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Die vorliegende Erfindung betrifft
DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Oligosaccharid-Transporters
enthalten, deren Einführung
in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Speicherstoffen
in transgenen Pflanzen verändert,
Plasmide, Bakterien und Pflanzen, die diese DNA-Sequenzen enthalten, sowie
ein Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen, die
die Identifikation der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen pflanzlicher Oligosaccharid-Transporter
ermöglichen,
und die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen.
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Der wichtigste Transportmetabolit
für gespeicherte
Energie ist bei vielen Pflanzen, beispielsweise der Kartoffel, die
Saccharose. Bei anderen Spezies können andere Oligosaccharide
diese Rolle einnehmen. Bei der japanischen Artischocke ist dies
beispielsweise die Stachiose.
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Die zentrale Stellung der Transport-Oligosaccharide
im Energiehaushalt der Pflanze wurde bereits an transgenen Pflanzen
gezeigt, bei denen durch Expression einer Invertase die Saccharose in
die Monosaccharide gespalten wird, wodurch erhebliche Veränderungen
im Habitus herbeigeführt
werden (
EP 442 592 ).
Wegen der Bedeutung der Saccharose bei der Bildung von Speicherstoffen
sind zahlreiche Versuche unternommen worden, die Biosynthese oder
den Metabolismus von Disacchariden zu untersuchen. Aus der
DE 42 13 444 ist die Verbesserung
der Lagereigenschaften von Ernteteilen transgener Kartoffeln, bei
denen durch Expression einer apoplastischen Invertase die Weiterleitung
von energiereichen Verbindungen an die heterotrophen Orte des Sprosswachstums
unterbunden ist, bekannt.
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Trotz der vielfältigen Bemühungen, den Mechanismus der
Verteilung von Speicherstoffen wie Oligosacchariden in Pflanzen
aufzuklären
und ihn zu beeinflussen, ist bisher nicht bekannt, wie die in den
Blättern in
der Folge der Photosyntheseprozesse gebildete Saccharose in die
Leitungsbahnen des Phloems der Pflanze gelangt und wie sie von den
Speicherorganen, z. B. den Knollen von Kartoffelpflanzen oder den
Samen, aufgenommen wird. An isolierten Plasmalemma-Membranen von
Zellen des Blattgewebes der Zuckerrübe Beta vulgaris wurde demonstriert,
dass der Transport von Saccharose durch die Membran bei Erzeugen
eines künstlichen
pH-Gradienten induziert und durch Erzeugen eines elektrochemischen
Potentials intensiviert werden kann (Lemoine & Delrot (1989) FEBS letters 249:
129–133).
Der Membrandurchtritt der Saccharose folgt einer Michaelis-Menten-Kinetik,
der km Wert des Saccharose-Transports beträgt etwa 1 mM (Slone & Buckhout, 1991,
Planta 183: 484–589).
Diese Art der Kinetik lässt
auf die Beteiligung eines Transporter-Proteins schließen. Untersuchungen
an Plasmalemma-Membranen von Zuckerrübe, Ricinvs communis und Cyclamen persicum
weisen darauf hin, dass es sich beim Saccharosetransport um einen
Cotransport mit Protonen handelt (Buckhout, 1989, Planta 178: 393–399; Williams
et al., 1990, Planta 182: 540–545;
Grimm et al., 1990, Planta 182: 480–485). Die Stöchiometrie
des Cotransports beträgt
1 : 1 (Bush, 1990, Plant Physi ol. 93: 1590–1596). Es werden jedoch auch
Mechanismen diskutiert, die von einem Transport der Saccharose durch die
Plasmodesmen der Pflanzenzellen ausgehen (Robards & Lucas, 1990,
Ann. Rev. Plant Physiol. 41: 369–419). Trotz der Kenntnis der
Existenz eines aktiven Transportsystems, das den Zellen erlaubt,
Saccharose an die Leitungsbahnen abzugeben, ist ein Protein mit
derartigen Eigenschaften bisher nicht bekannt. Bei N-Ethylmaleinimid-Markierung
von Plasmalemma-Proteinen der Zuckerrübe in Gegenwart und Abwesenheit von
Saccharose erhielten Gallet et al. (1989, Biochem. Biophys. Acta
978: 56–64)
Hinweise darauf, dass ein Protein der Größe 42 kDa mit Saccharose interagieren
kann. Antikörper
gegen eine Fraktion von Plasmalemma-Proteinen dieses Größenbereichs
können
den Saccharose-Transport durch Plasmalemma-Membranen inhibieren
(Lemoine et al., 1989, Biochem. Biophys. Acta 978: 65–71). Im
Gegensatz dazu erhielten Ripp et al., 1988, Plant Physiol. 88: 1435–1445) bei
Photoaffinitätsmarkierung
von Proteinen aus Sojabohne mit dem Saccharoseanalogon Desoxyazidohydroxybenzamido-Saccharose
Hinweise auf die Beteiligung eines 62 kDa-Proteins am Transport
der Saccharose durch Membranen. Eine Aminosäuresequenz eines Saccharose-Transporters
ist nicht bekannt.
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Es werden nun DNA-Sequenzen gemäß Anspruch
1 beschrieben, die die Kodierregion eines Oligosaccharid-Transporters
enthalten, und deren in der Nukleotidabfolge enthaltene Information
bei Sequenzintegration in ein pflanzliches Genom die Bildung von
RNA erlaubt, mit deren Hilfe eine neue Oligosaccharid-Transporter-Aktivität in Pflanzenzellen
eingeführt
werden oder eine endogene Oligosaccharid-Transporter-Aktivität exprimiert
werden kann. Unter einem Oligosaccharid-Transporter ist z. B. ein
Saccharose-Transporter
aus Pflanzen wie Spinat oder Kartoffel zu verstehen.
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Die Identifikation der Kodierregion
der Oligosaccharid-Transporter wird über ein Verfahren durchgeführt, das
die Isolation von pflanzlichen DNA-Sequenzen, die Transporter-Moleküle kodieren,
mittels Expression in spezifischen Mutanten der Hefe Saccharomyces
cerevisiae erlaubt. Hierzu müssen
geeignete Hefe-Mutanten verfügbar
sein, die nicht in der Lage sind, eine Substanz aufzunehmen, für die aus
einer pflanzlichen Genbank die Kodierregion eines Transporter-Moleküls isoliert
werden soll. Es ist bereits ein Verfahren zur Komplementation einer
Kaliumtransport-Defizienz in Hefe-Mutanten bekannt (Anderson et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3736–3740). Hierbei werden mit
Hilfe von Expressionsvektoren cDNA-Sequenzen zu pflanzlicher mRNA
in Hefe-Mutanten exprimiert. Diejenigen Hefen, die nun in der Lage
sind, die zu transportierende Substanz in die Zellen aufzunehmen,
enthalten die Kodierregion für
ein Transporter-Molekül
im Expressionsvektor. Das bekannte Verfahren ist zur Identifikation
von Kodierregionen für
Saccharose-Transporter jedoch nicht anwendbar, da Hefen keinen endogenen
Saccharose-Transporter besitzen, der durch Mutation ausgeschaltet
werden könnte.
Hefen kodieren eine spaltende Invertase, die extrazellulär Saccharose
spaltet, so dass von der Zelle Hexosen über einen Hexosetransporter
aufgenommen werden können.
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Für
die Herstellung und Transformation von Hefestämmen, die der Identifikation
pflanzlicher Oligosaccharid-Transporter dienen, wird nun
- a) zunächst
ein Hefestamm mit einem defekten suc2 Gen durch homologe Rekombination
hergestellt und daraus anschließend
- b) durch Transformation mit einem Gen für eine Saccahrose-Synthase-Aktivität aus pflanzlichen
Zellen ein Hefestamm, der intrazellulär Saccharose spalten kann,
gewonnen und
- c) durch Transformation dieses Stammes mit einer pflanzlichen
Genbibliothek in einen Expressionsvektor für Hefezellen die DNA-Sequenz
identifiziert, die für
einen pflanzlichen Oligosaccharid-Transporter kodiert.
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Die über dieses Verfahren erhältlichen
Hefestämme
zur Identifikation von pflanzlichen Oligosaccharid-Transportern
sind z. B. die Hefestämme
YSH 2.64-1A-SUSY (DSM 7106) und YSH 2.64-1A-INV (DSM 7105).
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Mit dem Hefestamm YSH 2.64-1A-SUSY
kann eine DNA-Sequenz für
einen pflanzlichen Saccharose-Transporter identifiziert werden,
die die folgende Sequenz aufweist: Saccharose-Transporter
aus Spinat (Seq. ID No: 1):
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Die identifizierten DNA-Sequenzen
können
in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen zur Expression
in eukaryontischen Zellen kombiniert werden (siehe Beispiel 5).
Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptians-Promotoren
und andererseits Transkriptions-Terminatoren. Mit den auf den Plasmiden
enthaltenen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
können
eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression
einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Saccharose-Transporters in den Zellen
ermöglicht,
oder mit dem Ziel der Expression einer nicht translatierbaren RNA,
die die Synthese eines endogenen Saccharose-Transporters verhindert.
Durch Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz
eines pflanzlichen Oligosaccharid-Transporters ist eine Veränderung
des pflanzlichen Kohlenhydratmetabolismus möglich, deren wirtschaftliche
Bedeutung darin liegt, dass die Verbesserung der Weiterleitung von
Speicherstoffen an Ernteteile zu einer Ertragssteigerung von Nutzpflanzen
führt.
Die Möglichkeit einer
forcierten Aufnahme von Speicherstoffen in einzelne Organe erlaubt
die Veränderung
der Gestalt einer Pflanze, indem das Wachstum einzelner Gewebe verlangsamt
wird – beispielsweise
von Blättern,
während
das Wachstum von Ernteteilen begünstigt
wird. Hierbei ist an eine Verlängerung
der Vegetationsphase von Kulturpflanzen zu denken, die zu einer
vermehrten Bildung von Speicherstoffen führt.
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Es sind bereits Verfahren zur genetischen
Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (vgl. u.
a. Gasser, C.S., Fraley, R. T., 1989, Science 244: 1293–1299; Potrykus,
1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42: 205–225). Zur
Expression der kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese
mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden.
Solche Elemente, Promotoren genannt, sind bekannt (u. a.
EP 375 091 ).
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Ferner müssen die Kodierregionen mit
einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie
korrekt transkribiert werden können.
Derartige Elemente sind ebenfalls beschrieben (vgl. Gielen et al., 1989,
EMBO J. 8: 23–29).
Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog
als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Falls
gewünscht,
sind Terminationsbereiche gegeneinander austauschbar. Die DNA-Sequenz
der Transkriptionstart- und -terminationsregionen kann synthetisch
hergestellt oder natürlich
gewonnen sein oder aus einer Mischung aus synthetischen und natürlichen
DNA-Bestandteilen erhalten
werden. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen
sind eine große
Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar,
die ein Replikationssignal für
E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten
Zellen erlaubt. Beispiele für
Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M 13 mp-Serien, pACYC 184 usw..
Je nach Einführungsmethode
gewünschter
Gene in die Pflanze können
weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation
der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens
die rechte Begrenzung, häufig
jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid
T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden.
Die Verwendung von T-DNA für
die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und
ausreichend in
EP 120 516 ; Hoekama,
in: The Binary Plant Vektor System, Offest-Drukkerij Kanters B.V.
Alblasserdam, (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit Rev. Plant
Sci., 4: 1–46
und An et al., (1985) EMBO J. 4: 277–287 beschrieben worden. Ist die
eingeführte
DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil
und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle
erhalten. Sie enthält
normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen
Resistenz gegenüber
einem Biozid oder Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin,
Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell
verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen
gegenüber
Zellen, denen die eingefügte
DNA fehlt, ermöglichen.
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Für
die Einführung
von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation
mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese
Techniken umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion
von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden und Virusinfektion.
Aus den transformierten Pflanzenzellen können dann in einem geeigneten
Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten
kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen
Pflanzen können
dann auf Anwesenheit der eingeführten
DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind an
sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es
können
einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen
aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden,
ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Die
transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen
Weise (s. auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84). Diese
Pflanzen können
normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleichen transformierten
Gene oder andere Gene besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden
hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
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Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch
in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für eine Expression
in prokaryontischen Zellen kombiniert werden. Die Bildung einer
von Bakterien translatierbaren RNA-Sequenz eines eukaryontischen
Saccharosetransporters führt
trotz der erheblichen Unterschiede in den Membranstrukturen von
Pro- und Eukaryonten überraschend
dazu, dass Prokaryonten nun Saccharose aufnehmen können. Dies
ermöglicht
die Produktion von technisch interessanten Bakterienstämmen, die
auf dem sehr preisgünstigen
Substrat Saccharose wachsen können
(s. Beispiel 5). Beispielsweise ist die Produktion von Polyhydroxybuttersäure im Bakterienstamm
Alkaligenes eutrophus beschrieben (Steinbüchel & Schubert, 1989, Arch. Microbiol.
153: 101–104).
Das Bakterium nutzt jedoch nur eine sehr begrenzte Auswahl von Substraten.
Die Expression eines Gens für
einen Saccharose-Transporter u. a. in Alkaligenes eutrophus wäre daher
von großem
Interesse.
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Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch
in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung
durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen
Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Saccharose-Transporters
verändert
werden.
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Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl.
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.
Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche
vorgenommen oder natürliche
oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung
der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren
oder Linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende
Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA
oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo
Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen
und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder
Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im Allgemeinen
eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische
Methoden durchgeführt.
Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten
und mit einer anderen DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann
in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
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Derivate oder Teile der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
und Plasmide können
auch zur Transformation von prokaryontischen und eukaryontischen
Zellen verwendet werden. Ferner können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
dazu genutzt werden, nach Standardverfahren aus dem Genom von Pflanzen
verschiedener Spezies homologe Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls
Saccharose- oder andere Oligosaccharidtransporter kodieren. Mit
diesen Sequenzen können
Konstruktionen zur Transformation von Pflanzenzellen hergestellt
werden, die Transportvorgänge
in den transgenen Pflanzen verändern.
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Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen,
muss man zunächst
Genbanken anlegen, die für
den Gehalt von Genen einer Pflanzenart oder für die Expression von Genen
in einer Pflanzenart repräsentativ
sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNR-Banken. Aus diesen
können
mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
als Sonde verwandte Sequenzen isoliert werden. Hat man die dazugehörigen Gene
identifiziert und isoliert, ist eine Bestimmung der Sequenz und
eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten
Proteine möglich.
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Zum besseren Verständnis der
dieser Erfindung zugrundeliegenden Beispiele werden die Verfahren, die
dafür notwendig
und per se bekannt sind, zunächst
aufgeführt:
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1. Klonierungsverfahren
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Zur Klonierung wurden der Phage Lambda
ZAP II sowie der Vektor pBluescriptSK (Short et al., 1988, Nucl.
Acids Res. 16: 7583-7600)
verwendet.
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Für
die Transformation von Hefen wurden die Vektoren YIplac 128 und
YEplac 112 verwendet (Gietz & Sugino,
1988, Gene 74: 527-534).
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Für
die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor
pBinAR (Höfgen & Willmitzer, 1990,
Plant Sci. 66: 221–230)
kloniert.
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2. Bakterien- und Hefestämme
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Für
den pBluescriptSK Vektor sowie für
pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm XL1blue (Bullock et al.,
1987, Biotechniques, 5, 37–378)
verwendet.
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Als Ausgangsstamm für die Erzeugung
des erfindungsgemäßen Hefestammes
YSH 2.64-1A-susy wurde der Stamm YSH 2.64-1A (Gozalbo & Hohmann, 1990,
Curr. Genet. 17: 77–79)
verwendet.
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Die Transformation der Plasmide in
die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes
LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8720) durchgeführt.
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3. Transformation von
Agrobacterium tumefaciens
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Der Transfer der DNA in die Agrobakterien
erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988,
Nucleic Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde
nach der Methode von Birnboim & Doly
(1979, Nucl. Acids Res. 7: 1513–1523)
isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch
analysiert.
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4. Pflanzentransformation
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Zehn kleine, mit einem Skalpell verwundete
Blätter
einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose
gelegt, welches 30–50 μl einer unter
Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach
3–5 minüti gem, leichtem
Schütteln
wurden die Blätter
auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2 mg/ml Zeatinribose, 0,02 mg/l
Naphthylessigsäure,
0,02 mg/l Giberellinsäure,
500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto Agar ausgelegt.
Nach einwöchiger
Inkubation bei 25°C
und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
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Hinterlegungen
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Am 12.06.1992 wurden bei der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik
Deutschland, folgende Plasmide und Hefestämme hinterlegt (Hinterlegungsnummern):
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Beschreibung der Abbildungen
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1:
Zeitverlauf der Aufnahme von Saccharose in Hefe-Zellen. "pmol/mg Zellen =
Menge der aufgenommenen 14C-markierten Saccharose
in pmol, bezogen auf das Nassgewicht der Hefezellen in mg; "112" = Ausgangsstamm
(ohne Transporter); "+Glucose" = Vorinkubation
der Zellen in Medium mit 10 mM Glucose; "-Glucose" = keine Vorinkubation der Zellen; "2,5 μMCCCP" = Coinkubation mit
dem Inhibitor Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP) in der
Konzentration 2,5 μM; "500 μMPCMBS" = Coinkubation mit
dem Inhibitor Parachlormercuribenzolsulfonsäure (PCMBS) in der Konzentration
500 μM; "10 μM Antimycin" = Coinkubation mit
dem Inhibitor Antimycin in der Konzentration 10 μM.
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2:
Klonierung des Plasmids pMA5-INV. Darstellung der Insertion des
2,4 kb großen
HindIII Fragments aus pSEYC 306-1 in pMA5-10.
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3:
zeigt das Plasmid pBinAR-S21. Darin bedeuten:
| CaMV
35S Promoter: | Promotor
des Gens für
die 35S RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus |
| A: | Kodierregion
des Saccharose-Transporters
aus Spinat, in Leserichtung orientiert |
| OCS: | Terminator
des Octopinsynthase-Gens aus Agorbacterium tumefaciens |
| SmaI,
NotI, BamHI: | Schnittstellen
der Restriktionsenzyme |
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4:
zeigt das Plasmid pBinAR-P62-anti. Darin bedeuten:
| CaMV
35S Promoter: | Promotor
des Gens für
die 35S RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus |
| OCS: | Terminator
des Octopinsynthase-Gens aus Agorbacterium tumefaciens |
| SmaI,
SacI, BamHI, | Schnittstellen
der Restriktionsenzyme |
| XbaI: | |
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5:
Gehalt verschiedener Kohlenhydrate in Blättern von BinAR-P62-anti Transformanden.
Darin bedeuten:
| fru: | Fruktose |
| suc: | Saccharose |
| sta: | Stärke |
| Kontrolle: | nichttransformierter
Starterpflanzen |
| sp-5
bis sp-43: | Transformanden
mit individuellen Nummern |
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6:
Kohlenhydrat-Efflux aus den Blattstielen von BinAR-P62-anti Transformanden.
| wt: | Wildtyp |
| sp-5
bis sp-43 | Transformanden
mit individuellen Nummern |
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Die nachfolgenden Beispiele beschreiben
die Herstellung der Hefestämme,
die Identifikation sowie die Funktion und Verwendung eines pflanzlichen
Saccharose-Transporters.
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Beispiel I
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Herstellung der Hefestämme YSH
2.64-1A-SUSY und YSH 2.64-1A-INV Der Hefestamm YSH 2.64-1A hat die
Eigenschaften suc2-, ma10, leu2, trp1 (Gozalbo & Hohmann, 1990, Curr. Genet. 17:
77–79).
Um in diesen Stamm eine enzymatische Aktivität zur Spaltung von Saccharose
einzuführen,
wurde er mit dem integrativen Plasmid YIp1ac128A2-SUSY transformiert,
das die Kodierregion der Saccharose-Synthase von Kartoffel als Fusion
an den Promotor des Gens für
Alkoholdehydrogenase aus Hefe enthält. Das Plasmid YIp1ac128A2-SUSY
wurde wie folgt hergestellt. Das Plasmid YIplac128 (Gietz & Sugino, 1988,
Gene 74: 527-534) wurde durch Schnitte mit PstI und EcoRI, Abbau
und/oder Auffüllen überhängender
Einzelstränge und
Ligation im Bereich des Polylinkers verkürzt. In die verbliebene SphI
Schnittstelle wurde eine 728 by Kassette mit dem Promotor der Alkoholdehydrogenase
aus dem Plasmid pVT102U (Vernet et al., 1987, Gene 52: 225–233) insertiert.
Dabei wurde YIp1ac128A2 erhalten. Die Kodierregion der Saccharose-Synthase
wurde durch Polymerase-Kettenreaktion mit den Oligonukleotiden SUSY1
(GAGAGAGGATCCTGCAATGGCTGAACGTGTTTTGACTCGTG) und SUSY2 (GAGAGAGGATCCTTCATTCACTCAGCAGCCAATGGAACAGCT) an
einem Lambda-Klon
der Saccharose-Synthase aus Kartoffel (Salanoubat & Belli ard, 1987,
Gene 60: 47–56) amplifiziert.
Aus dem Produkt wurde die Kodierregion als BamHI-Fragment präpariert
und in die BamHI-Schnittstelle
des Polylinkers der Kassette insertiert. Mit dem so hergestellten
Plasmid YIp1ac128A2-SUSY wurde der Hefestamm YSH 2.64-1A transformiert.
Da das Plasmid nicht die 2μ Region
trägt,
kann es in Hefe nicht autonom repliziert werden. Deshalb erhalten
nur solche Transformanden die Leucin-Auxotrophie, die die Plasmid-DNA
zumindest teilweise chromosomal integrieren.
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Leucin autotrophe Kolonien wurden
auf Expression des Saccharose-Synthase
Gens hin analysiert. Hierzu wurden Zellen einer 5 ml Flüssigkultur
unter Zusatz von Glasperlen durch starkes Schütteln aufgeschlossen, anschließend wurde
nach Zentrifugation Gesamtprotein aus dem Überstand für eine Enzymaktivitätsmessung
eingesetzt. Die Aktivität
der exprimierten Saccharose-Synthase beträgt 25 mU/mg Protein.
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Analog wurde eine Invertase-Aktivität in den
Hefestamm YSH 2.64-1A
eingeführt,
indem mit Hilfe des Plasmids YIplac128A1-INV ein Gen für eine cytosolische,
nicht spaltbare Invertase chromosomal ins Hefegenom integriert wurde.
YIplac128A1-INV enthält
anstelle der Kodierregion für
Saccharose-Synthase ein Invertase-Gen, dem die Signalsequenz für Export
des Genprodukts fehlt. Der Vorläufer
des Plasmids ist das Plasmid YIplac128A1, das sich von Y-Iplac128R2 in der
Orientierung des Polylinkers in der Kassette mit dem Promotor des
Alkoholdehydrogenase-Gens unterscheidet. Die Kassette für dieses
Plasmid stammt aus dem Plasmid pVT100U (Vernet et al., 1987, Gene
52: 225–233).
Mit den Oligonukleotiden INV3 (GAGCTGCAGATGGCAAACGAAACTAGCGATAGACCTTTGGTCACA)
und INV4 (GRGACTAGTTTATAACCTCTATTTTACTTCCCTTRCTTGGAA) wurde die
Kodierregion der Invertase durch eine Polymerase-Kettenreaktion
an DNA des suc2 Gens gewonnen. Die Kodierregion wurde als PstI/SpeI Fragment
in den mit Hilfe von PstI und XbaI linearisierten Vektor YIplac128A1
ligiert. Ein Test der enzymatischen Aktivität der in den Hefezellen exprimierten
Invertaseaktivität
ergab eine Enzymaktivität
von 68 mU/mg Gesamtprotein aus Hefezellen.
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Beispiel 2
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Klonierung
der cDNA eines pflanzlichen Saccharose-Transporters
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Von polyadenylierter RNA aus Blattgewebe
wachsender Spinat- und Kartoffelpflanzen wurde eine cDNA Bibliothek
im Phagen Lambda ZAP 11 angelegt. Von 500 000 Pfu wurde die Phagen-DNA
präpariert
und über
einen Cäsiumchlorid-Sarcosyl-Gradienten
gereinigt. Nach Schneiden der Phagen-DNA mit dem Enzym NotI wurden
Insertionen aus den Größenbereichen über und
unter 1,5 kbp aus einem 1%-igen Agarosegel präpariert und in die NotI Schnittstellen
des Expressionsvektors YEplac112A1NE ligiert. Der Vektor ist ein
Derivat des Vektors YEplac112 (Gozalbo & Hohmann, 1990, Curr. Genet. 17:
77–79),
bei dem wie in Beispiel 1 beschrieben der Polylinker gegen eine
Kassette mit dem Promotor des Alkoholdehydrogenasegens ausgetauscht
wurde. Der Polylinker der Kassette wurde durch Schneiden mit den
Enzymen PstI und XbaI wiederum entfernt und gegen ein doppelsträngiges Oligonukleotid
ersetzt, das eine NotI und eine EcoRI Schnittstelle einführt (Sequenz:
GATCCGCGGCCGCCCGGAATTCTCTAGACTGCA). Etwa 90 000 Klone für den Größenbereich
unter 1,5 kbp und etwa 40 000 Klone für den Größenbereich über 1,5 kbp wurden bei Transformation
in E. coli erhalten. Von diesen wurde Plasmid-DNA präpariert.
Vierzehn mal wurden 2 μg
DNA in den Hefestamm YSH2.64-1A suc-.susy transformiert. Transformanden
wurden auf Medium mit 2% Glucose angezogen, und jeweils fünf- bis
zehntausend wurden mit Flüssigmedium
von Agarplatten abgespült
und auf Saccharose-haltiges Medium ausplattiert. Die Kolonien, die
schneller wachsen konnten, wurden weiter analysiert. Die Insertion in
den Vektor YEplac112A1NE der Transformanden S21 oder P62 (YEplac112A1NE-S21)
wurden sequenziert. Die Sequenzen sind oben wiedergegeben.
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Beispiel 3
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Analyse von
Saccharose metabolisierenden Hefe-Transformanden
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Der Hefe-Transformand YEplac112A1NE-S21,
der entsprechend Beispiel 2 erhalten wurde, wurde in Flüssigmedium
angezogen, bis die Kultur die logarithmische Phase erreicht hatte.
Nach Zentrifugation der Kultur wurden die Zellen in Medium mit Glukose
einer Vorinkubation für
5 Minuten unterzogen und dann in Medium mit 14C-markierter
Saccharose aufgenommen. Die Aufnahme der markierten Saccharose wurde
nach dem von Cirillo (1989, Meth. Enzymol. 174: 617–622) beschriebenen
Verfahren gemessen. Die Aufnahme der markierten Saccharose wurde
mit derjenigen ohne Vorinkubation mit Glukose sowie denjenigen bei
Coinkubation mit den Inhibitoren Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon
(CCCP), Parachlormercuribenzolsulfonsäure (PCMBS) und Antimycin verglichen.
Der Zeitverlauf ist in 1 wiedergegeben.
Die berechnete Reduktion der Saccharoseaufnahme durch Inhibitoren
ist in der Tabelle F aufgeführt.
Ein Kompetitionsexperiment mit verschiedenen Zuckern als Kompetitor
der markierten Saccharose, aus dem die Spezifität des Transporters abgelesen
werden kann, ist in Tabelle II gezeigt.
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Analoge Messungen wurden mit dem
Hefestamm YEplac112A1NE-P62 durchgeführt. Diese ergaben ähnliche
Ergebnisse.
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Beispiel 4
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Transformierung
von Bakterienstämmen
mit DNA-Sequenzen zur Expression einer Saccharose-Transporter-Aktivität
-
Um aufgenommene Saccharose metabolisieren
zu können,
benötigen
Bakterienzellen eine enzymatische Aktivität zur Spaltung in Mo nosaccharide.
Zur Einführung
einer solchen Aktivität
wurden Bakterien mit dem Plasmid pMA5-INV transformiert und bezüglich der
Invertase-Aktivität
untersucht. Das Plasmid pMA5-INV wurde wie folgt hergestellt. Das
Plasmid pMA5-10 (Stanssens et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17: 4441–4454) wurde
an der HindIII Schnittstelle des Polylinkers linearisiert. In die
HindIII Schnittstelle wurde das 2,4 kb HindIII Fragment des Plasmids
pSEYC306-1 (Taussig & Carlson,
1983, Nucl. Acids Res. 11: 1943–1954)
kloniert. Den entsprechenden Ausschnitt des Plasmids zeigt 2. Die enzymatische Aktivität der Invertase
in Bakterienzellen, die mit dem Plasmid pMA5-INV transformiert worden
waren, wurde nach bekannten Methoden in einem gelelektrophoretischen
Aktivitätstest
bestimmt. Die Möglichkeit
der Bildung eines funktionalen Saccharose-Transporters durch Expression
einer pflanzlichen cDNA in Bakterienzellen wurde durch Transformation von
E. coli mit dem Plasmid pSK-S21 untersucht. Das Plasmid ist in Beispiel
3 beschrieben. Nach Transformation von Bakterienzellen mit pSK-S21
wurden Untersuchungen der Saccharose-Aufnahme durchgeführt.
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Beispiel 5
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Transformation
von Pflanzen mit einem Konstrukt zur Überexpression der Kodierregion
des Saccharose-Transporters
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Aus den Vektoren YEplac112A1NE-S21
und YEplac112A1NE-P62, die als Insertionen die cDNA für den Saccharosetransporter
aus Spinat und/oder Kartoffel (siehe Beispiele 2 und 3) enthalten,
wurden die Insertionen nach NotI Spaltung isoliert und in die NotI
Schnittstelle der Plasmide pBluescript-SK (pSK-S21 und/oder pSK-P62) ligiert. Für pSK-S21
wurde die Insertion als SacI/XbaI Fragment präpariert und nach Auffüllen der überhängenden
Einzelstrang-DNA in "sense"-Orientierung in
pBinAR (Höfgen & Willmitzer, 1990, Plant
Sci. 66: 221–230),
welcher zuvor mit den Enzymen SmaI und XbaI geschnitten worden war,
kloniert. Das resul tierende Plasmid pBinAR-S21 (siehe 3) kann zur Transformation
von Pflanzen insertiert werden, um den Saccharose-Transporter überzuexprimieren.
Für pSK-P62
wurde die Insertion als ein 1,7 kbp großes NotI Fragment isoliert
und in "antisense"-Orientierung in
die SmaI Schnittstelle des binären
Vektors pBinAR kloniert, wobei pBinAR-P62-anti (siehe 4) resultierte. Dieses Plasmid
ist zur Transformation von Pflanzen mit dem Ziel einer "antisense"-Inhibierung der
Expression des Saccharose-Transporters geeignet.
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Die transformierten Agrobakterien
wurden anschließend
zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel verwendet.
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In zehn unabhängig erhaltene Transformanden,
bei denen die Anwesenheit des intakten, nicht umgelagerten chimären Gens
durch "Southern
Blot"-Analyse nachgewiesen
war, wurden die Änderungen
des Saccharose-, Hexose- bzw. Stärkegehalts
getestet.
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Transformanden, die die T-DNA aus
pBinAR-P62-anti enthielten, zeigten eine stark erhöhte Konzentration
von Stärken,
Hexosen und Saccharose in den Blättern
(siehe 5). Der Efflux
von Kohlenhydraten aus den Blattstielen der Pflanzen ist in wässrigem
Medium stark reduziert (siehe 6).
Aus diesen Daten ist die Bedeutung des Saccharose-Transporters für den Transport
des Photoassimilats aus den photosynthetisch aktiven Organen klar
ersichtlich. Da eine Inhibierung der Aktivität des Transporters den Abtransport
von Kohlenhydraten begrenzt, resultiert dies in einer Verringerung
des Transfers von Photoassimilaten zu den Speicherorganen im Fall
einer Überexpression,
beispielsweise unter Verwendung des Plasmids pBinAR-S21. Tabakpflanzen,
in welche die T-DNA aus pBinAR-S21 integriert wurde, zeigen weiterhin
ein reduziertes Spitzenwachstum, d. h. sie zeigen einen buschartigen
Wuchs. Eine derartige phänotypische
Veränderung
ist bei spielsweise in Tomatenpflanzen sehr erwünscht. Das Plasmid pBinAR-S21
mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz
(Seq. ID No. 1) ist daher zur Modifikation von Pflanzen mit dem
Ziel einer Verbesserung wichtiger Züchtungscharakteristika wie
einem buschigen Wuchs geeignet.
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Tabelle
I
| Inhibitor | Saccharose-Transport (%) |
| Kontrolle | 100 |
| 0,5 μM CCCP | 65 |
| 2,5 μM CCCP | 21 |
| 25 μM PCMBS | 73 |
| 100 μM PCMBS | 21 |
| 25 μM 2,4-DNP | 61 |
| 100 μM 2,4-DNP | 9 |
| 1 mM
Natriumarsenat | 34 |
| 10 μM Antimycin
A | 59 |
| 1 m
cAMP | 102 |
- CCCP
- Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon
- PCMBS
- p-Chlormercuribenzolsulfonsäure
- 2,4-DNP
- 2,4-Dinitrophenol
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Tabelle
II
| Kompetitor | Saccharose-Transport (%) |
| Kontrolle | 100 |
| 2 mM
Saccharose | 28 |
| 2 mM
Maltose | 58 |
| 10
mM Maltose | 37 |
| 2 mM
Phenylglucosid | 7 |
| 2 mM
Phloridzin | 16 |
| 2 mM
Lactose | 91 |
| 10
mM Palatinose | 102 |
| 10
mM Trehalose | 103 |
