HU220335B - Oligoszacharid-transzportot kódoló DNS-szekvenciák - Google Patents

Oligoszacharid-transzportot kódoló DNS-szekvenciák Download PDF

Info

Publication number
HU220335B
HU220335B HU9403767A HU9403767A HU220335B HU 220335 B HU220335 B HU 220335B HU 9403767 A HU9403767 A HU 9403767A HU 9403767 A HU9403767 A HU 9403767A HU 220335 B HU220335 B HU 220335B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
gly
ser
phe
pro
Prior art date
Application number
HU9403767A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT70472A (en
HU9403767D0 (en
Inventor
Wolf-Bernd Frommer
Jörg Riesmeier
Original Assignee
HOECHST Schering AgrEvo GmbH.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HOECHST Schering AgrEvo GmbH., filed Critical HOECHST Schering AgrEvo GmbH.,
Publication of HU9403767D0 publication Critical patent/HU9403767D0/hu
Publication of HUT70472A publication Critical patent/HUT70472A/hu
Publication of HU220335B publication Critical patent/HU220335B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1062—Sucrose synthase (2.4.1.13)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Nukleotidszekvenciában tárolt információt egy növényi genombaintegrálva RNS képződését, és RNS révén egy új oligoszacharid-transzport-aktivitást létrehozó vagy endogén oligoszacharid-transzporter-aktivitás expresszióját, ezáltal a tartalék tápanyagokmegváltozott képződését és transzportját biztosító DNS-szekvenciák,melyek egy oligoszacharid-transzportot kódoló régióját tartalmazzák. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyát egy oligoszacharid-transzporter kódolórégióját tartalmazó DNS-szekvenciák képezik, amelyeknek a növényi genomba való juttatása módosítja a tartalék tápanyagok képződését és transzferét a transzgenikus növényben, valamint a találmány tárgyát képezik az ezeket a DNS-szekvenciákat tartalmazó plazmidok, baktériumok és növények, illetve olyan élesztőtörzsek előállítására szolgáló eljárások, amelyek lehetővé teszik a találmány szerinti növényi oligoszacharid DNS-szekvenciák azonosítását, valamint a találmány szerinti DNS-szekvenciák alkalmazását.
A tárolt energia legfontosabb transzport metabolitja a legtöbb növényben például a burgonyában, a szacharóz. Más fajokban más oligoszacharidok láthatják el ezt a feladatot. A japán articsókában ez például a stachyose.
Az oligoszacharid-transzport központi helyzetét a növény energiaállapotában már igazolták transzgenikus növényekben, amelyekben egy invertáz expresszálása révén a szacharóz monoszacharidokra hasad, aminek eredménye a tulajdonságok jelentős megváltozása (EP 442 592). Mivel a szacharóz jelentős szerepet játszik a tartalék tápanyagok képződésében, ezért számos kísérletet végeztek azzal a céllal, hogy tanulmányozzák a diszacharidok metabolizmusát. A DE 42 13 444 szabadalmi bejelentésből ismert, hogy a betakarított részek tárolási tulajdonságai javíthatók a transzgenikus burgonyáknál, amelyeknél egy apoplasztikus invertáz expresszálódása révén az energiában gazdag vegyületeknek a növekvő gyökerek heterotróf részei felé való transzferé gátlódik.
Számos erőfeszítés ellenére a tartalék tápanyagok, úgymint az oligoszacharidok elosztásának mechanizmusát nem sikerült tisztázni a növényekben, és azzal a céllal, hogy ezt befolyásolják, még nem világos, hogy a szacharóz hogyan keletkezik a levelekben a fotoszintézist követően, hogyan éri el a növény háncsrészében levő transzportcsatomákat, és hogyan veszi fel a növény a tárolószervekből, például a burgonya gumóiból vagy a magvakból. A cukorrépa (Béta vulgáris) levélszövete sejtjeinek izolált plazmamembránján kimutatták, hogy a szacharóz membránon keresztül való transzportja azzal indukálható, hogy egy mesterséges pH-gradienst biztosítunk, és azzal intenzifikálható, ha elektrokémiai potenciált biztosítunk [Lemaine & Delrot, FEBS Letters, 249, 129-133 (1989)]. A szacharóz membránon való átjutása Michaelis-Menten kinetikát követ, amelyben a szaharóztranszport 1 mmol/1 körül van [Slone & Buckhout, Planta, 183, 484-589 (1991)]. Ez a fajta kinetika arra utal, hogy egy transzporter fehérje is szerepet játszik benne. A cukorrépa, a Ricinus communis és a Cyclamen persicum plazmamembránjaival végzett kísérletek azt mutatták, hogy a szaharóztranszport-protonok kotranszportjával van kapcsolatban [Buckhout, Planta, 178, 393-399 (1989); Williams et al., Planta, 182, 540-545 (1990); Grimm et al., Planta, 182, 480-485 (1990)]. A kotranszport sztöchiometriája 1:1 [Bush, Plánt Physiol., 93, 1590-1596 (1990)]. A szacharóznak a növényi sejtek plasmodiumán keresztül való transzportjára azonban mechanizmust is javasoltak [Robards & Lucas, Ann. Rév. Plánt Physiol., 41,
369-419 (1990)]. Annak ellenére, hogy tudjuk, hogy egy ilyen aktív transzportrendszer létezik, amely lehetővé teszi, hogy a szacharóz eljusson a transzportcsatornákhoz, az ilyen tulajdonságokkal rendelkező fehérje még nem ismert. A cukorrépa-plazmamembránt szacharóz jelenlétében, illetve a nélkül, N-etil-maleimiddel festve Gáliét és munkatársai [Biochem. Biophys. Acta, 978, 56-64 (1989)] olyan információkhoz jutottak, hogy egy 42 kD méretű fehéqe léphet kölcsönhatásba a szacharózzal. A plazmamembrán fehérjéinek ebbe a mérettartományba eső frakciója elleni antitestek gátolhatják a szacharóznak a plazmamembránokon való átfutását [Lemoine et al., Biochem. Biophys. Acta, 978, 65-71 (1989)]. Ezzel szemben olyan információkhoz is jutottak egyes kutatók [Ripp et al., Plánt Physiology, 88, 1435-1445 (1988)], hogy a szójababfehéijét a szacharóz analóggal, a dezoxi-azido-hidroxi-benzamidoszacharózzal fotoaffinitás módszerrel jelezve, egy 62 kD méretű fehérje is részt vesz a szacharóz membránokon át történő transzportjában. A szaharóztranszporter aminosavszekvenciája azonban nem ismert.
Az alábbiakban olyan DNS-szekvenciákat ismertetünk, amelyek egy oligoszacharid-transzporter kódolórégióját tartalmazzák, és amelyeknek a nukleotidszekvenciában tárolt információja lehetővé teszi, a növényi genomba való integráció révén, hogy egy olyan RNS keletkezzen, amelynek révén egy új oligoszacharid-transzport-aktivitás juttatható be a növényi sejtekbe, illetve egy endogén oligoszacharid-transzporter-aktivitás expresszálható. Az oligoszacharid-transzporter szakkifejezés alatt egy növényi eredetű, például spenótból vagy burgonyából származó szaharóztranszportert értünk.
Az oligoszacharid-transzporter kódolórégiójának azonosítását egy olyan eljárással végezzük, amely lehetővé teszi a transzporter molekulákat kódoló izolálását, oly módon, hogy Saccharomyces cerevisiae élesztő egy specifikus mutánsában expresszáljuk. Ehhez megfelelő élesztőmutánsokat kell előállítani, amelyek nem képesek felvenni azt az anyagot, amelyre egy megfelelő transzportermolekula kódolószekvenciáját kell izolálni egy növényi génkönyvtárból. A káliumtranszport-deficiencia komplementálására élesztőmutánsokban már ismert egy eljárás [Anderson et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89, 3736-3740 (1992)]. Ebben az eljárásban növényi mRNS-ről készített élesztő-cDNS-szekvenciákat expresszálnak élesztőmutánsokban, expressziós vektorok alkalmazásával. Azok az élesztők, amelyek így fel tudják venni a sejtekbe transzportálandó anyagokat, az expressziós vektorban tartalmazzák egy transzportermolekula kódolórégióját. Ez az ismert eljárás azonban nem alkalmas egy szaharóztranszporter-molekula kódolórégiójának azonosítására, mivel az élesztő nem tartalmaz olyan endogén szaharóztranszporter-molekulát, amelyet a mutációval ki lehetne kapcsolni. Az élesztők egy hasító invertázt kódolnak, amely az extracelluláris szacharózt úgy hasítja, hogy a hexózokat a sejtek a hexóztranszporter révén tudják felvenni.
Ahhoz, hogy olyan élesztőtörzseket készítsünk, illetve transzformáljunk, amelyek egy növényi oligoszacha2
HU 220 335 Β rid-transzporter azonosítását szolgálják, a következő lépéseket hajtjuk végre:
a) először, homológ rekombinációval egy hibás suc2 gént tartalmazó élesztőtörzset készítünk, amely nem képes az invertázt elhasítani, majd ebből
b) egy növényi sejtekből származó, szacharózszintetázaktivitással rendelkező génnel való transzformációval egy olyan élesztősejtet készítünk, amely képes az intracelluláris szacharózt elhasítani, majd
c) ezt a törzset egy élesztősejtekben működő expreszsziós vektorban készített növényi cDNS-könyvtárral transzformálva azonosítjuk azt a DNS-szekvenciát, amely egy növényi oligoszacharid-transzportert kódol.
Az ebben az eljárásban növényi oligoszacharidtranszporterek azonosítására kapott élesztőtörzsek pél5 dául az YSH 2.64-1A-SUSY (DSM 7106) és az YSH 2.64-1A-INV (DSM 7105).
Az YSH 2.64-1 A-SUSY élesztőtörzs segítségével, a SEQ ID NO. 1 szekvenciával rendelkező, spenótból származó, illetve a SEQ ID NO 2. szekvenciával rendelkező, burgonyából származó szaharóztranszportert kódoló DNS-szekvenciákat azonosítottuk.
SEQ ID NO. 1 szekvencia
AAAAACACAC ACCCAAAAAA AAAACACTAC GACTATTTCA AAAAAAACAT TGTTACTAGA 60
AATCTTATT ATG GCA GGA AGA AAT ATA AAA AAT GGT GAA AAT AAC 105
Me t Alá Gly Arg Asn Ile Lys Asn Gly Glu Asn Asn 1 5 10
AAG Ly s ATT GCG GGT TCT TCT CTT CAC TTA GAG AAG AAC Asn CCA Pro 25 ACA Thr ACT Thr 150
Ile Al a 15 Gly Ser Ser Leu Hi s 20 Leu Glu Lys
CCC CCC GAG GCC GAG GCT ACC TTA AAG AAG CTC GGC CTC GTG GCT 195
Pro Pro Glu 30 Al a Glu Al a Thr Leu 35 Ly s Ly s Leu Gly Leu 40 Va 1 Al a
TCA GTA GCG GCC GGG GTT CAG TTC GGG TGG GCT TTA CAG CTC TCC 240
Ser Va 1 Al a 45 Al a Gly Val Gin Phe 50 Gly Trp Al a Leu Gin 55 Leu Ser
CTA CTG ACC CCG TAC GTC CAA CTA CTG GGC ATT CCC CAC ACT TGG 285
Leu Leu Thr 60 Pro Tyr Val Gin Leu 65 Leu Gly Ile Pro Hi s 70 Thr Trp
GCC GCC TAC ATC TGG TTG TGC GGC CCA ATC TCG GGG ATG ATT GTC 330
Al a Al a Tyr 75 Ile Trp Leu Cy s Gly 80 Pro Ile Se r Gly Me t 85 Ile Va 1
CAG CCA TTG GTC GGG TAC TAT AGT GAC CGG TGC ACC TCC CGC TTC 375
Gin Pro Leu 90 Val Gly Tyr Tyr Ser 95 Asp Arg Cy s Thr Ser 100 Arg Phe
GGC CGA CGT CGC CCC TTC ATT GCA GCA GGG GCG GCT CTA GTG GCC 420
G1 y Arg Arg 105 Arg Pro Phe Ile Al a 110 Alá Gly Al a Al a Leu 115 Va 1 Al a
GTA GCG GTG GGG CTA ATC GGA TTC GCC GCC GAT ATC GGC GCA GCG 465
Val Al a Val 120 Gly Leu Ile Gly Phe 125 Al a Al a Asp Ile Gly 130 Al a Al a
TCG GGT GAT CCA ACG GGA AAC GTG GCA AAA CCC CGG GCC ATC GCG 510
Ser Gly As p 135 Pro Thr Gly Asn Va 1 140 Al a Lys Pro Arg Al a 145 Ile Al a
GTG TTT GTG GTC GGG TTT TGG ATC CTC GAC GTG GCT AAC AAC ACC 555
Val Phe Val 150 Va 1 Gly Phe Trp Ile 155 Leu Asp Va 1 Al a Asn 160 As n Thr
HU 220 335 Β
600
CTG CAA GGC CCA TGC AGG GCG TTG TTA GCA GAC ATG GCC GCC GGG
Leu Gin G1 y 165 Pro Cy s Arg Al a Leu 170 Leu Alá Asp Me t Al a 175 Al a Gly
TCG CAA ACC AAA ACC CGG TAC GCT AAC GCC TTC TTC TCC TTC TTC
Ser Gin Thr 180 Ly s Thr Arg Tyr Al a 185 Asn Al a Phe Phe Ser 190 Phe Phe
ATG GCG TTA GGA AAC ATC GGA GGG TAC GCC GCC GGT TCA TAC AGC
Me t Al a Leu 195 Gly Asn Ile Gly Gly 200 Tyr Alá Al a Gly Ser 205 Tyr Ser
CGC CTC TAC ACG GTG TTC CCC TTT ACC AAA ACC GCC GCC TGC GAC
Arg Leu Tyr 210 Thr Va 1 Phe Pro Phe 215 Thr Ly s Thr Al a Al a 220 Cy s Asp
GTC TAC TGC GCC AAT CTA AAA TCC TGC TTC TTC ATC TCC ATC ACA
Val Tyr Cy s 225 Al a Asn Leu Ly s Ser 230 Cy s Phe Phe Ile Ser 235 Ile Thr
CTC CTA ATC GTC CTC ACA ATC CTA GCA CTT TCC GTC GTA AAA GAG
Leu Leu I le 240 Val Leu Thr Ile Leu 245 Al a Leu Ser Val Val 250 Ly s Glu
CGT CAA ATC ACA ATC GAC GAA ATC CAA GAA GAA GAA GAC TTA AAA
Arg Gin I le 255 Thr Ile As p Glu Ile 260 Gin Glu Glu Glu Asp 265 Leu Ly s
AAC AGA AAC AAT AGC AGC GGT TGT GCA AGA CTA CCG TTC TTC GGA
Asn Arg Asn 270 Asn Ser Ser Gly Cy s 275 Al a Arg Leu Pro Phe 280 Phe Gly
CAA TTA ATA GGC GCT CTC AAA GAT CTA CCA AAA CCA ATG CTA ATC
Gin Leu Ile 285 Gly Al a Leu Ly s Asp 290 Leu Pro Ly s Pro Me t 295 Leu Ile
CTA TTA CTA GTA ACA GCC CTA AAT TGG ATC GCA TGG TTT CCA TTC
Leu Leu Leu 300 Val Thr Al a Leu Asn 305 Trp Ile Al a Trp Phe 310 Pro Phe
TTG TTG TTC GAT ACT GAT TGG ATG GGT AAA GAA GTG TAC GGT GGT
Leu Leu Phe 315 Asp Thr Asp Trp Me t 320 Gly Ly s Glu Val Tyr 325 Gly Gly
ACA GTC GGA GAA GGT AAA TTG TAC GAC CAA GGA GTT CAT GCC GGT
Thr Va 1 Gly 330 Glu Gly Ly s Leu Tyr 335 As p Gin Gly Val Hi s 340 Al a Gly
GCC TTA GGT CTG ATG ATT AAC TCC GTT GTC TTA GGT GTT ATG TCG
Al a Leu Gly 345 Leu Me t Ile Asn Ser 350 Val Val Leu Gly Val 355 Me t Ser
TTG AGT ATT GAA GGT TTG GCT CGT ATG GTA GGC GGT GCT AAA AGG
Leu Ser Ile 360 Glu Gly Leu Al a Arg 365 Me t Val G1 y Gly Al a 370 Ly s Arg
TTA TGG GGA ATT GTC AAT ATT ATT CTT GCT GTT TGT TTA GCT ATG
Leu Trp Gly 375 Ile Val Asn Ile Ile 380 Leu Al a Val Cy s Leu 385 Al a Me t
645
690
735
780
825
870
915
960
1005
1050
1095
1140
1185
1230
HU 220 335 Β
ACG Thr GTG TTA GTT Val ACT Thr AAG Ly s TCC Ser GCC GAA CAC TTC CGT GAT AGC CAC 1275
Va 1 Leu 390 Al a 395 Glu Hi s Phe Arg Asp 400 Ser Hi s
CAT ATT ATG GGC TCC GCC GTC CCT CCG CCG CCG CCT GCT GGT GTT 1320
Hi s I le Me t 405 Gly Ser Al a Val Pro 410 Pro Pro Pro Pro Al a 415 Gly Val
AAG GGT GGC GCT TTG GCT ATC TTT GCC GTT CTT GGT ATC CCT CTT 1365
Lys Gly Gly 420 Al a Leu Al a I le Phe 425 Al a Val Leu Gly I le 430 Pro Leu
GCG ATC ACT TTC AGT ATT CCT TTG GCC TTG GCG TCA ATC TTT TCA 1410
Al a I le Thr 435 Phe Ser I le Pro Phe 440 Al a Leu Al a Ser I le 445 Phe Ser
GCA TCT TCC GGT TCA GGA CAA GGT CTT TCT CTA GGA GTT CTC AAC 1455
Al a Ser Ser 450 Gly Ser Gly Gin Gly 455 Leu Ser Leu Gly Val 460 Leu Asn
CTC GCC ATC GTT GTA CCC CAG ATG TTT GTG TCG GTA ACA AGT GGG 1500
Leu Al a I le 465 Val Va 1 Pro Gin Me t 470 Phe Val Ser Val Thr 475 Ser Gly
CCA TGG GAT GCA ATG TTT GGT GGA GGA AAT TTG CCA GCA TTC GTG 1545
Pro Trp Asp 480 Al a Me t Phe Gly Gly 485 Gly Asn Leu Pro Al a 490 Phe Val
GTG GGA GCT GTA GCA GCA ACA GCC AGT GCA GTT CTT TCA TTT ACA 1590
Val Gly Al a 495 Val Al a Al a Thr Al a 500 Ser Al a Va 1 Leu Ser 505 Phe Thr
TTG TTG CCT TCT CCA CCC CCT GAA GCT AAA ATT GGT GGG TCC ATG 1635
Leu Leu Pro 510 Ser Pro Pro Pro Glu 515 Al a Ly s I le Gly Gly 520 Ser Me t
GGT GGT CAT TAAGAAATTT AATACTACTC CGTACAATTT AAACCCAAAT 1684
Gly Gly His
525
TAAAAATGAA AATGAAAATT TTTAACCCAT GTTCGTTACG TTGTAATTAG 1734
AGAGAAAAAT GATATATTGA ACGAAGCCGT TAATTTATGC TCCGTTCATC 1784
TTGTAATTCT TTTTCTCTCT GCTTTTTTTT TTTTTTTTTA ACGCGACGTG 1834
TTTTTGAGAT AAGGAAGGGC TAGATCGAGG ATGGGGGAAT TGGCAAGAAA 1884
TTGCTCGGGT ATAAATATTT ATCCCTCTTT GTAATTTTCA GTAACATTTA 1934
ATAGCCAGAA ATCAAAAAGT CAAGAAAAAT CGAAA 1969
SEQID NO. 2 szekvencia
AAAA 4
ATG GAG AAT GGT ACA AAA AGA GAA GGT TTA GGG AAA CTT ACA GTT 49
Me t Glu Asn Gly Thr Lys Arg Glu Gly Leu Gly Lys Leu Thr Val
10 15
HU 220 335 B
TCA TCT TCT CTA CAA GTT GAA CAG CCT TTA GCA CCA TCA AAG CTA
Ser Ser Ser Leu Gin 20 Val Glu Gin Pro Leu 25 Alá Pro Ser Ly s Leu 30
TGG AAA ATT ATA GTT GTA GCT TCC ATA GCT GCT GGT GTT CAA TTT
Trp Ly s I le I le Val 35 Val Al a Ser I le Al a 40 Al a Gly Val Gin Phe 45
GGT TGG GCT CTT CAG CTC TCT TTG CTT ACA CCT TAT GTT CAA TTG
Gly Trp Al a Leu Gin 50 Leu Ser Leu Leu Thr 55 Pro Tyr Val Gin Leu 60
CTC GGA ATT CCT CAT AAA TTT GCC TCT TTT ATT TGG CTT TGT GGA
Leu Gly I le Pro Hi s 65 Ly s Phe Al a Ser Phe 70 I le Trp Leu Cy s Gly 75
CCG ATT TCT GGT ATG ATT GTT CAG CCA GTT GTC GGC TAC TAC AGT
Pro I le Ser Gly Me t 80 I le Val Gin Pro Val 85 Va 1 Gly Tyr Tyr Ser 90
GAT AAT TGC TCC TCC CGT TTC GGT CGC CGC CGG CCA TTC ATT GCC
Asp Asn Cy s Ser Ser 95 Arg Phe G1 y Arg Arg 100 Arg Pro Phe I le Al a 105
GCC GGA GCT GCA CTT GTT ATG ATT GCG GTT TTC CTC ATC GGA TTC
Al a Gly Al a Al a Leu 110 Val Me t I le Al a Val 115 Phe Leu I le Gly Phe 120
GCC GCC GAC CTT GGT CAC GCC TCC GGT GAC ACT CTC GGA AAA GGA
Al a Al a Asp Leu Gly 125 Hi s Al a Ser Gly Asp 130 Thr Leu Gly Ly s Gly 135
TTT AAG CCA CGT GCC ATT GCC GTT TTC GTC GTC GGC TTT TGG ATC
Phe Ly s Pro Arg Al a 140 1 le Al a Val Phe Val 145 Val Gly Phe Trp I le 150
CTT GAT GTT GCT AAC AAC ATG TTA CAG GGC CCA TGC AGA GCA CTA
Leu As p Val Al a Asn 155 Asn Me t Leu Gin Gly 160 Pro Cy s Arg Al a Leu 165
CTG GCT GAT CTC TCC GGC GGA AAA TCC GGC AGG ATG AGA ACA GCA
Leu Al a Asp Leu Ser 170 Gly Gly Ly s Ser Gly 175 Arg Me t Arg Thr Al a 180
AAT GCT TTT TTC TCA TTC TTC ATG GCC GTC GGA AAC ATT CTG GGG
Asn Al a Phe Phe Ser 185 Phe Phe Me t Al a Val 190 Gly Asn I le Le u Gly 195
TAC GCC GCC GGT TCA TAT TCT CAC CTC TTT AAA GTA TTC CCC TTC
Tyr Al a Al a Gly Ser 200 Tyr Ser Hi s Leu Phe 205 Ly s Val Phe Pro Phe 210
TCA AAA ACC AAA GCC TGC GAC ATG TAC TGC GCA AAT CTG AAG AGT
Ser Ly s Thr Ly s Al a 215 Cy s Asp Me t Tyr Cy s 220 Al a Asn Leu Ly s Ser 225
TGT TTC TTC ATC GCT ATA TTC CTT TTA CTC AGC TTA ACA ACC ATA
Cy s Phe Phe I le Al a I le Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Thr I le
230 235 240
139
184
229
274
319
364
409
454
499
544
589
634
679
724
HU 220 335 Β
GCC TTA ACC TTA GTC CGG GAA AAC GAG CTC CCG GAG AAA GAC GAG 769
Al a Leu Thr Leu Val 245 Arg Glu Asn Glu Leu 250 Pro Glu Lys Asp Glu 255
CAA GAA ATC GAC GAG AAA TTA GCC GGC GCC GGA AAA TCG AAA GTA 814
Gin Glu I le Asp Glu 260 Lys Leu Al a Gly Al a 265 Gly Ly s Ser Lys Va 1 270
CCG TTT TTC GGT GAA ATT TTT GGG GCT TTG AAA GAA TTA CCT CGA 859
Pro Phe Phe Gly Glu 275 I le Phe Gly Al a Leu 280 Ly s Glu Leu Pro Arg 285
CCG ATG TGG ATT CTT CTA TTA GTA ACC TGT TTG AAC TGG ATC GCG 904
Pro Me t Trp lle Leu 290 Leu Leu Va 1 Thr Cy s 300 Le u Asn Trp I le Al a 305
TGG TTT CCC TTT TTC TTA TAC GAT ACA GAT TGG ATG GCT AAG GAG 949
Trp Phe Pro Phe Phe 310 Leu Tyr Asp Thr Asp 315 Trp Me t Al a Ly s Glu 320
GTT TTC GGT GGA CAA GTC GGT GAT GCG AGG TTG TAC GAT TTG GGT 994
Val Phe Gly Gly Gl n 325 Va 1 Gly Asp Al a Arg 330 Leu Tyr Asp Leu Gly 335
GTA CGC GCT GGT GCA ATG GGA TTA CTG TTG CAA TCT GTG GTT CTA 1039
Val Arg Alá Gly Al a 340 Me t Gly Leu Leu Leu 345 Gin Ser Val Val Leu 350
GGG TTT ATG TCA CTT GGG GTT GAA TTC TTA GGG AAG AAG ATT GGT 1084
Gly Phe Me t Ser Leu 355 Gly Val Glu Phe Leu 360 Gly Ly s Lys I le Gly 370
GGT GCT AAG AGG TTA TGG GGA ATT TTG AAC TTT GTT TTG GCT ATT 1129
Gly Al a Lys Arg Leu 375 Trp Gly I le Leu Asn 380 Phe Val Leu Al a lle 385
TGC TTG GCT ATG ACC ATT TTG GTC ACC AAA ATG GCC GAG AAA TCT 1174
Cy s Leu Al a Me t Thr 390 I le Leu Va 1 Thr Lys 395 Me t Alá Glu Lys Ser 400
CGC CAG CAC GAC CCC GCC GGC ACA CTT ATG GGG CCG ACG CCT GGT 1219
Arg Gin Hi s As p Pro 405 Al a Gly Thr Leu Me t 410 Gly Pro Thr Pro Gly 415
GTT AAA ATC GGT GCC TTG CTT CTC TTT GCC GCC CTT GGT ATT CCT 1264
Val Ly s I le Gly Al a 420 Leu Leu Leu Phe Al a 425 Al a Leu Gly I le Pro 430
CTT GCG GCA ACT TTT AGT ATT CCA TTT GCT TTG GCA TCT ATA TTT 1309
Leu Al a Al a Thr Phe 435 Ser I le Pro Phe Al a 440 Leu Al a Ser lle Phe 445
TCT AGT AAT CGT GGT TCA GGA CAA GGT TTG TCA CTA GGA GTG CTC 1354
Ser Ser Asn Arg Gly 450 Ser Gly Gin Gly Leu 455 Ser Leu Gly Val Leu 460
AAT CTT GCA ATT GTT GTA CCA CAG ATG TTG GTG TCA CTA GTA GGA 1399
As n Leu Al a I le Va 1 465 Val Pro Gin Me t Leu 470 Va 1 Ser Leu Va 1 Gl y 475
HU 220 335 Β
GGG CCA TGG GAT GAT TTG TTT Phe GGA GGA GGA AAC TTG CCT GGA TTT 1444
Gly Pro Trp Asp Asp 480 Leu Gly Gly Gly 485 Asn Leu Pro Gly Phe 490
GTA GTT GGA GCA GTT GCA GCT GCC GCG AGC GCT GTT TTA GCA CTC 1489
Val Va 1 Gly Alá Val Al a Al a Al a Alá Ser Al a Val Leu Al a Leu
495 500 505
ACA ATG TTG CCA TCT CCA CCT GCT GAT GCT AAG CCA GCA GTC GCC 1534
Thr Me t Leu Pro Ser Pro Pro Al a Asp Alá Ly s Pro Al a Val Al a
510 515 520
ATG GGG CTT TCC ATT AAA TAATTACAAA AGAAGGAGAA GAACAACTTT 1582
Me t Gly Leu Ser I le Ly s
525
TTTTTAATAT TAGTACTTCT CTTTTGTAAA CTTTTTTTAT TTTAGAAAAC 1632
AAACATAACA TGGAGGCTAT CTTTACAAGT GGCATGTCCA TGTATCTTCC 1682
TTTTTTCATA AAGCTCTTTA GTGGAAGAAG AATTAGAGGA AGTTTCCTTT 1732
TAATTTCTTC CAAACAAATG GGGTATGTGT AGTTGTTTTC A 1773
Az azonosított DNS-szekvenciákat plazmidokba lehet építeni, és ezáltal az eukarióta sejtekben való expresszáláshoz szükséges vezérlőelemekkel lehet kombinálni (lásd 5. példa). Ezek a vezérlőelemek egyrészt transzkripciós promoterek, illetve transzkripciós terminátorok. A plazmidokban levő, találmány szerinti DNSszekvenciákkal az eukarióta sejtek transzformálhatok, azzal a céllal, hogy egy transzlációs folyamatba vihető mRNS képződjön, amely lehetővé teszi, hogy a sejtekben egy szaharóztranszporter szintetizálódjon, illetve azzal a céllal, hogy egy transzlációs folyamatba nem vihető RNS keletkezzen, amely megakadályozza, hogy a sejtekben egy endogén szaharóztranszporter szintetizálódjon. A találmány szerinti szekvenciáknak megfelelő oligoszacharid-transzporter RNS expresszálásával lehetséges a növényi szénhidrát-metabolizmus módosítása, aminek az lehet a jelentősége, hogy a tartalék tápanyagoknak fokozódik a betakarított növényi részekbe való áramlása, és ennek eredménye a mezőgazdasági termények termésátlagának növekedése. Az, hogy a tartalék tápanyagoknak az egyes növényi szervekbe való eljutását fokozni lehet, lehetővé teszi a teljes növény módosítását, aminek eredménye az, hogy az egyes szöveteknek, például a leveleknek a növekedése lelassul, míg a betakarított részeknek a növekedése meggyorsul. Ehhez el lehet képzelni a termények vegetatív fázisának meghosszabbodását, ami a tartalék tápanyagok fokozott képződéséhez vezet.
A kétszikű és egyszikű növények genetikai módosítására szolgáló eljárások már ismertek [Gasser, C. S., Fraley, R. T., Science, 244, 1293-1299 (1989); Potrykus, Ann. Rév. Plánt Mól. Bioi. Plánt Physiol., 42, 205-225 (1991)]. A növényekben való expresszióhoz a kódolószekvenciákat transzkripciós szabályozóelemekhez kell kapcsolni. Az ilyen elemeket promotereknek hívják, és jól ismertek (EP 375091). Emellett a kódolórégiókat transzkripciós terminációs szignálokkal is el kell látni, amelyek lehetővé teszik, hogy helyesen íródjanak át. Ezeket az elemeket is leírták már [Gielen et al., EMBO J., 8, 23-29 (1989)]. A transzkripciós startrégió lehet eredeti, természetes, és/vagy homológ, illetve idegen és/vagy heterológ az adott gazdanövényben. Ha szükséges, akkor a terminációs régiók egymással felcserélhetők. A transzkripció kezdő és terminációs régióinak DNS-szekvenciája szintetikusan is előállítható, illetve a sejtekből izolálható, illetve szintetikus és természetes DNS-elemek keverékeként is előállítható. Ahhoz, hogy idegen géneket magasabbrendű növényekbe juttassunk, nagyszámú klónozóvektor áll rendelkezésünkre, amelyek tartalmaznak egy Escherichia coli replikációs szignált is, valamint egy marker gént, amely lehetővé teszi a transzformált sejtek szelektálását. Ilyen vektor például a pBR322, a pUC-sorozat, az M13 mp-sorozat, a pACYC 184, stb. Attól függően, hogy milyen módszerrel juttatjuk be a kiválasztott gént a növényekbe, más DNS-szekvenciák is megfelelők lehetnek. Ha a Ti- vagy Ri-plazmidot kell használnunk, például a növényi sejt transzformálására, akkor a Tivagy Ri-plazmid T-DNS-ének legalább a jobb karját, gyakran azonban mind a jobb, mind a bal kaiját egy határolórégióként hozzákapcsoljuk a bejuttatandó génhez. A T-DNS-ek használatát növényi sejtek transzformálására intenzíven kutatták, és részletesen ismertetik a szakirodalomban [EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plánt Vector System, Offset-drukkerij Kanters Β. V. Alblasserdam, Chapter V (1985); Fraley et al., Crit. Rév. Plánt Sci., 4, 1-46; An et al., EMBO J., 4, 277-287 (1985)]. Ha egyszer a bejuttatott DNS integrálódik a genomba, akkor ott törvényszerűen stabil, és megmarad az eredetileg transzformált sejtek utódaiban is. Normális körülmények között tartalmaz egy szelekciós markert, amely a transzformált növényi sejtekben
HU 220 335 Β rezisztenciát indukál egy biocid vagy antibiotikum ellen, például kanamicin, G418, bleomicin, higromicin, foszfmotricin, stb. ellen. Az alkalmazott markemek lehetővé kell tennie, hogy a transzformált sejteket a többi, a bejuttatott DNS-t nem tartalmazó sejtek közül kiválasszuk.
Ahhoz, hogy a DNS-t egy növényi gazdasejtbe bejuttassuk, az Agrobacteriummal végzett transzformáció mellett számos technika használható. Ilyen technika például a protoplasztfüzió, a DNS mikroinjektálása, az elektroporáció, valamint a ballisztikus módszerek és a vírusfertőzés. A transzformált növényi anyagból egy megfelelő, a szelekcióhoz antibiotikumokat vagy biocideket tartalmazó táptalajon teljes növények regenerálhatok. A keletkező növények megvizsgálhatok a bejuttatott DNS szempontjából. Az elektroporációban vagy az injektálásban alkalmazott plazmidokkal szemben nincsenek speciális igények. Egyszerű plazmidok, például pUC származékok használhatók. Ha azonban az ilyen transzformált sejtekből teljes növényeket kell regenerálni, akkor egy szelektálható marker gént is kell hogy tartalmazzanak. A transzformált sejtek a növényben a szokásos módon növekszenek [McCormick et al., Plánt Cell Reports, 5, 81-84 (1986)]. Ezek a növények normálisan felnevelhetők és más növényekkel keresztezhetek, amelyek vagy ugyanazokat a bejuttatott géneket tartalmazzák, vagy eltérő növények. A keletkező hibrid egyedek a megfelelő fenotípussal rendelkeznek.
A találmány szerinti DNS-szekvenciákat plazmidokba is be lehet juttatni, és prokarióta sejtekben való expresszióhoz szükséges szabályzóelemekkel lehet kombinálni. Ha baktériumokban eukarióta szaharóztranszporter génről transzlációs folyamatba vihető RNS-szekvencia keletkezik, akkor ennek az a következménye, hogy annak ellenére, hogy jelentős különbségek vannak a prokarióták és az eukarióták membránjának a szerkezetében, olyan prokarióta szervezetek jönnek létre, amelyek képesek felvenni a szacharózt. Ez lehetővé teszi technikai szempontból érdekes baktériumtörzsek előállítását, amelyek a viszonylag olcsó szacharózon szaporíthatok (lásd 5. példa).
Például a polihidroxivajsav Alcaligenes eutrophus baktériumban való előállítását már leírták [Steinbüchel & Schubert, Arch. Microbiol., 153, 101-104 (1989)]. A baktérium azonban csak nagyon kevés számú szubsztrátot képes hasznosítani. Tehát egy szaharóztranszporter gén Alcaligenes eutrophusban való expresszálása nagyon érdekes lenne.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák plazmidokba is beépíthetők, ami lehetővé teszi a mutagenezist vagy a szekvencia módosítását a DNS-szekvencia rekombinációja révén eukarióta vagy prokarióta rendszerekben. Ily módon a szaharóztranszporter specifitása módosítható.
Standard eljárások alkalmazásával [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)] báziscserék hajthatók végre, illetve természetes vagy szintetikus szekvenciák építhetők be. A DNS-molekulák egymáshoz kötésére adapter vagy linker molekulák kapcsolhatók a fragmentekhez. Emellett olyan manipulációk végezhetők el, amelyekkel megfelelő restrikciós hasítási helyek készíthetők, illetve a fölösleges restrikciós hasítási helyek eltávolíthatók. Ahol inszerciókat, deléciókat vagy szubsztitúciókat kell végezni, in vitro mutagenezis, primer repair, restrikciós emésztések vagy ligálások végezhetők. Az elemzés módszereként általában szekvenciaelemzés, restrikciós elemzés és más biokémiai, molekuláris biológiai módszerek használhatók. Az egyes manipulációk után a használt DNS-szekvenciát el lehet hasítani és más DNS-szekvenciához lehet kapcsolni. Az egyes plazmidszekvenciák ugyanabban, vagy egy eltérő plazmidban klónozhatok.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák származékai vagy részei, valamint a találmány szerinti plazmidok használhatók prokarióta és eukarióta sejtek transzformálására is. Emellett a találmány szerinti DNS-szekvenciák standard módszerekkel használhatók hasonló szekvenciák izolálására különböző növényfajok genomjából, amely szekvenciák szintén szacharózt vagy egyéb oligoszacharidot transzportáló molekulát kódolnak. Ezekkel a szekvenciákkal növényi sejtek transzformálására alkalmas konstrukciók készíthetők, amelyek módosítják a transzportfolyamatokat a transzgenikus növényekben.
Abból a célból, hogy meghatározzuk a rokon DNSszekvenciákat, először génkönyvtárakat kell készíteni, amelyek egy növényfaj génjeit tartalmazzák, illetve az egy növényfajban expresszálódó géneket tartalmazzák. Az előzőeket genomiális könyvtáraknak, az utóbbiakat cDNS-könyvtáraknak nevezzük. Ezekből a rokon szekvenciák a találmány szerinti DNS-szekvenciákat próbaként használva izolálhatok. Ha egyszer a rokon gént azonosítottuk és izoláltuk, akkor már lehetséges a szekvencia meghatározása és a szekvencia által kódolt fehérjék tulajdonságainak elemzése.
Abból a célból, hogy megértsük a találmány alapjait képező példákat, az összes, a tesztekhez szükséges eljárást, amelyek önmagukban ismertek, az alábbiakban soroljuk fel:
1. Klönozási eljárás
A klónozáshoz a Lambda ZapII fágot használjuk, valamint a pBluescript SK vektort [Short et al., Nucleic Acids Research, 16, 7583-7600 (1988)].
Az élesztők transzformálásához az Ylplac 128 és YEplac 112 vektorokat használjuk [Gietz & Sugino, Gene, 74, 527-534 (1988)].
A növények transzformálásához a pBinAR bináris vektorban levő génkonstrukciókat használjuk [Höfgen & Wilmitzer, Plánt Sci., 66, 221-230 (1990)].
2. Baktérium- és élesztőtörzsek
A pBluescript SK vektorhoz és a pBinAR konstrukcióhoz a Escherichia coli XLlblue törzset használjuk [Bullock et al., Biotechniques, 5, 376-378 (1987)].
A találmány szerinti YSH 2.64-lA-susy élesztőtörzs előállításához kiindulási törzsként az YSH 2.64-1 A törzset használjuk [Gozzalbo & Hohmann, Curr. Génét., 17, 77-79 (1990)].
A plazmid burgonyanövénybe való transzformálását Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel
HU 220 335 Β végezzük [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8720 (1984)].
3. Az Agrobacterium tumefaciens törzs transzformálása
A DNS-nek az Agrobacteriumok.'m. való juttatását közvetlen transzformációval végezzük, Höfgen és Willmitzer módszerével [Nucleic Acids Research, 16, 9877 (1988)]. A transzformált Agrobacterium plazmidDNS-ét Bimbóim és Doly módszerével izoláljuk [Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)], majd gélelektroforézissel elemezzük, a megfelelő restrikciós enzimes emésztések után.
4. Növényi transzformáció
Steril burgonyatenyészetből tíz kis levelet, amelyeket egy szikével felsértettünk, 10 ml MS táptalajba teszünk, amely 30-50 μΐ Agrobacterium tumefaciens éjszakán át szelekciós nyomás alatt növesztett tenyészetét tartalmazza. 3-5 perces enyhe rázatás után a leveleket MS táptalajra tesszük, amely 1,6% glükózt, 2 mg/1 zeatin ribózt, 0,02 mg/1 naftilecetsavat, 0,02 mg/1 gibberellinsavat, 500 mg/1 claforant, 50 mg/1 kanamicint és 0,8% Bacto agart tartalmaz. Miután egy hétig 25 °C-on, 3000 lux megvilágítás mellett inkubáltuk, a táptalajban levő claforankoncentrációt a felére csökkentjük.
Letétbe helyezések
Az alábbi plazmidokat és élesztőtörzseket helyeztük letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél (DSM, Braunschweig, Németország), 1992. december 6-án. A letéti számok:
Plazmid PSK.-S21 (DSM 7115)
Élesztőtörzs YSH 2.64-1 A-SUSY (DSM 7106)
Élesztőtörzs YSH 2.64-1A-INV (DSM 7105)
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
1. ábra
A szacharóz élesztősejtekbe való felvételének időgörbéje „pmol/mg sejt”=a 14C-jelzett szacharóz mennyisége pmol-ban, az élesztősejtek mg-ban kifejezett nedves súlyához viszonyítva;
„112”=kiindulási törzs (transzporter nélkül); „+Glükóz”=a sejtek előinkubálása 10 mmol/1 glükózt tartalmazó táptalajban;
,,-Glükóz”=a sejtek nincsenek előinkubálva;
„2,5 pMCCCP”=2,5 pmol/l koncentrációjú inhibitorral, a karbonil-cianid-m-klór-fenil-hidrazonnal (CCCP) való előinkubálás;
„500 pMMPCMBS”=500 pmol/l koncentrációjú inhibitorral, a p-klór-merkuri-benzolszulfonsawal (PCMBS) való előinkubálás;
„10 pmol/l Antimicin”= 10 pmol/l koncentrációjú inhibitorral, az antimicinnel való előinkubálás.
2. ábra
A pMA5-lNVplazmid klónozása A pSEYC 306-1 plazmidból származó 2,4 kb méretű HindlII fragmentnek a pMA5-10 plazmidba való beépülését mutatja.
3. ábra
A pBinAR-S21 plazmidot mutatja Az ábrán levő jelölések jelentése:
CaMV 35S promoter: a karfiol-mozaikvírus 35S RNS génjének promotere;
A: a szaharóztranszporter kódolórégiója spenótban;
ÖCS: Az Agrobacterium tumefaciensből származó oktopin szintetáz gén terminátora;
Smal, NotI, BamHI: A restrikciós enzimek hasítási helyei.
4. ábra
A pBinAR-P62-anti plazmidot mutatja Az ábrán levő jelölések jelentése:
CaMV 35S promoter: a karfiol-mozaikvírus 35S RNS génjének promotere;
ÖCS: Az Agrobacterium tumefaciensből származó oktopin szintetáz gén terminátora;
Smal, SacI, BamHI, Xbal: A restrikciós enzimek hasítási helyei.
5. ábra
A különböző szénhidrátok mennyisége a
BinAR-P62-anti transzformánsokban Az ábrán levő jelölések jelentése:
Fru: fruktóz;
sza: szacharóz;
ke: keményítő;
kontroll: transzformálatlan kiindulási növények;
sp-5-től sp-43-ig az egyes transzformánsok számai.
6. ábra
A szénhidrátok áramlása a pBinAR-P62-anti transzformánsok levélnyelében wt: vad típus;
sp-5-től sp-43-ig az egyes transzformánsok számai.
Az alábbi példákban ismertetjük az élesztőtörzsek készítését, valamint egy növényi szaharóztranszporter azonosítását, működését és használatát.
1. példa
Az YSH 2.64-1 A-SUSY és az YSH 2.64-1A-INV élesztőtörzsek készítése
Az YSH 2.64-1 A élesztőtörzs tulajdonságai: suc2-, malO, leu2, trpl [Gozalbo & Hohmann, Curr. Génét., 17, 77-79 (1990)]. Abból a célból, hogy ebbe a törzsbe egy szacharózt hasító enzimatikus aktivitást juttassunk be, a törzset az YIplazl28A2-SUSY integratív plazmiddal transzformáljuk, amely a burgonyából származó szacharózszintetáz gén kódolórégióját tartalmazza, az élesztőből származó alkohol-dehidrogenáz gén promoteréhez fúzionáltatva. Az Ylplac 128A2-SUSY plazmidot az alábbiak szerint állítjuk elő. Az YIplacl28 plazmidot [Gietz & Sugino, Gene, 74, 527-534 (1988)] PstI és EcoRI restrikciós enzimekkel való emésztéssel megrövidítjük, a túlnyúló végeket leemésztjük vagy feltöltjük, és a polilinker régióba Egáljuk. A megmaradt Sphl hasítási helyre egy 728 bp méretű kazettát építünk be a pVT102U plazmidból származó alkohol-dehidrogenáz promoterrel [Vemet et al, Gene, 52, 225-233 (1987)]. Ily módon kapjuk az YIplacl28A2 plazmidot. A szaharózszintetáz kódoló10
HU 220 335 B régióját polimeráz láncreakcióval ampliflkáljuk, az alábbi oligonukleotidok felhasználásával:
SUSY1 (GAGAGAGGATCCTGCAATGGCTGAAC GTGTTTTGACTCGTG) és
SUSY2 (GAGAGAGGATCCTTCATTCACTCAGCA GCCAATGGAACAGCT) egy burgonya szacharózszintetáz lambda-klónba [Salanoubat & Beliard, Gene, 60, 47-56 (1987)]. A termékből a kódolórégiót kinyerjük egy BamHI fragment formájában, majd a kazetta polilinkerének BamHI hasítási helyére építjük be. Az YSH 264-1A élesztőtörzset az így előállított YIplacl28A2-SUSY plazmiddal transzformáljuk. Mivel a plazmid nem tartalmazza a 2 mikronos régiót, ezért nem képes autonóm replikádéra élesztőben. Ezért az ilyen transzformánsoknak csak leucin auxotrófiára van szükségük, amelyek legalább részben kromoszómálisan integrálják a plazmidDNS-t.
A leucin autotróf telepeket megvizsgáljuk a szacharózszintetáz gén expressziója szempontjából. Ehhez egy 5 ml-es folyadéktenyészet sejtjeit feltárjuk, oly módon, hogy üveggyöngyöket adunk hozzá, majd erőteljesen kevertetjük, majd centrifügálás után a felülúszóban levő összes fehérjét egy enzimakti vitás-mérésben használjuk fel. Az expresszált szaharózszintetáz aktivitása 25 mE/mg fehérje.
Hasonlóképpen egy invertázvizsgálatot is beállítunk az YSH 2.64-1 A élesztőtörzzsel, amelyben az YIplacl28Al-INV plazmid segítségével egy citoszólba kerülő, nem hasítható invertáz gént kromoszómálisan integrálunk az élesztő genomjába. Az YIplacl28Al-INV a szaharózszintetáz gént kódoló régió helyett egy invertáz gént tartalmaz, amelyről hiányzik a géntermék exportálásához szükséges szignálszekvencia. A plazmid prekurzora az YIplacl28Al plazmid, amely az YIplacl28A2 plazmidtól az alkohol-dehidrogenáz gént tartalmazó kazettában levő polilinker orientációjában tér el. Az ebben a plazmidban levő kazetta a pVTIOOU plazmidból származik [Vemet et al., Gene, 52, 225-233 (1987)]. Az invertáz kódolórégióját a suc2 gént tartalmazó DNS-ről kapjuk polimeráz láncreakcióval, az INV3 és az INV4 oligonukleotidok felhasználásával.
INV3 GAGCTGCAGATGGCAAACGAAACTAGCG ATAGACCTTTGGTCACA
INV4 GAGACTAGTTTATAACCTCTATTTTACTT CCCTTACTTGGAA.
A kódolórégiót Pstl/Spel fragment formájában ligáljuk a PstI és Xbal enzimekkel linearizált YIplacl28Alden vektorba. Az élesztősejtekben expresszált invertázaktivitás vizsgálata alapján az enzim aktivitása 68 mE/mg, élesztőből származó összfehérje.
2. példa
A növényi szaharóztranszporter cDNS-génjének klónozása
Növekedésben levő spenót- és burgonyanövények levélszövetéből izolált poliadenilezett RNS felhasználásával lambda-ZAP II fágban cDNS-könyvtárat készítünk. 500 000 tarfoltból izoláljuk a fág-DNS-t, majd cézium-klorid-szarkozil-gradiensen tisztítjuk. Miután a fág-DNS-t a NotI enzimmel hasítottuk, az 1,5 kb alatti és feletti méretű fragmenteket 1%-os agarózgélből izoláljuk, majd az YEplacll2AlNE expressziós vektor NotI hasítási helyére ligáljuk. A vektor az YEplacll2AlNE vektor származéka [Gozalbo & Hohmann, Curr. Génét., 17, 77-79 (1990)], amellyel, amint azt az 1. példában leírtuk, a polilinkert az alkohol-dehidrogenáz promoterét tartalmazó kazettára cseréljük le. A kazetta polilinkerét ismét eltávolítjuk PstI és Xbal enzimekkel való emésztéssel, majd egy kétszálú oligonukleotiddal helyettesítjük, amely a NotI és EcoRI hasítási helyeket viszi be a DNS-be. Szekvenciája:
GATCCGCGGCCGCCCGGAATTCTCTAGACTGCA. Az 1,5 kb alatti méretű fragmentekkel körülbelül 90 000 kiónt kaptunk, az 1,5 kb feletti méretű fragmentekkel körülbelül 40 000 kiónt kaptunk Escherichia coli transzformálása után. Ezekből a klónokból plazmidDNS-t izolálunk. 2 pg DNS-t transzformálunk tizennégyszer az YSH 2.64-1A suc-.susy élesztőtörzsbe. A transzformánsokat 2% glükózt tartalmazó táptalajon növesztjük, majd mindegyikből 5-10 000 telepet lemosunk az agarlemeznek megfelelő folyadék táptalajjal, majd szacharózt tartalmazó táptalajra szélesztjük. Azokat a telepeket elemezzük, amelyek gyorsabban nőnek. Az S21 vagy P62 (YEplacll2AlNE-S21) transzformánsok YEplacll2AlNE vektorában levő inszerciót szekvenáljuk. A szekvenciákat az előzőkben adtuk meg.
3. példa
A szacharózt metabolizáló élesztőtranszformánsok elemzése
Az YEplac 112ΑΙΝΕ-S21 élesztőtranszformánst, amelyet a 2. példában állítottunk elő, folyékony táptalajon szaporítjuk, ameddig a tenyészet a logaritmikus fázisba kerül. A tenyészet centrifügálása után a sejteket 5 percre glükózt tartalmazó táptalajban előinkubáljuk, majd 14C-jelzett szacharózt tartalmazó táptalajban vesszük fel. A jelzett szacharóz felvételét a Cirillo által közölt módszerrel mérjük [Methods in Enzymology, 174, 617-622 (1989)]. A jelzett szacharóz glükózban való elóinkubálás nélküli felvételét hasonlítjuk össze azzal, amikor az inhibitorokkal, azaz a karbonil-cianidm-klór-fenil-hidrazonnal (CCCP), p-klór-metil-merkuri-benzolszulfonsawal (PCMBS) és antimicinnel végeztünk előinkubálást. Az időgörbét az 1. ábrán mutatjuk be. A szacharóz felvételének az inhibitorok által való számított csökkenését az 1. táblázatban mutatjuk be. Egy kompetíciós kísérlet eredményét mutatjuk be a II. táblázatban, amely kísérletben különböző cukrokat használtunk kompetitorokként Ebből a kísérletből a transzporter specifitása határozható meg. Analóg méréseket végeztünk az YEplac 112A1NE-P62 élesztőtörzzsel. Ezek hasonló eredményeket adtak.
4. példa
Baktériumtörzsek transzformálása egy szaharóztranszporter-aktivitással rendelkező DNS-szekvencia expresszálása céljából
HU 220 335 B
Abból a célból, hogy a felvett szacharózt metabolizálni tudják, olyan baktériumtörzsekre van szükség, amelyek a monoszacharid hasítására képes enzimaktivitással rendelkeznek. Az ilyen aktivitás bejuttatásához a baktériumokat a pMA5-INV plazmiddal transzformáljuk, és vizsgáljuk az invertáz aktivitásukat. A pMA5-INV plazmidot az alábbiak szerint állítjuk elő. A pMA5-10 plazmidot [Stanssens et al., Nucleic Acids Research, 17, 4441-4454 (1989)] a polilinkerben levő HindlII hasítási helyen linearizáljuk. A HindlII hasítási helyre a pSEYC306-l plazmid [Taussig & Carlsson, Nucleic Acids Research, 11, 1943-1954 (1983)] 2,4 kb méretű HindlII fragmentjét klónozzuk. A plazmid hasítási térképét a 2. ábrán mutatjuk be. Az invertáz aktivitást a pMA5-INV plazmiddal transzformált baktériumsejtekben gélelektroforézisaktivitás vizsgálattal mutatjuk ki, az ismert módon. Annak a lehetőségét, hogy egy funkcionális szaharóztranszporter képződik baktériumsejtekben egy növényi cDNS expressziója következtében, Escherichia coli pSK-S21 plazmiddal való transzformálásával vizsgáltuk. A plazmidot a 3. példában ismertettük. Miután a baktériumsejteket a pSK-S21 plazmiddal transzformáltuk, megvizsgáltuk a szacharózfelvételt.
5. példa
Növények transzformálása a szaharóztranszporter kódolórégiójának túlexpressziójára képes konstrukcióval
Az YEplacll2AlNE-S21 és YEplacl 12A1NE-P62 vektorokból, amelyek inszertként tartalmazzák a spenótból és/vagy burgonyából származó szaharóztranszporter cDNS-ét (lásd 2. és 3. példa), NotI restrikciós enzimmel való hasítás után izoláljuk a az inszerteket, és a pBluescript-SK (pSK-21 és/vagy pSK-P62) plazmid NotI hasítási helyére ligáljuk. A pSK-S21 plazmidhoz az inszertet egy Sacl/Xbal fragment formájában izoláljuk, majd a túlnyúló végek feltöltése után az „értelmes” orientációban a pBinAR plazmidba klónozzuk [Höfgen & Willmitzer, Plánt Sci., 66, 221-230 (1990)], amelyet előzőleg Smal és Xbal enzimekkel hasítottunk. A kapott pBinAR-A21 plazmidot (lásd 3. ábra) növények transzformálására lehet használni, azzal a céllal, hogy a szaharóztranszportert túlexpresszáljuk. A pSK-P62 plazmidhoz az inszertet egy 1,7 kb méretű NotI fragment formájában izoláljuk, majd „antiszensz” orientációban a pBinAR bináris vektor Smal hasítási helyére klónozzuk, így kapjuk a pBinAR-P62-anti vektort (lásd 4. ábra). Ez a plazmid alkalmas növények transzformálására, azzal a céllal, hogy a szaharóztranszporter expresszióját „antiszensz” hatás révén gátolja.
Az Agrobacteriumók transzformálását használjuk ezután a dohány és burgonya levélszegmentjeinek fertőzésére.
Tíz függetlenül kapott transzformánsban, amelyekben az érintetlen, át nem rendeződött kiméra gén jelenlétét Southem-blot elemzéssel ki lehet mutatni, vizsgáljuk a szacharóz-, hexóz- és keményítőtartalom változásait is.
Azok a transzformánsok, amelyek a pBinAR-P62anti plazmid T-DNS-ét tartalmazzák, erősen megnövekedett keményítő-, hexóz- és szacharózkoncentrációval rendelkeznek a levelekben (lásd 5. ábra). A növényekből vett levélnyelekből a szénhidrátok áramlása erősen lecsökken vizes közegben (lásd 6. ábra). Ezekből az adatokból világosan látható a szaharóztranszporter jelentősége a fotoasszimiláció termékeinek a fotoszintetikusán aktív szervekből való elszállításában. Mivel a transzporter aktivitásának gátlása korlátozza a szénhidrátok elszállítását, ezért ennek az az eredménye, hogy csökken a fotoasszimiláció termékeinek szállítása a tároló szervekbe, ha például a pBinAR-S21 plazmid felhasználásával túlexpressziót hozunk létre. Azok a dohánynövények, amelyekbe a pBinAR-S21-ből származó T-DNS-t integráltuk, további csökkent apikális dominanciát mutatnak, azaz bokros növekedésűek. Az ilyen fenotípusos változás például nagyon kívánatos a paradicsomnövényeknél. A pBinAR-S21 plazmid a találmány szerinti DNS-szekvenciával (SEQ ID NO. 1) ennélfogva alkalmas növények módosítására, azzal a céllal, hogy javítsuk a lényeges tulajdonságokat, azaz például a bokros növekedést.
I. táblázat
Inhibitor Szacharóztranszport* (%)
Kontroll 100
0,5 pmol/l CCCP 65
2,5 pmol/l CCCP 21
25 pmol/l PCMBS 73
100 pmol/l PCMBS 21
25 pmol/l 2,4-DNP 61
100 pmol/l 2,4-DNP 9
1 mmol/1 nátrium-arzenát 34
10 pmol/l antimicin A 59
1 mmol/1 cAMP 102
CCCP=karbonil-cianid-m-klór-fenil-hidrazon
PCMBS=p-klór-merkuri-benzolszulfonsav
2,4-DNP=2,4-dmitrofenol *=Az YEplacl 12AlNE-S21-hcz (kontroll) viszonyítva
II. táblázat
Kompetitor Szacharóztranszport* (%)
Kontroll 100
2 mmol/1 szacharóz 28
2 mmol/1 maltóz 58
10 mmol/1 maltóz 37
2 mmol/1 feníl-glükozid 7
2 mmol/1 floridzin 16
2 mmol/1 laktóz 91
10 mmol/1 palatinóz 102
10 mmol/1 trehalóz 103
*=t\7. YEplacl 12AlNE-S21-hez (kontroll) viszonyítva
HU 220 335 Β aktivitás expresszióját, ezáltal a tartalék tápanyagok megváltozott képződését és transzportját biztosító DNS-szekvenciák, melyek egy oligoszacharid-transzporter kódolórégióját tartalmazzák.

Claims (22)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Nukleotidszekvenciában tárolt információt egy növényi genomba integrálva RNS képződését, és RNS révén egy új oligoszacharid-transzport-aktivitást létrehozó vagy endogén oligoszacharid-transzporter
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely a következő nukleotidszekvenciát tartalmazza.
    AAAAACACAC ACCCAAAAAA AAAACACTAC GACTATTTCA AAAAAAACAT TGTTACTAGA 60
    AATCTTATT ATG GCA GGA AGA AAT ΑΤΑ AAA AAT GGT GAA AAT AAC 105
    Me t Alá Gly Arg Asn I le Lys Asn Gly Glu Asn Asn 1 5 10
    AAG ATT GCG GGT TCT TCT CTT CAC TTA GAG AAG AAC CCA ACA ACT Lys I le Alá Gly Ser Ser Leu His Leu Glu Lys Asn Pro Thr Thr
    15 20 25
    CCC CCC GAG GCC GAG GCT ACC TTA AAG AAG CTC GGC CTC GTG GCT Pro Pro Glu Alá Glu Alá Thr Leu Lys Lys Leu Gly Leu Val Alá
    30 35 40
    TCA GTA GCG GCC GGG GTT CAG TTC GGG TGG GCT TTA CAG CTC TCC Ser Val Alá Alá Gly Val Gin Phe Gly Trp Alá Leu Gin Leu Ser
    45 50 55
    CTA CTG ACC CCG TAC GTC CAA CTA CTG GGC ATT CCC CAC ACT TGG Leu Leu Thr Pro Tyr Val Gin Leu Leu Gly I le Pro His Thr Trp
    60 65 70
    GCC GCC TAC ATC TGG TTG TGC GGC CCA ATC TCG GGG ATG ATT GTC Alá Alá Tyr I le Trp Leu Cys Gly Pro I le Ser Gly Met Ile Val
    75 80 85
    CAG CCA TTG GTC GGG TAC TAT AGT GAC CGG TGC ACC TCC CGC TTC Gin Pro Leu Val Gly Tyr Tyr Ser Asp Arg Cys Thr Ser Arg Phe 90 95 100
    GGC CGA CGT CGC CCC TTC ATT GCA GCA GGG GCG GCT CTA GTG GCC Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Alá Alá Gly Alá Alá Leu Val Alá 105 110 115
    GTA GCG GTG GGG CTA ATC GGA TTC GCC GCC GAT ATC GGC GCA GCG Val Alá Val Gly Leu Ile Gly Phe Alá Alá Asp Ile Gly Alá Alá 120 125 130
    TCG GGT GAT CCA ACG GGA AAC GTG GCA AAA CCC CGG GCC ATC GCG Ser Gly Asp Pro Thr Gly Asn Val Alá Lys Pro Arg Alá Ile Alá 135 140 145
    GTG TTT GTG GTC GGG TTT TGG ATC CTC GAC GTG GCT AAC AAC ACC Val Phe Val Val Gly Phe Trp Ile Leu Asp Val Alá Asn Asn Thr 150 155 160
    150
    195
    240
    285
    330
    375
    420
    465
    510
    555
    CTG CAA GGC CCA TGC AGG GCG TTG TTA GCA GAC ATG GCC GCC GGG Leu Gin Gly Pro Cys Arg Alá Leu Leu Alá Asp Met Alá Alá Gly 165 170 175
    TCG CAA ACC AAA ACC CGG TAC GCT AAC GCC TTC TTC TCC TTC TTC Ser Gin Thr Lys Thr Arg Tyr Alá Asn Alá Phe Phe Ser Phe Phe
    600
    645
    HU 220 335 Β
    180 185 190 ATG GCG TTA GGA AAC ATC GGA GGG TAC GCC GCC GGT TCA TAC AGC 690 Me t Al a Leu 195 Gly Asn I le Gly Gly 200 Tyr Al a Al a Gly Ser 205 Tyr Ser CGC CTC TAC ACG GTG TTC CCC TTT ACC AAA ACC GCC GCC TGC GAC 735 Arg Leu Tyr 210 Thr Val Phe Pro Phe 215 Thr Ly s Thr Al a Al a 220 Cy s As p GTC TAC TGC GCC AAT CTA AAA TCC TGC TTC TTC ATC TCC ATC ACA 780 Val Tyr Cy s 225 Al a Asn Leu Ly s Ser 230 Cy s Phe Phe I le Ser 235 I le Thr CTC CTA ATC GTC CTC ACA ATC CTA GCA CTT TCC GTC GTA AAA GAG 825 Leu Leu I le 240 Val Leu Thr I le Leu 245 Al a Leu Ser Val Val 250 Ly s Glu CGT CAA ATC ACA ATC GAC GAA ATC CAA GAA GAA GAA GAC TTA AAA 870 Arg Gin I le 255 Thr I le Asp Glu I le 260 Gin Glu Glu Glu Asp 265 Leu Ly s AAC AGA AAC AAT AGC AGC GGT TGT GCA AGA CTA CCG TTC TTC GGA 915 Asn Arg Asn 270 Asn Ser Ser Gly Cy s 275 Al a Arg Leu Pro Phe 280 Ph e Gly CAA TTA ATA GGC GCT CTC AAA GAT CTA CCA AAA CCA ATG CTA ATC 960 Gin Leu I le 285 Gly Al a Leu Ly s As p 290 Leu Pro Ly s Pro Me t 295 Leu I le CTA TTA CTA GTA ACA GCC CTA AAT TGG ATC GCA TGG TTT CCA TTC 1005 Leu Leu Leu 300 Val Thr Al a Leu Asn 305 Trp I le Al a Trp Phe 310 Pro Phe TTG TTG TTC GAT ACT GAT TGG ATG GGT AAA GAA GTG TAC GGT GGT 1050 Leu Leu Phe 315 Asp Thr As p Trp Me t 320 Gly Ly s Glu Val Tyr 325 Gly Gly ACA GTC GGA GAA GGT AAA TTG TAC GAC CAA GGA GTT CAT GCC GGT 1095 Thr Va 1 Gly 330 Glu Gly Ly s Leu Tyr 335 Asp Gin Gly Val His 340 Al a Gly GCC TTA GGT CTG ATG ATT AAC TCC GTT GTC TTA GGT GTT ATG TCG 1140 Al a Leu Gly 345 Leu Me t I le As n Ser 350 Val Val Leu Gly Va 1 355 Me t Ser TTG AGT ATT GAA GGT TTG GCT CGT ATG GTA GGC GGT GCT AAA AGG 1185 Leu Ser I le 360 Glu Gly Leu Al a Arg 365 Me t Val Gly Gly Al a 370 Ly s Arg TTA TGG GGA ATT GTC AAT ATT ATT CTT GCT GTT TGT TTA GCT ATG 1230 Leu Trp Gly 375 11 e Val Asn 11 e 11 e 380 Leu Al a Val Cy s Leu 385 Al a Me t ACG GTG TTA GTT ACT AAG TCC GCC GAA CAC TTC CGT GAT AGC CAC 1275 Thr Val Leu 390 Val Thr Ly s Ser Al a 395 Glu Hi s Phe Arg Asp 400 Ser Hi s CAT ATT ATG GGC TCC GCC GTC CCT CCG CCG CCG CCT GCT GGT GTT 1320 Hi s 11 e Me t 405 Gly Ser Al a Va 1 Pro 410 Pro Pro Pro Pro Al a 415 Gly Val
    HU 220 335 Β
    AAG GGT GGC GCT TTG GCT ATC TTT Phe 425 GCC Al a GTT CTT GGT ATC CCT CTT 1365 Lys Gly Gly Alá 420 Leu Al a Ile Val Leu Gly Ile 430 Pro Leu GCG ATC ACT TTC AGT ATT CCT TTG GCC TTG GCG TCA ATC TTT TCA 1410 Alá 1 le Thr Phe Ser Ile Pro Phe Al a Leu Al a Ser Ile Phe Ser 435 440 445 GCA TCT TCC GGT TCA GGA CAA GGT CTT TCT CTA GGA GTT CTC AAC 1455 Al a Ser Ser Gly Ser Gly Gin G1 y Leu Ser Leu Gly Val Leu Asn 450 455 460 CTC GCC ATC GTT GTA CCC CAG ATG TTT GTG TCG GTA ACA AGT GGG 1500 Leu Al a Ile Val Val Pro Gin Me t Phe Val Ser Val Thr Ser Gly 465 470 475 CCA TGG GAT GCA ATG TTT GGT GGA GGA AAT TTG CCA GCA TTC GTG 1545 Pro Trp Asp Al a Me t Phe Gly Gly Gly Asn Leu Pro Al a Phe Val 480 485 490 GTG GGA GCT GTA GCA GCA ACA GCC AGT GCA GTT CTT TCA TTT ACA 1590 Val Gly Al a Val Al a Al a Thr Al a Ser Al a Val Leu Ser Phe Thr 495 500 505 TTG TTG CCT TCT CCA CCC CCT GAA GCT AAA ATT GGT GGG TCC ATG 1635 Leu Leu Pro Se r Pro Pro Pro Glu Al a Lys Ile Gly Gly Ser Me t 510 515 520
    GGT GGT CAT TAAGAAATTT AATACTACTC CGTACAATTT AAACCCAAAT 1684
    Gly Gly Hi s
    525
    TAAAAATGAA AATGAAAATT TTTAACCCAT GTTCGTTACG TTGTAATTAG 1734 AGAGAAAAAT GATATATTGA ACGAAGCCGT TAATTTATGC TCCGTTCATC 1784 TTGTAATTCT TTTTCTCTCT GCTTTTTTTT TTTTTTTTTA ACGCGACGTG 1834 TTTTTGAGAT AAGGAAGGGC TAGATCGAGG ATGGGGGAAT TGGCAAGAAA 1884 TTGCTCGGGT ATAAATATTT ATCCCTCTTT GTAATTTTCA GTAACATTTA 1934 ATAGCCAGAA ATCAAAAAGT CAAGAAAAAT CGAAA 1969
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely a következő nukleotidszekvenciát tartalmazza:
    AAAA 4
    ATG GAG AAT GGT ACA AAA AGA GAA GGT TTA GGG AAA CTT ACA GTT 49
    Me t Glu Asn Gly Thr Lys Arg Glu Gly Leu Gly Lys Leu Thr Va1
    5 10 15
    TCA TCT TCT CTA CAA GTT GAA CAG CCT TTA GCA CCA TCA AAG CTA 94
    Ser Ser Ser Leu Gin Val Glu Gin Pro Leu Alá Pro Ser Lys Leu
    20 25 30
    TGG AAA ATT ATA GTT GTA GCT TCC ATA GCT GCT GGT GTT CAA TTT 139
    Trp Lys I le Ile Val Val Alá Ser I le Alá Alá Gly Val Gin Phe
    35 40 45
    HU 220 335 B
    GGT TGG GCT CTT CAG CTC TCT TTG CTT ACA CCT TAT GTT CAA TTG Gly Trp Al a Leu Gin 50 Leu Ser Leu Leu Thr 55 Pro Tyr Val Gin Leu 60 CTC GGA ATT CCT CAT AAA TTT GCC TCT TTT ATT TGG CTT TGT GGA Leu Gly I le Pro Hi s 65 Lys Phe Al a Ser Phe 70 I le Trp Leu Cy s Gly 75 CCG ATT TCT GGT ATG ATT GTT CAG CCA GTT GTC GGC TAC TAC AGT Pro I le Ser Gly Me t 80 I le Val Gin Pro Val 85 Val Gly Tyr Tyr Ser 90 GAT AAT TGC TCC TCC CGT TTC GGT CGC CGC CGG CCA TTC ATT GCC As p Asn Cys Ser Ser 95 Arg Phe Gly Arg Arg 100 Arg Pro Phe I le Al a 105 GCC GGA GCT GCA CTT GTT ATG ATT GCG GTT TTC CTC ATC GGA TTC Al a Gly Al a Al a Leu 110 Val Me t I le Al a Val 115 Phe Leu I le Gly Phe 120 GCC GCC GAC CTT GGT CAC GCC TCC GGT GAC ACT CTC GGA AAA GGA Al a Al a As p Leu Gly 125 Hi s Al a Ser Gly As p 130 Thr Leu Gly Ly s Gly 135 TTT AAG CCA CGT GCC ATT GCC GTT TTC GTC GTC GGC TTT TGG ATC Phe Ly s Pro Arg Al a 140 I le Al a Val Phe Val 145 Va 1 Gly Phe Trp I le 150 CTT GAT GTT GCT AAC AAC ATG TTA CAG GGC CCA TGC AGA GCA CTA Leu Asp Val Al a Asn 155 Asn Me t Leu Gin Gly 160 Pro Cys Arg Al a Leu 165 CTG GCT GAT CTC TCC GGC GGA AAA TCC GGC AGG ATG AGA ACA GCA Leu Al a As p Leu Ser 170 Gly Gly Lys Ser Gly 175 Arg Me t Arg Thr Al a 180 AAT GCT TTT TTC TCA TTC TTC ATG GCC GTC GGA AAC ATT CTG GGG Asn Al a Phe Phe Ser 185 Phe Phe Me t Al a Val 190 G1 y Asn I le Leu Gly 195 TAC GCC GCC GGT TCA TAT TCT CAC CTC TTT AAA GTA TTC CCC TTC Tyr Al a Al a Gly Ser 200 Tyr Ser Hi s Leu Phe 205 Ly s Va 1 Phe Pro Phe 210 TCA AAA ACC AAA GCC TGC GAC ATG TAC TGC GCA AAT CTG AAG AGT Ser Ly s Thr Ly s Al a 215 Cys Asp Me t Tyr Cys 220 Al a Asn Leu Ly s Ser 225 TGT TTC TTC ATC GCT ATA TTC CTT TTA CTC AGC TTA ACA ACC ATA Cys Phe Phe I le Al a 230 I le Phe Leu Leu Leu 235 Ser Leu Thr Thr I le 240 GCC TTA ACC TTA GTC CGG GAA AAC GAG CTC CCG GAG AAA GAC GAG Al a Leu Thr Leu Val 245 Arg Glu Asn Glu Leu 250 Pro Glu Ly s As p Glu 255 CAA GAA ATC GAC GAG AAA TTA GCC GGC GCC GGA AAA TCG AAA GTA Gin Glu I le Asp G1 u Ly s Leu Al a Gly Al a Gly Ly s Ser Ly s Val
    260 265 270
    184
    229
    274
    319
    364
    409
    454
    499
    544
    589
    634
    679
    724
    769
    814
    HU 220 335 Β
    CCG Pro TTT Phe TTC Phe GGT Gly GAA Glu 275 ATT TTT GGG GCT TTG AAA Ly s GAA Glu TTA CCT CGA Arg 285 859 I le Phe Gly Al a Leu 280 Leu Pro CCG ATG TGG ATT CTT CTA TTA GTA ACC TGT TTG AAC TGG ATC GCG 904 Pro Me t Trp I le Leu 290 Leu Leu Va 1 Thr Cy s 300 Leu Asn Trp I le Al a 305 TGG TTT CCC TTT TTC TTA TAC GAT ACA GAT TGG ATG GCT AAG GAG 949 Trp Phe Pro Phe Phe 310 Leu Tyr As p Thr As p 315 Trp Me t Al a Lys Glu 320 GTT TTC GGT GGA CAA GTC GGT GAT GCG AGG TTG TAC GAT TTG GGT 994 Va 1 Phe Gly Gly Gin 325 Val Gly Asp Al a Arg 330 Leu Tyr Asp Leu Gly 335 GTA CGC GCT GGT GCA ATG GGA TTA CTG TTG CAA TCT GTG GTT CTA 1039 Val Arg Al a Gly Al a 340 Me t Gly Leu Leu Leu 345 Gin Ser Val Val Leu 350 GGG TTT ATG TCA CTT GGG GTT GAA TTC TTA GGG AAG AAG ATT GGT 1084 Gly Phe Me t Ser Leu 355 Gly Val Glu Phe Leu 360 Gly Ly s Ly s I le Gly 370 GGT GCT AAG AGG TTA TGG GGA ATT TTG AAC TTT GTT TTG GCT ATT 1129 Gly Al a Ly s Arg Leu 375 Trp Gly 1 le Leu Asn 380 Phe Val Leu Al a 1 le 385 TGC TTG GCT ATG ACC ATT TTG GTC ACC AAA ATG GCC GAG AAA TCT 1174 Cy s Leu Al a Me t Thr 390 I le Leu Val Thr Lys 395 Me t Al a Glu Ly s Ser 400 CGC CAG CAC GAC CCC GCC GGC ACA CTT ATG GGG CCG ACG CCT GGT 1219 Arg Gin Hi s Asp Pro 405 Al a Gly Thr Leu Me t 410 Gly Pro Thr Pro Gly 415 GTT AAA ATC GGT GCC TTG CTT CTC TTT GCC GCC CTT GGT ATT CCT 1264 Val Ly s I le Gly Al a 420 Leu Leu Leu Phe Al a 425 Al a Leu Gly I le Pro 430 CTT GCG GCA ACT TTT AGT ATT CCA TTT GCT TTG GCA TCT ATA TTT 1309 Leu Al a Al a Thr Phe 435 Ser I le Pro Phe Al a 440 Leu Al a Ser I 1 e Phe 445 TCT AGT AAT CGT GGT TCA GGA CAA GGT TTG TCA CTA GGA GTG CTC 1354 Ser Ser Asn Arg Gly 450 Ser Gly Gin Gly Leu 455 Ser Leu Gly Va 1 Leu 460 AAT CTT GCA ATT GTT GTA CCA CAG ATG TTG GTG TCA CTA GTA GGA 1399 Asn Leu Al a 11 e Val 465 Val Pro Gin Me t Leu 470 Va 1 Ser Leu Va 1 Gly 475 GGG CCA TGG GAT GAT TTG TTT GGA GGA GGA AAC TTG CCT GGA TTT 1444 Gly Pro Trp Asp As p 480 Leu Phe Gly Gly Gly 485 Asn Leu Pro Gly Phe 490 GTA GTT GGA GCA GTT GCA GCT GCC GCG AGC GCT GTT TTA GCA CTC 1489 Val Va 1 Gly Al a Val 495 Al a Al a Al a Al a Ser 500 Al a Val Leu Al a Leu 505
    HU 220 335 Β
    ACA ATG TTG CCA TCT CCA CCT GCT GAT GCT AAG CCA GCA GTC GCC 1534
    Thr Met Leu Pro Ser Pro Pro Alá Asp Alá Lys Pro Alá Va1 Alá
    510 515 520
    ATG GGG CTT TCC ATT AAA TAATTACAAA AGAAGGAGAA GAACAACTTT 1582
    Met Gly Leu Ser I le Lys
    525
    TTTTTAATAT TAGTACTTCT CTTTTGTAAA CTTTTTTTAT TTTAGAAAAC 1632
    AAACATAACA TGGAGGCTAT CTTTACAAGT GGCATGTCCA TGTATCTTCC 1682
    TTTTTTCATA AAGCTCTTTA GTGGAAGAAG AATTAGAGGA AGTTTCCTTT 1732
    TAATTTCTTC CAAACAAATG GGGTATGTGT AGTTGTTTTC A 1773
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciát tartalmazó plazmid.
  5. 5. A pSK-S21 plazmid (DSM 7115).
  6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligo- 20 szacharid-transzporter DNS-szekvenciáit vagy ennek szármázékait, vagy részeit tartalmazó plazmid alkalmazása prokarióta vagy eukarióta sejtek transzformálására, és oligoszacharid-transzporter-aktivitású sejtek nyerésére.
  7. 7. Transzgén növények, melyek a növénybe transzformálva az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligoszacharid-transzporter kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak.
  8. 8. Baktériumok, azzal jellemezve, hogy az 1-3. 30 igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazzák.
  9. 9. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciák használata szacharóz felvételére képes baktériumok előállításában.
  10. 10. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligoszacharid-transzporter DNS-szekvencia alkalmazása a megváltoztatott specifitassal rendelkező transzporter DNS-szekvenciák előállítására.
  11. 11. Az 1 - 3. igénypontok bármelyike szerinti oligo- 40 szacharid-transzporter DNS-szekvencia használata hasonló szekvenciák növényi genomból való izolálásában.
  12. 12. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligoszacharid-transzporter DNS-szekvencia használata 45 transzlációba vihető mRNS előállítására, ami lehetővé teszi egy szaharóztranszporter szintézisét a sejtekben.
  13. 13. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligoszacharid-transzporter DNS-szekvencia használata a sejtekben egy endogén szaharóztranszporter keletkézé- 50 sét megakadályozó, transzlációba nem vihető mRNS előállítására.
  14. 14. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligoszacharid-transzporter DNS-szekvencia használata prokarióta sejtekben való expresszióhoz szükséges vezérlő- 55 elemekkel kombinálva.
  15. 15. Eljárás oligoszacharid-transzporter azonosítására alkalmas élesztőtörzsek készítésére és transzformálására, azzal jellemezve, hogy
    a) először egy olyan élesztőtörzset készítünk homológ rekombinációval, amelyben defektív suc2 gén található, amely nem hasítható invertázzal, majd ebből
    b) egy növényi sejtekből származó szacharóz szintetázaktivitást kódoló génnel való transzformációval
    25 egy olyan élesztőtörzset állítunk elő, amely képes elhasítani az intracelluláris szacharózt, majd
    c) ezt a törzset élesztősejtekben működő expressziós vektorban készített növényi cDNS-könyvtárral transzformálva azonosítjuk a növényi oligoszacharid-transzportert kódoló DNS-szekvenciát.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárással kapott élesztőtörzsek, amelyeket növényi oligoszacharid-transzporterek azonosítására lehet használni.
  17. 17. Az YSH 2.64-1A-SUSY élesztőtörzs (DSM
    35 7106).
  18. 18. Az YSH 2.64-1A-INV élesztőtöizs (DSM 7105).
  19. 19. A 16-19. igénypontok szerinti élesztőtörzsek használata egy növényi oligoszacharid-transzporter azonosításában.
  20. 20. A pSK-S21 (DSM 7115) plazmidból előállított pBin AR-S21 plazmid használata növények transzformálására a szacharóztranszporter túlexpresszióval rendelkező növények előállításánál.
  21. 21. A pSK-P62 plazmidból előállított pBin AR-P62-anti plazmid használata növények transzformálására a szaharóztranszporter expressziójának „antiszensz” módszerrel gátolt növények előállításánál.
  22. 22. A 2. igénypont szerinti DNS-szekvenciát tartalmazó pBin AR-S21 plazmid használata javított, fontos terméktári tulajdonságokkal, így megnövelt terméshozammal, a teljes növény módosításával, az egyes szövetek, például levelek lassult növekedésével, ugyanakkor magasabb terméshozammal, illetve meghosszabbított vegetatív fázissal és tárolt anyag gyarapodásával rendelkező módosított növények előállításánál.
HU9403767A 1992-06-24 1993-06-22 Oligoszacharid-transzportot kódoló DNS-szekvenciák HU220335B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4220759A DE4220759A1 (de) 1992-06-24 1992-06-24 DNA-Sequenzen für Oligosaccharid-Transporter, Plasmide, Bakterien und Pflanzen enthaltend einen Transporter sowie Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen zur Identifikation des Transporteers
PCT/EP1993/001604 WO1994000574A1 (en) 1992-06-24 1993-06-22 Dna sequences encoding oligosaccharide transporter

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9403767D0 HU9403767D0 (en) 1995-02-28
HUT70472A HUT70472A (en) 1995-10-30
HU220335B true HU220335B (hu) 2001-12-28

Family

ID=6461754

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9403767A HU220335B (hu) 1992-06-24 1993-06-22 Oligoszacharid-transzportot kódoló DNS-szekvenciák

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5608146A (hu)
EP (1) EP0647273B1 (hu)
JP (1) JP3565845B2 (hu)
AT (1) ATE248915T1 (hu)
AU (1) AU671135B2 (hu)
CA (1) CA2137346A1 (hu)
DE (2) DE4220759A1 (hu)
ES (1) ES2204903T3 (hu)
HU (1) HU220335B (hu)
IL (1) IL106121A0 (hu)
RU (1) RU2151802C1 (hu)
WO (1) WO1994000574A1 (hu)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4420782C1 (de) * 1994-06-15 1995-08-17 Fluegge Ulf Ingo Prof Dr DNA-Sequenz, kodierend einen 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter
DE4343527A1 (de) * 1993-12-16 1995-06-22 Schering Ag Verfahren zur Identifizierung von Stoffen mit potentieller herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung mittels pflanzlicher Transporterproteine, Verwendung der Transporterproteine sowie Substanzen mit herbizider und wachstumsregulatorischer Wirkung
DE4439748A1 (de) * 1994-10-31 1996-05-02 Inst Genbiologische Forschung Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen
AU3569897A (en) * 1996-06-11 1998-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Nucleotide sugar transporters and uses thereof
EE04819B1 (et) * 1997-01-15 2007-04-16 Yeda Research And Development Co. Ltd. Rekombinantne DNA molekul ja ekspressioonivektorit sisaldav peremeesrakk
WO1998053086A1 (en) * 1997-05-22 1998-11-26 Washington State University Research Foundation Sucrose-binding proteins
DE19736343B4 (de) * 1997-08-21 2006-02-09 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Erhöhung der Genexpression von Saccharose Synthase
AU2053799A (en) * 1997-12-15 1999-07-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Transgenic plants with an altered potassium metabolism
EP1276882A2 (de) * 2000-03-24 2003-01-22 Frommer, Wolf-Bernd, Prof. Dr. Verfahren zur genetischen modifizierung einer pflanze
RU2463352C2 (ru) * 2005-12-01 2012-10-10 КРОПДИЗАЙН Н.Фи. Растения, имеющие улучшенные характеристики роста, и способы их получения
WO2008115840A2 (en) 2007-03-16 2008-09-25 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
EP2064330A2 (en) * 2007-05-22 2009-06-03 BASF Plant Science GmbH Plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production
US7947483B2 (en) * 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
US8278057B2 (en) * 2007-09-14 2012-10-02 Nestec S.A. Addressable antibody arrays and methods of use
WO2010030711A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
CN102459138A (zh) * 2009-06-04 2012-05-16 基因组股份公司 分离发酵液成分的方法
MY187676A (en) 2009-06-04 2021-10-08 Genomatica Inc Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
CA2777459A1 (en) * 2009-10-13 2011-04-21 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
WO2011066076A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
KR101395434B1 (ko) * 2012-05-25 2014-05-14 포항공과대학교 산학협력단 모노리그놀 수송체 유전자들의 발현량을 변화시키는 재조합 벡터 및 리그닌 함량이 변화된 형질전환 식물
TW201410865A (zh) 2012-06-04 2014-03-16 Genomatica Inc 製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法
EP2970068B1 (en) 2013-03-15 2021-07-28 Genomatica, Inc. Process and systems for obtaining 1,4-butanediol from fermentation broths

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585479A (en) * 1992-07-24 1996-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA

Also Published As

Publication number Publication date
CA2137346A1 (en) 1994-01-06
RU94046212A (ru) 1996-10-20
ATE248915T1 (de) 2003-09-15
EP0647273A1 (en) 1995-04-12
RU2151802C1 (ru) 2000-06-27
AU4500393A (en) 1994-01-24
DE4220759A1 (de) 1994-01-05
HUT70472A (en) 1995-10-30
DE69333180T2 (de) 2004-05-27
EP0647273B1 (en) 2003-09-03
AU671135B2 (en) 1996-08-15
IL106121A0 (en) 1993-10-20
WO1994000574A1 (en) 1994-01-06
JP3565845B2 (ja) 2004-09-15
JPH07509123A (ja) 1995-10-12
HU9403767D0 (en) 1995-02-28
ES2204903T3 (es) 2004-05-01
US5608146A (en) 1997-03-04
DE69333180D1 (de) 2003-10-09
US5981181A (en) 1999-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220335B (hu) Oligoszacharid-transzportot kódoló DNS-szekvenciák
CA2142308C (en) Dna sequences which lead to the formation of polyfructans (levans), plasmids containing these sequences as well as a process for preparing transgenic plants
AU672017B2 (en) Dna sequences and plasmids for the preparation of plants with changed sucrose concentration
EP0455316B1 (en) Plasmide containing DNA sequences that bring about changes in the carbohydrate and protein concentration and the carbohydrate and protein composition in plants, and plant cells and plants containing those plasmids
CZ299374B6 (cs) Molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy SST, SST, transgenní rostlinná bunka, rostlina, rostlinný rozmnožovací materiál a zpusob prípravy 1-kestózy, nys
HU221178B1 (en) Dna molecules which code for a plastid 2-oxoglutarate/malate translocator and their use for producing transgenic plants
JP3431177B2 (ja) 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド
HU221515B (en) Transgenic plants with improved biomass production
JP2898499B2 (ja) エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子
AU734951B2 (en) Processes for increasing the yield in plants
JPH09504171A (ja) アンモニウム輸送体、該輸送体を含有するプラスミド、細菌、酵母、植物細胞および植物
CA2184741A1 (en) Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants
EP0909314A4 (en) PLANTS DETECTING SUGARS AND THEIR USES
US6700039B1 (en) Genetic method for controlling sprouting
US20040168214A1 (en) Process for increasing the yield in plants by expressing stably integrated recombinant polypeptides
JP3349440B2 (ja) 植物の制御方法
CZ2000451A3 (cs) Způsob zvýšení výnosů rostlin

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: HOECHST SCHERING AGREVO GMBH, DE

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: PROF. DR. FROMMER, WOLF-BERND, DE

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee