CZ2000451A3

CZ2000451A3 - Způsob zvýšení výnosů rostlin

Info

Publication number: CZ2000451A3
Application number: CZ2000451A
Authority: CZ
Inventors: Marion Kwart; Jörg Riesmeier; Lothar Willmitzer
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2000-07-12

Abstract

Způsoby zvýšení výnosu rostlin, kdy je exprimována nukleotidová sekvence řízená promotorem specifickým pro průvodní buňky. Nukleotidová sekvence kóduje proteiny, jejichž exprese vede ke stimulaci vkládání fotoasimilátů do floemu

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobů zvýšení výnosu rostlin, molekul rekombinantní nukleové kyseliny použitých v takových způsobech, jejich použití a také rostlin se zvýšeným výnosem.

Dosavadní stav techniky

V oboru zemědělství a lesnictví stále trvají snahy získat rostliny se zvýšeným výnosem, zvláště proto, aby bylo možné udržet zásobování rostoucí světové populace potravinami a zaručit zásobu obnovitelných surovin. Obvyklá je snaha získat rostliny se zvýšeným výnosem pomocí konvečního šlechtění, což je způsob náročný jak časově tak i z hlediska vynaložené práce, kromě toho, vhodné šlechtitelské programy se musí provádět pro každý požadovaný rostlinný druh.

Částečného pokroku bylo dosaženo pomocí genetického inženýrství rostlin, tj . vnášením molekul rekombinantní nukleové kyseliny do rostlin a jejich expresí v rostlinách. Tyto metody mají tu výhodu, že zpravidla nejsou omezeny na jediný rostlinný druh, ale jsou přenositelné i na jiné druhy. V patentu EP AO 511 979 se např. popisuje exprese prokaryotické asparaginsyntetázy v rostlinných buňkách, která kromě jiného vede ke zvýšené produkci biomasy.

V patentové přihlášce WO 96/21737 se popisuje příprava rostlin se zvýšeným výnosem díky expresi deregulované nebo neregulované fruktózo-1,6-bisfosfatázy, která vede ke zvýšení fotosyntézy.

·♦·· ··· ··** • · ···· · · · >

• · · · ······· · · · • · ··♦ ···· ···· ··· ·· » ·· «·

Nicméně stále existuje potřeba získat obecně použitelné způsoby ke zlepšení výnosu rostlin zajímavých z hlediska zemědělství nebo lesnictví.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsoby zvýšení výnosu rostlin.

Řešením výše zmíněných problémů poskytuje vynález tím, že poskytuje provedení vynálezu, která jsou charakterizovaná patentovými nároky.

Předkládaný vynález se týká způsobu zvýšení výnosu rostlin, který spočívá v tom, že se rekombinantní molekuly DNA trvale integrované do genomu rostlin jsou exprimovány, přičemž tyto DNA molekuly obsahují:

a) úsek umožňující transkripci specificky v průvodních buňkách, a k němu operativně připojenou

b) nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny obsahující

í) proteiny s enzymatickou aktivitou, která štěpí sacharózu, ii) přenašeče sacahrózy, iii) proteiny, jejichž aktivita vede ke stimulaci protonového gradientu lokalizovaného na plazmatické membráně rostlinných buněk, a iv) citrátsyntázy (E.C.4.1.3.7.)

Překvapivě bylo zjištěno, že exprese výše uvedených proteinů specificky ve floemu rostlin vede k výraznému zvýšení výnosu.

Termín „zvýšení výnosu se výhodně týká zvýšení tvorby biomasy, zejména biomasy stanovené jako čerstvá hmotnost rostliny.

• · 0 0 0 0«

Takové zvýšení výnosu se výhodně týká tzv. „síňkových” orgánů rostliny, což jsou orgány, které přijímají fotoasimiláty tvořené při fotosyntéze. Zvláště výhodné jsou takové části rostlin, které mohou být sklizeny, jako jsou semena, plody, zásobní kořeny, kořeny, hlízy, květy, pupeny, nadzemní části, stonky nebo dřevo. Zvýšení výnosu podle vynálezu je nejméně 3 % ve srovnání s biomasou netransformovaných rostlin stejného genotypu, když jsou pěstovány za stejných podmínek, výhodněji nejméně 10 % a zvláště výhodně nejméně 20 %.

Výše uvedené proteiny mají společné to, že když jsou exprimovány ve floemu, jejich biologická aktivita vede ke zvýšenému přenosu a ukládání fotoasimilátů do floemu.

V kontextu předkládaného vynálezu se pojmem fosoasimiláty rozumí cukry a/nebo aminokyseliny.

Podle zmíněná v předkládaného b) obvykle bakteriální protein nebo sekvence vynálezu nukleotidová kóduje rostlinný protein nebo se jedná o protein pocházející z houby nebo zvířecího organismu.

Ve výhodném provedení vynálezu nukleotidová sekvence kóduje sacharózosyntázu (E.C.2.4.2.13), výhodně rostlinnou sacharózosyntázu ze Solanum tuberosum a zvláště výhodně typ sacharózosyntázy exprimovaný v hlízách Solanum tuberosum. Takové sekvence byly např. popsány v publikaci Salanoubat a Belliard (Gene 60, 1987, 47-56) a jsou dostupné v genové bance EMBL pod přírůstkovým číslem X67125.

V dalším výhodném provedení vynálezu nukleotidová sekvence kóduje sacharózofosforylázu (E.C.2.4.17) . Sekvence kódující sacharózofosforylázu jsou známy např. z patentového dokumentu WO 96/24679.

V jiném výhodném provedení vynálezu nukleotidová sekvence kóduje invertázu (E.C.3.2.1.26) , výhodně invertázu z mikroorganismu, zvláště z hub rodu Saccharomyces, výhodně * 4 • 4

4 • 4 4 • 4 44 4 4 ze S. cerevisiae. Zvláště výhodné jsou sekvence kódující cytosolovou invertázu (Sonnewald a kol., Plant. J. 1, 1991,

95-106).

Podle předkládaného vynálezu se termínem přenašeč sacharózy míní přenašeč přenášející sacharózu v rostlinných systémech přes membránu. Takový přenašeč je výhodně rostlinného původu (jako je např. vzorek, č. G21319 v genové bance EMBL). Zvláště výhodná je sekvence popsaná v b) kódující sacharózový přenašeč ze špenátu (Spinacia oleracea], zejména se sekvencí kódující SoSUTl, jak byla popsána v publikaci Riesmeier a kol. (EMBO J. 11, 1992, 47%05-4713).

V dalším výhodném provedení vynálezu protein, který stimuluje protonový gradient lokalizovaný na plazmatické membráně, je protonová ATPáza.

V takovém případě sekvence popsaná v b) výhodně kóduje protein z mikroorganismu, zejména z hub rodu Saccharomyces, výhodně ze S. cerevisiae.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jsou sekvence kódující protonovou ATPázu PMA1 ze S. cerevisiae (Serrano a kol., Nátuře 319, 1986, 689-693, genová banka EMBL) nebo jiná verze této protonové ATPázy ze S. cerevisiae, která je zkrácena na 3'konci, zejména ATPáza ΔΡΑΜΙ, jak je popsána v příkladu 3 předkládané přihlášky.

Alternativně nukleotidová sekvence kóduje protonovou ATPázu z rostlin, výhodně protonovou ATPázu ze Solanum tuberosum.

Zvláště výhodná je sekvence kódující protonovou ATPázu PHA2 z bramboru (Harms a kol., Plant. Mol. Biol. 26, 1994,

979-988, genová banka EMBL X76535) nebo verze této protonové ATPázy z bramboru, která je zkrácena na 3'konci, zejména ATPáza ΔΡΗΑ2, jak je popsána v příkladu 4 předkládané přihlášky.

4

4 4 •

4 4 4 4

4

4444

Citrátsyntáza podle předkládaného vynálezu je jakákoliv citrátsyntáza, např. z bakterie, houby, zvířat nebo rostlin. DNA sekvence kódující citrátsyntázu jsou známy, např. z následujících organismů: Bacillus subtilis (U05256 a U05257), E. coli (V01501), R. prowazekii (M17149),

P. aeruginosa (M29728), A. anitratum (M33037) (viz Schendel a kol., Appl. Environ. Microbiol. 58, 1992, 335-345 a tam citované odkazy), Haloferax volcanii (James a kol., Biochem. Soc. Trans. 20, 1992, 12), Arabidopsis thaliana (Z17455) (viz Unger a kol., Plant Mol Biol. 13, 1989, 411-418), B. coagulans (M74818), C. burnetti (M36338)(Henzen a kol., Gene 109, 1990, 63-69), M. smegmatis (X60513), T. acidophilum (X55282), T. thermophila (D90117), prase (M21197)(Bloxham a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78, 1981, 5381-5385), N. crasa (M84187) (Ferea a kol., Mol. Gen. Genet. 242, 1994, 105-110), S. cerevisiae (Z11113, Z23259, M14686, M54982, X00782)(Suissa a kol., EMBO J. 3, 1984, 1773-1781) a brambor (viz EP 95913066.7). Čísla v závorkách odpovídají číslům v databázi genEMBL.

Nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu obecně kódují jakékoliv vhodné proteiny z jakýchkoliv organismů, zejména z rostlin, hub, bakterií nebo zvířat. Sekvence výhodně kódují proteiny z rostlin nebo hub. Výhodně jsou rostliny vyšší rostliny, zvláště užitkové rostliny akumulující škrob nebo olej, např. brambory nebo obilniny jako je rýže, kukuřice, pšenice, ječmen, žito, tritikale, oves, proso a pod. a také špenát, tabák, cukrová řepa, sója bavlník a další.

Houby patří výhodně k rodu Saccharomyces, schizosaccharomyces, Aspergillus nebo Neurospora, zejména jde o Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus flavus, Aspergillus niger a Neuorospora crassa.

·· • «0 ·

0 0 ·

Ve výhodném provedení způsobu podle předkládaného vynálezu úsek zmíněný v a), který zaručuje specifickou transkripci v průvodních buňkách, je promotor genu role z Agrobacterium rhizogenes.

Tento promotor byl popsán např. v publikacích Schmueling a kol. (Plant Cell 1989, 665-671) a Kuhn (Characterisation and localization of the sucrose carrier SUTI in Solanceae, Doctoral Thesis, 1991, Freie Universitat Berlin, Biology Departmenet). Výhodně je užit úsek promotoru, který má nukleotidovou sekvenci popsanou zde jako sekvence id. č. 1.

Kromě promotoru rolC uvedeného výše může odborník užít, bez dalších problémů, jiné promotory pro expresi specifickou pro průvodní buňky. Další promotory pro expresi specifickou pro průvodní buňky jsou popsány v odborné literatuře, jako je např. promotor sacharózového přenašeče z Arabidopsis thaliana (Truernit a Sauer, Planta 196, 1995, 564-570).

Kromě toho byly v odborné literatuře popsány různé druhy RNA a proteinů, které se specificky vyskytují v průvodních buňkách (viz např. Foley a kol., Plant Mol. Biol. 30, 1996, 687-695, DeWitt, Plant J., 1991, 121-128, Stadler a kol., Plant Cell 7, 1995, 1545-1554) . Pokud se vyjde ze známého proteinu, odborník může bez problémů izolovat cDNA pomocí protilátek nebo pomocí oligonukleotidů odvozených z aminokyselinové sekvence (srovnej např. Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, N.Y. Pokud se vyjde z takto získané cDNA je možné prohledávat připravené genomové knihovny z odpovídajících organismů a identifikovat genomové fragmenty. Srovnáním nukleotidové sekvence cDNA a genomového klonu je možné zhruba stanovit polohu promotoru. Specifičnost promotoru je možné ověřit v transgenním pokusu pomocí chimérického genu složeného z daného promotoru a indikátorového genu, jako je např. β-glukuronidáza (srovnej

Ί • · · φφφφ φ φ např. Kertbundit a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1991, 5212-5216).

Způsob podle předkládaného vynálezu je možné v principu aplikovat na jakoukoliv rostlinu. Proto jsou zvláště vhodné jak dvouděložné tak jednoděložné rostlinné druhy. Způsob je zvláště vhodný pro rostliny, které jsou zajímavé z hlediska zemědělského, zahradnického nebo lesnického.

K příkladům patří zeleniny jako je např. okukrka, meloun, dýně, lilek, cuketa, rajče, špenát, zelí a kapusty, hrách, fazole a pod. a také ovoce jako hrušky, jablka a pod.

Kromě toho vynález lze výhodně využít pro olejniny jako je řepka olejka, slunečnice a sója. Zvláště výhodné je využít vynález pro rostliny akumulující škrob, zvláště obilniny (rýže, kukuřice, pšenice, žito, oves, tritikale, proso, ječmen), brambory, maniok, sladké brambory a pod.

Způsob podle vynálezu lze aplikovat také na rostliny akumulující sacharózu, jako je např. cukrová řepa nebo cukrová třtina, ale také na další užitkové rostliny jako je např. bavlník, tabák, různé druhy dřevin, vinná réva, chmel a pod.

Předkládaný vynález se dále týká molekul rekombinantní nukleové kyseliny obsahující:

a) úsek umožňující transkripci specifickou pro průvodní buňky rostlin,a k němu operativně připojenou

i) sacharózosyntázy, ii) sacharózofosforylázy, iii) přenašeče sacharózy, iv) proteiny, jejichž aktivita vede k stimulaci protonového gradientu lokalizovaného na plazmatické membráně rostlinných buněk, a

v) citrátsyntázy.

» β «

Pokud jde o výhodná provedení těchto molekul podle předkládaného vynálezu, pro úseky zmíněné v a) a nukleotidové sekvence uvedené v b) platí totéž co již bylo uvedeno v souvislosti se způsobem podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se také týká vektorů obsahujících molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, zvláště takových, které jsou vhodné pro transformaci rostlinných buněk a také pro integraci cizorodé DNA do rostlinného genomu.

Předkládaný vynález se dále týká rostlinných buněk transformovaných molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, která je trvale obsažena v jejich genomu. Tyto buňky se liší od přirozeně se vyskytujících buněk např. tím, že molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu jsou integrovány do genomu buňky v místě, kde se nevyskytují v přirozeném stavu.

Předkládaný vynález se dále týká transgenních rostlin obsahujících rostlinné buňky podle vynálezu, které díky expresi molekuly rekombinantní nukleové kyseliny integrované do genomu průvodních buněk rostliny projevují zvýšený výnos ve srovnání s odpovídajícími rostlinami, které nejsou transformované, pokud by se pěstovaly za stejných podmínek.

Předkládaný vynález se dále týká rostlinného rozmnožovacího materiálu rostlin podle vynálezu obsahujícího výše popsané buňky podle vynálezu. Termín „rozmnožovací materiál zahrnuje zejména semena, plody, hlízy, oddenky, řízky, klusy, buněčné kultury a pod.

A nakonec se předkládaný vynález týká i použití molekul rekombinantní nukleové kyseliny obsahující úsek umožňující transkripci specifickou pro průvodní buňky rostlin, a k němu operativně připojenou nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny obsahující

i) proteiny s enzymatickou aktivitou štěpící sacharózu, ii) přenašeče sacharózy, • · • · ·

4*44 iii) proteiny, jejichž aktivita vede k stimulaci protonového gradientu lokalizovaného na plazmatické membráně rostlinných buněk, a iv) citrátsyntázy pro expresi v transgenních rostlinách ke zvýšení výnosu.

Výhodně kódované proteiny jsou proteiny popsané výše.

Způsoby transformace jednoděložných i dvouděložných rostlin jsou odborníkovi známy.

Pro vnášení DNA do hostitelské rostlinné buňky je k dispozici mnoho různých metod. Tyto metody obsahují transformaci rostlinné buňky pomocí T-DNA prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes, fúzi protoplastů, injekci nebo elektroporaci DNA, vnesení DNA biolistickou metodou a další způsoby.

Pro injekci nebo elektroporaci DNA do rostlinné buňky není třeba, aby plazmidy splňovaly nějaké specifické požadavky. Mohou se užít jednoduché plazmidy jako jsou deriváty plazmidu pUC.

Použití Agrobacterium pro transformaci rostlinných buněk je již dostatečně prozkoumáno a bylo podrobně popsáno např. v patentovém dokumentu EP-A 120 516 nebo publikacích Hoekma (v Binary Plant Vector System, Offsetdrukekerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, kapitola V), Fraley a kol. (Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46) a An a kol. (EMBO J. 4, 1985, 277-287).

Aby se přenesla DNA do rostlinné buňky, je možné rostlinné explantáty společně kultivovat (tzv. kokultivovat) s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (např. listových explantátů, segmentů stonku, kořenů anebo také protoplastů nebo suspenzních kultur rostlinných buněk) pak může být regenerována celá rostlina ve vhodném médiu, které obsahuje antibiotika nebo biocidní látky pro selekci transformovaných buněk. Rostliny získané tímto způsobem se pak testují na

Φ· přítomnost vnesené DNA. Jinou známou možností pro vnesení cizorodé DNA je využití biolistické metody nebo transformace protoplastů (viz např. Willmitzer,L., 1993, Transgenic Plants. v: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise, H.J.Rehm, G.Reed, A.Puhler, P.Stadler, eds., Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-BAsel-Cambridge).

Transformace dvouděložných rostlin prostřednictvím Ti-plazmidového vektoru Agrobacteríum tumefaciens je dobře známa a užívána. Nedávné studie ukázaly, že pomocí vektorů Agrobacterium je možné transformovat i jednoděložné rostliny (Chán a kol., Plant Mol. Biol. 22, 1993, 491-506, Hiei a kol., Plant J. 6, 1994, 271-281, Deng a kol., Science in China 33, 1990, 28-34, Wilmink a kol., Plant Cell reports 11, 1992, 76-80, May a kol., Bio/Technology 13, 1995, 486-492, Conner a Domisse, Int. J. Plant Sci. 153, 1992, .550-555, Ritchie a kol., Transgenic Res. 2, 1993, 252-265).

Alternativními systémy pro transformaci jednoděložných rostlin je transformace pomocí biolistické metody (Wan a Leamuix, Plant Physiol. 104, 1994, 37-48, Vasil a kol., Bio/Technology 11, 1993, 1553-1558, Ritala a kol., Plant Mol. Biol. 24, 1994, 317-325, Spencer a kol., Theor. Appl. Genet. 79, 1990, 625-631), transformace protoplastů, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, a také vnesení DNA pomocí skleněných vláken.

Zejména transformace kukuřice byla mnohokrát popsána v patentové a odborné literatuře (viz např. WO95/06128, EP 0 513 849, EP 0 465 875, Fromm a kol., Biotechnology 8, 1990, 833-844, Gordon-Kamm a kol., Plant Cell 2, 1990, 603618, Koziel a kol., Biotechnology 11, 1993, 194-200). V patentovém dokumentu EP 292 435 a v článku Shillito a kol. (Bio/technology 7, 1989, 581) je popsán způsob, jak získat fertilní rostliny kukuřice, když se užije jako výchozí materiál měkký kalus bez slizu. Prioli a Sondahl ·· • · ·♦·· •» 99 » · · 4

I · · 4 • · ·· · (Bio/Technology 7, 1989, 589) popsali regeneraci a získání fertilních rostlin z protoplastů kukuřice Cateto a inbrední linii CatlOO-1.

Byla také popsána úspěšná transformace dalších obilnin, např. ječmene (Wan a Lemaux, viz výše, Ritala, viz výše) a pšenice (Nehra a kol., Plant J. 5, 1994, 285-297).

Jakmile je jednou cizorodá DNA integrována v genomu rostlinné buňky, je tam obvykle stabilní a je také obsažena v potomstvu původně transformované buňky. Ta obvykle obsahuje také selekční markér, který uděluje transformované buňce rezistenci k biocidní látce nebo antibiotiku jako je např. kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, fosfinotricin a další. Tudíž individuálně zvolený markér umožňuje selekci transformovaných buněk lišících se od buněk, které postrádají vnesenou DNA.

Transformované buňky rostou v rostlině zcela normálně (viz McCormock a kol., Plant Cell Reports 5, 1986, 81-84), výsledné rostliny je možné normálně pěstovat, a mohou být získána také semena z těchto rostlin.

Je třeba vypěstovat dvě a více generací, aby byla jistota, že fenotypové znaky jsou stabilizovány a přenášeny. Je třeba také sklidit semena, aby byla jistota, že je udržován odpovídající fenotyp nebo jiné vlastnosti.

Přehled výkresů

Obr. 1 schematicky znázorňuje konstrukci plazmidu pBinRolC-SS.

Obr. 2a ukazuje analýzu aktivity sacharózosyntázy (SS) v listech transgenního bramboru, který byl transformován konstruktem pBinRolC-SS. Enzymatická aktivita byla stanovena způsobem podle Zrenner a kol. (Plant J. 7, 1995, 97-107).

·· · 00 0 0 00 · · • · 0 0 • · 0 0 · • 0 · ·

0000 000 ·· • · 0000 >· 00 • 0 0 0

0 0 0

0 0 *

0 0 0 • 0 ··

Aktivita je uvedena v μπιοί hexózových ekvivalentů za 1 minutu na 1 g čerstvé hmotnosti. Sloupcové grafy představují průměrné hodnoty ze třech vzorků pro každý genotyp. Uvedena je také směrodatná odchylka.

Obr. 2b ukazuje analýzu výnosu hlíz transgenního bramboru, který byl transformován konstruktem pBinRolC-SS. Sloupcové grafy představují průměrné hodnoty z patnácti vzorků pro každý genotyp. Uvedena je také směrodatná odchylka. Výnos je uveden v g na čerstvou hmotnost.

Obr. 2c ukazuje analýzu škrobu v hlízách transgenního bramboru, který byl transformován konstruktem pBinRolC-SS. Pro tento účel byly sklizeny hlízy z patnácti rostlin pro každý genotyp a obsah škrobu byl stanoven metodou podle Von Scheele a kol. (Landw. Verš. Sta. 127, 1937, 67-96).

Obr. 3 pBinRolC-Suc2.	schematicky	znázorňuj e	konstrukci	plazmidu
. Obr. 4	schematicky	znázorňuj e	konstrukci	plazmidu

pBinRolC-ΔΡΜΑΙ.

Obr. 5 schematicky znázorňuje klonovací strategii při konstrukci ΔΡΜΑ1.

Kroky A až B: H⁺-ATPáza ΔΡΜΑ1, která je zkrácena na 3'konci, byla amplifikována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) použitím cDNA pro PMA1 jako předlohy a komplementárních vnitřních oligonukleotidových primerů (A). Krajní štěpná míst obklopující požadovaný PCR produkt (B) byla vnesena prostřednictvím vhodně syntetizovaných primerů.

Kroky B až C: Štěpení PStl/Notl a klonování fragmentu PCR do SK vektoru E. coli pomocí štěpných míst PStl/Notl (C).

0 0

0» 0 0 0 0

0 0 0

0 0 0 00 0

0 0

0 ·· • 0

0 0 ·

0 0 · • 0 0 0 0

0 0 0 >0

Kroky C až D: Štěpení BclI/Spel plazmidu SK-ÁPMAl a klonování fragmentu do kompatibilních štěpných míst BamHI/Xbal v pBinRolC (D).

Obr. 6 ukazuje výsledky polymerázové řetězové reakce se specifickými oligonukleotidy ukazující stabilní integraci ΔΡΜΑ1 v genomu transgenních rostlin, které byly získány transformací konstruktem rolC-ÁPMA2. Velikost produktu PCR = 730 bp, WT = divoký typ, M - markér.

Obr. 7 schematicky znázorňuje konstrukci plazmidu pBinRolC-ňPHA2.

Obr. 8 schematicky znázorňuje klonovací strategii při konstrukci ΔΡΗΑ2.

Kroky A až B: fT-ATPáza ΔΡΗΑ2, která je zkrácena na 3'konci, byla amplifikována pomocí PCR použitím cDNA pro PHA2 jako předlohy a komplementárních vnitřních primerů (A). Krajní štěpná míst obklopující požadovaný PCR produkt (B) byla vnesena prostřednictvím vhodně syntetizovaných primerů.

Kroky B až C: Štěpení PStl/EcoRI a klonování fragmentu PCR dddo SK vektoru E. coli pomocí štěpných míst PStl/EcoRI (C) .

Kroky C až D: Štěpení BglII/Spel plazmidu SK-áPHA2 a klonování fragmentu do kompatibilních štěpných míst BamHI/Xbal v pBinRolC (D).

Obr. 9 ukazuje výsledky polymerázové řetězové reakce se specifickými oligonukleotidy ukazující stabilní integraci ΔΡΗΑ2 v genomu transgenních rostlin, které byly získány transformací konstruktem rolC-APHA2. Velikost produktu PCR 758 bp, WT = divoký typ, M = markér.

« · • ···· · ·

Obr. 10 schematicky pBinRolC-SoSUTl.	znázorňuj e	konstrukci	plazmidu
Obr. 11 schematicky	znázorňuj e	konstrukci	plazmidu
pBinRolC-CiSy.

Obr. 12 ukazuje výsledky stanovení obsahu sacharózy ve vzorcích parenchymu hlíz roubovaných rostlin bramboru obohacených cévním pletivem. Genotypy použité pro roubování byly linie RolC-Suc2-#25 (cytosolová invertáza) a Solanum tuberosum divokého typu cv. Desirée. Obsah sacharózy byl stanoven metodou podle Stitt a kol. (Methods in Enzymol. 174, 1989, 518-52). Sloupcové grafy představují průměrné hodnoty ze 12 vzorků na každý naroubovaný typ. Uvedeny jsou také směrodatné odchylky. Obsah sacharózy je uveden v μιηοΐ hexózových ekvivalentů na 1 g čerstvé hmotnosti.

Obr. 13 analýzu floemového exudátu listů ΔΡΜΑ1, které byly ponechány na světle po dobu 6 hodin v atmosféře obsahující ^CO^. Obsah sacharózy byl stanoven metodou podle Stitt a kol. (citováno výše). Sloupcové grafy představují průměrné hodnoty ze čtyř až pěti vzorků pro každý genotyp. Uvedeny jsou také směrodatné odchylky.

Obr. 14 ukazuje výnos hlíz (v g čerstvé hmotnosti) rostlin bramboru ΔΡΜΑ1. Sloupcové grafy představují průměrné hodnoty z šesti rostlin pro každý genotyp. Uvedena je také směrodatná odchylka. Výnos hlíz je uveden v g čerstvé hmotnosti.

Obr. 15 ukazuje výnos hlíz (v g čerstvé hmotnosti) rostlin bramboru ΔΡΗΑ2. Sloupcové grafy představují průměrné hodnoty ze čtyř až pěti rostlin pro každý genotyp. Uvedena je • · φ φ φ • · • ·· • φ φ φ • φ φ · « φ · · » • φφφφ φ * φ φ φ • φ φφφφ také směrodatná odchylka. Výnos hlíz je uveden v g čerstvé hmotnosti.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález

Příklady provední vynálezu

Příklad 1

Příprava plazmidu pBinRolC-SS a transgenních rostlin bramboru

Plazmid pBinRolC-SS obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (Bevan, Nucl.Acids Res. 12, 1984, 8711 (srovnej obr. 1).

Fragment A obsahuje promotor rolC z Agrobacterium rhizogenes. Promotor rolC obsahuje jako DNA fragment EcoRI/Asp718 velikosti 1138 bp (Lerchl a kol., Plant Cell 7, 1995, 259-270) úsek DNA (poloha 11306 až poloha 12432) z TL-DNA plazmidu Ri-agropinového typu z A. rhizogenes (Slightom a kol., J. Biol. Chem. 261, 1986, 108-121. Fragment A je vložen do míst EcoRI a Asp718 polylinkeru (vícečetného klonovacího místa) v pBinl9.

Fragment B obsahuje kódující úsek (poloha 76 až 2493) cDNA sacharózosyntázy (SS) ze Solanum tuberosum (Salanoubat a Belliard, Gene 60, 1987, 47-56. Fragment B byl získán jako fragment BamHI velikosti 2427 bp z vektoru pBluescript SK', ve kterém je vložen jako inzert do štěpného místa BamHI polylinkeru. Fragment B byl vložen ve shodné orientaci („sense) do vektoru pBinl9 do štěpného místa BamHI, které je v poloze po směru transkripce („downstream) od promotoru rolC v orientaci, která dovoluje transkripci translatovatelné RNA.

genu 3 z T-DNA

3, 1984, 83544444 4 • 4 • 4 4 •

4 4 4 4

Fragment C obsahuje polyadenylační signál Ti-plazmidu pTi ACH5 (Gielen a kol., EMBO J.

846), konkrétně nukleotidy 11749 až 11939, který byl izolován jako fragment PvuII/HindlII z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella a kol., Nátuře 303, 1983, 209-213), a který byl po napojení linkerů (spojek) Sphl klonován do štěpného místa PvuII mezi místy Sphl a HindlII v polylinkeru pBinl9.

Výsledný plazmid pBinRolC-SS byl vnesen do rostlin bramboru pomocí přenosu genů zprostředkovaného Agrobacterium tumefaciens. Pro tento účel byly malé lístky ze sterilní kultury bramboru {Solanum tuberosum L, cv. Desirée) poraněna skalpelem a umístěny do 10 ml MS média (Murashige a Skoog, Physiol. Plant. 15, 1962, 473) s 2% sacharózou obsahujícího μΐ kultury Agrobacterium tumefaciens pěstované přen noc ze selekčních podmínek. Po 3 až 5 minutách jemného třepání následovala dvoudenní inkubace ve tmě. Pak byly listy přeneseny na MS médium s 1,6% glukózou, 5 mg/l naftyloctové kyseliny, 2,0 mg/l benzylaminopurinu, 250 mg/l claforanu, 50 mg/l kanamycinu a 0,8% baktoagaru pro indukci kalusů. Po inkubaci jeden týden v 25 °C při osvětlení 3000 lx byly listy přeneseny na MS médium s 1,6% glukózou, 1,4 mg/l zeatinribózy, 20 μg/l naftyloctové kyseliny, 20 μ9/1 giberelové kyseliny, 250 mg/l claforanu, 50 mg/l kanamycinu a 0,8% baktoagaru.

Analýzy listů z mnoha rostlin transformovaných uvedeným vektorovým systémeme nepochybně prokázaly přítomnost zvýšené aktivity sacharózosyntázy. To je výsledek exprese genu sacharózosyntázy z bramboru obsaženého ve vektoru pBinRolC-Ss (viz obr. 2a).

Analýza výnosu hlíz (čerstvá hmotnost hlíz v gramech) rostlin transformovaných tímto vektorovým systémem a vykazujících zvýšenou aktivitu sacharózosyntázy nepochybně prokázala zvýšený výnos hlíz. To je také výsledek exprese • · • ···· 0 genu sacharózosyntázy z bramboru obsaženého ve vektoru pBinRolC-Ss (viz obr. 2b).

Obsah škrobu v bramborových hlízách je lineárně závislý na hustotě hlíz (Von Schéele a kol., Landw. Verš. Sta. 127, 1937, 67-96. Analýza hustoty transgenních hlíz rostlin transformovaných vektorovým systémem pBinRolC-SS majících zvýšenou aktivitu sacharózosyntázy překvapivě ukázala zvýšený obsah škrobu. To je také výsledek exprese genu sacharózosyntázy z bramboru obsaženého ve vektoru pBinRolC-Ss (viz obr. 2c) .

Příklad 2

Příprava plazmidu pBinRolC-Suc2 a příprava transgenních rostlin bramboru

Plazmid pBinRolC-Suc2 obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (viz Bevan, citován výše), jak je uvedeno na obr. 3.

Fragmenty A a C odpovídají fragmentům A a C popsaným v příkladu 1.

Fragment B obsahuje kódující úsek (poloha 845 až 2384) genu cytosolové invertázy z kvasinek (Saccharomyces cerevisiae} . Fragment B byl získán jako fragment BamHI délky 154 8 bp z vektoru pBlueScript SK-, kde je vložen do BamHI místa v polylinkeru. Fragment B je vložen v souhlasné orientaci do pBinl9 do místa BamHI.

Výsledný plazmid pBinRolC-Suc2 byl vnesen do rostlin bramboru pomocí přenosu genů zprostředkovaného Agrobacterium tumefaciens. Z transformovaných buněk byly regenerovány celé rostliny. Tyto rostliny vykazovaly při srovnání s netransformovanými rostlinami zvýšený výnos (zvýšenou biomasu).

• · • 4 · ·· · ··

4*44 4·· 444 · 4 · 4 · 444 • · 44 44····· ·· · 4·· 4···

4··· ··· ·· · ·· ·*

Příklad 3

Příprava plazmidu pBinRolC-ΔΡΜΑΙ a příprava transgenních rostlin bramboru

Plazmid pBinRolC-ΔΡΜΑΙ obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (viz Bevan, citován výše) a je schematicky zobrazen na obr. 4.

Fragmenty A a C odpovídají fragmentům A a C popsaným v příkladu 1.

Fragment B obsahuje kódující úsek (poloha 937 až 3666) genu pro protonovou ATPázu PMA1 ze Saccharomyces cerevi sisae (Serrano a kol., Nátuře 319, 1986, 689-693). Fragment B byl získán pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Pro tento účel byl 3'konec kódujícího úseku genu PMA1 zkrácen o 27 bp a současně byl zařazen nový stop-kodon. Fragment DNA modifikovný tímto způsobem byl označen ΔΡΜΑ1. Fragment B byl vložen, jako BclI/Spel fragment o déle 2739 bp, v souhlasné orientaci, do místa BamHI (kompatibilní inzerční místo s restrikčním místem Bell) a místa Xba I (kompatibilní inzerční místo s restrikčním místem Spěl) ve vektoru pBinl9.

Fragment B byl získán jako BclI/Spel fragment z vektoru pBlueScript SK, kde je vložen prostřednictvím štěpných míst Notl a Pstl v polylinkeru (viz obr. 5) . Plazmid pBinRolCΔΡΜΑ1 byl vnesen do rostlin bramboru pomocí genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium tumefaciens.

Z transformovaných buněk byly regenerovány celé rostliny.

Stabilní integrace ΔΡΜΑ1 v genomu transgenních rostlin, které bylo dosaženo pomocí vektorového systému pBinRolC-ΔΡΜΑΙ byla detekována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR)(viz obr. 6).

• · • · · • · · • · · • · ·« • · • · • · » · · 4 » · · <

» · · 4 » · · « • * · ·

Transformované rostliny projevovaly zvýšený výnos (zvýšenou biomasu) ve srovnání rostlinami (viz obr. 13 a 14).

s netransformovanými

Příklad 4

Příprava plazmidu pBinRolC-APHA2 a příprava transgenních rostlin bramboru

Plazmid pBinRolC-AHA2 obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (viz Bevan, citován výše) a je schematicky zobrazen na obr. 7.

Fragmenty A a C odpovídají fragmentům A a C popsaným v příkladu 1.

Fragment B obsahuje kódující úsek (poloha 64 až 2672) cDNA pro protonovou ATPázu PHA2 (Harms a kol., Plant Mol. Biol. 26, 1994, 979-988). Fragment B byl získán pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Pro tento účel byl 3' konec kódujícího úseku genu PHA2 zkrácen o 249 bp a současně byly zařazeny dva nové stop-kodony. Fragment DNA modifikovný tímto způsobem byl označen ΔΡΗΑ2. Fragment B byl vložen, jako BglII/Spel fragment o déle 2631 bp, v souhlasné orientaci, do místa BamHI (kompatibilní inzerční místo s restrikčním místem BglII) a místa Xba I (kompatibilní inzerční místo s restrikčním místem Spěl) ve vektoru pBinl9.

Fragment B byl získán jako BglII/Spel fragment z vektoru pBlueScript SK, kde je vložen prostřednictvím štěpných míst EcoRI a Pstl v sekvenci polylinkeru (viz obr. 8, klonovací strategie ÁPHA2).

Plazmid pBinRolC-APHA2 byl vnesen do rostlin bramboru pomocí genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium tumefaciens. Z transformovaných buněk byly regenerovány celé rostliny.

• ·

9999 9

Stabilní integrace ΔΡΜΆ1 v genomu transgenních rostlin, které bylo dosaženo pomocí vektorového systému pBinRolC-ΔΡΜΑΙ byla detekována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR)(viz obr. 9).

Transformované rostliny projevovaly zvýšený výnos (zvýšenou biomasu) ve srovnání s netransformovanými rostlinami (viz obr. 15).

Příklad 5

Příprava plazmidu pBinRolC-SoSUTl a příprava transgenních rostlin bramboru

Plazmid pBinRolC-SoSUTl obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (viz Bevan, citován výše) a je schematicky zobrazen na obr. 10.

Fragmenty A a C odpovídají fragmentům A a C popsaným v příkladu 1.

Fragment B obsahuje cDNA (poloha 1 až 1969) kódující sacharózový přenašeč ze špenátu {Spinacia oleracea) , (Riesmeier a kol., EMBO J. 11, 1992, 4705-4713, sekvence uložené pod čísly X67125 a S51273) . Fragment B byl získán jako Notl fragment z vektoru pBlueScript SK^-, kde je vložen prostřednictvím Notl sekvence v polylinkeru. Pro klonování do místa Smál vektoru pBinl9 byly lepivé konce vzniklé v důsledku štěpení Notl přeměněny na tupé konce a fragment byl vložen v souhlasné orientaci do vektoru pBinl9. Výsledný plazmid byl nazván pBinRolC-SoSUTl.

Plazmid byl vnesen do rostlin bramboru pomocí genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium tumefaciens. Z transformovaných buněk byly regenerovány celé rostliny.

44··· · ·

Transformované rostliny projevovaly zvýšený výnos (zvýšenou biomasu) ve srovnání s netransformovanými rostlinami (viz obr. 13 a 14).

Příklad 6

Příprava plazmidu pBinRolC-CiSy a příprava transgenních rostlin bramboru

Plazmid pBinRolC-CiSy obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (Bevan, Nucl.Acids Res. 12, 1984, 8711) modifikovaném podle Beckera (Nucl. Acids Res. 18, 1990, 203) (viz obr. 11).

Fragment A obsahuje promotor rolC z Agrobacterium rhizogenes. Promotor rolC obsahuje jako DNA fragment EcoRI/Asp718 velikosti 1143 bp (Lerchl a kol., Plant Cell 7, 1995, 259-270) úsek DNA (poloha 11306 až poloha 12432) z TL-DNA plazmidu Ri-agropinového typu z A. rhizogenes (Slightom a kol., J. Biol. Chem. 261, 1986, 108-121. Fragment A je vložen do míst EcoRI a Asp718 polylinkeru pBinl9.

Fragment B obsahuje kódující úsek cDNA citrátsyntázy (poloha 76 až 2493) z kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Fragment B byl získán jako fragment BamHI velikosti 1400 bp z vektoru pBluescript SK', ve kterém je vložen jako inzert do štěpného místa BamHI polylinkeru (Landschutze, Studies on the influence of the acetyl-CoA synthesis and use in transgenic plants, Doctoral Thesis, Freie Universitat Berlin, 1985, D83/FB15 No. 028).

Fragment C obsahuje polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti-plazmidu pTi ACH5 (Gielen a kol., EMBO J. 3, 1984, 835846), konkrétně nukleotidy 11749 až 11939, který byl izolován jako fragment PvuII/HindlII z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella a kol., Nátuře 303, 1983, 209-213), a který ···· ·« ·· • · * 4 » ♦ · 4 ř · » 4 ) · · 4 byl po napojení linkerů Sphl klonován do štěpného místa PvuII mezi místa Sphl a HindlII polylinkeru pBinl9.Výsledný plazmid pBinRolC-CiSy má velikost přibližně 13 kb.

Výsledný plazmid pBinRolC-CiSy byl vnesen do rostlin bramboru pomocí přenosu genů zprostředkovaného Agrobacterium tumefaciens. Z transformovaných buněk byly regenerovány celé rostliny.

Analýza mnoha rostlin transformovaných tímto vektorovým systémem nepochybně prokázala zvýšenou biomasu, což je výsledek exprese cDNA CiSy obsaženého ve vektoru pBinRolCCiSy.

Příklad 7

Roubovací experimenty

Při roubovacích experimentech byly výhony nadzemní části rostliny-příjemce nahrazeny výhonkem rostliny-dárce.

V těchto experimentech byly výhony nadzemní části transgenní rostliny (RolC-Suc2 # 25) naroubovány na podnož rostliny divokého typu (Solanum tuberosum var. Desirée). V kontrolním experimentu byl výhon z rostliny divokého typu naroubován na podnož divokého typu, aby se vyloučil rozdíl v kultivaci v průběhu experimentu (autoštěp). Cílem experimentu bylo ověřit výlučný dopad fotosyntetické aktivity a distribuce fotoasimilátů v nadzemním části rostliny na orgány (v tomto případě na hlízy) podnože divokého typu.

Rostliny bramboru byly přeneseny z tkáňové kultury do půdy a umístěny ve skleníku. Přibližně po pěti týdnech (rostliny zatím v tomto vývojovém stadiu neindukovaly tvorbu hlíz) byly rostliny roubovány. Nepotřebná nadzemní část rostliny-příjemce byla odříznuta a ve stonku této rostlinypří jemce byl vytvořen klínovitý zářez. Výhon nadzemní části ·· ·♦ ·· ·· · rostliny-dárce byl vhodným způsobem odříznut a vložen do zářezu ve stonku rostliny-příjemce. Místo roubování bylo zpevněno lepicí páskou.

Pak byly naroubované rostliny udržován při zvýšené vlhkosti vzduchu ve stínu po dobu asi jednoho týdne. Během sedmi až deseti dnů se pak postupně adaptovaly na normální skleníkové podmínky. V tomto stadiu byly rostliny staré 7 týdnů.

Všechny původní listy z rostliny-příjemce byly nyní odstraněny a stonek byl zastíněn aluminiovou folií, aby bylo zaručeno, že fotosyntetická aktivita a distribuce asimilátů výlučně z naroubovaného výhonku dárce zajišťuje výživu podnože roubované rostliny.

Rostliny byly pěstovány ve skleníku až do sklizně hlíz přibližně dva měsíce po naroubování a přibližně tři měsíce po přenesení do půdy.

Výsledky tohoto roubovacího experimentu jsou uvedeny na obr. 12.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Způsob zvýšení výnosu rostlin vyznačuj ící s e tím, že rekombinantní molekuly nukleové kyseliny obsahuj ící

a) úsek umožňující transkripci specifickou pro průvodní buňky, a k němu operativně připojenou

b) nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny obsahující:

I) proteiny s enzymatickou aktivitou, která štěpí sacharózu,

II) přenašeče sacharózy,

III) proteiny, jejichž aktivita vede k stimulaci protonového gradientu lokalizovaného na plazmatické membráně rostlinných buněk, a

IV) citrátsyntázy, které jsou stabilně integrovány do genomu těchto rostlin, jsou exprimovány.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nukleotidové sekvence kóduje rostlinný protein.

3 . Způsob podle nároku 1 v y z n a č u j ící s e tím, že nukleotidové sekvence kóduj e protein z houby nebo bakterie • 4 . Způsob podle nároku 1 v y z n a č u j ící s e

tím, že nukleotidové sekvence kóduje protein, jehož enzymatická aktivita štěpí sacharózu, a který je vybrán ze skupiny obsahující sacharózosyntázu, sacharózofosforylázu a invertázu.

• ·

4 4 4 4*44
4 · 4 4 4 44 ·

44 4 4 4 4 4 * 4 · 4 ·

4 4 4 4 4 · 4

4 4 4 4 ♦ 4 4

5. Způsob podle nároku 1 v y z načuj ící s e tím, že nukleotidová sekvence kóduj e přenašeč sacharózy ze Spinacia olearacea. 6. Způsob podle nároku 1 v y z načuj ící s e tím, že nukleotidová sekvence kóduje protonovou ATPázu. 7 . Způsob podle nároku 6 v y z načuj ící s e tím, že nukleotidová sekvence kóduj e protonovou ATPázu ze

Solanum tuberosum nebo Saccharomyces cerevisiae.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že úsek a) je promotor rolC z Agrobacterium rhizogenes.
9. Molekula rekombinantní nukleové kyseliny, která obsahuj e

a) úsek umožňující transkripci specifickou pro průvodní buňky rostlin, a k němu operativně připojenou

b) nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny obsahující

I) sacharózosyntázy,

II) sacharózofosforylázy,

III) přenašeče sacharózy,

IV) proteiny, jejichž aktivita vede k stimulaci protonového gradientu lokalizovaného na plazmatické membráně rostlinných buněk, a

V) citrátsyntázy, přičemž tato molekula rekombinantní nukleové kyseliny, když je stabilně integrována v genomu rostliny a exprimována, vede ke zvýšení výnosu rostlin.

0 0 · · · · 0 0 ·· • · · · 0 0 0 * · ♦ · • · · · · 4 · · » · • · ·· ······· · · · • · 0 0 · 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0« 0 0
10. Vektor, který obsahuje molekulu rekombinantní nukleové kyseliny podle nároku 9.
11. Vektor podle nároku 10, který je vhodný pro transformaci rostlinných buněk a pro integraci cizorodé DNA do rostlinného genomu.
12. Transformovaná rostlinná buňka, která obsahuje molekulu rekombinantní nukleové kyseliny podle nároku 9.
13. Rostlina, která obsahuje rostlinné buňky podle nároku 12, a která projevuje zvýšený výnos ve srovnání s odpovídající netransformovanou rostlinou díky tomu, že exprimuje molekulu rekombinantní nukleové kyseliny ve svých průvodních buňkách.
14. Rostlinný rozmnožovací materiál rostlin podle nároku 13, kterýžto materiál obsahuje rostlinné buňky podle nároku 12.
15. Použití molekuly rekombinantní nukleové kyseliny, která obsahuje úsek umožňující transkripci specifickou pro průvodní buňky, a k němu operativně připojenou nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid vybraný ze skupiny obsahující:

I) proteiny s enzymatickou aktivitou, která štěpí sacharózu,

II) přenašeče sacharózy,

III) proteiny, jejichž aktivita vede k stimulaci protonového gradientu lokalizovaného na plazmatické membráně rostlinných buněk, a

IV) citrátsyntázy, pro expresi v transgenních rostlinách vedoucí ke zvýšení výnosu.