KR101395434B1 - 모노리그놀 수송체 유전자들의 발현량을 변화시키는 재조합 벡터 및 리그닌 함량이 변화된 형질전환 식물 - Google Patents

모노리그놀 수송체 유전자들의 발현량을 변화시키는 재조합 벡터 및 리그닌 함량이 변화된 형질전환 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리그닌의 주요 구성 요소인 모노리그놀 중 p-쿠마릴 알코올의 세포 밖 수송에 관여하는 유전자들과 이들 유전자를 이용하여 제조된 형질전환 식물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 p-쿠마릴 알코올의 세포밖 수송에 주로 관여하여 식물체의 리그닌 함량에 영향을 주는 유전자를 포함하는 조성물, 이 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 이용하여 제조한 리그닌 함량이 증가된 형질전환 식물, 이 유전자의 발현을 하향 규제시키는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질 전환 식물 등에 관한 것이다. 본 발명의 조성물, 재조합 벡터 및 형질전환 식물은 모노리그놀의 수송 자체에 영향을 주어 식물의 리그닌 함량을 변화시키기 때문에, 효과적으로 리그닌 함량이 증가 또는 감소된 형질전환 식물을 생산할 수 있다. 따라서 목재의 물리적 강도가 증가된 리그닌 함량이 증가된 형질전환 식물을 생산하는 데에 응용할 수 있고, 바이오연료나 펄프 생산에 이용하기 용이한 리그닌 함량이 감소된 형질전환 식물을 생산하는데 중요하게 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

모노리그놀 수송체 유전자들의 발현량을 변화시키는 재조합 벡터 및 리그닌 함량이 변화된 형질전환 식물{Recombinant vectors modifying the expression levels of monolignol transporter genes, and transgenic plants with modified levels of lignin}
본 발명은 리그닌의 주요 구성 요소인 모노리그놀 중 p-쿠마릴 알코올의 세포 밖 수송에 관여하는 유전자들과 이들 유전자를 이용하여 제조된 형질전환 식물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 p-쿠마릴 알코올의 세포밖 수송에 주로 관여하여 식물체의 리그닌 함량에 영향을 주는 유전자를 포함하는 조성물, 이 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 이용하여 제조한 리그닌 함량이 증가된 형질전환 식물, 이 유전자의 발현을 하향 규제시키는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질 전환 식물 등에 관한 것이다.
리그닌은 지구상에서 두 번째로 많은 천연 생체고분자물질이다. 식물들은 리그닌을 생산하여 조직을 강화하고 따라서 물리적 스트레스에 대하여 더 잘 견딜 수 있게 만든다. 리그닌은, 음압 하에 있어서, 수관 요소가 붕괴되지 않도록 하는 목질부 즉, 수관조직에 주로 축적된다. 리그닌은 또한, 줄기 및 가지의 중앙부에 더 높은 강도를 제공한다.
리그닌은 주로 p-쿠마릴 알코올, 코니페릴 알코올 및 시나포일 알코올의 세가지 모노리그놀로부터 합성된다. 이 모노리그놀들은 하이드록시시나모일 CoA 에스테르를 생성하는 페닐프로파노이드 경로를 통해 합성된다. 이 후, 두 번의 환원 단계를 통해 하이드록시시나모일 CoA 에스테르를 상기 세 가지 모노리그놀로 전환시킨다. 이러한 세 가지 모노리그놀들은 세포질에서 나와서 아포플라스트로 수송되며 여기서 세 가지 유형의 효소인 옥시다제, 페록시다제 및 락카제에 의해 축합된다. 즉, 리그닌 생합성은 i) 모노리그놀들의 합성; ii) 모노리그놀들을 아포플라스트로 수송, 및 iii) 모노리그놀의 축합으로 큰 복합체 형성의 3단계에 걸쳐 이루어진다. 리그닌은 셀룰로즈 피브릴 사이에 축적되며, 식물 세포벽을 구성하는 주요 요소가 된다.
지난 몇 년간, 식물을 바이오연료 원으로서 사용하기 위해 많은 연구가 이루어져 왔다. 지구상에서 가장 많은 생체고분자인 식물 세포벽의 주요 성분을 형성하는 셀룰로즈를 바이오에탄올로 발효시키는 것은 바이오 연료를 생산하는 가장 효과적인 방법 중의 하나이다. 바이오에탄올 생성을 최적화시키기 위해서는, 셀룰로즈를 순수하게 분리하는 것이 필수적이다. 그러나 식물 세포벽에 리그닌이 많이 포함되어 있기 때문에 순수한 셀룰로즈를 분리하는 것이 어렵다. 따라서 리그닌 함량이 감소된 식물을 개발하면 셀룰로즈를 더 쉽게 그리고 더 높은 수율로 추출할 수 있어 바이오에탄올 제조 단가가 크게 낮아질 수 있다. 또한 리그닌 함량이 낮아지면 펄프 생산에 유리하다.
따라서, 식물 성장과 구조적 안정성을 저해하지 않고 리그닌 함량을 감소시키는 것은 식물을 바이오 연료 생성에 사용하거나 펄프를 생산하기 위해 사용할 때 매우 바람직하다. 리그닌 함량을 감소시키기 위해 생합성 유전자 및 전사 인자를 변형하는 기술이 알려진 바 있으나, 모그리그놀 수송 자체를 변형하면 리그닌 함량이 감소된 식물을 생성하는데 더욱 효과적이고 확실한 방법이 될 것이다.
반대로, 식물체에서 리그닌의 함량이 높아지게 되면 목재의 주요 성분인 목질부의 밀도를 증가되어 목재의 질이 높아진다. 따라서 모노리그놀 수송을 증가시키면 효과적으로 리그닌 함량이 증가된 식물을 생성할 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의하여 안출된 것으로서, 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 전체 리그닌 함량을 증가시키는 유전자를 포함하는 조성물 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공함을 목적으로 한다. 또한 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌 함량이 증가된 형질전환 식물 및 그 제조방법, 형질전환된 식물 세포, 식물의 일부를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 유전자의 발현을 하향 규제시키는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌 함량이 저하된 형질전환 식물 및 그 제조방법, 형질전환된 식물 세포, 식물의 일부를 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 모노리그놀인 p-쿠마릴 알코올을 수송할 수 있는 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP-결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
리그닌 함량이 증가된 식물체를 생산하기 위해서, 본 발명은 하기의 조성물, 재조합 벡터 및 형질전환 식물을 제공한다.
본 발명은 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 식물체의 리그닌 함량을 증가시키는 유전자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 서열은 서열번호 1과 60% 이상의 상동성을 가지는 서열임을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 식물체의 리그닌 함량을 증가시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 벡터는 전사조절인자, 번역 조절인자, 또는 유전자 발현을 확인할 수 있는 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전사 조절인자는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S프로모터(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter), 아그로박테리움 튜메팩시엔스 Ti 플라스미드의 노팔린 신테이즈 프로모터(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid nopaline synthase promoter), 옥토파인 신테이즈 프로모터(octopine synthase promoter), CASP1 (카스파리안 선 막도메인 단백질 1, 내피-특이적 단백질) 프로모터 및 만노파인 신테이즈 프로모터(mannopine synthase promoter)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마커는 항생제 내성 유전자, 베타 글루쿠로니데이즈를 암호화하는 유전자(β glucuronidase encoding gene), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈, 루시퍼레이즈, 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자(green fluorescent protein encoding gene)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터들은 pBI121,pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC, pGEM 및 pHellsgate8로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터들을 제공한다.
상기 재조합 벡터들의 일 구현예로서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터들에 있어서, 상기 서열은 서열번호 1과 60% 이상의 상동성을 가지는 서열임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌의 발현이 증가되어 목재의 물리적 강도가 높아진 식물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 식물은 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바로 로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 식물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 식물세포는 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바의 식물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 식물세포를 제공한다.
또한 본 발명은 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 리그닌 함량을 증가시키는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제조하는 단계,
상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계,
상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 단계를 포함하는,
형질전환된 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 리그닌 함량이 저하된 식물을 생산하기 위하여, 하기의 조성물, 재조합 벡터, 형질전환 식물, 식물 세포를 제공한다.
본 발명은 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 식물체의 리그닌 함량을 증가시키는 유전자의 전부 또는 일부에 대한 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, amiRNA 또는 이들을 생성할 수 있는 RNA를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 벡터는 전사조절인자, 번역 조절인자, 또는 유전자 발현을 확인할 수 있는 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 전사 조절인자는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S프로모터(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter), 아그로박테리움 튜메팩시엔스 Ti 플라스미드의 노팔린 신테이즈 프로모터(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid nopaline synthase promoter), 옥토파인 신테이즈 프로모터(octopine synthase promoter), CASP1 (카스파리안 선 막도메인 단백질 1, 내피-특이적 단백질) 프로모터 및 만노파인 신테이즈 프로모터(mannopine synthase promoter)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마커는 항생제 내성 유전자, 베타 글루쿠로니데이즈를 암호화하는 유전자(β glucuronidase encoding gene), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈, 루시퍼레이즈, 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자(green fluorescent protein encoding gene)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터들은 pBI121,pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC, pGEM 및 pHellsgate8로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터들을 제공한다.
상기 재조합 벡터들의 일 구현예로서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터들에 있어서, 상기 서열은 서열번호 1과 60% 이상의 상동성을 가지는 서열임을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌의 발현이 감소된 식물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 식물은 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바로 로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 식물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 식물세포는 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바의 식물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 식물세포를 제공한다.
또한 본 발명은 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 리그닌 함량을 증가시키는 유전자의 전부 또는 일부에 대한 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, amiRNA, 또는 이들을 생성할 수 있는 RNA를 포함하는 발현 카세트를 제조하는 단계,
상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계,
상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 단계를 포함하는,
형질전환된 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 조성물, 재조합 벡터 및 형질전환 식물은 모노리그놀의 수송 자체에 영향을 주어 식물의 리그닌 함량을 변화시키기 때문에, 효과적으로 리그닌 함량이 증가 또는 감소된 형질전환 식물을 생산할 수 있다. 따라서 목재의 물리적 강도가 증가된 리그닌 함량이 증가된 형질전환 식물을 생산하는 데에 응용할 수 있고, 바이오연료나 펄프 생산에 이용하기 용이한 리그닌 함량이 감소된 형질전환 식물을 생산하는데 중요하게 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 AtABCG29/AtPDR1(이하 AtABCG29)의 조직 특이적 발현을 나타낸다. AtABCG29의 발현은 5일 된 식물 (A, B)과 2주 된 식물(C)의 뿌리에서 관찰된다. 특히 뿌리 신장 부(elongation zone)의 내피(endodermis)와 관다발 조직에서(vascular tissue)에서 발현된다 (D-F).

도 2는 AtABCG29가 도관 조직 및 내피 세포의 세포막에 국소화되어 있는 것을 나타낸다. 막 국소화는 N-말단에서 노란 형광 단백질을 AtABCG29에 융합시킴으로써 달성되었다.

도 3은 p-쿠마릴 알코올에 의해 저해된 8개 ABC 수송체 변이체 효모 YMM12의 성장이 AtABCG29를 발현시킴으로써 회복된 것을 나타낸다 (D). 코니페릴 알코올(B), 시나필 알코올(D)에 의한 성장저해는 AtABCG29 발현에 의해서 회복되지 않았다.

도 4는 AtABCG29를 발현하는 YMM12 효모 세포가 더 적은 p-쿠마릴 알코올을 포함하고 (A) 이러한 모노리그놀로 미리 적재될 때 더 많은 p-쿠마릴 알코올을 배출하는 것(B)을 나타낸다.
이러한 세포들로부터 분리된 막 베지클들은 벡터 대조군 (empty vector control)에 비해 더 많은 p-쿠마릴 알코올을 수송한다 (C). 야생형 효모(검은 삼각형), pNEV 벡터 대조군 (흰 원) 및 AtABCG29 과발현 (검은 원)을 발현하는 변이 주. (D). 모노리그놀 수송은 공지된 ABC-type 수송체의 저해체인 바나데이트에 의해 저해되나, 수송 과정의 제2 에너지화에 사용되는 pH 구배를 소산시키는 암모늄 클로라이드에 의해서는 저해되지 않는다.

도 5는 AtABCG29에 대한 기능 상실 변이체가 야생형 식물보다 p-쿠마릴 알코올에 더 민감한 것을 나타낸다.
(A) 상기 유전자를 불활성화하는 T-DNA의 위치
(B) 어떤 전사체도 생성되지 않는 것을 증명.
(C) 야생형 식물 및 AtABCG29 녹다운 변이체로 독성 시험.
(D) p-쿠마릴 알코올 존재하에서 AtABCG29의 발현이 증가하는 것을 나타낸다.
표는 리그닌 중 p-하이드록시페닐 (p-hydroxyphenyl, H), 구아이아실 (guaiacyl, G), 시린질 (syringyl, S) 유닛의 함량이 AtABCG29 변이 식물에서 약 30% 감소된 것을 나타낸다
도 6은 야생형 및 AtABCG29 변이주 사이에서 대사 산물들에서 상대적인 차이를 시각화한 열 지도를 나타낸다.
(A) GC-MS 분석 및 (B) LC-MS 분석에 의해 검출된 대사산물. 양쪽 데이터들은 아가 플레이트 상에서 배양된 3-주령 뿌리로부터 수득되었다.
Log2 배율 변화 (Log2FC)는 야생형=0으로 설정함으로써 측정되었다.
약어의 설명:
Q-3GR-7R, 퀘르세틴-3-O-(2''-O-Rha)Glc-7-O-Rha;
K-3GR-7R, 카엠페롤 -3-O-(2''-O-Rha)Glc-7-O-Rha;
K-3G-7R, 카엠페롤-3-O-Glc-7-O-Rha;
K-3R-7R, 카엠페롤-3-O-Rha-7-O-Rha;
A9, 시아니딘 3-O-[2''-O-(2'''-O-(Sin)Xyl 6''-O-(p-O-Cou)Glc] 5-O-[6'''-O-(Mal)Glc];
시나포일-Mal, 시나포일-말레이트;
3MSOP, 3-메틸설피닐프로필 글루코시놀레이트;
4MSOB, 4-메틸설피닐부틸 글루코시놀레이트;
8MSOO, 8-메틸설피닐옥틸 글루코시놀레이트;
4MTB, 4-메틸티오부틸 글루코시놀레이트;
5MSP, 5-메틸티오펜틸 글루코시놀레이트;
I3M, 4-하이드록시-인돌릴-3-메틸 글루코시놀레이트;
1MOI3M,1-메톡시-인돌릴-3-메틸 글루코시놀레이트;
4MOI3M, 4-메톡시-인돌릴-3-메틸 글루코시놀레이트.
AtABCG29는 초본 또는 목본에 존재하는 유전자로서, 본 발명자들은 이 유전자가 모노리그놀의 수송에 관여하여 식물체의 리그닌 함량에 영향을 주는 것을 발견하였다. AtABCG29가 과발현된 경우 리그닌 함량이 높아져 식물체의 물리적 강도가 높아지며, 발현이 저하된 경우 식물체의 리그닌 함량이 낮아져 셀룰로즈 추출이 용이하게 된다.
AtABCG29는 특히 모노리그놀 중 다른 모노리그놀의 전구체 역할을 한다고 생각되는 p-쿠마릴 알코올의 수송에 영향을 주어, 결과적으로 리그닌 중 p-하이드록시페닐 (p-hydroxyphenyl, H), 구아이아실 (guaiacyl, G), 시린질 (syringyl, S) 유닛의 합성에 모두 영향을 주는 역할을 한다고 생각되는 유전자이다.
본 발명에서 사용되는 용어의 의미는 다음과 같다.
용어 “ABC (ATP-binding cassette) 수송체”는 ATP 가수분해의 에너지를 사용하여 영양분을 세포내로 흡수하는 것 및, 예를 들어 독성물질을 세포 밖으로 배출하는 것과 같은, 다양한 물질의 경막 수송을 수행하는 단백질을 지칭한다.
용어 “상동성”은 유전자의 핵산 (DNA) 서열들 사이 또는 단백질의 아미노산 서열들 사이의 유사성을 지칭한다.
용어 “RNA 간섭 (RNA interference)은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 기법으로, 세포 내에 주입된 두 가닥의 RNA(double-strand RNA, dsRNA)가 절단, 가공되어 이에 상보되는 전사 RNA(messenger RNA)를 분해하여 궁극적으로 단백질의 합성을 저해하게 되는 현상이다. 이는 short hairpin RNA, small interfering RNA, 안티센스 RNA, artificial micro RNA 등을 통해 수행될 수 있다.
용어 “안티센스 RNA(antisense RNA)”는 DNA의 일부와 상동성이 있고 상기 유전자를 암호화하는 RNA에 대한 상보적인 RNA를 말한다.
용어 "short hairpin RNA(shRNA)"는 DNA의 일부와 상동성이 있는 서열 후에 stuffer sequence라고 불리는 서열을 배치하고 그 후에 앞의 서열과 상보적인 서열을 배치하여 스스로 hairpin 구조를 형성하기 쉬운 RNA를 말한다.
용어 “artificial micro RNA(amiRNA)"는 gene silencing을 위해 실험적으로 주입하는, 타겟이 되는 mRNA에 상보적인 RNA를 말한다.
용어 " small interfering RNA(siRNA)"는 이중가닥 RNA가 dicer 효소에 의해 잘린 짧은 가닥을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 “형질전환 식물”은 재조합 벡터 등을 이용하여 그 형질이 전환된 식물을 지칭한다.
용어 “모노리그놀”은 p-쿠마릴 알코올, 시나포일 알코올 및 코니페릴 알코올인, 리그닌의 구성 요소 (building block)를 지칭한다.
용어 “모노리그놀 수송체”는 모노리그놀의 배출에 직접 또는 간접적으로 관계되는, 지질 이중막을 관통하는 경막 단백질을 지칭한다.
본 발명의 ABC수송체는 애기장대(Arabidopsisthaliana)로부터 유래되고 이 단백질에 상응하는 염기서열을 가지는 AtABCG29거나, 염기 서열이 서열번호 1과 적어도 60% 에서 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 90% 내지 95%, 및 가장 바람직하게는 95 내지 99% 상동성을 가지는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 상기 ABC 수송체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열이거나 또는 서열번호 1과 적어도 60%에서 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 90% 내지 95%, 및 가장 바람직하게는 95 내지 99% 상동성을 가지는 뉴클레오타이드일 수 있다.
또한 서열번호 2 내지 4의 염기 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 상동성이 인정되는 서열들이다. 이는 하기 표에 기재되어 있다.
이름 AtABCG29 유전자/단백질과의 상동성 AGI No. (유전자번호) 서열번호
AtABCG35/ AtPDR7
 78/68 %
 At1g15210
 2
AtABCG36/ AtPDR8
 80/67 % At1g59870 3
AtABCG34/ AtPDR6 85/56 % At2g36380 4
본 발명의 발현 카세트는 AtABCG29 또는 이의 상동체 및 전사 종결인자를 암호화하는 유전자를 발현, 과발현 또는 하향규제하도록 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 식물체에서 발현된 임의의 프로모터를 사용할 수 있다.
예를 들어, 상기 프로모터는 AtABCG29 프로모터, CMV (꽃양배추 모자이크 바이러스) 35S 프로모터, 아그로박테리움 투메마시엔스 Ti 플라즈미드의 nos (노팔린 신타제) 프로모터, ocs (옥토핀 신타제) 프로모터, mas (만노핀 신타제) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 루비스코 프로모터, CASP1 (카스파리안 선 막도메인 단백질 1, 내피-특이적 단백질) 프로모터, 및 임의의 다른 공지된 식물 발현 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 과발현에 바람직한 것은 CMV 35s 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터 또는 루비스코 프로모터이다. 그러나, 본 발명은 상기 예에 제한되지 않는다.
또한 카세트에 인핸서가 포함될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 인핸서로는 전사 증진용 35s 프로모터 인핸서, 또는 번역 증진용 AtADH 5’ UTR (애기장대 ADH 유전자의 5’-미번역 부위내의 서열) 인핸서 혹은 OsADH 5’-UTR (쌀 ADH 유전자의 5’-미번역 부위내의 서열) 인핸서를 사용할 수 있다.
또한 식물세포에서 통상적으로 사용되는 전사 종결인자들이 카세트에 포함될 수 있다.
본 발명의 발현 카세트 또는 재조합 벡터는 AtABCG29 유전자의 발현을 나타내거나 상기 유전자를 발현하는 형질전환 식물을 선택하게 하는 마커를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 마커 유전자의 예는 카나마이신, 스펙티노마이신, 바스타, 하이그로마이신, 젠타마이신 및 블레오마이신과 같은 항생제에 내성적인 유전자 또는 GUS (β-글루쿠로니다제), CAT(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제), 루시페라제 및 GFP (녹색 형광 단백질)을 암호화하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이러한 마커가 상기 발현 카세트와 함께 식물에 도입되는 경우, 그로 인해, 기질과의 반응 또는 형광의 결과로서, 특정 항생제를 포함하는 배지에서 자라는 동안 나타나는 또는 청색 (GUS), 발광 (루시페라제)를 나타내는 형질전환 식물을 선택하게 할 수 있다. 재조합 벡터는 발현 카세트를 공지된 벡터의 주구조물에 삽입함으로써 제조될 수 있고 및 ABC 수송체를 암호화하는 서열을 포함한다. 재조합 벡터에서, 상기 서열은 전사 및 번역 인자와 작동가능하게 연결되어 있고 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에서 발현되도록 고안되어 있고, 조건적으로 과발현되거나 하향규제된다.
상기 공지된 벡터의 예는 pBI121, pHellsgate8, pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC, 및 pGEM을 포함한다. 또한, CMV35s 프로모터를 포함하는, 식물체에서 발현되는 벡터는 예를 들어 pCAMBIA 시리즈 (pCAMBIA1200, 1201, 1281, 1291, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1380, 1381, 2200, 2201, 2300, 2301, 3200, 3201, 3300), pMDC32, 및 pC-TAPapYL436와 같은 것이 사용될 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
발현 억제는 RNAi, 즉, 상기 ABC 수송체 유전자의 부분 또는 전체 서열에 상보적인 siRNA, 안티센스 RNA, miRNA 또는 이들을 생성할 수 있는 헤어핀 구조의 RNA를 첨가하고, inserting T-DNA 또는 내재적 트랜스포존을 삽입하고 또는 상기 유전자의 부분 또는 전체 뉴클레오타이드 또는 하나 아미노산 서열의 변경 또는 삭제를 통해 전사나 번역 수준에서 유전자를 변이시킴으로써 기능 상실을 유도하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 ABC 수송체-암호화 서열을 포함하고 이는 전사 및 번역 인자와 작동가능하게 연결되고 이의 의해 제어되도록 고안되어 있다. 본 발명에서 설명된 형질전환 식물체는 식물, 식물 세포 또는 식물 조직이다. 식물 조직은 식물 종자를 포함한다. 상기 식물은 초본 또는 교본 식물일 수 있고, 예를 들어, 현화식물, 원예식물, 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무우, 상추, 브로콜리, 담배, 페추니아, 해바라기, 유채꽃, 갓, 애기장대, 서양유채(Brassica campestris), 겨자풀, 담배, 자작나무, 포플러, 교배종 포플러 (예, Populus alba X P. tremula var. glandulosa: Populus alba 및 P. tremula var. glandulosa의 천연 교배종), 박달, 사탕수수, 무늬왕갈대, 큰 푸른줄기, 카멜리나, 조팝나무, 좀개구리밥, 야트로파 (Jatropha curcas), 애기등 (Millettia pinnata), 억새 (Miscanthus giganteus), 스위치그라스 (Switchgrass), 보리, 카사바 (cassava), 평지씨앗, 콩, 사탕무, 및 옥수수를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물은 체세포 배형성, 조직 배양 및 세포주 배양으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 무성생식으로 증식될 수 있다. 상기 형질전환 식물체는 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 전형적인 비제한적 예는 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 DNA 전달이다. 더 바람직하게는, 전기천공, 미립자 주사 또는 유전자 총에 의해 제조된 재조합 아그로박테리움을 흡수 방법 (soaking method)로 숙주 식물 세포를 감염하도록 유도할 수 있다.
애기장대와 관련 초본 또는 목본에서 발현되는 서열번호 1의 염기서열과 65% 이상의 상동성을 가지는 유전자 정보.
Locus Name
 Gene Name Homology to AtABCG29
(Protein/Gene)
 Organism
318409
 96/96% Arabidopsis lyrata
Thhalv10019897m 90/90% Thelungiella halophila
Bra021173 88/89% Brassica rapa
Eucgr.F3072 75/69% Eucalyptus grandis
VIT_09s0002g03640 74/69% Vitis vinifera
Lus10025824
 74/68% Linum usitatissimum
POPTR_0001s19030 PDR8 73/70% Populus trichocarpa
cassava4.1_025030m.g
 73/69% Manihot esculenta
cassava4.1_000208m.g 73/68% Manihot esculenta
Lus10014150 73/68% Linum usitatissimum
ppa000237m 72/71% Prunus persica
cassava4.1_031766m
 72/70% Manihot esculenta
ppa026987m 72/68% Prunus persica
Eucgr.J02941 72/68% Eucalyptus grandis
Lus10037562
 72/66% Linum usitatissimum
POPTR_0003s04800 71/68% Populus trichocarpa
Eucgr.J02944 71/68% Eucalyptus grandis
30146.t000089 71/70% Ricinus communis
Glyma07g01860 71/68% Glicine max
Phvulv091008496m.g 71/68% Phaseolus vulgaris
Glyma08g21540 71/69% Glicine max
471713 PDR7 70/70% Arabidopsis lyrata
Medtr8g015890 70/69% Medicago trunacatula
Carubv10019656m 70/69% Capsella rubella
하기에서, 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. AtABCG29의 이형 발현 및 수송 분석
야생형 및 형질전환 식물체의 애기장대 씨앗 (별다른 언급이 없으면 생태형 콜럼비아-0)을 1.5% 수크로즈를 함유한 절반 강도 (1/2) Murashige-Skoog (MS) 아가 플레이트 상에서 8/16-시간 명암주기로 22°C/18°C에서 배양하였다. p-쿠마릴 알코올 처리를 위해, 식물체를 발아시키고 지시된 농도의 p-쿠마릴 알코올을 함유한1/2 MS 배지상에서 배양하였다.
본 연구에서 사용된 S. 세레비지아에 균주는 다음과 같다: 야생형 YPH499 (MATa;ade2-201;his3-200;leu2-1;ura3-52;trp1-63;lys2-801)및 변이체 YMM12 (Δsnq2::hisG;Δpdr10::hisG;Δpdr12::hisG;Δpdr5::TRP1;Δpdr15loxP-KanMx-lox;Δpdr18::hisG;Δpdr11::HIS3-MX6;Δyor1::HIS3-MX6). AtABCG29를 pNEV 벡터의 NotI 부위에 클론하였다. 연속 성장 실험을 위해, 효모 균주를 형광계 Fusion-α (Packard) 내의 마이크로타이터 플레이트에서 배양하였다. 효모 배양물을 최소 글루코스 배지 (SCD)에서 배양하고 중간 지수 증식기(midlog phase)에서 원심분리로 수확하였다. 이들을 SCD 배지를 사용하여 두 번 세척하고, 동일한 배지에 재현탁하였다. 다음, 모노리그놀을 세포 현탁액에 첨가하고 가볍게 혼합하였다. 지시된 시간에, 세포 현탁액을 원심분리로 펠렛화시키고 세포를 500 μl의 빙냉수로 세척하였다. 유리 비드로 세포를 분쇄하고 모노리그놀 함량을 HPLC로 결정하였다.
실시예 2. 효모 마이크로좀을 시용한 수송 분석
YMM12효모 변이체를 아무런 삽이체를 내포하지 않거나 (YMM12) AtABCG29cDNA를 가진 (YMM12 ABCG29) 발현벡터 pNEV로 형질전환시켰다. 마이크로좀 베지클을 알려진 바와 같이 분리하였다. p-쿠마릴 알코올을 수송 완충액, 1 mM 디티오트레이톨, 5 mM ATP, 10 mM MgCl2,10 mM 크레아틴 포스페이트, 및 100 μg/ml 크레아틴 키나제으로 구성된 반응 혼합물에 첨가하였다. 효모 마이크로좀을 첨가하여 수송 분석을 개시하였다. 이 분석은 실온에서 수행하였다. 0.45 μm-지름 공극 크기의 니크로셀룰로즈 필터 상에 세 개 분획물을 전달하고 0.5 ml의 메탄올-물 (1:1 v/v)로 추출함으로써 정기적으로, p-쿠마릴 알코올 흡수를 결정하였다. 상등액을 건조시키고, 및 샘플을 물에 재현탁하였다. p-쿠마릴 알코올 함량은 HPLC로 결정하였다.
실시예 3. 용해성 모노리그놀의 분석
수성 상의 모노리그놀을 Hypersil 컬럼 (MZ Analytical) (5 mm, 250 x 4.6 mm)을 사용하는 역상 HPLC에서, 0.1% 트리플루오로아세트 산 (용매 B)를 함유한 0.1% 수성 트리플루오로아세트 산 (용매 A)로 산성화된 메탄올-아세토니트릴 (25:75, v/v)의 증가 구배를 사용하면서, HPLC Dionex system에 의한 구배 용출로 정량화하였다. 하기 구배 용출 조건을 사용하였다: 시간= 0 분/0% B; 시간= 25 분/60% B; 시간= 27 분/100% B; 유동 속도 = 1.5 ml/분; 온도 40 °C; 주입 루프= 150 μl. 모든 용매는 HPLC 급 순도이다. 흡광 스펙트럼은 200 내지 450 nm로 스캔닝하면서 Dionex PDA-100 포토다이오드 어레이 검출기로 기록하였다. 피크 높이를 230 및 450 nm 사이의 최대 흡광값에서 정량하였다. Chromeleon 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 통합하였다.
실시예 4. AtABCG29 국소화의 결정
pABCG29::NLS-GFP-GUS 제작을 위해 애기장대(A. thaliana)에서 얻은 게놈성 DNA를 주형으로서 및 프라이머 pPDR1-attB1 (5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCTGTATGTTCCTATTGGA TAAGGGCATCTTG-3’) 및 pPDR1-attB1r (5’-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACT TGCTTTTTTTTTTTTGGTGGATTTGGGAA-3’)를 사용하여 2.2 kb AtABCG29프로모터를 증폭하였다. AtABCG29의 세포내 위치를 결정하기 위해, 시트린 단백질을 AtABCG29 (Citrine-ABCG29)의 N-말단에 융합하였다. 융합 작제물을 얻기 위해, PDR1-gDNA Sense (5’-GACATTGTTCA TGGATGAGATATCGACAG-3’) 및 PDR1-gDNA AS (5’-GTTAAAGAGAACCGTAA ACCCGAGAATGC-3’)를 사용하는 PCR로 AtABCG29 (제1 ~ 제4 인트론)의 1.7 kb 게놈성 단편물을 증폭하였다. Multisite Gateway System (Invitrogen)을 사용하여 PCR 생성물을 클론하였다. 작제물을 Agrobacteriumtumefaciens GV3101 균주에 도입한 후, 이를 사용하여 디핑 방법으로 A. thaliana (Col-0)를 형질전환하였다. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경방법을 역상 Leica TCS SP2 AOBS 공촛점 현미경에서 수행하였다.
실시예 5. 가스 크로마토그래피 질량 분광분석법 (GC-MS)에 의한 대산산물 분석
GC-MS에 의한 대사산물 분석은 기본적으로 공지된 바와 같이 수행되었다 [29]. 갈아진 냉동 애기장대 뿌리 조직 (50 mg)을 액체 질소로 미리 냉각된 볼밀을 사용하여 균질화시키고 메탄올 1400 μl에서 추출한 다음, 60 μl의 내부 표준액 (0.2 mg 리비톨 ml?1물)을 정량 표준물로서 첨가하였다. TaGFinder [30] 또는 MASSLAB 프로그램 (ThermoQuest)을 사용하여 크로마코그램과 질량 분광분석을 평가하고, 결과된 데이터를 공지된바와 같이 준비하고 제시하였다. 질량 분광분석은 Golm Metabolome Database의 것과 상호참조되었다. 분석은 독립적으로 세 번 반복되었다.
실시예 6. 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법(LC-MS)에 의한 대사산물 분석
갈은 냉동 뿌리를 분주하고 및 생 뿌리의 밀리그램 무게당 추출 완충액 (80% MeOH, 10μg ml-1이소비텍신) 5 μl 을 사용하여 믹서 밀에서 3 분간 25 Hz로 길코니아 볼을 사용하여 균질화시켰다. 12,000g에서 원심분리후, 상등액을 즉시 이차 대산산물 분석에 사용하였다. LC-MS에 의한 일반적인 이차 대산산물 분석은 Finnigan LTQ-XP system (Thermo Finnigan, USA)과 연계된 HPLC system Surveyor (Thermo Finnigan, USA) 상에서 공지된 바와 같이 수행되었다. 모든 데이터는 Xcalibur 2.1 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 가동되었다. 얻어진 데이터 매트릭스는 내부 표준액 (이소피텍신, CAS: 29702-25-8)을 사용하여 표준화하였다. 대사산물 확인 및 주해는 표준 화합물 및 이전 작업을 사용하여 수행되었다. 분석은 독립적으로 세번 반복되었다.
실시예 7. 세포벽 정제
세포벽 분획물의 분리는 공지된 방법에 따라서 수행되었다. 갈은 냉동된 뿌리 물질 500 mg 을 믹서 밀에 넣고 3분간 에서 길코니아 볼을 사용하여 50% MeOH (1 ml)에서 균질화하였다. 상등액을 제거하고 잔류물을 하기 용액으로 세척하였다: MeOH, H2O,0.5%SDS,1MNaCl,H2O,MeOH,Me2CO및 n-헥산 (각각 2×1 ml, 상기와 같이 교반하고 원심분리함). 잔류물을 조작상 정제된 세포벽으로 정의하고 Speed-Vac (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 건조시킨 후 ?20 °C에서 보관하였다.
실시예 8. 리그닌 티오산분해 생성물의 GC-MS 분석
유도화 후 티오산 분해 절단은 리그닌에 있는 에테르들을 절단함으로써 분석가능한 단량체를 생성하는 그리닌 구성 분석 방법이다. 건조된 세포벽 분획물 (뿌리 샘플의 500 mg로부터 제조)을 Teflon-코팅된 스크류 캡을 가진 유리 병에 옮기고 반응 혼합물 3 ml (0.2M 보론 트리플루오라이드 에테레이트를 함유한, 질소 가스를 가진 디옥산/에탄티올 (8.75/1, v/v))에 현탁하였다. 반응 혼합물을 오일 중탕에서 100°C에서 4.0 시간 가볍게 교반하였다. 얼음에서 냉각한 후, 티오산 분해 산물을 디클로로메탄 (3 ml)에 붓고 증류수 3 ml를 첨가하였다. 수성 상의 pH를 중탄산 나트륨 (0.4M)을 사용하여 4.0으로 조절하였다. 유기상울 디클로로메탄을 사용하여 (3 ml x 2) 추출하고 및 증발시켜 완전히 건조하였다. 잔류물을 디클로로메탄(500 μl)에 용해하였다. 12,000g에서 원심분리후, 상등액 100 μl을 증발시키고 GC-MS 분석을 TMS 유도 단계 [29]에서 설명된 바와 같이 수행하였다. 검출된 에탄티올화된 페닐 알코올류는 그들의 표준 화합물 (p-쿠마릴 알코올, 코니페릴 알코올 및 시나포일 알코올)에 의해 확인되었다. 에리소- 미 트레오- 형태의 상대적인 피크 면적을 요약하고 각각 p-하이드록시페닐 (H), 구아이아실 (G) 및 시린질 (S) 형태의 단위 수준을 평가하는 데 사용하였다. 분석은 독립적으로 세번 반복하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (27)

  1. 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 식물체의 리그닌 함량을 증가시키는 유전자를 포함하는 조성물로서,
    상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 식물체의 리그닌 함량을 증가시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로서,
    상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 전사조절인자, 번역 조절인자, 또는 유전자 발현을 확인할 수 있는 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 전사 조절인자는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S프로모터(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter), 아그로박테리움 튜메팩시엔스 Ti 플라스미드의 노팔린 신테이즈 프로모터(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid nopaline synthase promoter), 옥토파인 신테이즈 프로모터(octopine synthase promoter), CASP1 (카스파리안 선 막도메인 단백질 1) 프로모터 및 만노파인 신테이즈 프로모터(mannopine synthase promoter)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 마커는 항생제 내성 유전자, 베타 글루쿠로니데이즈를 암호화하는 유전자(β glucuronidase encoding gene), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈, 루시퍼레이즈, 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자(green fluorescent protein encoding gene)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 pBI121,pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC, pGEM 및 pHellsgate8로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 4항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌의 발현이 증가된 형질전환 식물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 식물은 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바로 로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 식물.
  13. 제 4항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 식물세포는 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바의 식물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 식물세포.
  15. 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 리그닌 함량을 증가시키는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제조하는 단계;
    상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
    상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법으로서,
    상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법.
  16. 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 식물체의 리그닌 함량을 변화시키는 유전자의 전부 또는 일부에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA(small interfering RNA), amiRNA(artificial micro RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 이들을 생성할 수 있는 RNA를 포함하는 재조합 벡터로서,
    상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 전사조절인자, 번역 조절인자, 또는 유전자 발현을 확인할 수 있는 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 전사 조절인자는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter), 아그로박테리움 튜메팩시엔스 Ti 플라스미드의 노팔린 신테이즈 프로모터(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid nopaline synthase promoter), 옥토파인 신테이즈 프로모터(octopine synthase promoter), CASP1 (카스파리안 선 막도메인 단백질 1) 프로모터 및 만노파인 신테이즈 프로모터(mannopine synthase promoter)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 마커는 항생제 내성 유전자, 베타 글루쿠로니데이즈를 암호화하는 유전자(β glucuronidase encoding gene), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈, 루시퍼레이즈, 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자(green fluorescent protein encoding gene)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  20. 제 16항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 pBI121, pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC, pGEM 및 pHellsgate8로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 16항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환되어 리그닌의 함량이 감소된 형질전환 식물.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 형질전환 식물은 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바로 로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 형질전환 식물.
  25. 제 16항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 식물세포는 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무, 평지, 콩, 사탕무, 옥수수, 조팝나무, 무늬왕갈대, 큰애기등(Mellettia pinnata), 억새(Miscanthus giganteus), 스위치그래스(Switchgrass), 보리 및 카사바의 식물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 식물세포.
  27. 6개의 생체막 통과 도메인과 1개의 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열로 이루어지고 p-쿠마릴 알코올의 수송에 관여하여 리그닌 함량을 증가시키는 유전자의 전부 또는 일부에 대한 안티센스 RNA, siRNA, amiRNA, shRNA 또는 이들을 생성할 수 있는 RNA를 포함하는 발현 카세트를 제조하는 단계;
    상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
    상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법으로서,
    상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법.
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PNAS, "ATP-binding cassette-like transporters are involved in the transport of lignin precursors across plasma and vacuolar membranes"(2010년 발간) *
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