepa de tps1\Delta transformada con la construcción con supresión N-terminal. De las Figuras 14 y 15 resulta que la diferencia entre la cepa de tps1\Delta y la cepa de tps1\Delta que contiene el plásmido de expresión de \DeltaN Sl TPS1 es el nivel de ATP. Mientras que el nivel de ATP en la cepa de tps1\Delta cae a cero, éste no es el caso en las otras cepas. El nivel de ATP que se deja es aparentemente suficiente para crecer en glucosa.

Claims (22)

1. Un método para preparar un organismo eucariota no humano que tiene actividad de trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS) aumentada con relación al organismo eucariota de tipo natural correspondiente, cuyo método comprende las etapas de:

a.

proporcionar una proteína de TPS de plantas;

b.

alinear la proteína de TPS con una proteína de levadura correspondiente para determinar el dominio de la proteína de TPS asociado con una acción inhibidora en la actividad de TPS, en el que dicho dominio inhibidor corresponde a la parte de la proteína de TPS que se extiende más allá del término N de la proteína de levadura;

c.

suprimir la acción del dominio inhibidor mutagenizando o truncando la parte N-terminal de la proteína de TPS;

d.

clonar un gen correspondiente a la proteína modificada así en un vector de expresión bajo el control de un promotor constitutivo, inducible y/o específico para el órgano; y

e.

transformar una célula o tejido eucariota de un organismo eucariota con el vector de expresión obtenido así.

2. El método según la reivindicación 1, en el que al menos el dominio inhibidor entero se suprime de la proteína de TPS.

3. Un método según las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha célula o tejido eucariota es una célula o tejido de plantas y en el que dicha transformación es seguida por regeneración de una planta completa a partir de dicha célula o tejido de plantas transformados.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que dicha planta es una planta de cultivo.

5. Un método según la reivindicación 3, en el que dicha planta se selecciona del grupo constituido por arroz, manzana, remolacha azucarera, girasol (Helianthus annuus), tabaco (Nicotiana tabacum) y soja (Glycine max).

6. Un método según las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho organismo eucariota es un hongo.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que dicho hongo se selecciona del grupo constituido por Aspergillus niger, Agaricus bisporis, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis y levaduras metilotróficas.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que el organismo eucariota no humano se selecciona entre cultivos de células de mamíferos e invertebrados usados para producir proteínas y pequeñas moléculas, células de invertebrados usadas para expresión de baculovirus.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho organismo eucariota tiene actividad de síntesis de trehalosa aumentada con relación a organismos eucariotas correspondientes que no tienen dicho TPS modificado.

10. Un método para fabricar una proteína de Trehalosa Fosfato Sintasa (TPS) modificada, que comprende las etapas de:

a.

proporcionar una proteína de TPS de plantas;

b.

alinear la proteína de TPS con una proteína de levadura correspondiente para determinar el dominio de la proteína de TPS asociado con una acción inhibidora en la actividad de TPS, en el que dicho dominio inhibidor corresponde a la parte de la proteína de TPS que se extiende más allá del término N de la proteína de levadura;

c.

suprimir la acción del dominio inhibidor mutagenizando o truncando la parte N-terminal de la proteína de TPS, preferiblemente suprimiendo al menos el dominio inhibidor entero.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha proteína de TPS es de una planta.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que dicha planta se selecciona del grupo constituido por Selaginella lepidophylla, Arabidopsis thaliana, arroz, manzana, remolacha azucarera, girasol (Helianthus annuus), tabaco (Nicotiana tabacum) y soja (Glycine max).

13. Un organismo eucariota obtenible por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho organismo eucaiota comprende un vector de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de TPS que tiene un dominio inhibidor suprimido como se define en la reivindicación 1, y cuyo organismo eucariota tiene una actividad catalítica de trehalosa-6-fosfato sintasa aumentada.

14. Una proteína de Trehalosa Fofato Sintasa (TPS) aislada con un dominio inhibidor suprimido como se define en la reivindicación 1 y opcionalmente además una truncación C-terminal, en la que dicha proteína de TPS tiene actividad catalítica aumentada con relación a dicha proteína de TPS sin un dominio inhibidor suprimido como se define en la reivindicación 1.

15. Una fusión quimérica de una proteína de TPS y una de TPP, en la que dicha fusión es entre:

(i)

un dominio de TPS con un dominio inhibidor suprimido como se define en la reivindicación 1 y una proteína de TPP de longitud completa;

(ii)

un dominio de TPS con un dominio inhibidor suprimido como se define en la reivindicación 1 y un dominio de TPP;

(iii)

una proteína de TPS de longitud completa con un dominio inhibidor suprimido como se define en la reivindicación 1 y una proteína de TPP de longitud completa; o

(iv)

una proteína de TPS de longitud completa con un dominio inhibidor suprimido como se define en la reivindicación 1 y un dominio de TPP.

16. Plantas que tienen una tolerancia al estrés aumentada y/o una productividad fotosintética aumentada y/o una repartición de carbono mejorada en la planta completa o en partes espedcíficas de la planta y/o una alteración morfológica o de desarrollo y que albergan en su genoma un gen de TPS modificado específicamente que codifica una proteína según la reivindicación 14.

17. Una planta según la reivindiación 16, obtenible por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. Semillas de una planta según las reivindicaciones 16 o 17, que albergan en su genoma un gen de TPS modificado específicamente que codifica una proteína según la reivindicación 14.

19. Plantas obtenidas de semillas según la reivindicación 18, que albergan en su genoma un gen de TPS modificado específicamente que codifica una proteína según la reivindicación 14.

20. Progenie de las plantas según una cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 o 19, que albergan en su genoma un gen de TPS modificado específicamente que codifica una proteína según la reivindicación 14.

21. Hongos que tienen una capacidad de fermentación mejorada y que albergan en su genoma un gen de TPS modificado específicamente que codifica una proteína según la reivindicación 14.

22. Hongos que tienen una capacidad de fermentación mejorada y que albergan en su genoma un gen de TPS modificado específicamente que codifica una proteína según la reivindicación 14.