DE69233380T2

DE69233380T2 - Transgene pflanzen mit geändertem polyolgehalt

Info

Publication number: DE69233380T2
Application number: DE69233380T
Authority: DE
Inventors: C. Mitchell TARCZYNSKI; G. Richard JENSEN; J. Hans BOHNERT; M. Daniel VERNON
Original assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona; University of Arizona
Current assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona; University of Arizona
Priority date: 1991-05-09
Filing date: 1992-05-08
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2012-05-09
Also published as: ES2225817T3; US5563324A; ATE271131T1; EP0538461A1; EP0538461A4; DE69233380D1; EP0538461B1; CA2087036A1; AU2015992A; WO1992019731A1

Description

Kurze Zusammenfassung der Offenbarung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den allgemeinen Bereich der genetischen Manipulation von höheren Pflanzen und bezieht sich vor allem auf die Schaffung von transgenen Pflanzen, die verändert wurden, um erhöhte Gehalte von polyhydroxylierten Zuckern oder Polyolen zu bilden.
Hintergrund der Erfindung
Eine der Einsatzmöglichkeiten der modernen Biotechnologie war die Ermöglichung der genetischen Manipulation von höheren Pflanzen. Mit dem Begriff genetische Manipulation, wie er hier verwendet wird, wird beabsichtigt, die Einfügung von einem oder mehreren fremden, für gewöhnlich chimären Genen, die entweder nicht natürlicherweise in dem Pflanzengenom vorhanden sind oder nicht in dieser Form in der Pflanze vorkommen, in das vererbbare, genetische Material einer Pflanze zu beschreiben. Die transformierte Pflanze selber und ihre Nachkommen, die das eingefügte Gen tragen, werden als transgene Pflanzen bezeichnet, und das eingefügte Gen kann manchmal als ein Transgen bezeichnet werden. Es ist wichtig, dass das eingefügte fremde Gen durch Nachkommenschaft der ursprünglich manipulierten Pflanzen durch normale sexuelle Mendel'sche Vererbung vererbbar ist, in anderen Worten, dass die Keimlinie der Pflanze transformiert ist.
Das erste, und immer noch am weitesten verbreitete Verfahren der genetischen Manipulation von Pflanzen basiert auf der Fähigkeit eines natürlichen pflanzlichen Pathogens, Agrobacterium tumefaciens, einen Teil seiner Plasmid-DNA, die als seine T-DNA (Transfer-DNA) bezeichnet wird, in eine Wirtspflanze einzuführen. Das Agrobacterium-Plasmid, das für diese Fähigkeit verantwortlich ist, ist als "Ti"-Plasmid, für Tumorinduzierend, bekannt, da es die natürliche Funktion des Plasmids ist, in infizierten Pflanzenzellen einen onkogenen Prozess zu induzieren, durch den sich die Bakterien ernähren. Wissenschaftler haben gelernt, wie die onkogene Fähigkeit aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium entfernt, oder dieses "entwaffnet" werden kann, und dann in die T-DNA des entwaffneten Ti-Plasmids das fremde Gen einzufügen, das in die Pflanze eingeführt werden soll. Dem das veränderte Ti-Plasmid tragende Agrobacterium wird dann ermöglicht, anfällige Pflanzenzellen zu infizieren, und sein Transferprozess überträgt das fremde Gen bzw. die fremden Gene in der T-DNA in die Pflanzenzellen. Wenn ein selektierbarer Resistenzmarker, d. h. ein Transgen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum oder Herbizid, gegen das die Pflanze anfällig ist, verleiht, in das Ti-Plasmid eingefügt wird, kann das Selektionsagens verwendet werden, um auf die transformierten Pflanzenzellen zu selektieren. Die transformierten Zellen können dann zu vollständigen, sexuell reifen Pflanzen regeneriert werden.
Die Techniken der Agrobakterium-vermittelten Pflanzentransformation wurden auf eine große Anzahl von Pflanzen angewendet, einschließlich Tabak, Tomate, Petunie, Baumwolle, Karotte, Sojabohne und Walnuss. Die Technik kann jedoch in einigen Pflanzen wegen Einschränkungen im Wirtsbereich von Agrobacterium-Arten (vor allem bezüglich dikotyler Pflanzen) und dem Fehlen von Regenerationsprotokollen für einige Pflanzen eingeschränkt sein. Andere Ansätze ermöglichten die genetische Manipulation der meisten der wichtigen Pflanzenarten, die einer Agrobacterium-Transformation nicht zugänglich sind. Es ist möglich, Gene durch die einen elektrischen Schock um fassende Elektroporation, oder durch chemische Zellwanddurchlöcherung bei Verwendung von Polyethylenglykol in einzelne Pflanzenzellen einzuführen, und diese Techniken wurden verwendet, um Protoplasten von Reis und anderen Cerealien, die keine Agrobacterium-Wirte sind, zu transformieren. Dieser Ansatz ist für Arten geeignet, die aus Protoplasten regeneriert werden können. Eine andere kürzlich entwickelte Technik nutzt mit DNA bedeckte Mikroprojektile, die physisch in Pflanzenzellen hinein beschleunigt werden. Von dieser „beschleunigte Partikel-Transformationstechnik" wurde berichtet, dass sie mit Gewebekulturen von Tabak, mit Gewebekulturen von Mais und Baumwolle und mit meristematischen Gewebe von Sojabohne, Pappel und Baumwolle funktioniert.
Im Allgemeinen sind transgene Pflanzen, obwohl sie sich ein wenig von natürlichen Pflanzen der Art unterscheiden, generell nicht vollständig verändert. Die transgene Pflanze kann ein oder mehrere, manchmal viele Kopien eines eingefügten fremden Gens tragen. Die eingefügten Gene können oft exprimiert werden, obwohl für die Gene, die exprimiert werden, die Stärke der Expression abhängig von Variablen wie der Kopienzahl, dem Ort der Insertion (von dem angenommen wird, dass er zufällig ist), der Stärke von Promotor oder Enhancer, und der Beschaffenheit der kodierenden Sequenz variieren wird. Da Kopienzahl und Insertionsstelle mit jedem Transformationsereignis variieren, ist es gewöhnlich der Fall, dass verschiedene unabhängige transgene Pflanzenfamilien oder -linien erzeugt werden, die etwas verschiedene Expressionseigenschaften haben können. Im Allgemeinen scheint es keine grundlegenden Unterschiede zwischen den transgenen Pflanzen, die durch eines dieser Verfahren erzeugt wurden, zu geben, d. h. es gibt Variation zwischen den Pflanzen, aber diese ist von dem Verfahren der Transformation unabhängig. In jedem Fall, obwohl noch nicht alle Pflanzen genetisch verändert wurden, deuten die momentan verfügbaren Techniken und die große Bandbreite von Pflanzen, auf die sie angewendet wurden, darauf hin, dass es keine biologischen Barrieren für der genetischen Manipulation einer jeden Pflanzenart gibt.
Beim Studium von transgenen Pflanzen werden Tabak und Arabidopsis am häufigsten als Modellsysteme verwendet. Dies liegt daran, dass Tabak durch die Verfügbarkeit bekannter und geeigneter selektierbarer Marker und fertiger Regenerationsprotokolle im Allgemeinen eine der am einfachsten durch Agrobacterium-Transformation genetisch zu manipulierenden Pflanze ist. Allgemein wurde gezeigt, dass Transgene, die in Tabak gut exprimiert werden, mit vergleichbaren Eigenschaften in anderen Pflanzenarten exprimiert werden. Tabak ist ferner in seiner osmotischen Regulation und Zuckersynthese typisch für Stress-sensitive Nutzpflanzen. Tabak produziert natürlicherweise kein Mannitol in seinen Geweben und von ihm wurde berichtet, dass er zum Abbau von Mannitol nicht in der Lage ist.
Während die Verfahren für die genetische Manipulation der meisten der wichtigen landwirtschaftlichen Nutzarten inzwischen entwickelt wurden, gab es einen etwas geringeren Fortschritt bei der Identifizierung von fremden Merkmalen oder Genen, die nutzbringend in Pflanzen eingefügt werden können. Die bei dieser Technik bisher am bekanntesten Beispiele betreffen Gene, die Resistenz verleihen, zum Beispiel Resistenz gegenüber Herbiziden oder Schädlingen. Solche Gene können das gewünschte Merkmal (d. h. Resistenz) durch ein einzelnes Transgen verleihen. Die Verbesserung einiger die Vitalität, Ausbeute, Wasser- oder Salztoleranz, Hitzestress oder dergleichen betreffenden, eher agronomisch wichtigen Merkmale von Pflanzen erschien anfänglich eine etwas schwierigere Zielsetzung zu sein. Die mit diesen Qualitäten assoziierten Merkmale sind wenig verstanden, und das Gen, oder wahrscheinlicher, die Gene, die mit den verschiedenen Merkmalen verbunden sind, sind im Großen und Ganzen nicht charakterisiert. Dementsprechend gibt es eine Notwendigkeit, neue Klassen von Merkmalen oder Genen zu identifizieren, die in Nutzpflanzen eingefügt werden können, um zu versuchen, diese besser wachsen zu lassen. Sogar wenn neu eingefügte Gene eine Pflanze unter landwirtschaftlichen Bedingungen nicht besser abschneiden lassen, sind derartige Gene tragende transgene Pflanzen für Forschungsvorhaben zur Untersuchung sinnvoll, wie Veränderungen in internen Prozessen der Pflanze (z. B. osmotische Regulation) die Leistung der Pflanzen auf dem Feld beeinflussen.
Natürlich fangen alle Pflanzen Energie in Form des Sonnenlichtes ein und speichern Energie in einer chemischen Form als Zucker. Dennoch variieren die von den Pflanzen gebildeten Zucker in Art und relativer Menge von Pflanze zu Pflanze. Zusätzlich zu ihrer Funktion als chemischer Energiespeicher können einige Zucker oder andere Kohlenhydrate ebenfalls zur Regulation des osmotischen Gleichgewichts der Pflanzen dienen. Die osmotische Fähigkeit der Pflanzenzellen und die relativen osmotischen Gleichgewichte zwischen den sub-zellulären Organellen können grundlegend mit der Fähigkeit der Pflanzen zusammenhängen, verschiedenen Typen von Stress zu widerstehen, so z. B. Einfrieren oder Salzstress zusätzlich zu Dürre oder Wasserstress. Kälte beispielsweise kann für Pflanzengewebe wegen des auftretenden Wasserverlustes verheerend sein, lange bevor Temperaturspitzen erreicht werden, bei denen Eis in den Pflanzengeweben kristallisieren würde. Diese Fähigkeit des Überstehens von Wasserstress kann grundlegend mit der Pflanzenleistung unter ungünstigen Bedingungen zusammenhängen.
Die Rolle von Polyalkoholzuckern oder Polyolen im Pflanzenmetabolismus ist wenig verstanden, trotz der Tatsache, dass bis zu 30 Prozent der jährlichen globalen Kohlenstoffproduktion durch höhere Pflanzen eher in Polyole gehen dürfte als in einfache Zucker. Von den Polyolen ist Mannitol das in der Na tur am meisten verbreitetste. Während es in ungefähr 70 Pflanzenfamilien gefunden wird, wird es mit Ausnahme von Stangensellerie (Apiaceae), Kaffee (Rubiaceae) und Olive (Oleaceae) in keiner wichtigen landwirtschaftlichen Feld- oder Gemüsefrucht in messbaren Mengen gebildet. In Algen und Pilzen wird Mannitol ziemlich verbreitet gebildet.
In einigen Pflanzenarten sind andere Polyole verbreitet, sogar in einigen Fällen, bei denen keine metabolische Rolle für Polyole offensichtlich ist. Beispielsweise ist bekannt, dass die Polyole Ononitol und Pinitol in einigen Pflanze bei Stressbedingungen durch Dürre, Salz oder niedrige Temperatur produziert werden. In einigen dieser Pflanzen scheint das gebildete Polyol ein Endprodukt zu sein, d. h. eines, das keine weitere metabolische Rolle innehat und von dem aus kein anderes Metabolit synthetisiert wird. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass die Anreicherung von derartigen Polyolen einer osmotisch regulativen Aufgabe dient.
In Pflanzen gibt es zwei getrennte Wege für die Mannitol-Biosynthese. Ein zum Beispiel in Braunalgen verwendeter Weg beginnt mit der Reduktion von Fruktose-6-P zu Mannitol-1-P durch die Mannitol-1-P-Dehydrogenase mit einem NAD-Cofaktor, gefolgt von Dephosphorylierung durch eine spezifische Mannitol-1-P-Phosphatase. (Mannitol-6-P und Mannitol-1-P sind gleichbedeutend.) In Stangensellerie ist der Ablauf verschieden, beginnend mit Mannose-6-P, das reduziert wird zu Mannitol-1-P durch Mannose-6-P-Reduktase mit einem NADP-Cofaktor, gefolgt wiederum von Dephosphorylierung.
In E. coli ist ein katabolisches System für Mannitol bekannt. In E. coli wird Mannitol aus der Umgebung aufgenommen und durch Phosphorylierung zu Mannitol-1-Phosphat (M1P) umgewandelt. Dann wandelt ein NAD-abhängiges Enzym, Mannitol-1-Phosphat-Dehydrogenase (M1PD) in einer Gleichgewichtsreaktion das Mannitol-1-Phosphat in Fruktose-6-Phosphat um. Das für dieses Enzym kodierende Gen, das als mt1D bezeichnet wird, wurde kürzlich durch andere kloniert.
Die Untersuchung der Polyol-Bildung in stresstoleranten Pflanzen ist ein Ansatz zur Abschätzung der Funktion von Polyolen in der pflanzlichen Stressantwort. Es gibt eine Anzahl von salztoleranten Pflanzen, die als Halophyten bezeichnet werden, die verhältnismäßig tolerant gegenüber Dürre und Kälte als auch Salz sind. Unglücklicherweise sind die meisten unserer wichtigen Nutzpflanzen Salz-empfindliche Arten, die als Glykophyten bezeichnet werden. Wenn die Gene und Mechanismen, die von Halophyten verwendet werden, um Stress zu bekämpfen, identifiziert sind, könnte es möglich werden, diese Gene und/oder Mechanismen durch genetische Manipulation in wichtige Nutzpflanzen zu überführen.
Ein einmaliges System, das verwendet werden kann, um Stresstoleranzgene und -mechanismen zu identifizieren, ist der induzierbare Halophyt Mesembryanthemum crystallinum, die gewöhnliche Eispflanze. Als ein fakultativer Halophyt unterzieht sich die Eispflanze einer Reihe von Stress-induzierten biologischen Veränderungen, um stresstoleranter zu werden. Eine dieser Veränderungen beinhaltet einen Wechsel der metabolischen Pfade, d. h. von C₃ zum Crassulaceen-Säuremetabolismus („crassulacean acid metabolism"), als eine Maßnahme zur Wasserspeicherung. Andere dieser Veränderungen waren bisher wenig charakterisiert.
Schaewen et al, EMBO J. 1990, Band 9, Seiten 3033–3044 berichten von der Expression einer aus Hefe stammenden Invertase in der Zellwand von Tabak- und Arabidopsispflanzen. Diese führt zu einer, das Wachstum und den Phänotyp von transgenen Tabakpflanzen stark beeinflussenden Anreicherung von Kohlenhydraten und der Inhibierung der Photosynthese.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanze zur Verfügung, die in ihren Zellen als vererbbares, genetisches Merkmal ein fremdes Gen umfasst, das die Expression eines Enzyms bedingt, das die Bildung eines Polyols in den Geweben der Pflanze aus natürlicher Weise in der Pflanze vorkommenden Substanzen katalysiert, wobei das Polyol in den Geweben der Pflanze natürlicherweise nicht gebildet wird und das Polyol in der Pflanze ohne nachteilige Auswirkungen auf die Pflanze akkumuliert.
In einer besonderen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Pflanze, die in ihren Zellen als ein vererbbares, genetisches Merkmal ein fremdes Gen umfasst, das die Expression eines Enzyms bedingt, das die Bildung von Mannitol in den Geweben der Pflanze aus einer natürlicherweise in der Pflanze vorkommenden Substanz katalysiert.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Veränderung der Zuckeralkohol-Bestandteile einer Nutzpflanzenart zur Verfügung, welches das Einführen eines Gens in das Genom der Nutzpflanze durch genetische Manipulation umfasst, wobei das Gen ein Enzym exprimiert, das in den Zellen der Pflanze die Bildung eines in Pflanzen der Pflanzenart natürlicherweise nicht gebildeten Zuckeralkohols aus einem natürlicherweise in Pflanzen der Pflanzenart gebildetem Zucker katalysiert.
Die Beschreibung eines neuen Ansatzes zur genetischen Manipulation von höheren Pflanzen ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, so dass nützliche Nutzpflanzen mit neuen Merkmalen hergestellt werden können und die Forschung zur Verbesserung von Nutzpflanzen gefördert werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die genetische Manipulation von natürlicherweise kein Mannitol bildenden Pflanzen, damit diese Mannitol bilden. Die Bildung von Mannitol in solchen Pflanzen ist für Forschungszwecke nützlich, und kann wegen der erhöhten Stresstoleranz der manipulierten Pflanzen landwirtschaftlich nützlich sein.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die genetische Manipulation von natürlicherweise kein Ononitol bildenden Pflanzen, damit diese Ononitol bilden. Die Bildung von Ononitol oder seinem Metabolit Pinitol kann auch die Stresstoleranz in Glykophyten-Pflanzen erhöhen.
Pflanzen zu verändern, damit diese in wachsenden Pflanzen neue Kohlenhydrate ohne nachteilige Auswirkungen auf die Pflanze bilden, ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Es ist ein überraschendes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass Mannitol-bildende, transgene Pflanzen, die von einer Pflanzenart abstammen, die natürlicherweise kein Mannitol bildet und von der berichtet wurde, dass sie Mannitol schlecht metabolisiert, wenn sie es überhaupt metabolisieren kann, durch die Anwesenheit von Mannitol in ihrem Gewebe nicht nachteilig beeinflusst sind, sondern deren Vitalität und Stresstoleranz sich tatsächlich erhöht zu haben scheinen.
Andere Gegenstände, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung offensichtlich, wenn diese in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen betrachtet wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion der Pflanzenexpressionsvektoren p35SMTLDL und p35SMTLDS.
2 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Pflanzenexpressionsvektors pRBCSMTLDS.
3 ist ein Schaubild, das die verschiedenen, von den hiesigen Erfindern konstruierten Expressionsvektoren darstellt.
4 illustriert drei grafische Darstellungen der Ergebnisse von Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAE-PAD)-Analyse der löslichen Zucker von Pflanzengeweben.
5 illustriert drei weitere grafische Darstellungen von HPAE-PAD-Analysen von transgenen Pflanzengeweben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren der genetischen Manipulation von Pflanzen gerichtet, um agronomische oder physiologische Veränderungen in den Pflanzen durch die Veränderung der Bildung von polyhydroxylierten Zuckern oder Polyolen in den Geweben der Pflanzen zu erzeugen. Im Besonderen wurde herausgefunden, dass es möglich ist, eine Pflanze, die natürlicherweise ein bestimmtes Polyol, wie zum Beispiel Mannitol, nicht bildet, genetisch so zu manipulieren, dass sie physiologisch messbare Mengen des Polyols als ein metabolisches Produkt aus Vorläuferzuckern, die normalerweise in den Geweben der Pflanze vorhanden sind, bildet. Überraschenderweise erzeugt die Bildung von Mannitol durch eine Pflanze, die es natürlicherweise nicht bildet, keine nachteilige Auswirkungen auf die Pflanze, es scheint das Wachstum der Pflanze zu fördern, was zu einer sichtbar vitaleren und gesünderen Pflanze führt. Dieses Ergebnis wurde erreicht durch Einführen eines fremden Gens in das Genom einer Pflanze, das für die Expression eines bakteriellen Enzyms kodiert, das bei im Zytosol der Pflanzenzelle vorherrschenden physiologischen Bedingungen in der Lage ist, die Bildung von Mannitol aus Fruktose zu katalysieren.
Es wurde ferner herausgefunden, dass einer der Stressinduzierten Mechanismen in fakultativen Halophyten ebenfalls die Synthese von Polyolen beinhaltet. Durch Identifizierung und Klonierung eines der für eine derartige Stress-Antwort verantwortlichen Gene ist es nun möglich geworden, mit dem direkten Transfer von Stress-Toleranzmerkmalen, die mit der Polyolbildung zusammenhängen, in Glykophytenarten zu beginnen.
Die Arbeit, aus der die hier beschriebene Erfindung hervorgegangen ist, begann als eine Untersuchung der Durchführbarkeit einer Veränderung der relativen Kohlenhydratbestandteile von Pflanzengeweben. Als die Technik der genetischen Manipulation bekannter und anerkannter wurde, wurde eine daraus folgende Untersuchung darauf gerichtet, welche nützlichen Veränderungen in Pflanzen gemacht werden könnten, so dass diese einfacher manipuliert werden können, letztlich für höhere agronomische Zwecke. Veränderungen bei der Bildung von Polyolen oder Zuckeralkoholen in Pflanzen haben ferner einen unmittelbareren Forschungsnutzen durch Beweisen der Variationen und Veränderungen, die in Pflanzenosmolyten erzeugt werden können, so dass das osmotische Gleichgewicht von Pflanzengeweben besser verstanden werden kann.
Eines der Ziele der genetischen Manipulation von Pflanzen ist die Erzeugung von Pflanzen, die gegenüber Stressen in der Feldumgebung resistenter sind. Die Gesamtanpassungsfähigkeit von Pflanzen gegenüber Wasser- und Salzstressen scheint abhängig zu sein von osmotischen Anpassungen, die von der Pflanze während Stresszeiten gemacht werden können, und die Fähigkeit von Pflanzen, solche osmotischen Anpassungen zu machen, scheint von einer Anzahl von kompatiblen Cytosoluten abzuhängen, die innerhalb der Zellen von höheren Pflanzen gebildet werden. Höhere Pflanzen erzeugen eine Vielzahl von kompatiblen Cytosoluten. Enthalten innerhalb dieser Verbindungen sind verschiedene Zuckermoleküle, einschließlich Oligosaccharide und Polyole. Daher wäre ein möglicher Weg, die Fähigkeit von genetischen Manipulatoren der Pflanze zur Veränderung der Stresssensitivität von Pflanzen zu testen, die Veränderung der Polyol-Bildung innerhalb einer bestimmten Pflanze, und die Verwendung dieser Pflanze zur Untersuchung, welche Effekte erzielt würden. Es war vor den Ergebnissen, von denen hier berichtet wird, nicht klar, dass diese Zielsetzung möglich war. In der Theorie könnte man erwarten, dass das Pflanzengewebe überschüssige Mengen einer Verbindung zu ihrem Nachteil anreichern, wenn man in eine Pflanze die Fähigkeit zur Synthese einer nicht-natürlichen Verbindung aus einem reichlich vorhandenen Substrat in Abwesenheit eines metabolischen Abbauweges für diese Verbindung einführt. Beispielsweise könnte man erwarten, dass Polyol-Biosynthese endogene pflanzliche Metabolite von Wildtyp-Pflanzen abziehen würde und dadurch metabolische Pfade des Wildtyps zum Nachteil der transgenen Pflanze verändern würde. Überraschend war, was man herausgefunden hat, dass relativ große Mengen eines Polyols, wie Mannitol, ohne Schädigung der Pflanze in Pflanzengeweben gebildet werden können, sogar wenn von diesen Pflanzenarten berichtet wurde, dass sie Mannitol schlecht metabolisieren. Zusätzlich und sogar noch überraschender wurde herausgefunden, dass die Einführung eines einzelnen Gens, das die Bildung eines einzelnen Polyols ermöglicht, zu einer sichtbaren Verbesserung der Vitalität und Produktivität in einer Pflanze (d. h. Mannitolanreicherung) führen kann, und eindeutig zu signifikanten biochemischen Veränderungen der Pflanze ohne übermäßigen Stress oder Schaden für die Pflanze führen kann. Tatsächlich wird die transgene Pflanze stresstoleranter.
Ein anderer Weg der Untersuchung desselben Problems war auf die Charakterisierung der Mechanismen der Stressantwort von Stress-toleranten Pflanzen gerichtet. Diese Untersuchung war auf die gewöhnliche Eispflanze, Mesembryanthemum crystallinum gerichtet, da diese Pflanze ein induzierbarer Halophyt ist. Durch Studie der Mechanismen, die in der Pflanze durch Stress induziert werden, und Gegenüberstellen dieser Mechanismen mit denen aus der Pflanze in ihrem nicht-induziertem Zustand, wurde ein besseres Verständnis von Verfahren erreicht, mit denen glykophytische Pflanzen mit Stresstoleranz versehen werden können.
Es ist herausgefunden worden, dass eine der Stressantworten in der Eispflanze die transkriptionelle Induzierung eines für eine neue Metyltransferase kodierenden Gens ist. Diese Metyltransferase wurde durch einen funktionellen Test als eine myo-Inositol-O-Metyltransferase identifiziert, und ist in der Eispflanze an der Biosynthese des zyklischen Polyols D-Pinitol beteiligt. Pinitol wird in einer Anzahl von salz- und stresstoleranten Arten reichlich gebildet, und kann sich in der Eispflanze auf über 70 Prozent des löslichen Kohlenhydrats der Pflanze anreichern. Paul und Cockburn, Jour. Exp. Bot. 40: 1093–1098 (1989). Da myo-Inositol ein weit verbreitetes Pflanzenmetabolit ist, ermöglicht die Verfügbarkeit des für die myo-Inositol-O-Metyltransferase kodierenden Gens, das hier als Imt1 bezeichnet wird, die Einführung dieses einzelnen Gens in eine große Anzahl von Zielpflanzenarten, um Anreicherung von Ononitol in diesen Pflanzen durch Metylierung von myo-Inositol zu verursachen.
Daher werden, wie unten beschrieben, zwei einzelne Gene beschrieben, die in der Lage sind, eine neue Polyol-Biosynthese in transgenen Pflanzen zu induzieren. Ein Gen ist bakteriellen Ursprungs und das andere stammt aus einer stresstoleranten Pflanze. Es ist daher offensichtlich, dass eine Vielzahl von Techniken zur Herbeiführung einer Polyol-Anreicherung in Pflanzen für Stresstoleranz in Pflanzen möglich ist. Jedes der beiden beispielhaften Gene, die diese Techniken ermöglichen, ist unten beschrieben.
Gen zur Mannitolbildung
Das Gen bakteriellen Ursprungs wurde verwendet, um zu zeigen, dass transgene Tabakpflanzen gebildet wurden, die Mannitol bilden können und die eine erhöhte Toleranz gegenüber Salz haben. Vor der hier beschriebenen Arbeit war es unbekannt, ob Pflanzen ohne ungünstige Folgen derart verändert werden können, dass sie Mannitol bilden. Tatsächlich konnte vernünftigerweise erwartet werden, dass die Bildung von Mannitol in Pflanzenzellen schädlich für diese Zellen ist, da die untersuchte Pflanzenart, Tabak, normalerweise kein Mannitol bildet. Von Tabak wurde normalerweise nicht erwartet, dass es einen Abbauweg für eine Chemikalie, d. h. Mannitol hat, die es normalerweise nicht bildet, und von ihm wurde berichtet, dass er es schlecht abbaut, Thompson et al., Physio. Plant., 65, Seiten 365–369 (1986). Basierend auf diesem wäre die vernünftige Erwartung bei einer Bildung von Mannitol eine übermäßige Anreicherung von Mannitol in den Zellen der Pflanze, die zu einem osmotischen Ungleichgewicht und schließlich zum Platzen oder Deformierung von Pflanzenzellen führen würde. Tatsächlich ist dies aus Gründen, die noch unklar sind, nicht der Fall gewesen. Endogene Systeme innerhalb der Tabakpflanze scheinen tatsächlich in der Lage zu sein, mit Mannitol umzugehen und auf es zu reagieren, im Besonderen es systemisch innerhalb der Pflanze bevorzugt zu bestimmten Teile der Pflanze zu transpor tieren. Folglich und überraschenderweise war die Bildung eines einzigartigen Polyols, das normalerweise in einer Pflanzenart nicht vorkommt, nicht nur nicht in der Lage, die Pflanze zu schädigen, die Pflanze schien hingegen gut in der Lage zu sein, mit der Existenz dieses Polyols in ihren Geweben umzugehen und das Polyol bevorzugt innerhalb der Pflanze zu transportieren, ohne dass zusätzliche Modifikationen der Pflanzengenetik notwendig sind.
Folglich begannen die Erfinder der vorliegenden Erfindung mit diesem Ziel im Kopf die Polyolbildungseigenschaften von höheren Pflanzen zu verändern. Dies zu tun erforderte die Bildung eines heterologen oder fremden Enzyms, das die Bildung eines gewünschten Polyols in den Zellen von Pflanzengeweben katalysieren würde, in Pflanzenzellen. Die Enzyme, welche die Bildung von Polyolen in höheren Pflanzen katalysieren, waren vor der hier beschriebenen Arbeit allgemein schlecht charakterisiert. Klone für die Gene dieser Pflanzenenzyme waren noch nicht erhältlich. Daher war die Suche nach einem geeigneten Enzymgen, das in Pflanzenzellen transformiert werden sollte, zuerst auf Gene für Enzyme gerichtet, die in bakteriellen Systemen charakterisiert waren. Da die Effizienz von Enzymen über einen pH-Bereich variiert, ist es ratsam, nach einem Gen für ein Enzym zu suchen, das in dem pH-Bereich des Pflanzenzytosols arbeiten kann. Das Enzym sollte ein Substrat verwenden, das in ausreichenden Mengen sowohl im Zytosol von Pflanzen als auch in den Chloroplasten vorhanden ist. Die Konzentration dieses Substrats innerhalb des Zytosols und des Chloroplasten sollte ausreichend sein, um ausreichende Mengen des Polyols zu produzieren, die zu biochemischen Veränderungen in der Pflanze führen, die mit einem angemessen zuverlässigem Test detektiert werden können. Es wird weiterhin bevorzugt, dass das Enzym entweder einen leicht verfügbaren Co-Faktor oder keinen Faktor verwendet, so dass Katalyse in einer transgenen Pflanzen fortschreiten kann, die ein einzelnes transfor mierendes Gen in sich eingeführt trägt. Es ist, daher bevorzugt, dass das Enzym ein einfaches Enzym ist, eines ohne zusätzliche Untereinheiten oder benötigte Co-Faktoren.
Die Suche nach einem Enzym, das die oberen Bedingungen trifft, wurde durchgeführt, die zur Identifizierung eines Enzyms führte, das als Mannitol-1-P-Dehydrogenase (M1PD) bekannt ist, das in E. coli identifiziert wurde. Das Gen für dieses Enzym wurde kloniert und war für Forscher in der Molekularbiologie verfügbar, wie beschrieben von Lee und Saier, J. Bact., 153: 2, Seiten 685–692 (1983). Das Gen für das M1PD-Enzym wird als mt1D bezeichnet. In E. coli ist das Enzym am Katabolismus von Mannitol beteiligt, das eine Kohlenstoffquelle für die Bakterien ist. Mannitol wird durch die Bakterien phosphoryliert, um Mannitol-1-Phosphat zu bilden, das dann durch das M1PD-Enzym dehydrogenisiert wird, um Fruktose-6-Phosphat zu bilden. NADH ist der einzige Co-Faktor für diese Reaktion. Die Reaktion ist reversibel und das Enzym ist ein einzelnes Polypeptid, das keine zusätzlichen Untereinheiten benötigt und ist daher als einzelne Einheit aktiv. Die kodierende Sequenz für das für die Expression dieses Enzyms kodierende bakterielle Gen ist als SEQ ID: NO: 1 unten angegeben, welche die kodierende Sequenz für mt1D enthält. Dieses bakterielle Enzym arbeitet effizient bei einem optimalen pH zwischen 6,5 und 8,5, was mit Bedingungen im Pflanzenzytosol verträglich ist. Das Substrat für die Biosynthese von Mannitol-1-P ist Fruktose-6-P, die reichlich im Zytosol von allen höheren Pflanzen vorhanden ist. Zusätzlich ist der Co-Faktor NADH ebenfalls in höheren Pflanzen vorhanden. Folglich scheinen alle notwendigen Bedingungen für die Synthese von Mannitol-1-P aus Fruktose-6-P durch die Einführung eines dieses einzelne Enzym kodierenden Gens in der Theorie in den Geweben von Tabak vorhanden zu sein. Bevor die Pflanzen erzeugt wurden war nicht klar, dass diese Bedingungen ausreichend sind.
In den hier beschriebenen transgenen Pflanzen wird Mannitol eindeutig in physiologisch signifikanten Mengen gebildet. Der gefolgerte Weg der Mannitol-Synthese ist, dass Fruktose-6-P aus freier Fruktose durch einen natürlichen Prozess in den Zellen der Pflanze gebildet wird. Fruktose-6-P ist ein natürliches indirektes Produkt des photosynthetischen Zuckerbildungsprozesses. Das Fruktose-6-P wird durch das M1PD-Enzym, das durch das mt1D-Gen exprimiert wird, in Mannitol-1-P umgewandelt. Das Mannitol-1-P wird dann durch eine nichtspezifische Phosphatase, die natürlicherweise in der Pflanze vorkommt, dephosphoryliert. Während die Umwandlung von Fruktose-6-P zu Mannitol-1-P in einem thermodynamischen Gleichgewicht sein kann, ist die Dephosphorylierung von Mannitol-1-P hochgradig bevorzugt und dieser Syntheseweg legt daher nicht nahe, wie das Mannitol danach abgebaut werden könnte.
Die durch Einführen des mt1D-Gens erzeugten transgenen Tabakpflanzen werden durch die Anwesenheit des Gens nicht schädlich beeinflusst. Die Pflanzen scheinen im Gegenteil mindestens ebenso gesund und vital zu sein wie nicht-transformierte Kontrollen. Zusätzlich haben die transgenen Pflanzen gezeigt, dass sie einen erhöhten Grad an Salztoleranz haben. In Kontrollexperimenten sind das mt1D-Gen exprimierende transgene Pflanzen unter Bedingungen, die für Kontrollpflanzen schädlich waren, vital geblieben. Damit wurde die Fähigkeit der Polyol-Anreicherung, die Stresstoleranz zu erhöhen, gezeigt.
Wie oben kurz beschrieben sind verschiedene Techniken für die Einführung von fremden einzelnen Genmerkmalen in höhere Pflanzen nun allgemein weit bekannt und können von Fachleuten durchgeführt werden. Kodierende Sequenzen für eingeführte Proteine, wie die unten angegenben mt1D-kodierende Sequenz in SEQ ID: NO: 1, können mit geeigneten flankierenden regulatorischen Sequenzen, wie Promotoren und Terminatoren, kombiniert werden, um Expressionskassetten zu bilden, die in Pflanzenzellen transformiert werden können. Eine Vielzahl von Techniken kann verwendet werden, um solche Pflanzenexpressionsvektoren in Pflanzenzellen einzuführen. Die als erste entwickelte und am meisten verwendete Technik basiert, wie oben beschrieben, auf dem infektiösen Mechanismus von Agrobacterium tumefaciens. Es wurden aber auch andere Techniken, wie die Elektroporation von Protoplasten und die Einführung von Nukleinsäuren in das Innere von Pflanzenzellen durch beschleunigte Partikel entwickelt und gezeigt, dass sie effektiv bei der Bildung transgener Pflanzen sind.
Es ist in der Industrie auch bekannt und anerkannt, dass die Einführung einer ein oder zwei Gene tragenden Pflanzenexpressionskassette in das Genom einer Pflanze zu transgenen Pflanzen führt, die in der Lage sind, die eingeführten Transgene durch normale Mendel'sche Vererbung an ihre Nachkommen weiterzugeben. Während es einige Abweichungen in verschiedenen Familien oder Linien von Pflanzen, die durch Verwendung solcher Pflanzentransformationstechniken erzeugt wurden, gibt, sind die Variationen innerhalb von Pflanzenlinien oder Familien stabil und scheinen von solchen Variationen wie der Kopienanzahl und des Lokus des genetischen Einschubs in das Genom der Pflanze abzuhängen. Wie unten beschrieben werden wird, haben die Erfinder verschiedene unterschiedliche, unabhängige, das mt1D-Gen unter verschiedenen Promotoren tragende Pflanzenlinien erzeugt, und alle sind effektiv, indem sie Mannitol in den transgenen Pflanzen in einfach messbaren Mengen bilden. Das eingefügte Gen ist vollständig durch Mendel'sche Vererbung vererbbar und ist wirksam, egal ob es in homozygoten oder heterozygoten Pflanzen vorhanden ist.
Was hierdrin vorgeschlagen wird, ist, dass die gleiche Methodik auf andere höhere Pflanzen, die natürlicherweise kein Mannitol bilden, angewendet wird. Keine der Hauptfeldfrüchte, wie die Getreide, einschließlich Mais und Weizen, und anderen Feldfrüchte, wie Baumwolle und Sojabohnen, und die Hauptgemüsefrüchte, mit Ausnahme von Stangensellerie, bilden Mannitol in messbaren Mengen oder mehr als ungefähr fünf Millimolar davon. Es wurde hier gefunden, dass die Einführung eines einzelnen Gens in Tabakpflanzen in relativ starker Mannitolbildung innerhalb des Zytosols der Pflanzen führt. Es hat sich gezeigt, dass Mannitolmengen größer als 100 Millimolar einfach messbar sind und wirksam, sichtbare Verbesserung der allgemeinen Vitalität und des Wachstums der transgenen Pflanzen, in die das Mannitolbildungsmerkmal eingeführt wurde, zu bewirken. Es ist ausdrücklich beabsichtigt und hier vorgesehen, dass Mannitolbildung daher in anderen Pflanzenarten erzeugt werden kann, sowohl als ein Laborwerkzeug, um die Katabolismus- und Speichereigenschaften von Polyolen in diesen Pflanzenarten zu untersuchen, als auch möglicherweise als eine Strategie, um verbesserte agronomische oder landwirtschaftliche Leistung der derartig gebildeten transgenen Pflanzen zu induzieren.
Als eine Variante der vorliegenden Erfindung ist es ebenfalls beabsichtigt, dass das mt1D-Gen so in transgene Pflanzen eingeführt wird, dass sie Mannitol bevorzugt in den Chloroplasten in den transformierten Pflanzen bilden. Es ist gewünscht, dass das Vorkommen des Enzyms und folglich Mannitols in den Chloroplasten vorhanden ist, speziell wegen der Theorie, dass die protektiven osmotischen Wirkungen des Mannitols ausgeprägter sein werden, wenn sie in den Chloroplasten vorhanden sind. Dies kann durch Plazieren der mt1D-kodierenden Sequenz in einer Pflanzenexpressionskassette durchgeführt werden, die eine 5'-Transit-Peptidsequenz enthält, die den Transit des exprimierten Peptids bevorzugt in die Chloroplasten verursacht. Eine derartige Transit-Peptid-Expressionskassette ist durch Guerineau et al., Nucl. Acids Res. 16: 23, Seite 11380 (1989) beschrieben. Wenn es möglich wird, Gene direkt in zelluläre Organelle zu transferieren, könnte sich dies ebenso als nützlich erweisen, den Ort der Mannitolsynthese zu kontrollieren.
Imt1-Gen
Wie oben erwähnt war ein anderer Weg der Untersuchung auf die Identifizierung von Mechanismen in dem Salz-toleranten Halophyten M. Crystallinum, der Eispflanze, gerichtet, um für seine induzierbare Salz-Toleranz verantwortliche Gene zu identifizieren. Eine subtrahierte cDNA-Bibliothek, die mit Stressinduzierten Sequenzen angereichert war, wurde erzeugt, um die molekulare Grundlage dieser induzierbaren Salztoleranz zu untersuchen. Die cDNA-Bibliothek wurde dann untersucht, um solche transkriptionellen Produkte zu identifizieren, deren Expression in der Pflanze nach Stressinduktion bevorzugt oder dramatisch erhöht war. Dies wurde durch Vergleich der cDNAs von gestressten und ungestressten Pflanzen durchgeführt. Eine Anzahl von cDNAs wurde identifiziert, die während des Prozesses der Stressantwort dramatisch hoch reguliert waren. Kreuzhybridisierungsexperimente zeigten letztlich, dass drei verschiedene Klone aus diesen cDNA identifiziert wurden. Einer dieser Klone wurde identifiziert als ein Gen, das für ein Enzym, myo-Inositol-O-Methyltransferase, kodiert, hier durch den Namen Imt1 bezeichnet. Das Methyltransferaseenzym in der Eispflanze an der Biosynthese des zyklischen Polyols Pinitol beteiligt. Pinitol ist ein in der Salz-gestressten Eispflanze reichlich vorkommendes Metabolit. Diese transkriptionelle Induzierung der Biosynthese des Imt1-Gens in der gestressten Eispflanze zeigt, dass die Bildung der Polyole eine entscheidende Rolle während der Adaption auf osmotischen Stress durch diesen fakultativen Halophyten spielt.
In der Eispflanze beginnt der Weg der Bildung von Pinitol mit Glukose-6-P, das in myo-Inositol-1-P und dann in myo-Inositol umgewandelt wird. myo-Inositol kann im Allgemeinen durch eine Methyltransferase abhängig von der Pflanzenart entweder in Sequoyitol oder D-Ononitol umgewandelt werden, welche dann in D-Pinitol umgewandelt werden. In der Eispflanze ist es D-Ononitol, das gebildet wird. Es wird angenommen, dass das Imt1-Enzym die Methyltransferasefunktion ausübt, um myo-Inositol in D-Ononitol umzuwandeln.
Die kodierende Region für das Imt1-Gen enthaltende cDNA-Klon wurde bestimmt. Die Sequenz ist als SEQ ID: NO: 3 unten dargestellt. Der cDNA-Klon ist 1524 Basenpaare lang und schließt eine Leadersequenz, die reich an A- und T-Resten ist, und ein ATG-Startcodon, gefolgt von einem ununterbrochenen Leserahmen von 1095 Nukleotiden, ein. Eine Analyse der kodierenden Sequenz für das Imt1-Gen sagt ein hydrophiles Protein von 365 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von ungefähr 40 kD voraus. Eine Suche in der genetischen NBRF-Datenbank offenbarte Ähnlichkeit zu einer bovinen Hydroxyindol-O-Methyltransferase aus der Zirbeldrüse, die über die gesamte Länge der das Protein kodierenden Region zu über 55 Prozent homolog war. Es zeigt sich, dass das vorhergesagte Proteinprodukt aus dem Imt1-Gen noch näher verwandt ist zu zwei pflanzlichen bifunktionellen Hydroxymethyltransferasen, welche die Ligninmonomere Kaffeesäure und Hydroxyferulinsäure methylieren, mit mehr als 50 Prozent Identität über die gesamte Länge der das Protein kodierenden Region.
Dies alles legt nahe, dass die möglich Funktion für diese Methyltransferase in der Reaktion auf Salzstress in der Eispflanze die Initiierung der Biosynthese von Pinitol ist. Pinitol reichert sich zu hohen Mengen in der Eispflanze zur selben Zeit an, zu der das Transkript des Imt-Gens in hohen Mengen im Zytosol der Pflanze erscheint. Um die angenommene physiologische Funktion des Imt-Gens in der Pinitol-Biosynthese zu substantiieren, wurde das Gen in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt und in E. coli exprimiert. Die bakteriellen Lysate aus den transformierten E. coli wurden auf myo-Inositol-Hydroxymethyltransferase-Aktivität getestet. In dem Lysat wurde ein Protein mit einer Molekularmasse von unge fähr 40 kD identifiziert, das auf Polyacrylamidgelen mit einem translatioriellen Produkt, das durch in vitro erzeugte, transkribierte Kopien des Imt1-Klons gebildet wird, co-migrierte. Extrakte aus E. coli Zellen, jeweils Kontrollzellen und das Imt1-Gen exprimierende Zellen, wurden auf myo-Inositolabhängige O-Methyltransferase-Aktivität getestet. Die erwartete Aktivität in den transformierten Extrakten wurde gefunden und die Akaivität fehlte in den Kontrollen. Es zeigte sich, dass das durch das Imt1-Gen gebildete Enzym fähig zur Methylierung von myo-Inositol zur Bildung von Ononitol, dem methylierten Zwischenprodukt in der Pinitol-Biosynthese, ist.
Die Tatsache, dass ein mit Stress-Toleranz verbundenes induzierbares Gen in einer induzierbaren Salz-toleranten Pflanze für die Synthese eines zyklischen Polyols verantwortlich ist, ist für die These hochgradig stützend, dass Anreicherung von Polyolen in Pflanzenzellen mit erhöhter Stabilität zum Widerstehen von Stress verbunden ist. Diese Schlussfolgerung ist somit durch zwei unabhängige Arten von Daten gestützt. Erstens, wie in dem ersten oben beschriebenen Beispiel angegeben, hat ein bakterielles Gen, das für ein Enzym kodiert, das in der Lage ist, die Bildung von Polyolen in Pflanzenzellen zu bedingen, der Pflanze erhöhte Stabilität verliehen, um Salzstress zu widerstehen. Zweitens beinhalten die natürlicherweise in Pflanzen vorkommenden Gene, die ferner mit Salzstress verbunden sind, Gene, die für die für Polyol-Synthese verantwortliche Enzyme kodieren. Beide Beobachtungen unterstützen also die Schlussfolgerung, dass ansonsten Stress-intolerante Pflanzen durch Einführen von Gensystemen in diese Pflanzen, die für die für Polyol-Anreicherung in den Zellen dieser Pflanze verantwortlichen Enzyme kodieren, stresstoleranter gemacht werden können.
Es wird ferner angenommen, dass die hier erhaltenen überraschenden Ergebnisse nahelegen, dass andere, nicht natür licherweise vorkommenden Polyole ebenfalls in Nutzpflanzen gebildet werden können, ohne die Pflanze zu schädigen und mit möglichem Nutzen. Geeignete Enzyme können gefunden werden, die in Pflanzenzellen andere Zuckeralkohole bilden, wie z. B. Ribitol, Erythritol, Xylitol, Arabitol, Sorbitol, Inositol, Methyl-Inositol, Dulcitol, Galactitol und Heptitol. Zusätzlich zu den oben identifizierten Zuckeralkoholen soll der Begriff "Polyol", wie er hier benutzt wird, für sowohl die Polyalkoholzucker als auch deren unmittelbare Derivate, wie z. B. methylierte Polyole, angewendet werden. Diese anderen Polyole können in höheren Pflanzen durch ein Verfahren vergleichbar mit der hier beschriebenen Bildung von Mannitol erzeugt werden, d. h. durch Identifizierung von Enzymen, welche die Synthese des gewünschten Polyols aus in den Zellen der Pflanze erhältlichen Substrat katalysieren, und durch Einführen eines Gens für dieses Enzym in transgene Pflanzen. Die derartig gebildeten transgenen Pflanzen werden in ihren Zellen ein oder mehrere, nicht natürlicherweise von Pflanzen dieser Art gebildeten Polyole anreichern.
Das Folgende sind Beispiele, die das genaue, von den Erfindern hier verwendete Protokoll wiedergeben. Es ist verständlich, dass diese Beispiele beispielhaft für die vorliegende Erfindung und nicht beschränkend für sie sind.
BEISPIELE
Beispiel 1: Bakterielles mt1D-Gen
Konstruktion von Pflanzenexpressionsvektor/-plasmiden
Die Konstruktion des Plasmids p35SMTLDL startete mit dem Plasmid pCD7.5, das in Lee und Saier, J. Bact. 153: 2, Seiten 685–692 (1983) beschrieben ist. Der Verdau von Kopien des pCD7.5 mit den Restriktionsenzymen NstI und PstI führte zu einem 1,5 Kilobasen-Fragment, das die gesamte kodierende Region aus E. coli für das strukturelle mt1D-Gen zusammen mit 150 Basenpaaren nicht-translatierter Leadersequenz enthielt. Dieses 1,5-Kilobasen-Fragment wurde dann in die Pst-I-Stelle eines aus p35SCATNOS abgeleiteten Vektors, aus dem das CAT-Gen deletiert wurde, subkloniert. Das Plasmid p35SCATNOS wurde von Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, Seiten 5824–5828 (1985) und Fromm et al., Nature, 319, Seiten 791–793 (1986) beschrieben. Die Subklonierung des Fragmentes in den Expressionssektor führte zu einem als p35SMTLDL bezeichnetem Plasmid. Dieses Verfahren ist schematisch in 1 dargestellt.
Dieser Vektor wurde dann durch Blunt-End-Subklonierung des durch Verdau von p35SMTLDL mit den Enzymen Ava1 und PstI erhaltenen Fragments in zusätzliche Kopien des Plasmids p35SCATNOS verändert, um die 150 Basenpaare 5'-nicht-translatierten Leader aus dem bakteriellen mt1D-Strukturgen zu entfernen, wodurch ein alternativer, als p35SMTLDS bezeichneter Expressionsvektor erzeugt wurde. Die Nachsilben "L" und "S" stehen für "Lang" („long") oder "kurz" ("short"), bezogen die Leadersequenz. Die Vektoren p35SMTLDL und p35SMTLDS enthalten beide kodierende Regionen für das Gen mt1D lokalisiert hinter dem Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor, ein als hochgradig aktiv und zu einem hohen Grad an Expression von fremden, in Pflanzenzellen transformierten Genen führend bekannter Promotor. Diese Vektoren können durch Bezug auf 3 verglichen werden.
Ein zweiter Satz von Expressionsvektoren enthält das mt1D-Gen hinter dem Nopalinsynthase-Promotor aus pNOSCATNOS, der ebenfalls durch Fromm et al. (loc. cit.) beschrieben wurde. Die Veränderungen waren exakt analog zu den oben beschriebenen, wodurch zwei als pNOSMTLDL und pNOSMTLDS bezeichnete Plasmide erhalten wurden, von denen jeder das mt1D-Strukturgen hinter den Nopalinsynthase-Promotor aus Agrobacterium tumefaciens lokalisiert enthält.
Zusätzliche Kopien des Plasmids p35SMTLDL wurden mit den Enzymen AvaI und EcoRI verdaut und dann mit stumpfen Enden versehen („blunt ended"). Das resultierende 1600-Basenpaar-Fragment wurde dann durch Elektrophorese isoliert und in ein als pBI131 bezeichnetes Plasmid ligiert, wie von Jefferson et al. im EMBO Journal 6, Seiten 3901–3907 (1987), beschrieben, das mit Sma1 verdaut wurde, wodurch ein als pRBCSMTLDS bezeichneter Vektor erzeugt wird. Dieser Vektor enthält als Promotor den Promotor der kleinen Untereinheit der Rubisco aus Tabak, von dem früher gezeigt wurde, dass er ein leicht aktivierbarer Promotor ist, der Expression von Genen nur in photosynthetischen Geweben oder anderen Geweben der Pflanze, die gelegentlicher Lichtstrahlung ausgesetzt sind, bedingt.
Ein zusätzliches Plasmid pD35SMTLDL wurde in einer Weise ähnlich zu p35SMTLDL gebildet, mit der Ausnahme, dass der Expressionsvektor pJIT117, beschrieben von Guerineau et al., Nucleic Acids Research 16: 23, Seite 11380 (1988), mit den Enzymen HindIII und SphI verdaut, mit stumpfen Enden versehen, religiert und dann mit PstI verdaut wurde. Dieses Plasmid enthielt das mt1D-Strukturgen hinter einem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor lokalisiert und eine untranslatierte Verstärkersequenz ebenfalls aus dem Blumenkohlmosaikvirus.
Das Plasmid pCABMTLDL wurde durch getrenntes Verdauen eines als pKH111 bezeichneten Plasmids (Harkins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87, Seiten 816–820 (1990)) und des Plasmids pUC18 mit den Enzymen EcoRI und SmaI, Isolierung des den CAB-Promotor aus dem pKH111-Verdau enthaltenden 1750-Basenpaar-Fragments und Ligieren des Fragments mit den linearisierten Kopien des pUC18 erzeugt. Der CAB-Promotor bezieht sich auf den Promotor aus dem Chlorophyll-AB-Bindeprotein-Gen. Dieser Vektor wurde dann mit PstI verdaut und das das obige mt1D-Strukturgen enthaltende Fragment wurde in Pst-I-verdauten pUCl8-Vektor ligiert. Dieser Vektor wurde danach mit PstI verdaut und an ein Pst-I-verdautes Vektorfragment ligiert, das den 300 Basenpaar-Nopalinsynthease-Terminator aus p35SMTLDL enthielt, der durch Verdau mit PstI und EcoRI aus diesem Plasmid isoliert wurde.
Jeder der hier beschriebenen Pflanzenexpressionsvektoren wurde in einen entschärften binären Vektor, Bin19 zur Einführung in Pflanzen wie von Bevan, Nucleic Acids Research 12, Seiten 8711–8721 (1984) beschrieben, subkloniert. Das binäre Vektorsystem trennt die Virulenzfunktion des Ti-Plasmids von der T-DNA. Dies wurde erreicht durch Anfertigung von HindIII-Verdauen von p35SMTLDL, p35SMTLDS und pRBCSMTLDS und durch Verwendung von EcoRI- und HindIII-Verdauen von pNOSMTLDL, pNOSMTLDS und pCABMTLDL. Für das Plasmid pD35SMTLDL erfolgt der Verdau mit SstI und XhoI. Jede dieser Expressionskassetten wurde in die entsprechende Restriktionsstelle des entschärften binären Vektors Bin19 subkloniert.
Transformation von Pflanzengewebe
Die für alle hier beschriebenen Transformationsexperimente verwendete Empfängerpflanze war Tabak, Nicotiana tabacum cv. SR1.
Um die Transformationsexperimente durchzuführen, wurden die Bin19-Expressionsvektoren jeweils getrennt in Kulturen von nicht-onkogenem Agrobacterium tumefaciens (Stamm LBA4404) über die von Bevin, Nucleic Acids Research 12: 8711–8721 (1984) beschriebene "triparental mating"-Technik eingeführt. Die Anwesenheit der Genkonstrukte in den A. tumefaciens wurde durch Southern Blot-Analyse bestätigt. Die nicht-onkogenen A. tumefaciens wurden dann verwendet, um Transformations/Regenerations-Techniken im Wesentlichen wie von Horscht et al. Science 227, Seiten 1229–1231 (1985) beschrieben, durchzuführen.
Das Verfahren kurz zusammenfassend wurden die A. tumefaciens-Kulturen für drei Tage bei 28°C auf MSO-Platten (MSO-Medium, das ein Fläschchen MS-Salze pro Liter, 5 ml/l 200 × Vitamine – 20000 mg/ml myo-Inositol, 100 mg/ml Nikotinsäure, 100 mg/ml Pyridoxin-HCl, 400 mg/ml Thiamin-HCl und 400 mg/ml Glycin – 30 g/l Saccharose, pH 5,8 mit KOH, 8 g/l Agar enthält) kultiviert. Die A. tumefaciens-Kultur wird in 7 Milliliter eines flüssigen MSO-Mediums, wie oben beschrieben, jedoch ohne Agar, überführt. Nach bakterieller Resuspension werden junge sterile Blattgewebestücke der Tabakpflanzen in 0,2 bis 0,5 Zentimeterquadrate geschnitten und für 10 bis 20 Minuten in der bakteriellen Suspension inkubiert. Die Blattgewebe wurden dann auf MSO-Agerplatten überführt und konnten mit den Bakterien für 48 Stunden bei Raumtemperatur co-kultivieren. Nach der Co-Kultivierung wurden die Blattgewebe in ein als MSS bezeichnetes Trieb-induzierendes Medium überführt, das aus dem MSO-Medium und Agar plus 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin, 400 mg/l Carbenicillin und 400 mg/l Kanamycin bestand, auf dem die Triebe für ungefähr vier Wochen wachsen konnten. Die gebildeten Tabaktriebe wurden von dem gebildeten Callusgewebe abgeschnitten und auf ein Wurzel-induzierendes Medium, ähnlich dem oben beschriebenen MSS mit Ausnahme von 2 g/l Saccharose, 8 g/l Glukose und 200 mg/l Carbenicillin und 75 mg/l Kanamycin, überführt. Die Triebe konnten für ungefähr vier Wochen wurzeln. Nach dem Bewurzeln wurden die Pflänzchen aus sterilen Magenta-Boxen entnommen und in Erde verbracht. Die Pflanzen konnten dann unter Gewächshausbedingungen gebracht werden, unter den sie normal in vollständige, sexuell fertile und reife Tabakpflanzen auswachsen konnten. Die anhand des Mannitol- Gehalts nachgewiesenen transgenen Pflanzen wurden geselbstet, um transgene Nachkommenschaft zu erhalten und Mendel'sche Auftrennung zu bestätigen.
Biochemische Eigenschaften der transgenen Pflanzen
Das Vorhandensein und die Expression der Transgene in den regenerierten (R0) und Nachkommen (R1)-Pflanzen wurde durch Analyse auf das Vorhandensein von Mannitol bestätigt. Keine Kontroll-, nicht-transformierte, aber regenerierte Pflanzen zeigten messbare Mannitolgehalte. Ungefähr 200 einzelne Mannitol enthaltende transgene Pflanzenlinien wurden gewonnen. Gemessene Mannitolgehalte überschritten gewöhnlicherweise 100 mM in den transgenen Pflanzen. Es zeigte sich, dass normale Gehalte der gewöhnlichen Zucker Saccharose, Fruktose und Glucose durch die Mannitol bildenden Pflanzen beibehalten wurden.
Blattmaterialabschnitte wurden von den jungen, axenisch angezogenen Pflanzen, die mit den Konstrukten p35SMTLDL, p35SMTLDS und pRBCSMTLDS transformiert waren, extrahiert. Aus den ungefähr drei Zentimeter langen Blattmaterialabschnitten wurden lösliche Kohlenhydrate extrahiert, die dann durch Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie, die mit amperometrischer Detektion gekoppelt war (HPAE-PAD) unter Verwendung der Technik von Lee, Analyt. Biochem., 189, Seiten 151–162 (1990), eluiert wurden, um den Kohlenhydratgehalt der Gewebe zu analysieren.
Die in 4 gezeigten drei chromatographischen Auftrennungen veranschaulichen die Ergebnisse der HPAE-PAD-Auftrennungen der Extrakte löslicher Kohlenhydrate aus den Pflanzen. In 4 gibt es drei Darstellungen des Ergebnisses der HPAE-PAD-Analyse von Blattmaterialien. Die drei chromatographischen Ergebnisse sind als 12, 14 und 16 bezeichnet. Kurve 12 veranschaulicht das Ergebnis der HPAE-PAD-Auftrennung des Extraktes löslicher Kohlenhydrate von einem Blatt einer nicht-transformierten, regenerierten Kontrollpflanze. In der Kurve 12 wurde die Referenzziffer 18 dort planiert, wo das für Mannitol charakteristische Merkmal angezeigt würde, und die Referenzziffer 20 bezeichnet das mit dem einfachen Zucker Saccharose verbundene.
Das als 14 bezeichnete HPAE-PAD-Trennungsergebnis repräsentiert das chromatographische Profil eines Extraktes aus einem Blatt einer untransformierten, regenerierten Pflanze, zu der als positive Kontrolle Mannitol in einer Menge von 0,25 Nanomol gegeben wurde. Mit 22 ist der mit der Retentionszeit von Mannitol assoziierte Peak bezeichnet, und mit 24 ist der Peak für Saccharose bezeichnet.
Das HPAE-PAD-Trennungschromatogramm für eine mit dem Pflanzenexpressionsvektor p35SMTLDL transformierte transgene Pflanze ist in Kurve 16 dargestellt. Als 26 angezeigt ist der mit den Elutionseigenschaften von Mannitol assoziierte Peak und als 28 der Peak für Saccharose.
Unter Bezugnahme auf die in 4 dargestellten Kurven kann leicht gesehen werden, dass die transgene Pflanze einen Peak für Mannitolbildung aufweist, der in den nicht-transformierten Proben nicht vorhanden ist. Daher wird der transgene Charakter der Pflanze eindeutig durch die Anwesenheit eines katalytischen Reaktionsprodukts in den Pflanzen angezeigt, der in nativen transformierten Tabakgeweben nicht vorhanden ist. Ähnliche Profile wurden bei anderen transgenen Pflanzenfamilien gefunden. Der Mannitolgehalt lag häufig im Bereich des Saccharosegehalts und überschritt ihn bei Gelegenheit.
Eine während der Regeneration der mit den hierin beschriebenen Vektoren und Genen transformierten transgenen Pflanzen gemachte überraschende und gleichbleibend anekdotenhafte Beob achtung ist, das die transformierten Pflanzen im Allgemeinen grüner und vitaler erschienen als vergleichbare, nicht-transformierte Kontrollpflanzen, die gleichzeitig regeneriert wurden. Obwohl vermutet werden konnte, dass die Bildung von Mannitol die Bildung anderer, für das Pflanzenwachstum und die Vitalität notwendige Kohlenhydrate schmälern würde, wurde überraschenderweise gefunden, dass die transgenen Pflanzen tatsächlich schneller auswachsen und sich schneller und vitaler entwickeln, als gleiche Pflanzen, die aus Gewebekultur regeneriert wurden, die nicht transformiert wurde. Der genaue Grund für diese offensichtliche Zunahme in der Wachstumsrate und in der Vitalität ist unklar, aber es zeigt deutlich, dass die Bildung von eigenem Mannitol innerhalb der Zellen der Pflanze nicht schädlich für das Gesamtwachstum und die Gesundheit der Pflanze ist und kann, in einer Weise, wie sie noch bestimmt werden muss, tatsächlich günstig für die Gesamtgesundheit und -vitaltät der transgenen Pflanzen sein, die diese Verbindung in ihren Zellen bilden.
Ein weiteres von den transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung erzeugtes überraschendes Ergebnis ist durch die in 5 dargestellten HPAE-PAD-Ergebnisse illustriert. Diese Ergebnisse gehören zu einer transgenen Pflanze, die mit dem Vektor pRBCSMTLDS transformiert wurde. Wie es erinnert werden dürfte, stammt der mit diesem Expressionsvektor assoziierte Promotor aus der kleinen Untereinheit der Rubisco und ist, wie früher bereits gezeigt wurde, lichtaktiviert. Daher konnte erwartet werden, dass Analyse der verschiedenen Gewebeteile der transgenen Pflanze, die diesen bestimmten Expressionsvektor enthält, Mannitolbildung nur in den Blättern oder anderen grünen Geweben der Pflanze anzeigen würde. Man konnte erwarten, nur Spurenmengen von Mannitol in den unterirdischen Teilen der Pflanze zu finden. Tatsächlich ist dies überraschenderweise nicht der Fall. Mit Bezug auf die in 5 dargestellten HPAE-PAD-Trennungschromatogramme zeigt die Referenzziffer 30 die Charakteristika einer HPAE-PAD-Trennungsanalyse der löslichen Zucker aus dem Wurzelmaterial einer transgenen Pflanze, die mit diesem Expressionsvektor transformiert wurde. Bei diesem Signal ist die Position des Mannitolpeaks bei 32 angegeben, und der Peak für Saccharose bei 34 angegeben. Ein zweites HPAE-PAD-Ergebnissignal ist durch die Referenzziffer 36 bezeichnet, in der die Ergebnisposition für Mannitol bei 38 und für Saccharose bei 40 angegeben ist. Bei 42 ist letztlich ein Chromatogramm angegeben, in dem die Mannitolposition bei 44 angegeben, und die Saccharoseposition bei 46 angegeben ist.
Der Graph 42 in 5 stellt das Kontrollexperiment dar. Das Signal ist aus Wurzelmaterial einer untransformierten, aber regenerierten Pflanze aufgenommen. Wie in dieser Negativkontrolle erwartet wurde, gibt es kein Anzeichen für die Anwesenheit von messbarem Mannitol innerhalb dieses Wurzelgewebes. Das Signal 36 stellt das Ergebnis von Blattmaterial dar, das aus einer transgenen Pflanze, derselben Pflanze, aus der der Wurzelextrakt in Signal 30 genommen wurde, isoliert wurde. Wie von dieser Funktion entnommen werden kann, ist Mannitol innerhalb der transgenen Pflanzengewebe in signifikanten Mengen enthalten. Auf Grundlage der Fläche unterhalb der Kurve, wie in dieser Figur dargestellt, wurde Mannitol auf ungefähr acht Prozent des Gesamtzuckergehalts des Blattmaterials geschätzt, und war deutlich mehrfach geringer als der von Saccharose. Was überraschend ist, ist dass Diagramm 30 die Trennung von löslichen Zuckern aus Wurzelmaterial der gleichen Pflanze darstellt. In dieser Kurve könnte es erscheinen, dass Mannitol mehr als 35 Prozent der gesamten Menge von in Wurzelmaterial messbaren Zuckern darstellt, und scheint mindestens mehrfach größer zu sein als das Vorkommen von Saccherose innerhalb dieses Gewebes.
Dieses Ergebnis ist unerwartet und sehr überraschend. Da Mannitol innerhalb des Gewebes von Tabakpflanzen nicht natür licherweise vorkommt, würde man nicht erwarten, dass innerhalb der Pflanze ein Transportmechanismus existieren würde, der in der Lage ist, Mannitol effizient aus den Blättern in die Wurzel zu transportieren. Solch ein System existiert aber offensichtlich, da der Promotor, der das Mannitol in den Pflanzen durch in den Chromatogrammen von 5 aufgetrennten löslichen Zuckern hervorbringt, mit einem licht-aktivierten Promotor transformiert war. Dementsprechend würde dies darauf hindeuten, dass Mannitol in den Blättern gebildet und durch einen noch uncharakterisierten Mechanismus aus den Blättern durch die Pflanzen zur Speicherung in die Wurzeln transportiert wird. Das Vorhandensein solch signifikanter Gehalte eines osmotischen Schutzstoffes in der Wurzel bietet deutlich ein Potential zur Stressentlastung für die Pflanze, da es die Pflanze weniger anfällig gegenüber Abweichungen im Feuchtigkeitsgehalt innerhalb der Erde macht.
Obwohl dieses Ergebnis durch die bis heute durchgeführte Forschung nicht bestätigt werden kann, beweist es deutlich, dass einzigartige und überraschende Effekte durch Gehalte löslicher Zucker von Pflanzengeweben durch Anwendung dieser Technologie erzeugt werden können, die Ergebnisse haben, die überraschend und eindeutig nützlich sind in der Forschung, mit der die Mechanismen der Speicherung und des Transports von Pflanzenzucker genauer ermittelt werden sollen.
Pflanzengewebe können in der Zukunft auch mit Pflanzenexpressionsvektoren transformiert werden, die so konstruiert sind, dass ein Transitpeptid zum Chloroplastentransport einschließen. Es wird erwartet, dass die einen solchen Vektor exprimierenden wiederhergestellten transgenen Pflanzen Mannitol bevorzugt in den Chloroplasten anreichern werden. Feldversuche werden zeigen, in welchem Ausmaß eine derartige Anreicherung zusätzliche Resistenz gegenüber Feuchtigkeitsstress unter Feldbedingungen verleihen wird.
Salztoleranztest von transgenen Pflanzen
Ein kontrollierter Test wurde durchgeführt, der die Stresstoleranz gegenüber Salz von sowohl den transgenen Tabakpflanzen als auch Kontrollen, d. h. untransformierten Tabakpflanzen, vergleicht, um zu überprüfen, ob die Effekte der Einführung des Mtl1D-Gens in die transgenen Pflanzen wirklich zu Toleranz gegenüber Stressbedingungen führt oder nicht. Der Test wurde unter Verwendung von Salztoleranz durchgeführt, mit Salzkonzentrationen von der Hälfte des Seewassergehaltes.
Das Wachstum für jeweils Kontroll-(untransformiert) und transgenen, das Mtl1-Gen exprimierenden Tabakpflanzen wurde im Hinblick auf Salztoleranz abgeschätzt. Sowohl Kontrollpflanzen und Transformanden wurden hydroponisch im selben Kulturraum angezogen. Nach vier Wochen in Wasserkultur ohne Salz ausgesetzt zu sein, erhielten Gruppen von sowohl Kontroll- als auch transgenen Pflanzen Nährlösungen, die mit 250 mM NaCl versetzt waren. Die anderen verbliebenen Pflanzen erhielten ausschließlich Nährlösung. Alle Pflanzen wurden in Intervallen von drei bis vier Tagen bis zum Ablauf eines Monats fotografiert. Nach einem Monat Kultur unter diesen Bedingungen wurden Größe, Frischgewicht und Mannitolgehalt in der Wurzel und den Blättern dieser Pflanzen bewertet. Wachstumsumfänge einer Gesamtmenge von drei unabhängigen Transformanden wurden mit den Kontrollen verglichen. Jede experimentelle Gruppe (eine Gesamtheit von dreien) enthielt mindestens vier Replikate von jeweils den Kontrollen und den Transformanden.
In Abwesenheit von NaCl zeigten sowohl die Kontrollen als auch die transgenen Pflanzen keinen signifikanten Unterschied in Höhe, Beginn der Blütenbildung oder beim Frischgewicht in Prozent des Startgewichts zu Beginn des Experiments. Jedoch hatten die Mannitol-bildenden transgenen Pflanzen in jeder ex perimentellen Gruppe, die Salz in der Nährlösung ausgesetzt war, am Ende des Experimentes signifikant größere Masse. Die typische transgene Pflanze erschien sichtbar robuster und weniger chlorotisch, als es die Kontrollpflanzen taten. In einigen Fällen überlebten die Mannitol-synthetisierenden transgenen Pflanzen die Salzbehandlung nicht nur, die Pflanzen wuchsen weiter und blühten letztlich. In nahezu allen Fällen waren die der Salzbehandlung ausgesetzten Kontrollpflanzen unfähig, zu überleben. Da die das Mannitol-Bildungsmerkmal enthaltenden transgenen Pflanzen in der Salzlösung wuchsen, waren ihre Höhen signifikant größer als die der Kontrollen. Ein Eins-zu-Eins-Vergleich von Pflanzen mit und ohne Salz zeigte, dass sowohl Kontroll- als auch transgene Pflanzen, die einer Nährlösung mit Salz nicht ausgesetzt waren, höher wuchsen, früher blühten und eine größere Gesamtgröße aufwiesen verglichen mit Pflanzen, die der Salzlösung ausgesetzt waren. Ein ähnlicher Vergleich von Pflanzen, die der Salzlösung ausgesetzt waren, zwischen den Kontrollen und den transgenen Pflanzen zeigte jedoch, dass die transgenen Pflanzen signifikant größer wuchsen, blühten und eine größere Gesamtgröße hatten, als die der Salzlösung ausgesetzten Kontrollpflanzen.
Ermöglichung weiterer Konstrukte
Die vollständige Nukleotidsequenz des mt1D-Gens und die Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins sind unten angegeben. Pflanzengenetiker mit durchschnittlichen Fähigkeiten werden in der Lage sein, diese Sequenz zu verwenden, um die Expression von mt1D-Genen entweder durch Verwendung von Hybridisierung oder Probing zu erreichen, um die Gene aus E. coli zu gewinnen, oder um synthetische kodierende Sequenzen unter Verwendung von Oligonukleotiden zu konstruieren. Wie es auch erreicht wird, wenn die kodierende Sequenz einmal erhalten wurde, ist es möglich, geeignete Pflanzenexpressionsvektoren wie die oben beschriebenen zur Transformation in Pflanzen zu konstruieren. Es wird vorausgesehen, dass solche Pflanzenexpressionsvektoren für die Verwendung mit einer Vielzahl von Nutzpflanzen, anderen als der hier beschriebenen Modellart Tabak, konstruiert werden, so dass Mannitol in Pflanzengeweben, die dieses Polyol nicht natürlicherweise erzeugen, gebildet werden kann.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für das mt1D-Gen und das entsprechende M1PD-Enzym sind unten dargelegt. Während unter Berücksichtigung des momentanen technischen Standes in der Sequenzanalyse und Sequenzverarbeitung angenommen wird, dass diese Sequenzen vollständig richtig sind, können gelegentliche Basenpaarfehler vorhanden sein. Derartige Fehler werden die Verwendung dieser Sequenz durch Fachmänner auf dem Fachgebiet ohne übermäßiges Experimentieren nicht verhindern.
Beispiel 2: Pflanzliches Imt1-Gen
Identifizierung des Gens
Diese Arbeit wurde durchgeführt, um die durch die Umwelt induzierten Veränderungen in den Expressionseigenschaften zu identifizieren, die an der Adaption der Eispflanze an Salzstress beteiligt sind. Dies wurde durch Konstruieren und differentielles Durchmustern einer mit Stress-induzierten Sequenzen angereicherten subtrahierten cDNA-Bibliothek erreicht. Zuerst wurde cDNA aus poly A⁺RNA generiert, die aus sieben Wochen alten, auf Erde angezogenen Pflanzen isoliert wurde, die mit 500 mM NaCl für zehn Stunden gestresst wurden. Nach zehn Stunden Salz-Exposition beginnen sich normale Eispflanzen von dem Stress-induzierten transientem Welken zu erholen und beginnen die mRNAs anzureichern, die mit den Veränderungen der notwendigen metabolischen Eigenschaften der Pflanze verbunden sind. Drei Runden differentielles Durchmustern von ungefähr 10⁵ Plaques mit markierten Erststrang-cDNAs aus gestressten und ungestressten Pflanzen brachte acht Inserts hervor, die in den gestressten Pflanzengeweben durchgehend häufiger vorkamen. Kreuzhybridisierungsexperimente deuteten an, dass die Inserts drei getrennte Klone darstellen. Einer dieser Klone, ein 1,6 kBp-Insert, das nun als Imt1 bezeichnet wird, wurde für weitere Analysen ausgewählt.
Expression der Imt1-mRNA
Auf Northern-Blots mit RNA, die in Wurzeln und Blattgeweben von hydroponisch angezogenen Eispflanzen gebildet wurde, wurde die Expression des Imt1-Transkripts analysiert. Gesamt-RNA wurde aus ungestressten Pflanzen und auch aus Pflanzen isoliert, die zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf einer sechstägigen Stressbehandlung mit 400 mM NaCl geerntet wurden. Die Imt1-cDNA-Sonde hybridisierte an eine Salinitätsinduzierte mRNA von ungefähr 1,6 kBp in sowohl der Blatt- als auch der Wurzel-RNA. Die Induktionsmuster differierten zwischen Blatt- und Wurzelgeweben. Das Imt1-Transkriptionsprodukt war in ungestresstem Blattgewebe in sehr kleinen Mengen vorhanden. Das Transkript reicherte sich graduell in gestressten Blättern an, detektierbar nach sechs Stunden Stress, aber unauffällig bis zum zweiten Tag nach ungefähr 30 Stunden Stress. Anreicherung des Transkriptes in Blättern erreichte ein Maximum am sechsten Tag der Salzstressbehandlung. Im Gegensatz dazu war das Imt1-Transkript in Wurzelgeweben transient hochreguliert, von nicht detektierbaren Gehalten ansteigend bis hin zu einer maximalen Stärke der Expression während des zweiten Stresstages. Interessanterweise verschwand die mRNA zum Zeitpunkt der maximalen Expression in Blättern vollständig aus den Wurzeln. Blotverdünnungen von jeweils Blatt- und Wurzel-RNA deuteten an, dass zu Zeiten der höchsten relativen Expression das Transkript in Blättern 25 Mal häufiger war als in Wurzeln.
Genomische Analyse
Das in Blättern und Wurzeln induzierte Imt1-Transkript ist durch ein einzelnes nukleäres Gen oder möglicherweise eine kleine, miteinander in Beziehung stehende Genfamilie kodiert. Genomische DNA aus dem Kern der Eispflanze wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und auf einem 1%-Agarosegel aufgetrennt und zusammen mit dem Äquivalent der Zahl der genomischen Kopien der klonierten cDNA aus SEQ ID: NO: 3 (siehe unten) Southern-geblotted. Die Blots wurden mit ³²P-markierten cDNA-Fragmenten untersucht ("probed") und mit einem Beta-Scanner (Betagen, Inc.) die Signalintensitäten quantifiziert. Die Sonden waren entweder für die 5'-kodierende Region oder das 3'-nicht-kodierende Ende der cDNA spezifisch. Die Sonden hybridisierten mit einzelnen Banden gleicher Intensität in jeder Spur. Die hochstringenten Waschbedingungen waren mit denen für Northern-Blots verwendeten identisch. Ein Vergleich der Bandenintensitäten mit ihren Kopienzahlrekonstituenten legt nahe, dass die Banden wahrscheinlich ein einzelnes Gen repräsentieren.
Sequenzanalyse
Die Sequenz der cDNA wurde bestimmt, um Einblick in die biochemische und physiologische Funktion des Imt1-Proteins zu erlangen. Diese Sequenz ist als SEQ ID: NO: 3 unten angegeben. Die Sequenz ist 1524 Basenpaare lang. Die Sequenz enthält einen Leader, der reich A- und T-Resten ist, und ein ATG-Startcodon gefolgt von einem nicht-unterbrochenen Leserahmen von 1095 Nukleotiden. Das 3'-Ende der langen nicht-kodierenden Region von 383 Nukleotiden umfasst zwei mögliche Adenylierungs-Erkennungssequenzen stromaufwärts von dem 31-Basenpaar langen polyA-Schwanz.
Die aus den Imt1-Kernsequenzdaten abgeleitete, vorhergesagte Proteinsequenz ist unten als SEQ ID: NO: 4 gezeigt. Dieses vorhergesagte Polypeptid von 365 Aminosäuren wäre hydrophil mit einer molekularen Masse von 40 kD.
Expression von Imt1 und E. coli
Die kodierende Region des Imt1-Gens aus SEQ ID: NO: 3 (siehe unten) wurde in einen Expressionsvektor zur Expression in dem bakteriellen Wirt E. coli eingeführt, um die enzymatische Aktivität des durch das Imt1-Gen kodierte Protein zu überprüfen. Der vollständige offene Leserahmen von Imt1 wurde als eine transkriptionelle Fusion in beiden Orientierungen hinter die T7-Polymerasepromotoren in einen Bluescript KS+-Vektor kloniert.
Die Konstrukte wurden in Zellen des E. coli-Stamms BL21 (DE3) transformiert, die das für die T7-Polymerase kodierende Gen unter der Kontrolle eines Isopropyl-beta-thiogalaktosid (IPTG)-induzierenden Promotors enthielt. Von einer zufällig lokalisierten AAGAG-Sequenz im 5'-Leader der cDNA wurde vorhergesagt, dass sie in E. coli als Ribosomenbindungsstelle fungieren wird. IPTG wurde vier Stunden vor Ernte in einer Endkonzentration von 0,5 mM zu den Kulturen gegeben. Die Proteinexpression wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf 10%-Acrylamidgelen analysiert. Proben wurden durch Kochen von Aliquots der transformierten E. coli-Kulturen für zwei Minuten im gleichen Volumen SDS-Extraktionspuffer hergestellt.
Das lösliche Protein aus mit dem Imt1-Expressionskonstrukt oder unverändertem Bluescript KS+-Vektoren transformierten E. coli wurde aus mit 2500 g für zehn Minuten zentrifugierten 20–200 ml Kulturen extrahiert und in Methyltransferase-Extraktionspuffern (MTEB) resuspendiert, indem ein ml des MTEB-Puffers pro 20 ml der E. coli-Kultur verwendet wurden. Der MTEB-Puffer enthält 100 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTR und 1 ml beta-Mercaptoethanol pro 20 ml Kultur. Die Zellen wurden durch Ultraschall lysiert und die Extrakte durch Zentrifugation bei 10000 g für 20 Minuten geklärt. Die Gesamtproteinkonzentration wurde bestimmt. Überstände wurden entweder sofort für Tests verwendet oder mit 5% Glycerin bei –70°C gelagert.
Mit dem so extrahierten gelösten Protein wurden Methyltransferase-Tests durchgeführt. 1 mg lösliches Gesamtprotein enthaltende Aliquots von 200 Mikroliter Volumen wurden in 50 mM Tris-Cl pH 8, in mM MgCl, und 1,0 mM myo-Inositol gelöst. Die Tests wurden bei 30°C für fünf Minuten vorinkubiert und durch Zugabe von 5-Adenosyl-1-Methionin(SAM) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM gestartet. SAM-Vorratslösung enthielt unmarkiertes SAM (Sigma) und ¹⁴C-markiertes SAM (ICN Biochemicals) in einem Verhältnis von 50 : 1. Die Tests wurden für 30–120 Minuten bei 30°C ausgeführt und durch Transfer auf Eis und Chloroformextraktion beendet. Die wässrige Phase wurde einer weiteren Behandlung in der HPLC-Analyse zugeführt.
Für die HPLC-Analyse wurden die Proben durch Extraktion mit der zweifachen Menge Methanol/Chloroform/Wasser (12 : 5 : 3), gefolgt von der Zugabe von 0,4 ml Wasser vorbereitet. Eine Entsalzungssäule von HG50WX4 (BioRad) in Amberlite IRA-68 (Sigma) in OH-Form wurde verwendet, um die Extrakte zu entsalzen und um Ladungen zu entfernen. Die Proben wurden getrocknet, in deionisiertem Wasser gelöst und durch eine Nylon-Acrodisc 13 (Gelman) gefiltert. Gleiche Mengen gelöster Kohlenhydrate aus jedem Ansatz wurden in einer 300 × 7,8 mM HPX 78 C Kalziumform-Ligandenaustauschsäule (BioRad) bei 85°C mit einer Flussrate von 0,6 ml pro Minute unter Verwendung von entgastem, deionisiertem Wasser als Laufmittel aufgetrennt. 0,6 ml pro Minute Nachsäulen-NaOH wurden mit 0,3 M zugegeben und Spuren wurden durch Verwendung eines amperometischen Pulsdetektors bei 35°C und eines Spectrophysic SP4290-Integrators erhalten. Fraktionen wurden in 7,5 Sekunden- oder 0,5 Minuten-Intervallen gesammelt und die Szintillation gezählt.
Das Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, dass das Imt1-Gen für eine SAM-abhängige myo-Inositol-O-Methyltransferase kodiert. Das mit radioaktiven Kohlenstoff markierte Produkt der Tests der E. coli-Extrakte war auf HPLC-Auswertungen als deutlicher Peak mit einer Retentionszeit von etwas unter 11,1 Minuten sichtbar. Der gleiche Peak war in Ansätzen aus Kontrollextrakten nicht vorhanden. Um zu beweisen, dass das durch das Imt1-Protein gebildete methylierte myo-Inositol Ononitol, das methylierte Zwischenprodukt in der Pinitol-Biosynthese, war, wurde seine Retentionszeit mit der Retentionszeit von Methyl-myo-Inositol-Standards verglichen. Es gibt vier Mono-Methyl-myo-Inositol-Isomere: Sequoyitol, Ononitol und D-1-Bornesitol. Nur Ononitol und Sequoyitol sind mögliche Vorläufer für Pinitol und nur Ononitol wurde als das Vorläufer für Pinitol in Angiospermen dokumentiert. Extrakte aus E. coli-Kontrollen wurden mit derartigen Standards versetzt und parallel durch HPLC analysiert. Die Retentionszeiten von Sequoyitol und Bornesitol betrugen jeweils 11,5 und 12,2 Minuten. Ononitol zeigte jedoch eine Retentionszeit, die identisch war mit der des Reaktionsproduktes aus den transformierten E. coli.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das isolierte Imt1-Gen, dessen Sequenz unten angegeben ist, für eine induzierte Bildung einer Polyolanreicherung als Teil der Stressantwort der Eispflanze verantwortlich ist. Da die vollständige kodierende Sequenz der das Protein kodierenden Region dieses Gens unten angegeben ist, ist der Einbau dieses Gens in Klonierungsvektoren und die Einführung in transgene Pflanzen nun möglich. Da das Substrat myo-Inositol, mit dem das Enzym arbeitet, in Pflanzengeweben allgegenwärtig ist, wurde hier ein weiterer Mechanismus präsentiert, der zur Übertragung in andere Pflanzenarten geeignet ist, um die Anreicherung von nicht- natürlicherweise vorkommenden Polyolen in diesen Pflanzenarten zu induzieren.
Es ist ferner verständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die besonderen hier beschriebenen besonderen Ausführungsformen zu beschränken ist, sondern alle solche Modifikationen und Variationen davon umfasst, die sich im Umfang der folgenden Ansprüche ergeben.
SEQUENZLISTE

Claims

Transgene Pflanze, die in ihren Zellen als vererbbares, genetisches Merkmal ein fremdes Gen umfasst, das die Expression eines Enzyms bedingt, das die Bildung eines Polyols in den Geweben der Pflanze aus natürlicherweise in der Pflanze vorkommenden Substanzen katalysiert, wobei das Polyol in den Geweben der Pflanze natürlicherweise nicht gebildet wird und das Polyol in der Pflanze ohne nachteilige Auswirkungen auf die Pflanze akkumuliert.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, bei der das Polyol Ribitol, Erythritol, Xylitol, Arabitol, Sorbitol, Inositol, Methyl-Inositol, Dulcitol, Galactitol, Heptitol oder Mannitol ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Enzym bakteriellen Ursprungs ist.
Transgene Pflanze, die in ihren Zellen als vererbbares, genetisches Merkmal ein fremdes Gen umfasst, das die Expression eines Enzyms bedingt, das die Bildung von Mannitol in den Geweben der Pflanze aus einer natürlicherweise in den Pflanzen vorkommen Substanz katalysiert.
Transgene Pflanze nach Anspruch 4, die einer Art angehört, die in ihren Zellen Mannitol natürlicherweise nicht in Mengen von mehr als 5 mM bildet, wobei die transgene Pflanze in ihren Zellen mehr als 100 mM Mannitol umfasst.
Transgene Pflanze nach Anspruch 4 oder 5, bei der das fremde Gen in Form eines genetischen Konstruktes vorliegt, das eine ein Protein kodierende Region und flankierende regulatorische Sequenzen einschließt und das in der Lage ist, ein Protein zu exprimieren, das durch die kodierende Region in den Zellen der Pflanze kodiert ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei der das Enzym die Bildung von Mannitol-1-P aus Fruktose-1-P katalysiert.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 4 bis 7, bei der das Enzym eine Mannitol-1-P-Dehydrogenase, wie eine bakterielle Mannitol-1-P-Dehydrogenase, ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 8, bei der das Enzym natürlicherweise in E. coli vorkommt.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 4 bis 9, bei der das Enzym ein Protein ist, das die Sequenz von SEQ ID NO: 2 hat.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 4 bis 10, bei der das Enzym m1PD ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei der die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei der die Pflanze Tabak ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei der das fremde Gen im Kerngenom oder Chloroplastengenom der Pflanze beherbergt ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die eine erhöhte Toleranz gegenüber Salzstress aufweist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei der das fremde Gen durch Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation in einen Vorläufer der Pflanze eingeführt und durch Mendelsche Vererbung an die Pflanze weitergegeben wurde.
Samen der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Samen das fremde Gen umfasst, das die Expression eines Enzyms bedingt, das die Bildung von in den Geweben der Pflanze natürlicherweise nicht gebildetem Polyol katalysiert.
Verfahren zur Veränderung der Zuckeralkohol-Bestandteile einer Nutzpflanzenart, welches das Einführen eines Gens in das Genom der Nutzpflanze durch genetische Manipulation umfasst, wobei das Gen ein Enzym exprimiert, das in den Zellen der Pflanze die Bildung eines in Pflanzen der Pflanzenart natürlicherweise nicht gebildeten Zuckeralkohols aus einem natürlicherweise in Pflanzen der Pflanzenart gebildeten Zucker katalysiert.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die genetische Manipulation mittels eines Agrobacterium-Transformationsverfahrens durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, bei dem das Enzym bakteriellen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 18, 19 oder 20, bei dem der Zuckeralkohol Mannitol ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das Enzym ein bakterielles Enzym ist, das die Dehydrogenierung von Mannitol reversibel katalysiert.