TW201410865A - 製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法 - Google Patents

製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201410865A
TW201410865A TW102119681A TW102119681A TW201410865A TW 201410865 A TW201410865 A TW 201410865A TW 102119681 A TW102119681 A TW 102119681A TW 102119681 A TW102119681 A TW 102119681A TW 201410865 A TW201410865 A TW 201410865A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
microorganism
coa
hydroxybutyrate
bdo
pathway
Prior art date
Application number
TW102119681A
Other languages
English (en)
Inventor
Priti Pharkya
Anthony P Burgard
Dien Stephen J Van
Robin E Osterhout
Mark J Burk
John D Trawick
Michael P Kuchinskas
Brian Steer
Original Assignee
Genomatica Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genomatica Inc filed Critical Genomatica Inc
Publication of TW201410865A publication Critical patent/TW201410865A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C31/00—Saturated compounds having hydroxy or O-metal groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C31/18—Polyhydroxylic acyclic alcohols
    • C07C31/20—Dihydroxylic alcohols
    • C07C31/207—1,4-Butanediol; 1,3-Butanediol; 1,2-Butanediol; 2,3-Butanediol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/01—Saturated compounds having only one carboxyl group and containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
    • C08G18/2805—Compounds having only one group containing active hydrogen
    • C08G18/2815—Monohydroxy compounds
    • C08G18/284—Compounds containing ester groups, e.g. oxyalkylated monocarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
    • C08G18/30—Low-molecular-weight compounds
    • C08G18/32—Polyhydroxy compounds; Polyamines; Hydroxyamines
    • C08G18/3203—Polyhydroxy compounds
    • C08G18/3206—Polyhydroxy compounds aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/06—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from hydroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/12—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/16—Dicarboxylic acids and dihydroxy compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/12—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/16—Dicarboxylic acids and dihydroxy compounds
    • C08G63/18—Dicarboxylic acids and dihydroxy compounds the acids or hydroxy compounds containing carbocyclic rings
    • C08G63/181—Acids containing aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01052—Oxoglutarate dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01031—Phosphoenolpyruvate carboxylase (4.1.1.31)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Abstract

本發明提供具有4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇或其他產物途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇或其他產物之非天然微生物，其中該微生物包含一或多種遺傳修飾。本發明另外提供使用該等微生物產生4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇或其他產物或相關產物之方法。

Description

製造4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇及相關化合物之微生物及方法
本發明申請案含有已經由EFS-Web以ASCII格式提交之序列表且其全部內容以引用方式併入本文中。於2013年5月29日創建之該ASCII拷貝命名為871943-228191_SL.txt且大小為242,819個位元組。
本申請案主張2012年6月4日提出申請之美國臨時申請案第61/655,429號之優先權之權益，其全部內容以引用方式併入本文中。
本發明概言之係關於生物體之電腦上之設計及生物體之改造，該生物體更特定而言為具有1,4-丁二醇、4-羥基丁醯基-CoA、4-羥基丁醛或腐胺生物合成能力之生物體。
化合物4-羥基丁酸(4-羥基丁酸酯(4-hydroxybutanoate)、4-羥基丁酸酯(4-hydroxybutyrate)、4-HB)係具有作為各種商品及特殊化學品之結構單元之工業潛力的4-碳羧酸。特定而言，4-HB具有用作進入1,4-丁二醇化學品家族之新進入點之潛力，該家族包括溶劑、樹脂、聚合物前體及特殊化學品。1,4-丁二醇(BDO)係聚合物中間體及工業溶劑，全球市場為約30億lb/年。BDO目前係自石油化學前體(主要為乙炔、馬來酸酐及環氧丙烷)產生。
例如，使乙炔在Reppe合成反應中與2分子甲醛反應(Kroschwitz 及Grant，Encyclopedia of Chem.Tech.,John Wiley & Sons公司，New York(1999))，之後催化氫化以形成1,4-丁二醇。據估計，美國產生之乙炔的90%之消耗用於產生丁二醇。或者，其可藉由源自丁烷之馬來酸酐之酯化及催化氫化來形成。在下游，可進一步轉化丁二醇；例如，藉由氧化轉化成γ-丁內酯，γ-丁內酯可進一步轉變成吡咯啶酮及N-甲基-吡咯啶酮，或者藉由氫解而轉變成四氫呋喃。該等化合物具有作為聚合物中間體、溶劑及添加劑之各種應用，且具有接近20億lb/年之組合市場。期望研發藉由替代手段產生該等化學品之方法，該等替代手段不僅可再生地代替基於石油之原料，且亦較少地使用能量-及資本密集型製程。
因此，相關技藝需要用於有效地產生商業量之1,4-丁二醇及其化學前體之替代手段。本發明滿足此需要且亦提供相關優點。
本發明提供具有4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇或其他產物途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇或其他產物之非天然微生物，其中該微生物包含一或多種遺傳修飾。本發明另外提供使用該等微生物產生4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇或其他產物或相關產物之方法。
圖1係顯示產生4-羥基丁酸酯(4-HB)及1,4-丁二醇之生物化學途徑的示意圖。前5個步驟係大腸桿菌(Escherichia coli)之內源性步驟，而其餘步驟可異源表現。催化生物合成反應之酶係：(1)琥珀醯基-CoA合成酶；(2)非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；(3)α-酮戊二酸去氫酶；(4)麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶；(5)麩胺酸去羧酶；(6)CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；(7)4-羥基丁酸去氫酶；(8)α-酮戊二酸去羧酶；(9)4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶；(10)丁酸激酶；(11)磷酸轉丁醯基酶；(12)醛去氫酶；(13)醇去氫酶。
圖2係顯示大腸桿菌中之高絲胺酸生物合成之示意圖。
圖3顯示使用具有表現4-HB途徑基因之各種組合之質粒的大腸桿菌菌株在葡萄糖最低培養基中產生4-HB。(a)培養營養液中之4-HB濃度；(b)培養營養液中之琥珀酸酯濃度；(c)在600nm下量測之培養物OD。條形簇代表24小時、48小時及72小時(若量測)時間點。沿x軸之代碼指示所用菌株/質粒組合。第一索引係指宿主菌株：1，MG1655 lacIQ；2，MG1655 △gabD lacIQ；3，MG1655 △gabD △aldA lacIQ。第二索引係指所用質粒組合：1，pZE13-0004-0035與pZA33-0036；2，pZE13-0004-0035與pZA33-0010n；3，pZE13-0004-0008與pZA33-0036；4，pZE13-0004-0008與pZA33-0010n；5，對照載體pZE13與pZA33。
圖4顯示在表現來自結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之α-酮戊二酸去羧酶之大腸桿菌菌株中自葡萄糖產生4-HB。菌株1-3含有pZE13-0032及pZA33-0036。菌株4僅表現空載體pZE13及pZA33。宿主菌株如下：1及4，MG1655 lacIQ；2，MG1655 △gabD lacIQ；3，MG1655 △gabD △aldA lacIQ。條形係指24小時及48小時時之濃度。
圖5顯示在重組大腸桿菌菌株中自10mM 4-HB產生BDO。編號位置對應於使用MG1655 lacIQ之實驗，其含有表現來自牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)之cat2之pZA33-0024及在pZE13上表現之以下基因：1，無(對照)；2，0002；3，0003；4，0003n；5，0011；6，0013；7，0023；8，0025；9，0008n；10，0035。基因編號定義於表6中。對於各位置而言，條形分別係指好氧性條件、微好氧性條件及厭氧性條件。微好氧性條件係藉由密封培養管但不將其抽空來產生。
圖6顯示由在補加有4g/L未經標記葡萄糖(a、c、e及g)、均勻標記13C-葡萄糖(b、d、f及h)之M9最低培養基中生長之MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036產生之4-HB及BDO的質譜 圖。(a)及(b)，衍生化BDO之質量116特徵性片段，其含有2個碳原子；(c)及(d)，衍生化BDO之質量177特徵性片段，其含有1個碳原子；(e)及(f)，衍生化4-HB之質量117特徵性片段，其含有2個碳原子；(g)及(h)，衍生化4-HB之質量233特徵性片段，其含有4個碳原子。
圖7係用於產生γ-丁內酯之生物過程之示意性過程流程圖。圖(a)圖解說明利用分批分離之分批補料發酵且圖(b)圖解說明利用連續分離之分批補料發酵。
圖8A及8B顯示實例性1,4-丁二醇(BDO)途徑。圖8A顯示始自琥珀醯基-CoA之BDO途徑。圖8B顯示始自α-酮戊二酸酯之BDO途徑。
圖9A-9C顯示實例性BDO途徑。圖9A及9B顯示始自4-胺基丁酸酯之途徑。圖9C顯示自乙醯乙醯基-CoA至4-胺基丁酸酯之途徑。
圖10顯示始自α-酮戊二酸酯之實例性BDO途徑。
圖11顯示始自麩胺酸酯之實例性BDO途徑。
圖12顯示始自乙醯乙醯基-CoA之實例性BDO途徑。
圖13顯示始自高絲胺酸之實例性BDO途徑。
圖14顯示大腸桿菌琥珀醯基-CoA合成酶之核苷酸及胺基酸序列。圖14A顯示大腸桿菌sucCD操縱子之核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。圖14B(SEQ ID NO：47)及14C(SEQ ID NO：48)顯示由sucCD操縱子編碼之琥珀醯基-CoA合成酶次單元之胺基酸序列。
圖15顯示牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)α-酮戊二酸去羧酶之核苷酸及胺基酸序列。圖15A顯示牛分枝桿菌sucA基因之核苷酸序列(SEQ ID NO：49)。圖15B顯示牛分枝桿菌α-酮戊二酸去羧酶之胺基酸序列(SEQ ID NO：50)。
圖16顯示大腸桿菌在厭氧性(微好氧性)條件下在最低培養基中經由α-酮戊二酸酯自葡萄糖生物合成4-羥基丁酸酯。宿主菌株係ECKh- 401。實驗基於存在於質粒pZA33上之上游途徑基因標記如下：1)4hbd-sucA；2)sucCD-sucD-4hbd；3)sucCD-sucD-4hbd-sucA。
圖17顯示大腸桿菌在最低培養基中經由琥珀酸酯及α-酮戊二酸酯自葡萄糖生物合成4-羥基丁酸酯。宿主菌株係野生型MG1655。實驗基於存在於質粒pZE13及pZA33上之基因標記如下：1)空對照載體；2)空pZE13、pZA33-4hbd；3)pZE13-sucA、pZA33-4hbd。
圖18A顯示來自牙齦卟啉單胞菌之CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶(sucD)之核苷酸序列(SEQ ID NO：51)，且圖18B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：52)。
圖19A顯示來自牙齦卟啉單胞菌之4-羥基丁酸去氫酶(4hbd)之核苷酸序列(SEQ ID NO：53)，且圖19B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。
圖20A顯示來自牙齦卟啉單胞菌之4-羥基丁酸CoA轉移酶(cat2)之核苷酸序列(SEQ ID NO：55)，且圖20B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：56)。
圖21A顯示來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)之磷酸轉丁醯基酶(ptb)之核苷酸序列(SEQ ID NO：57)，且圖21B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：58)。
圖22A顯示來自丙酮丁醇梭菌之丁酸激酶(buk1)之核苷酸序列(SEQ ID NO：59)，且圖22B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：60)。
圖23顯示丙酮丁醇梭菌020(磷酸轉丁醯基酶)之替代核苷酸序列，其相對於丙酮丁醇梭菌天然序列具有改變為更常見之大腸桿菌密碼子之密碼子。圖23A-23D(020A-020D，分別為SEQ ID NO：61-64)所含序列中經更常見密碼子置換之罕見大腸桿菌密碼子之數目遞增(A<B<C<D)。
圖24顯示丙酮丁醇梭菌021(丁酸激酶)之替代核苷酸序列，其相 對於丙酮丁醇梭菌天然序列具有改變為更常見之大腸桿菌密碼子之密碼子。圖24A-24D(021A-021B，分別為SEQ ID NO：65-68)所含序列中經更常見密碼子置換之罕見大腸桿菌密碼子之數目遞增(A<B<C<D)。
圖25顯示丁酸激酶(BK)及磷酸轉丁醯基酶(PTB)之經改良表現，其密碼子經最佳化以供在大腸桿菌中表現。圖25A顯示用考馬斯藍(Coomassie blue)對蛋白質染色之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；泳道1，無插入之對照載體；泳道2，丙酮丁醇梭菌天然序列在大腸桿菌中之表現；泳道3，020B-021B密碼子最佳化之PTB-BK之表現；泳道4，020C-021C密碼子最佳化之PTB-BK之表現。顯示BK及PTB之位置。圖25B顯示天然丙酮丁醇梭菌序列(2021n)相較於密碼子最佳化之020B-021B(2021B)及020C-021C(2021C)之BK及PTB活性。
圖26顯示BDO及γ-丁內酯(GBL)在表現以下產生BDO之酶之不同菌株中之產生：Cat2(034)；2021n；2021B；2021C。
圖27A顯示天然拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)ald基因(025n)之核苷酸序列(SEQ ID NO：69)，且圖27B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：70)。
圖28A-28D顯示拜氏梭菌ald基因之替代基因序列(025A-025D，分別為SEQ ID NO：71-74)，其中經更常見密碼子置換之罕見密碼子之數目遞增(A<B<C<D)。
圖29顯示天然拜氏梭菌ald基因及密碼子最佳化之變體之表現：無插入(無插入對照)、025n、025A、025B、025C、025D。
圖30顯示不同菌株中之BDO或BDO及乙醇產生。圖30顯示含有天然拜氏梭菌ald基因(025n)或密碼子經最佳化以供在大腸桿菌中表現之變體(025A-025D)之菌株中的BDO產生。圖30B顯示相較於密碼子最佳化變體025B表現丙酮丁醇梭菌AdhE2酶(002C)之菌株中之乙醇及 BDO產生。第三組顯示牙齦卟啉單胞菌sucD(035)之表現。在所有情況下，亦表現牙齦卟啉單胞菌Cat2(034)。
圖31A顯示來自熱葡糖苷酶地芽胞桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)之adh1基因之核苷酸序列(SEQ ID NO：75)，且圖31B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：76)。
圖32A顯示熱葡糖苷酶地芽胞桿菌adh1基因在大腸桿菌中之表現。對於無插入質粒、具有083(頭狀地黴(Geotrichum capitatum)N-苯甲基-3-吡咯啶醇去氫酶)插入之質粒及具有084(熱葡糖苷酶地芽胞桿菌adh1)插入之質粒，藉由SDS-PAGE分析全部溶胞物或上清液並用考馬斯藍染色。圖32B顯示具有丁醛(菱形)或4-羥基丁醛(正方形)作為受質之084之活性。
圖33顯示BDO在不同菌株中之產生：無插入質粒；025B；025B-026n；025B-026A；025B-026B；025B-026C；025B-050；025B-052；025B-053；025B-055；025B-057；025B-058；025B-071；025B-083；025B-084；PTSlacO-025B；PTSlacO-025B-026n。
圖34顯示載體pRE118-V2之質粒圖譜。
圖35顯示涵蓋aceF及lpdA基因之ECKh-138區之序列(SEQ ID NO：77)。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)lpdA基因加下劃線，且Glu354Lys突變體中改變之密碼子帶陰影。
圖36顯示天然大腸桿菌lpdA(SEQ ID NO：78)與突變肺炎克雷伯氏菌lpdA(SEQ ID NO：79)之蛋白質序列比較。
圖37顯示菌株AB3、MG1655 △ldhA及ECKh-138中之4-羥基丁酸酯(左條形)及BDO(右條形)產生。所有菌株皆在中度拷貝質粒pZA33上表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，且在高度拷貝質粒pZE13上表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2。
圖38顯示融合至pflB-p6啟動子及核糖體結合位點(RBS)之aceE基因之5’末端的核苷酸序列(SEQ ID NO：80)。5’斜體序列顯示在與pdh操縱子相反之方向上轉錄之aroP基因之起點。3’斜體序列顯示aceE基因之起點。大寫體：pflB RBS。加下劃線：FNR結合位點。粗體：pflB-p6啟動子序列。
圖39顯示菌株ECKh-456中aceF-lpdA區之核苷酸序列(SEQ ID NO：81)。
圖40顯示菌株ECKh-439、ECKh-455及ECKh-456中之每一者之4-羥基丁酸酯、BDO及丙酮酸酯之產生(分別為自左至右之條形)。
圖41A顯示用於缺失mdh基因之重組位點之示意圖。圖41B顯示氯黴素(chloramphenicol)抗性基因(CAT)之擴增之PCR產物的核苷酸序列(SEQ ID NO：82)及所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：83)，該抗性基因側接來自質粒pKD3之mdh基因之FRT位點及同源區。
圖42顯示菌株ECKh-401中arcA缺失區之序列(SEQ ID NO：84)。
圖43顯示涵蓋菌株ECKh-422之經突變gltA基因之區域之序列(SEQ ID NO：85)。
圖44顯示野生型gltA基因產物及R163L突變體之檸檬酸合成酶活性。在0.4mM NADH不存在(菱形)或存在(正方形)下實施分析。
圖45顯示菌株ECKh-401及ECKh-422中之4-羥基丁酸酯(左條形)及BDO(右條形)產生，該兩個菌株皆在質粒上表現完整BDO途徑之基因。
圖46顯示來自代謝標記實驗之中心代謝通量及相關95%信賴區間。各值係正規化成1mmol/hr之葡萄糖吸收速率之莫耳通量。結果指示，碳通量在氧化方向上途經檸檬酸合成酶，且多數碳進入BDO途徑，而非完成TCA循環。
圖47顯示菌株ECKh-138及ECKh-422之細胞外產物形成，該兩個 菌株皆在質粒上表現整個BDO途徑。所量測產物係乙酸酯(Ace)、丙酮酸酯(Pyr)、4-羥基丁酸酯(4HB)、1,4-丁二醇(BDO)、乙醇(EtOH)及其他產物，其包括γ-丁內酯(GBL)、琥珀酸酯及乳酸酯。
圖48顯示由流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶(pepck)置換PEP羧化酶(ppc)後之該區之序列(SEQ ID NO：86)。pepck編碼區加下劃線。
圖49顯示含有50mM NaHCO3之最低培養基中生長之進化pepCK菌株之生長。
圖50顯示在質粒pZS*13上表現牙齦卟啉單胞菌Cat2及拜氏梭菌Ald之菌株ECKh-453中之產物形成。所量測產物係1,4-丁二醇(BDO)、丙酮酸酯、4-羥基丁酸酯(4HB)、乙酸酯、γ-丁內酯(GBL)及乙醇。
圖51顯示兩個菌株ECKh-453及ECKh-432之BDO產生。兩者皆含有表現牙齦卟啉單胞菌Cat2及拜氏梭菌Ald之質粒pZS*13。使培養物在微好氧性條件下生長，其中用27或18號針刺穿容器，如所指示。
圖52顯示菌株ECKh-426之基因組DNA在插入含有啟動子、sucCD基因、sucD基因、4hbd基因及終止子序列之多順反子DNA片段之區中之核苷酸序列(SEQ ID NO：87)。
圖53顯示菌株ECKh-432之染色體區在插入含有啟動子、sucA基因、克氏羧菌(Clostridium kluyveri)4hbd基因及終止子序列之多順反子序列之區中之核苷酸序列(SEQ ID NO：88)。
圖54顯示在最低培養基中在ECKh-432菌株中自葡萄糖合成BDO，該菌株具有整合至染色體中之編碼上游BDO途徑之基因且含有具有下游BDO途徑基因之質粒。
圖55顯示含有側接與rrnC區同源之區之非磷酸轉移酶(非PTS)蔗糖利用基因的PCR產物(SEQ ID NO：89)。
圖56顯示rrnC操縱子中之整合位點之示意圖。
圖57顯示在葡萄糖上生長之菌株ECKh-432及蔗糖上生長之菌株ECKh-463生長48小時後正規化成培養物OD600之平均產物濃度。兩者皆含有表現牙齦卟啉單胞菌Cat2及拜氏梭菌Ald之質粒pZS*13。數據係關於各菌株之6個重複培養物。所量測產物係1,4-丁二醇(BDO)、4-羥基丁酸酯(4HB)、γ-丁內酯(GBL)、丙酮酸酯(PYR)及乙酸酯(ACE)(分別為自左至右之條形)。
圖58顯示自琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸酯產生1,4-丁二醇之實例性途徑。縮寫：A)琥珀醯基-CoA還原酶(形成醛)，B)α-酮戊二酸去羧酶，C)4-羥基丁酸去氫酶，D)4-羥基丁酸還原酶，E)1,4-丁二醇去氫酶。
圖59A顯示來自伊文思奴卡菌(Nocardia iowensis)之羧酸還原酶(GNM_720)之核苷酸序列(SEQ ID NO：90)，且圖59B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：91)。
圖60A顯示密碼子最佳化之磷酸泛醯巰基乙胺轉移酶之核苷酸序列(SEQ ID NO：92)，且圖60B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：93)。
圖61顯示質粒pZS*-13S-720 721opt之質粒圖譜。
圖62A及62B顯示自琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸酯產生1,4-丁二醇之途徑。縮寫：A)琥珀醯基-CoA還原酶(形成醛)，B)A-酮戊二酸去羧酶，C)4-羥基丁酸去氫酶，D)4-羥基丁酸還原酶，E)1,4-丁二醇去氫酶，F)琥珀酸還原酶，G)琥珀醯基-CoA轉移酶，H)琥珀醯基-CoA水解酶，I)琥珀醯基-CoA合成酶(或琥珀醯基-CoA連接酶)，J)麩胺酸去氫酶，K)麩胺酸轉胺酶，L)麩胺酸去羧酶，M)4-胺基丁酸去氫酶，N)4-胺基丁酸轉胺酶，O)4-羥基丁酸激酶，P)磷酸轉-4-羥基丁醯基酶，Q)4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醛)，R)4-羥 基丁醯基磷酸酯還原酶，S)琥珀醯基-CoA還原酶(形成醇)，T)4-羥基丁醯基-CoA轉移酶，U)4-羥基丁醯基-CoA水解酶，V)4-羥基丁醯基-CoA合成酶(或4-羥基丁醯基-CoA連接酶)，W)4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)，X)α-酮戊二酸還原酶，Y)5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶，Z)5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶，AA)5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。
圖63顯示自琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸酯產生腐胺之途徑。縮寫：A)琥珀醯基-CoA還原酶(形成醛)，B)α-酮戊二酸去羧酶，C)4-胺基丁酸還原酶，D)腐胺去氫酶，E)腐胺轉胺酶，F)琥珀酸還原酶，G)琥珀醯基-CoA轉移酶，H)琥珀醯基-CoA水解酶，I)琥珀醯基-CoA合成酶(或琥珀醯基-CoA連接酶)，J)麩胺酸去氫酶，K)麩胺酸轉胺酶，L)麩胺酸去羧酶，M)4-胺基丁酸去氫酶，N)4-胺基丁酸轉胺酶，O)α-酮戊二酸還原酶，P)5-胺基-2-酮基戊酸去氫酶，Q)5-胺基-2-酮基戊酸轉胺酶，R)5-胺基-2-酮基戊酸去羧酶，S)鳥胺酸去氫酶，T)鳥胺酸轉胺酶，U)鳥胺酸去羧酶。
圖64A顯示來自恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)mc(2)155(命名為890)之羧酸還原酶之核苷酸序列(SEQ ID NO：94)，且圖64B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：95)。
圖65A顯示來自鳥分枝桿菌副結核亞種K-10(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis K-10)(命名為891)之羧酸還原酶之核苷酸序列(SEQ ID NO：96)，且圖65B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：97)。
圖66A顯示來自海棲分枝桿菌M(Mycobacterium marinum M)(命名為892)之羧酸還原酶之核苷酸序列(SEQ ID NO：98)，且圖66B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：99)。
圖67顯示大腸桿菌MG1655染色體在核苷酸760928與765930之間 之示意圖。
圖68a-68e顯示用於構築sucCD缺失之序列及寡核苷酸之示意圖。
圖69顯示實例性BDO途徑。各編號步驟之酶名稱如下：(1)α-酮戊二酸去羧酶；(2)CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；(3)4-羥基丁酸去氫酶；(4)4-羥基丁醯基-CoA轉移酶；(5)4-羥基丁醯基-CoA還原酶；(6)4-羥基丁醛還原酶。
圖70顯示自葡萄糖形成BDO之實例性途徑。縮寫：G6P-葡萄糖-6-磷酸酯、PEP-磷酸烯醇丙酮酸酯、PYR-丙酮酸酯、OA-草醯乙酸酯、ACCOA-乙醯基-CoA、CIT-檸檬酸酯、ICIT-異檸檬酸酯、AKG-α-酮戊二酸酯、SUCCOA-琥珀醯基-CoA、SUCSAL-琥珀酸半醛、4HB-4-羥基丁酸酯、4HBCoA-4-羥基丁醯基-CoA、4HBALD-4羥基丁醛、BDO-1,4-丁二醇、GBL-γ-丁內酯。所關注基因：ppc-PEP羧化酶、sucCD-琥珀醯基-CoA合成酶、sucAB-lpdA-AKG去氫酶複合物之次單元、ybgC、tesB-醯基-輔酶A硫酯酶。
圖71顯示相較於對照菌株之4個重複之相應平均值，來自基因ppc過表現之產生4HB之宿主菌株之4個重複的平均BDO及4HB數量。
圖72顯示相較於對照，來自ppc過表現之菌株之4個重複之平均乙醇數量的降低。
圖73顯示相較於來自對照菌株之4個重複之相應平均值，來自基因sucAB及突變lpdA在pZS*上過表現之產生4HB之宿主菌株之4個重複的平均BDO及4HB數量。ALD及ADH係在質粒pPZSX23R上表現。
圖74顯示相較於對照，來自基因sucAB及突變lpdA在pZS*上過表現之菌株之4個重複之平均麩胺酸酯數量的降低。
圖75顯示4-HB內酯化成GBL之表觀平衡常數隨pH之變化(在22℃下)(來自Efe等人，Biotechnol.Bioeng.99：1392-1406(2008))。
圖76顯示相較於來自對照菌株(2237)之4個重複之相應平均值， 來自整合有酯酶之能夠產生4-羥基丁醯基-CoA之宿主菌株(2387)之4個重複的平均BDO及4HB數量。
圖77顯示相較於來自對照菌株(2237)之4個重複之相應平均值，來自整合有酯酶之宿主菌株(2387)之4個重複的平均GBL數量。觀察到整合有酯酶之菌株之GBL較低。
圖78顯示相較於來自對照菌株(4070)之4個重複之相應平均值，來自缺失基因sucCD之宿主菌株(4269)之4個重複的平均BDO及4HB數量。
圖79顯示相較於來自對照菌株(1136)之3個重複之相應平均值，來自缺失基因ybgC及tesB之宿主菌株(1197)之3個重複的平均BDO及4HB數量。
圖80顯示相較於來自對照菌株(1136)之3個重複之相應平均值，來自缺失基因ybgC及tesB之宿主菌株(1197)之3個重複的平均GBL數量。
圖81顯示各部分之陰離子交換溶析、回流活性以及SDS page之概況。
圖82顯示各部分之分子大小篩選層析、回流活性以及SDS page之概況。
圖83顯示分子大小篩選管柱及SDS page之回流活性。
圖84顯示，利用抗生蛋白鏈菌素標籤選殖yjgB基因，使其表現並純化以表徵其性質。純化結果係經由SDS-PAGE獲得。
圖85顯示在100mM BDO中之yjgB活性。
圖86顯示菌株1872相對於菌株1889之平均BDO、4HB及GBL數量。
圖87顯示菌株956相對於菌株879之平均BDO、4HB及GBL數量。
圖88顯示菌株1889、2424、2611及2471之平均BDO、4HB及GBL 數量。
圖89A顯示耶氏桿菌屬(Yersinia)基因(基因座yinte0001_13710)之核苷酸序列(SEQ ID NO：177)，且圖89B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：179)。
圖90A顯示來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之基因之核苷酸序列(SEQ ID NO：178)，且圖90B顯示所編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：180)。
圖91顯示對應於以下之代謝修飾之實例性組合：(A)增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表現之遺傳修飾；(B)增加α-酮戊二酸去氫酶表現之遺傳修飾；(C)增加非磷酸轉移酶(PTS)葡萄糖吸收系統表現之遺傳修飾；(D)增加γ-丁內酯酯酶表現之遺傳修飾；(E)降低琥珀醯基-CoA合成酶表現之遺傳修飾；(F)降低醯基輔酶A硫酯酶表現之遺傳修飾；(G)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾；(H)降低非產能NADH去氫酶表現之遺傳修飾；(I)降低細胞色素氧化酶表現之遺傳修飾；(J)增加丙酮酸去氫酶表現之遺傳修飾；(K)降低好氧性呼吸控制調節系統表現之遺傳修飾；(L)增加對NADH不敏感之檸檬酸合成酶表現之遺傳修飾；(M)降低蘋果酸去氫酶表現之遺傳修飾；(N)降低乳酸去氫酶表現之遺傳修飾；(O)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾；及(P)降低丙酮酸甲酸裂解酶表現之遺傳修飾。
本發明係關於具有4-羥基丁酸(4-HB)、γ-丁內酯、1,4-丁二醇(BDO)、4-羥基丁醛(4-HBal)、4-羥基丁醯基-CoA(4-HBCoA)及/或腐胺生物合成產生能力之細胞及生物體的設計及產生。特定而言，本發明係關於藉由引入一或多個編碼BDO、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺途徑酶之核酸能夠產生BDO、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺之微生物的設計。
在一個實施例中，本發明利用大腸桿菌代謝之電腦上化學計量模型，其鑑別用於4-羥基丁酸(4-HB)、1,4-丁二醇(BDO)、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺之生物合成產生之代謝設計。本文所述結果指示，代謝途徑可經設計並重組改造以在大腸桿菌及其他細胞或生物體中生物合成4-HBal、4-HBCoA或4-HB及下游產物，例如1,4-丁二醇或腐胺。生物合成產生用於(例如)電腦上設計之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺可藉由構築具有所設計代謝基因型之菌株來確認。該等代謝改造細胞或生物體亦可經過適應性進化以進一步增進4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺生物合成，包括在接近理論最大生長之條件下。
在某些實施例中，所設計菌株之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺生物合成特性使其遺傳穩定且尤其可用於連續過程。 藉由向大腸桿菌或其他宿主生物體中納入不同的非天然或異源反應能力來鑑別單獨菌株設計策略，從而自非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶獲得產生4-HB及1,4-丁二醇之代謝途徑。鑑別在大腸桿菌與酵母菌物種二者中自該等代謝途徑中之每一者生物合成4-HB的電腦上代謝設計。1,4-丁二醇中間體γ-丁內酯可藉由自發環化在pH<7.5之條件下，尤其在酸性條件下，例如低於pH 5.5，例如，pH<7，pH<6.5，pH<6，且尤其在pH<5.5或更低下在培養中生成。
經由平臺之計算組件鑑別之菌株可藉由遺傳改造生物合成產生4-HB、1,4-丁二醇或其他中間體及/或下游產物之任一預測代謝改變來實際地產生。在再一實施例中，展現生物合成產生該等化合物之菌株可進一步經過適應性進化以進一步增進產物生物合成。適應性進化後之產物生物合成產量亦可藉由系統之計算組件預測。
在其他具體實施例中，構築微生物以表現編碼自琥珀酸酯至4- HB及至4-HB-CoA之酶促步驟之4-HB生物合成途徑。相較於缺乏4-HB生物合成途徑之宿主微生物，在宿主微生物中共表現琥珀酸輔酶A轉移酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、NAD-依賴性4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁酸輔酶A轉移酶顯著產生4-HB。在其他具體實施例中，藉由引入編碼α-酮戊二酸去羧酶及依賴NAD之4-羥基丁酸去氫酶之核酸來生成利用α-酮戊二酸酯作為受質的產生4-HB之微生物。
另一具體實施例中，構築含有1,4-丁二醇(BDO)生物合成途徑之微生物，當在4-HB存在下培養時，其生物合成BDO。BDO生物合成途徑係由編碼多官能醛/醇去氫酶之核酸或編碼醛去氫酶及醇去氫酶之核酸組成。為了支持在4-HB受質上生長，該等產生BDO之微生物亦表現4-羥基丁酸CoA轉移酶或4-丁酸激酶以及磷酸轉移羥基丁醯基酶。在再一具體實施例中，生成經由外源性表現編碼功能性4-HB生物合成途徑及功能性BDO生物合成途徑之核酸來合成BDO的微生物。 4-HB生物合成途徑係由琥珀酸輔酶A轉移酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、依賴NAD之4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁酸輔酶A轉移酶組成。BDO途徑係由多官能醛/醇去氫酶組成。本文進一步闡述用於產生BDO之其他途徑(參見圖8-13)。
在又一實施例中，本文闡述在4-羥基丁醛、4-羥基丁醯基-CoA或1,4-丁二醇代謝途徑中發揮功能之羧酸還原酶之選殖及表現。採用羧酸還原酶而非醯基-CoA還原酶來形成4-羥基丁醛(4-羥基丁醛)之優點包括伴隨BDO產生的較低乙醇及GBL副產物形成。本文亦揭示，應用羧酸還原酶作為其他諸多途徑中之一部分自三羧酸(TCA)循環代謝物(例如，琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA及/或α-酮戊二酸酯)產生1,4-丁二醇及腐胺。
本文所用術語「非天然」在參考本發明微生物或微生物使用時意指，微生物具有至少一個並非通常在參考物種之天然菌株(包括參 考物種之野生型菌株)中發現之遺傳改變。遺傳改變包括(例如)引入編碼代謝多肽之可表現核酸之修飾、其他核酸添加、核酸缺失及/或對微生物之遺傳材料之其他功能破壞。此等修飾包括(例如)與參考物種異源、同源或異源及同源之多肽之編碼區及其功能片段。其他修飾包括(例如)修飾改變基因或操縱子之表現之非編碼調節區。實例性代謝多肽包括4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺家族化合物生物合成途徑內之酶或蛋白質。
代謝修飾係指自天然狀態改變之生物化學反應。因此，非天然微生物可具有對編碼代謝多肽或其功能片段之核酸之遺傳修飾。本文揭示實例性代謝修飾。
本文所用術語「經分離」在參考微生物使用時，意指實質上不含當在自然界中發現參考微生物時所存在之至少一種組份的生物體。 該術語包括自當在微生物天然環境中發現其時所存在之一些或全部組份移出之微生物。該術語亦包括自當在非天然環境中發現微生物時所存在之一些或所有組份移出之微生物。因此，經分離微生物與當在自然界中發現其時或當其在非天然環境中生長、儲存或存活時所存在之其他物質部分或完全分開。經分離微生物之具體實例包括部分純的微生物、實質上純的微生物及在非天然培養基中培養之微生物。
本文所用術語「微生物(microbial)」、「微生物(microbial organism)」或「微生物(microorganism)」意指包括在古菌域、細菌域或真核生物域內作為顯微細胞存在之任何生物體。因此，該術語意欲涵蓋具有微觀大小之原核或真核細胞或生物體且包括所有物種之細菌、古菌及真細菌以及真核微生物，例如酵母菌及真菌。該術語亦包括可經培養用於產生生物化學物質之任一物種之細胞培養物。
本文所用術語「4-羥基丁酸」意指丁酸之4-羥基衍生物，其具有化學式C4H8O3且分子質量為104.11g/mol(126.09g/mol，對於其鈉鹽 而言)。化學化合物4-羥基丁酸在相關技藝亦稱為4-HB、4-羥基丁酸酯、γ-羥基丁酸或GHB。該術語在本文中使用時，意欲包括化合物之各種鹽形式中之任一者且包括(例如)4-羥基丁酸鹽(4-hydroxybutanoate)及4-羥基丁酸鹽(4-hydroxybutyrate)。4-HB之鹽形式之具體實例包括4-HB鈉及4-HB鉀。因此，術語4-羥基丁酸、4-HB、4-羥基丁酸酯(4-hydroxybutyrate)、4-羥基丁酸酯(4-hydroxybutanoate)、γ-羥基丁酸及GHB以及其他相關技藝認可之名稱在本文中作為同義詞使用。
本文所用術語「單體」在參考4-HB使用時，意指呈非聚合或未衍生化形式之4-HB。聚合4-HB之具體實例包括聚-4-羥基丁酸及例如4-HB與3-HB之共聚物。4-HB之衍生化形式之具體實例係4-HB-CoA。4-HB之其他聚合4-HB形式及其他衍生化形式亦為相關技藝已知。
本文所用術語「γ-丁內酯」意指具有化學式C4H6O2且分子質量為86.089g/mol之內酯。化學化合物γ-丁內酯在相關技藝亦稱為GBL、丁內酯、1,4-內酯、4-丁內酯、4-羥基丁酸內酯及γ-羥基丁酸內酯。該術語當其在本文中使用時，意欲包括該化合物之各種鹽形式中之任一者。
本文所用術語「1,4-丁二醇」意指丁烷之攜帶有兩個羥基之醇衍生物，其具有化學式C4H10O2且分子質量為90.12g/mol。化學化合物1,4-丁二醇在相關技藝亦稱為BDO且係在本文中稱作BDO化合物家族之化合物家族之化學中間體或前體。
本文所用術語「4-羥基丁醛」意指具有化學式C4H8O2且分子質量為88.10512g/mol之醛。化學化合物4-羥基丁醛(4-HBal)在相關技藝亦稱為4-羥基丁醛。
本文所用術語「腐胺」意指具有化學式C4H12N2且分子質量為88.15148g/mol之二胺。化學化合物腐胺在相關技藝亦稱為1,4-丁二 胺、1,4-二胺基丁烷、伸丁基二胺、四亞甲基二胺、四甲基二胺及1,4-伸丁基二胺。
本文所用術語「四氫呋喃」意指對應於芳香族化合物呋喃之完全氫化類似物之雜環有機化合物，其具有化學式C4H8O且分子質量為72.11g/mol。化學化合物四氫呋喃在相關技藝亦稱為THF、四氫呋喃、1,4-環氧丁烷、環氧丁烷、氧化環四亞甲基、氧雜環戊烷、氧化二伸乙基、氧戊環、呋喃啶(furanidine)、氫呋喃、氧化四亞甲基。該術語當其在本文中使用時，意欲包括該化合物之各種鹽形式中之任一者。
本文所用術語「CoA」或「輔酶A」意指有機輔因子或輔基(酶之非蛋白質部分)，其存在為許多酶(去輔基酶)形成活性酶系統所需。輔酶A在某些縮合酶中發揮功能，在乙醯基或其他醯基轉移以及脂肪酸合成及氧化、丙酮酸酯氧化以及其他乙醯基化中起作用。
本文所用術語「實質上厭氧性」在參考培養或生長條件使用時，意指氧量小於液體培養基中飽和溶解氧之約10%。該術語亦意欲包括利用小於約1%氧之氣氛維持之液體或固體培養基的密封室。
本發明之非天然微生物可含有穩定遺傳改變，此係指可培養大於5代而不損失該改變之微生物。通常，穩定遺傳改變包括持續存在大於10代之修飾，特定而言，穩定修飾將持續存在超過約25代，且更特定而言，穩定遺傳修飾將大於50代，包括無限代。
在基因破壞之情況下，尤其有用之穩定遺傳改變係基因缺失。使用基因缺失來引入穩定遺傳改變尤其可用於降低在遺傳改變前表型發生逆轉之可能性。例如，若需要，生物化學物質之穩定生長偶合性產生可藉由(例如)缺失一組代謝修飾內編碼催化一或多個反應之酶之基因來達成。生長偶合產生生物化學物質之穩定性可進一步經由多個顯著降低針對各受破壞活性發生多個補償逆轉之可能性之缺失來增 強。
彼等熟習此項技術者應理解，遺傳改變(包括本文所例示代謝修飾)係參考以下來闡述：適宜來源或宿主生物體(例如大腸桿菌、酵母菌或本文所揭示其他生物體及其相應代謝反應)或期望遺傳材料(例如編碼期望代謝途徑之相應代謝反應之酶之基因)之適宜來源生物體。然而，鑒於已對眾多種生物體進行完全基因組定序且極其熟習基因組學領域，彼等熟習此項技術者應能夠容易地將本文所提供之教示及指導應用於基本上所有其他生物體。例如，可藉由納入來自除參考物種外之物種之相同或類似編碼核酸容易地將本文所例示之大腸桿菌代謝改變應用於其他物種。此等遺傳改變包括(例如)物種同源物之遺傳改變，一般而言且特定而言為直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因替換。
直系同源物係一或多個因垂直傳遞(vertical descent)而相關且在不同生物體中負責實質上相同或一致之功能之基因。例如，可將小鼠環氧化物水解酶及人類環氧化物水解酶視為水解環氧化物之生物功能之直系同源物。當例如基因共有足以指示其同源之量之序列相似性時，其係因垂直傳遞而相關，或其係因自共同祖先進化而相關。若基因共有三維結構但未必共有足以指示其已自共同祖先進化至不可鑑別主要序列相似性之程度之量之序列相似性，則亦可將其視為直系同源物。直系同源基因可編碼具有約25%至100%胺基酸序列一致性之序列相似性之蛋白質。若編碼共有小於25%之胺基酸相似性之蛋白質之基因的三維結構亦顯示相似性，則亦可將其視為係藉由垂直傳遞產生。將絲胺酸蛋白酶家族成員(包括組織纖維蛋白溶酶原活化劑及彈性蛋白酶)視為係因垂直傳遞自共同祖先產生。
直系同源物包括結構或總體活性經由(例如)進化已有差異之基因或其所編碼基因產物。例如，倘若一個物種編碼展現兩種功能之基因 產物且倘若此等功能已在第二個物種中分離成不同基因，則將該三種基因及其相應產物視為直系同源物。對於生物化學產物之產生(包括生長偶合產生)而言，彼等熟習此項技術者應理解，將選擇具有欲引入或破壞之代謝活性之直系同源基因來構築非天然微生物。展現可分離活性之直系同源物之實例係其中不同活性已在兩個或更多個物種之間或在單一物種內分離成不同基因產物。具體實例係彈性蛋白酶蛋白質水解及纖維蛋白溶酶原蛋白質水解分離(兩種類型之絲胺酸蛋白酶活性)分離成作為纖維蛋白溶酶原活化劑及彈性蛋白酶之不同分子。 第二個實例係黴漿菌5’-3’外切核酸酶及果蠅(Drosophila)DNA聚合酶III活性之分離。可將來自第一個物種之DNA聚合酶與來自第二個物種之外切核酸酶或聚合酶中之任一者或二者視為直系同源物，且反之亦然。
相比之下，旁系同源物係藉由(例如)重複、之後進化趨異而相關之同源物且具有相似或共同但不相同之功能。旁系同源物可起源於或源自(例如)相同物種或不同物種。例如，可將微粒體環氧化物水解酶(環氧化物水解酶I)及可溶性環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)視為旁系同源物，此乃因其代表在同一物種中催化不同反應且具有不同功能的兩種共進化自共同祖先之不同酶。旁系同源物係彼此具有顯著序列相似性之來自同一物種之蛋白質，從而表明其同源，或因自共同祖先共進化而相關。旁系同源性蛋白質家族群包括HipA同源物、螢光素酶基因、肽酶及其他。
非直系同源基因替換係來自一個物種之非直系同源基因可取代不同物種中之參考基因功能。取代包括(例如)相較於不同物種中之參考功能能夠在起源物種中實施實質上相同或相似之功能。儘管通常可將非直系同源基因替換鑑別為與編碼參考功能之已知基因在結構上相關，但結構上較不相關但功能相似之基因及其相應基因產物將仍屬於 該術語在本文中使用時之含義內。相較於編碼尋求取代之功能之基因，功能相似性需要(例如)在非直系同源基因產物之活性位點或結合區具有至少一些結構相似性。因此，非直系同源基因包括(例如)旁系同源物或無關基因。
因此，在鑑別及構築具有4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺生物合成能力之本發明之非天然微生物時，彼等熟習此項技術者藉由將本文所提供之教示及指導應用於特定物種應理解，代謝修飾之鑑別可包括直系同源物之鑑別及納入或不活化。若旁系同源物及/或非直系同源基因替換存在於參考微生物中且編碼催化相似或實質上相似之代謝反應之酶，則彼等熟習此項技術者亦可利用該等在進化上相關之基因。相似地，對於基因破壞而言，在進化上相關之基因亦可在宿主微生物中受到破壞或缺失以降低或消除靶向破壞之酶促活性之功能冗餘。
直系同源物、旁系同源物及非直系同源基因替換可藉由彼等熟習此項技術者所熟知之方法測定。例如，對核酸序列或兩條多肽之胺基酸序列之檢查可揭示比較序列之間之序列一致性及相似性。基於此等相似性，熟習此項技術者可測定相似性是否高至足以指示蛋白質因自共同祖先進化而相關。彼等熟習此項技術者所熟知之算法(例如Align、BLAST、Clustal W及其他算法)比較並測定原始序列相似性或一致性，且亦測定序列中可指配權重或評分之空位之存在或顯著性。 此等算法亦為相關技藝已知且同樣可適用於測定核苷酸序列相似性或一致性。確定相關性之足夠相似性之參數係基於計算統計學相似性(或在隨機多肽中找到相似匹配之機率)及所測定匹配之顯著性之熟知方法來計算。若需要，彼等熟習此項技術者亦可對兩個或更多個序列之電腦比較進行視覺最佳化。可預計，相關基因產物或蛋白質具有高度相似性，例如，25%至100%序列一致性。若掃描足夠大小之數據 庫，則無關蛋白質之一致性可基本上等同於預計為偶然發生的機率(約5%)。介於5%與24%之間之序列可代表或可不代表足以斷定所比較序列相關之同源性。考慮到數據集大小，可實施用以測定此等匹配之顯著性之其他統計學分析來確定該等序列之相關性。
用於使用(例如)BLAST算法測定兩個或更多個序列之相關性之實例性參數可如下文所述。簡言之，胺基酸序列比對可使用BLASTP 2.0.8版(1999年1月5日)及以下參數來實施：矩陣：0 BLOSUM62；空位開放：11；空位延伸：1；x_降低：50；預期：10.0；字長：3；過濾器：開。核酸序列比對可使用BLASTN 2.0.6版(1998年9月16日)及以下參數來實施：匹配：1；錯配：-2；空位開放：5；空位延伸：2；x_降低：50；預期：10.0；字長：11；過濾器：關。彼等熟習此項技術者應瞭解，可對上述參數進行修改以例如增加或降低比較嚴格性，並測定兩個或更多個序列之相關性。
特定序列之「保守胺基酸取代」或簡單地「保守變異」係指用基本上一致之胺基酸序列置換一個胺基酸或一系列胺基酸。熟習此項技術者應認識到，改變、添加或缺失所編碼序列中之單一胺基酸或胺基酸百分比之個別取代、缺失或添加導致「保守變異」，其中該等改變導致胺基酸缺失、胺基酸添加或胺基酸經功能相似胺基酸取代。熟習此項技術者亦應認識到，本文所揭示指特定變體之個別取代、缺失或添加(例如甘胺酸殘基34經組胺酸取代(G34H))可包括在與本文所揭示相同之殘基處進行之保守取代，例如代替組胺酸在殘基34處被取代，可取代精胺酸(R)或離胺酸(K)。
提供功能相似胺基酸之保守取代表為相關技藝所熟知。保守胺基酸取代包括一個胺基酸經具有相同類型之功能基團或側鏈極性、大小、形狀或電荷之另一胺基酸(例如，脂肪族、芳香族、帶正電、帶負電、極性、非極性、正極性、負極性、不帶電極性、非極性疏水 性、可電離酸性、可電離鹼性或含有硫殘基)置換。
作為非限制性實例，以下6個群各自含有可為彼此之保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)、組胺酸(H)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；及6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。
因此，本文所揭示多肽序列之保守胺基酸取代可包括諸如小於1%、5%或10%等百分比之多肽序列胺基酸經相同保守取代基團之經保守選擇之胺基酸的取代。另外，本文所揭示多肽序列之保守取代變異可含有經相同保守取代基團之保守取代變異的不超過1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個或100個取代。
亦應理解，不改變核酸分子之所編碼多肽活性之核酸序列的添加或取代(例如非功能或非編碼序列之添加)係核酸序列之保守變異。熟習此項技術者應瞭解，所揭示核酸分子之許多保守變異產生功能相同之多肽。例如，由於遺傳密碼之簡併性，因此沉默取代(即，核酸序列中不會導致所編碼多肽改變之取代)係編碼胺基酸之每一核酸序列之隱含特徵。相似地，胺基酸序列中一或多個胺基酸之保守胺基酸取代可經具有高度相似性質之不同胺基酸取代，亦可容易地鑑別為與所揭示構築體高度相似。各所揭示序列之此等保守變異係本文所揭示多肽之特徵。
特定多肽之非保守修飾係彼等取代未表徵為保守取代之任一胺基酸者。例如，超出上文所述6個群之界限之任一取代。該等包括鹼性或酸性胺基酸取代為中性胺基酸(例如，天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、 天冬醯胺(N)或麩醯胺酸(Q)取代為纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)或甲硫胺酸(M))、芳香族胺基酸取代為鹼性或酸性胺基酸(例如，苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)取代為天冬胺酸(D)、天冬醯胺(N)、麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q))或不用類似胺基酸置換胺基酸之任一其他取代。
本文揭示非天然微生物生物觸媒或微生物，包括具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成途徑之微生物，該途徑包括至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去羧酶，其中該外源性核酸係以足以產生單體4-羥基丁酸(4-HB)之量來表現。4-羥基丁酸去氫酶亦稱作4-羥基丁酸去氫酶或4-HB去氫酶。琥珀醯基-CoA合成酶亦稱作琥珀醯基-CoA合成酶或琥珀醯基-CoA連接酶。
本文亦揭示非天然微生物生物觸媒或微生物，包括具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成途徑之微生物，該途徑具有至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或α-酮戊二酸去羧酶，其中該外源性核酸係以足以產生單體4-羥基丁酸(4-HB)之量來表現。
非天然微生物生物觸媒或微生物可包括採用代謝反應之組合生物合成產生本發明化合物的微生物。生物合成化合物可在細胞內產生及/或分泌至培養基中。由非天然微生物產生之實例性化合物包括(例如)4-羥基丁酸、1,4-丁二醇及γ-丁內酯。
在一個實施例中，非天然微生物經改造以產生4-HB。此化合物係進入1,4-丁二醇化合物家族之可用進入點者。用於自琥珀酸酯、自琥珀酸酯經由琥珀醯基-CoA或自α-酮戊二酸酯形成4-HB之生物化學反應示於圖1之步驟1-8中。
應理解，可使用BDO、4-HB、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺途徑之合適酶之任一組合，只要達成自起始組份轉變為BDO、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺產物即可。因此，應理解，可利用本文所揭示任一代謝途徑，且彼等熟習此項技術者應非常理解，如何選擇合適酶來達成期望途徑，如本文所揭示。
在另一實施例中，本文揭示非天然微生物，包含具有1,4-丁二醇(BDO)途徑之微生物，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶或4-羥基丁醯基-CoA去氫酶(參見實例VII表17)。BDO途徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
彼等熟習此項技術者應理解，可利用該等途徑之各種組合，如本文所揭示。例如，在非天然微生物中，該等核酸可編碼4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶或4-胺基丁酸-CoA連接酶；4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺)或4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶；及4-羥基丁醯基-CoA去氫酶。其他實例性組合具體闡述於下文中且進一步可參見圖8-13。例如，BDO途徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成酶)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
本文另外揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-胺基丁醯基-CoA還原酶、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(參見 實例VII及表18)，且可進一步包含1,4-丁二醇去氫酶。例如，外源性核酸可編碼4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶或4-胺基丁酸-CoA連接酶；4-胺基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)；及4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶。另外，該核酸可編碼4-胺基丁酸CoA轉移酶，4-胺基丁醯基-CoA水解酶或4-胺基丁酸-CoA連接酶；4-胺基丁醯基-CoA還原酶；4-胺基丁-1-醇去氫酶；及4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶。
本文亦揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含4-胺基丁酸激酶、4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁-1-醇轉胺酶、[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺)、[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸轉胺酶、4-羥基丁醯基磷酸酯去氫酶或4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見實例VII及表19)。例如，外源性核酸可編碼4-胺基丁酸激酶；4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)；4-胺基丁-1-醇去氫酶；及4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶。或者，外源性核酸可編碼4-胺基丁酸激酶；[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺)或[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸轉胺酶；4-羥基丁醯基磷酸酯去氫酶；及4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)。
本文另外揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二酮基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)、2,5-二酮基戊酸還原酶、α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二酸基-CoA水解酶、α-酮戊二酸基-CoA連接酶、α-酮戊二酸基-CoA還原酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶、α-酮戊二酸基-CoA還原酶(形成醇)、5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶或5-羥基-2-酮基 戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(參見實例VIII及表20)。BDO途徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。例如，外源性核酸可編碼α-酮戊二酸5-激酶；2,5-二酮基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)；2,5-二酮基戊酸還原酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶。或者，外源性核酸可編碼α-酮戊二酸5-激酶；2,5-二酮基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)；2,5-二酮基戊酸還原酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。或者，外源性核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二酸基-CoA水解酶或α-酮戊二酸基-CoA連接酶；α-酮戊二酸基-CoA還原酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶。在另一實施例中，外源性核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二酸基-CoA水解酶或α-酮戊二酸基-CoA連接酶；α-酮戊二酸基-CoA還原酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶及5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。或者，外源性核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二酸基-CoA水解酶或α-酮戊二酸基-CoA連接酶；α-酮戊二酸基-CoA還原酶(形成醇)；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶。在再一實施例中，外源性核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二酸基-CoA水解酶或α-酮戊二酸基-CoA連接酶；α-酮戊二酸基-CoA還原酶(形成醇)；及5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。
本文進一步揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶、麩胺醯基-CoA連接酶、麩胺酸5-激酶、麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)、麩胺醯基-CoA還原酶、麩胺酸-5-半醛還原酶、麩胺醯基-CoA還原酶(形成醇)、2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)、2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶、5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(參見實例IX及表21)。例如， 外源性核酸可編碼麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶或麩胺醯基-CoA連接酶；麩胺醯基-CoA還原酶；麩胺酸-5-半醛還原酶；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶或5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。或者，外源性核酸可編碼麩胺酸5-激酶；麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)；麩胺酸-5-半醛還原酶；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶或5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。在又一實施例中，外源性核酸可編碼麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶或麩胺醯基-CoA連接酶；麩胺醯基-CoA還原酶(形成醇)；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶或5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。在再一實施例中，外源性核酸可編碼麩胺酸5-激酶；麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶或5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)。
本文亦揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、3-羥基丁醯基-CoA去水酶、乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶或4-羥基丁醯基-CoA去水酶(參見實例X及表22)。例如，外源性核酸可編碼3-羥基丁醯基-CoA去氫酶；3-羥基丁醯基-CoA去水酶；乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶；及4-羥基丁醯基-CoA去水酶。
本文進一步揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含高絲胺酸去胺酶、高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶、高絲胺酸-CoA連接酶、 高絲胺酸-CoA去胺酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶、4-羥基丁-2-烯酸還原酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶(參見實例XI及表23)。例如，外源性核酸可編碼高絲胺酸去胺酶；4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶；4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶。或者，外源性核酸可編碼高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶或高絲胺酸-CoA連接酶；高絲胺酸-CoA去胺酶；及4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶。 在又一實施例中，外源性核酸可編碼高絲胺酸去胺酶；4-羥基丁-2-烯酸還原酶；及4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶或4-羥基丁醯基-CoA連接酶。或者，外源性核酸可編碼高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶或高絲胺酸-CoA連接酶；高絲胺酸-CoA去胺酶；及4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶。
本文進一步揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BOD之量來表現，該BDO途徑包含琥珀醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見表15)。此一BDO途徑可進一步包含琥珀醯基-CoA還原酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯基酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)或1,4-丁二醇去氫酶。
本文另外揭示非天然微生物，包含具有BDO途徑之微生物，該BDO途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含麩胺酸去氫酶、4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁酸轉胺酶、麩胺酸去羧酶、4-羥基 丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見表16)。此一BDO途徑可進一步包含α-酮戊二酸去羧酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯基酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)或1,4-丁二醇去氫酶。
上述途徑僅具有實例性。熟習此項技術者可視需要容易地自彼等本文所揭示之途徑選擇合適途徑來獲得適宜BDO途徑或其他代謝途徑。
本發明提供經遺傳修飾之生物體，其藉由增加產物或減少不合意副產物來允許諸如BDO等期望產物之改良產生。如本文所揭示，本發明提供非天然微生物，包含具有1,4-丁二醇(BDO)途徑之微生物，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現。在一個實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性琥珀醯基-CoA合成酶(參見實例XII)。例如，琥珀醯基-CoA合成酶可由大腸桿菌sucCD基因編碼。
在另一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性α-酮戊二酸去羧酶(參見實例XIII)。例如，α-酮戊二酸去羧酶可由牛分枝桿菌sucA基因編碼。在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性琥珀酸半醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶及視情況4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶(參見實例XIII)。例如，琥珀酸半醛去氫酶(CoA依賴性)、4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶可由牙齦卟啉單胞菌W83基因編碼。在另一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶(參見實例XIII)。例如，丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶可由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)buk1及ptb基因編碼。
在再一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性4-羥基丁醯 基-CoA還原酶(參見實例XIII)。例如，4-羥基丁醯基-CoA還原酶可由拜氏梭菌ald基因編碼。另外，在本發明實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性4-羥基丁醛還原酶(參見實例XIII)。例如，4-羥基丁醛還原酶可由熱葡糖苷酶地芽胞桿菌adh1基因編碼。在另一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性丙酮酸去氫酶次單元(參見實例XIV)。例如，外源性丙酮酸去氫酶可對NADH不敏感。丙酮酸去氫酶次單元可由肺炎克雷伯氏菌lpdA基因編碼。在一特定實施例中，微生物之丙酮酸去氫酶次單元基因可在丙酮酸甲酸裂解酶啟動子之控制下。
在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以破壞編碼好氧性呼吸控制調節系統之基因(參見實例XV)。例如，破壞可針對arcA基因。此一生物體可進一步包含破壞編碼蘋果酸去氫酶之基因。在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性對NADH不敏感之檸檬酸合成酶(參見實例XV)。例如，對NADH不敏感之檸檬酸合成酶可由gltA(例如gltA之R163L突變體)編碼。在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶(參見實例XVI)。例如，磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶可由流感嗜血桿菌磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶基因編碼。
在另一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表現之遺傳修飾(參見實例XXXI)。在增加磷酸烯醇丙酮酸酯表現之實施例中，微生物可相對於不存在遺傳修飾之親本微生物展現乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙胺酸或其組合之產生減少。如本文所揭示，磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)羧化酶之過表現導致較多磷酸烯醇丙酮酸酯轉變成草醯乙酸酯，藉此減少自PEP至丙酮酸酯中且隨後至乙醯基-CoA中之通量(實例XXXI)。減少自PEP至丙酮酸酯及乙醯基- CoA之通量增加至TCA循環及隨後4HB或BDO途徑中之通量。
在再一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含增加α-酮戊二酸去氫酶表現之遺傳修飾(參見實例XXXII)。相對於不存在遺傳修飾之親本微生物，α-酮戊二酸去氫酶之表現增加可導致麩胺酸酯之產生減少。此一微生物相對於不存在遺傳修飾之親本微生物亦可展現乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙胺酸或其組合之產生減少。如本文所揭示，麩胺酸酯之形成可導致碳損失及產率降低。因此，α-酮戊二酸去氫酶之表現增加可減少麩胺酸酯以及其他副產物，例如乙醇、乙酸酯、丙胺酸及/或丙酮酸酯。
在又一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含增加非磷酸轉移酶(PTS)葡萄糖吸收系統表現之遺傳修飾(參見實例XXXIII)。在此一實施例中，遺傳修飾可包含增加通透酶、葡萄糖激酶或葡萄糖促進劑或其組合之表現。另外，此一微生物相對於不存在遺傳修飾之親本微生物可展現乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙胺酸或其組合之產生減少。非PTS蔗糖吸收系統之引入先前已闡述於美國公開案2011/0045575中，其作為一種方式用以在利用蔗糖作為碳源之微生物中減少丙酮酸酯形成。相比之下，利用如本文所述非PTS葡萄糖吸收系統旨在於可用草醯乙酸酯之間提供相較於乙醯基-CoA更佳之平衡(參見實例XXXIII)。
在另一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含增加γ-丁內酯酯酶表現之遺傳修飾(實例XXXIV)。此一微生物相對於不存在遺傳修飾之親本微生物可展現γ-丁內酯之產生減少。如本文所揭示，γ-丁內酯係在糖至1,4-丁二醇發酵期間形成之副產物。γ-丁內酯可自不穩定途徑中間體4-羥基丁醯基-CoA以及4-羥基丁酸酯之自發內酯化形成。如本 文所揭示，γ-丁內酯之表現可加速γ-丁內酯水解成BDO，藉此改良BDO產物產率並消除副產物(參見實例XXXIV)。
在本文所揭示之其他實施例中，遺傳修飾可包括基因破壞或缺失以減少酶之表現。例如，在又一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含減少琥珀醯基-CoA合成酶表現之遺傳修飾(實例XXXV)。在此一實施例中，微生物相對於不存在遺傳修飾之親本微生物可展現4-羥基丁酸酯之產生增加。如本文所述，經過TCA循環之重複輪通量導致碳作為CO2損失。琥珀醯基-CoA合成酶缺失阻斷琥珀醯基-CoA下游之TCA循環，藉此減少CO2損失(參見實例XXXV)。
在又一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含降低醯基輔酶A硫酯酶表現之遺傳修飾(參見實例XXXVI)。在此一實施例中，微生物相對於不存在遺傳修飾之親本微生物可展現γ-丁內酯之產生減少。在再一實施例中，此一微生物可包含至少兩種降低至少兩種醯基輔酶A硫酯酶表現之遺傳修飾。如本文所揭示，BDO途徑中間體4-羥基丁醯基-CoA自發地且以酶促方式環化以形成γ-丁內酯(GBL)。藉由缺失醯基輔酶-A硫酯酶，減少副產物GBL之形成(參見實例XXXVI)。
在另一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含降低醇去氫酶表現之遺傳修飾(參見實例XXXVII)。在此一實施例中，微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物可展現來自4-羥基丁酸酯途徑之下游產物之回流減少。在高效價BDO(來自4-羥基丁酸酯之下游產物)下，高濃度產物可導致途徑內或經由副反應之回流，藉此導致產物產率降低及/或諸如醛等毒性副產物形成增加。如本文所述，發現若干內源性醇去氫酶促成回流，而缺失一或多種內源性醇去氫酶減少回流，但不 會減少4-羥基丁酸酯或BDO之產生，且實際上增加BDO形成(參見實例XXXVII)。
在又一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含降低非產能NADH去氫酶表現之遺傳修飾(參見實例XXXVIII)。非產能NADH去氫酶之表現降低抑制由非產能NADH去氫酶之活性所致NADH庫之消耗。另外，微生物相對於不存在遺傳修飾之親本微生物展現微生物之能量效率增加。如本文所述，電子傳遞鏈具有將質子轉位之能力不同之多種NADH去氫酶及細胞色素氧化酶。一些NADH去氫酶消耗NADH而不將該消耗與質子轉位及能量產生關聯，且將此等NADH去氫酶視為非產能NADH去氫酶。一個實例性非產能NADH去氫酶係大腸桿菌之NADH II(參見實例XXXVIII)。編碼具有非產能NAD(P)H去氫酶活性之酶的其他基因包括wrbA、yieF及kefF。熟習此項技術者將容易地理解，非產能NADH去氫酶之含義為不將NADH氧化與電子傳遞及質子轉位以及ATP形成偶合者。藉由降低非產能NADH去氫酶之表現，抑制細胞內NADH庫之消耗，藉此使細胞更加能量有效及/或允許NADH以期望合成途徑利用。
在又一實施例中，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含降低細胞色素氧化酶表現之遺傳修飾(參見實例XXXIX)。在此一實施例中，微生物相對於不存在遺傳修飾之親本微生物可展現能量效率增加。如本文所揭示，參與電子傳遞鏈之細胞色素氧化酶具有不同的節能效率。藉由降低一或多種細胞色素氧化酶之表現，可增加細胞之能量效率(參見實例XXXIX)。即使在某些條件下未觀察到產物產率增加的情況下(參見實例XXXIX)，此等遺傳修飾仍可有利地提供對一段氧濃度範圍之較大耐受性，特定而言在大型發酵器中更有效地產生產物，其中該發酵 器內之可用氧有所變化。藉由改良微生物之能量效率，生物體可耐受較低氧條件，此乃因降低對來自電子傳遞鏈之能量產生之需要。因此，在本發明之特定實施例中，微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物可展現對一段氧濃度範圍之耐受性增加。
因此，本發明提供具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯之非天然微生物，其中該微生物包含遺傳修飾，該遺傳修飾選自：(A)增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表現之遺傳修飾；(B)增加α-酮戊二酸去氫酶表現之遺傳修飾；(C)增加非磷酸轉移酶(PTS)葡萄糖吸收系統表現之遺傳修飾；(D)增加γ-丁內酯酯酶表現之遺傳修飾；(E)降低琥珀醯基-CoA合成酶表現之遺傳修飾；(F)降低醯基輔酶A硫酯酶表現之遺傳修飾；(G)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾；(H)降低非產能NADH去氫酶表現之遺傳修飾；(I)降低細胞色素氧化酶表現之遺傳修飾；及(J)以下之組合：(A)-(I)項之遺傳修飾中之兩種或更多種，例如，三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種或全部九種。在其他特定實施例中，(K)(A)、(B)或(C)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙胺酸或其組合之產生減少；(L)(B)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，麩胺酸酯之產生減少；(M)(C)項之微生物具有包含通透酶、葡萄糖激酶或葡萄糖促進劑或其組合之表現增加之遺傳修飾；(N)(D)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，γ-丁內酯之產生減少；(O)(E)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，4-羥基丁酸酯之產生增加；(P)(F)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，γ-丁內酯之產生減少；(Q)(F)項之微生物具有包含至少兩種降低至少兩種醯基輔酶A硫酯酶表現之遺傳修飾之遺傳修飾；(R)(G)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，自4-羥基丁酸酯途徑之下游產物之 回流減少；(S)(H)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，NADH庫消耗受到抑制或微生物中之能量效率增加或其組合；(T)(I)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，能量效率增加；或(U)(I)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，一段氧濃度範圍之耐受性增加。在又一實施例中，本發明提供微生物，其中(D)或(F)項之微生物進一步包含4-羥基丁醯基-CoA途徑。本發明進一步提供利用此等微生物產生4-羥基丁酸酯之方法。應理解，此等遺傳修飾包括(但不限於)實例XXIV-XXXIX中所述之具體闡述之基因添加及破壞。應理解，本文所述遺傳修飾可視需要單獨使用或與其他遺傳修飾、尤其彼等本文所揭示者組合使用，以提供產生菌株之合意特性。在基因破壞之情況下，應理解，此等破壞涉及破壞編碼欲降低活性之相應基因產物之內源性基因。
儘管上文剛剛闡述之途徑係關於4-HB途徑，但應理解，如本文所揭示，4-HB係諸如1,4-丁二醇(BDO)等下游產物之前體。此外，如本文所揭示，具有4-HB途徑之微生物可視需要進一步包括將4-HB轉變成諸如BDO等下游產物之酶。另外，即使亦揭示途徑中之其他步驟，本文所述產生4-HB之任一途徑仍應理解為提供4-HB途徑，此乃因此一途徑產生4-HB。因此，本發明提供包含4-HB途徑或BDO途徑之微生物以及使用此一生物體產生4-HB及/或BDO之方法，其中該生物體包含本文所揭示之一或多種遺傳修飾且產生4-HB、4-HB-CoA或BDO。應進一步理解，遺傳修飾可單獨使用或與一或多種遺傳修飾進行各種組合使用，如本文所揭示(參見實例)。另外，應理解，遺傳修飾可產生期望效應，包括(但不限於)增加產物產率、減少副產物、尤其毒性或生長抑制性副產物(例如，醛)產生、改良菌株培養物生長或發酵特性、改良分離或純化期望產物之能力及諸如此類。此外，應理解，下游產物(例如，BDO)之產生增加可指示上游產物(例如，途徑中 間體，例如4HB)之產生增加，其中下游產物之產生增加指示經過上游產物之通量增加。熟習此項技術者可容易地理解，本發明微生物用於產生期望途徑產物或中間體之該等或其他合意特性。因此，使用本文所揭示方法及彼等為相關技藝所熟知者，熟習此項技術者可納入各種代謝修飾，納入合適表現控制元件及/或方法及/或變體酶來提供具有最佳化產生性質之微生物。應進一步理解，此等最佳化產生性質可由彼等熟習此項技術者容易地測定，包括增加或降低特定分子之表現量，包括4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之代謝修飾及/或酶或蛋白質。
本文所用術語「親本微生物」當用於遺傳修飾之背景下時，應理解為意指未進行特定遺傳修飾但以其他方式具有相同遺傳組成之親本生物體或菌株。例如，若使用微生物菌株來達成增加基因產物表現之遺傳修飾，則親本菌株將為其中引入異源基因之起始菌株。相似地，已進行遺傳修飾(例如基因破壞或基因缺失)以降低表現之生物體之親本微生物，親本微生物將具有除基因破壞或缺失外相同之遺傳背景。然而，應理解，親本微生物可相差超過一種遺傳修飾(基因添加及/或破壞)，此取決於考慮單一抑或多種遺傳修飾。熟習此項技術者應容易地理解此一親本微生物之含義，此乃因將該微生物視為用於觀察一或多種遺傳修飾之效應之合適對照，如相關技藝所理解。
另外，彼等熟習此項技術者應理解，遺傳修飾(例如彼等本文所揭示者)可增加產物產率，減少副產物形成及/或改良微生物之特性。此等改良特性包括(但不限於)改良細胞生長、增加能量效率、增加對一段氧濃度範圍之耐受性，尤其在按比例放大之產生過程中(例如在大型發酵器中)顯示時。當與親本微生物比較時，可用遺傳修飾可並不僅僅展現可容易地在給定組之條件下量測之效應。然而，若可用遺傳修飾本身在一組給定條件下及/或與一或多種其他遺傳修飾組合時 有益於微生物之生長及/或產生特性，則該修飾可能有利。
應理解，增加期望酶表現之遺傳修飾通常藉由將編碼期望酶之異源核酸引入微生物中來實施。然而，應理解，如本文所述，增加表現之代謝修飾可包括修飾內源性基因之調節區，例如啟動子及/或增強子。另外，降低期望酶表現之遺傳修飾通常會涉及基因破壞或缺失，但亦可利用對調節之修飾以降低表現，如本文所揭示。
應進一步理解，如本文所揭示諸多遺傳修飾中之任一者可單獨使用或與本文所揭示一或多種遺傳修飾進行各種組合以增加產生BDO之微生物中BDO之產生。在一特定實施例中，微生物可經遺傳修飾以納入增加BDO產生之任何且最多所有遺傳修飾。在一特定實施例中，含有BDO途徑之微生物可經遺傳修飾以表現外源性琥珀醯基-CoA合成酶；以表現外源性α-酮戊二酸去羧酶；以表現外源性琥珀酸半醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶且視情況4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶；以表現外源性丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶；以表現外源性4-羥基丁醯基-CoA還原酶；及以表現外源性4-羥基丁醛還原酶；以表現外源性丙酮酸去氫酶；以破壞編碼好氧性呼吸控制調節系統之基因；以表現外源性對NADH不敏感之檸檬酸合成酶；及表現外源性磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶。此等用於改良產生之菌株闡述於實例XII-XIX中。因此，應理解，除上述修飾以外，此等菌株另外可包括本文所揭示之其他修飾。此等修飾包括(但不限於)內源性乳酸去氫酶(ldhA)、醇去氫酶(adhE)及/或丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)之缺失(參見實例XII-XIX及表28)。可引入微生物中之其他遺傳修飾包括彼等單獨或組合(包括與本文所揭示其他遺傳修飾組合)闡述於實例XXIV-XXXIX中者。
本發明另外提供除上述(A)-(J)之一或多種代謝修飾以外亦視情況進一步包含選自以下之代謝修飾的微生物：(i)增加丙酮酸去氫酶表現 之遺傳修飾；(ii)降低好氧性呼吸控制調節系統表現之遺傳修飾；(iii)增加對NADH不敏感之檸檬酸合成酶表現之遺傳修飾；(iv)降低蘋果酸去氫酶表現之遺傳修飾；(v)降低乳酸去氫酶表現之遺傳修飾；(vi)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾；(vii)降低丙酮酸甲酸裂解酶表現之遺傳修飾；及(viii)(i)-(vii)項之遺傳修飾之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種或全部的組合。
本文闡述代謝修飾之實例性組合。如本文所揭示，任一數目之代謝修飾組合皆可包括在本發明微生物中。對於正下方之表62及63以及圖91中列示之組合而言，使用以下字母表示法：(A)增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表現之遺傳修飾；(B)增加α-酮戊二酸去氫酶表現之遺傳修飾；(C)增加非磷酸轉移酶(PTS)葡萄糖吸收系統表現之遺傳修飾；(D)增加γ-丁內酯酯酶表現之遺傳修飾；(E)降低琥珀醯基-CoA合成酶表現之遺傳修飾；(F)降低醯基輔酶A硫酯酶表現之遺傳修飾；(G)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾(H)降低非產能NADH去氫酶表現之遺傳修飾；(I)降低細胞色素氧化酶表現之遺傳修飾；(J)增加丙酮酸去氫酶表現之遺傳修飾；(K)降低好氧性呼吸控制調節系統表現之遺傳修飾；(L)增加對NADH不敏感之檸檬酸合成酶表現之遺傳修飾；(M)降低蘋果酸去氫酶表現之遺傳修飾；(N)降低乳酸去氫酶表現之遺傳修飾；(O)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾；及(P)降低丙酮酸甲酸裂解酶表現之遺傳修飾。
代謝修飾之實例性組合命名為(例如)A-B，意指，微生物包含代謝修飾A(增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表現之遺傳修飾)及B(增加α-酮戊二酸去氫酶表現之遺傳修飾)。代謝修飾A-I之實例性組合示於表62中。
表62.代謝修飾之實例性組合(以方括號表示).
代謝修飾J-P之實例性組合示於表63中。
應理解，示於表62及63中之各種代謝修飾組合中之任一者皆可彼此組合或與個別代謝修飾A-P組合，以生成其他組合。例如，組合A-B可與P組合以生成組合[A-B-P]；C與J-L-O組合以生成組合[C-J-L-O]；組合A-C-D-E-G與J-K組合以生成組合[A-C-D-E-G-J-K]等等。此等其他組合僅僅具有實例性，且熟習此項技術者可容易地利用熟知方法及本文提供之教示來生成本文所揭示各種期望之代謝修飾組合。表62及62之代謝修飾(代謝修飾A-P)之其他實例性組合示於圖91中。因此，本發明提供微生物包含選自示於表62、表63或圖91中之代謝修飾 組合的代謝修飾。
另外提供一或多個編碼外源性表現酶之基因整合至宿主生物體之fimD基因座中之微生物(參見實例XVII)。例如，一或多個編碼BDO、4-HB、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺途徑酶之基因可整合至用於增加BDO、4-HB、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺產生之fimD基因座中。進一步提供表現增加BDO產生之非磷酸轉移酶蔗糖吸收系統之微生物。
儘管本文所揭示經遺傳修飾之微生物例示為含有特定BDO、4-HB、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺途徑酶之微生物，但應理解，此等修飾可納入具有BDO、4-HB、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺途徑之任一微生物中，該途徑適於增強本文所揭示任何途徑在該等遺傳修飾存在下之產生。因此，本發明微生物可具有本文所揭示BDO、4-HB、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺途徑中之任一者(例如，參見圖1、8-13、58、62及63)。例如，若所描繪途徑顯示BDO途徑，而4-羥基丁酸酯係BDO途徑之中間體，則應理解，如本文所揭示，若需要，亦提供達成4-羥基丁酸酯之途徑。因此，本文所述途徑可產生所描繪途徑之最終產物或所描繪途徑之期望中間體，如本文所述。
在本發明實施例中，提供包含達成期望產物(例如BDO、4-HB、4-HBal、4-HBCoA及/或腐胺)之代謝修飾及途徑之微生物。本文揭示實例性途徑且其包括繪示於圖1、8-13、58、62及63中之途徑。在一個實施例中，該微生物包含4-羥基丁酸(4-HB)及/或1,4-丁二醇(1,4-BDO)生物合成途徑，該生物合成途徑包含α-酮戊二酸去羧酶或α-酮戊二酸去氫酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶；4-羥基丁醯基-CoA：乙醯基-CoA轉移酶或丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶；醛去氫酶；及醇去氫酶。
在另一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含α-酮戊二酸去羧酶或α-酮戊二酸去氫酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶；4-羥基丁醯基-CoA轉移酶或4-羥基丁酸激酶及磷酸轉-4-羥基丁醯基酶；4-羥基丁醯基-CoA還原酶；及4-羥基丁醛還原酶或醛/醇去氫酶。在又一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含α-酮戊二酸去羧酶或琥珀醯基-CoA合成酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；4-羥基丁酸去氫酶；4-羥基丁醯基-CoA轉移酶或4-羥基丁酸激酶及磷酸轉-4-羥基丁醯基酶；及醛去氫酶；及醇去氫酶或醛/醇去氫酶。在另一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去氫酶及麩胺酸去羧酶及去胺4-胺基丁酸氧化還原酶或4-胺基丁酸轉胺酶或α-酮戊二酸去氫酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸激酶及磷酸轉-4-羥基丁醯基酶及4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛還原酶或4-羥基丁酸激酶及磷酸化4-羥基丁醛去氫酶及4-羥基丁醛還原酶、或4-羥基丁酸激酶及磷酸轉-4-羥基丁醯基酶及形成醇之4-羥基丁醯基-CoA還原酶或4-羥基丁醯基-CoA轉移酶或4-羥基丁醯基-CoA水解酶或4-羥基丁醯基-CoA連接酶及4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛還原酶或4-羥基丁醯基-CoA轉移酶或4-羥基丁醯基-CoA水解酶或4-羥基丁醯基-CoA連接酶及形成醇之4-羥基丁醯基-CoA還原酶。在再一實施例中，微生物可包含BDO途徑，該途徑包含麩胺酸CoA轉移酶或麩胺醯基-CoA水解酶或麩胺醯基-CoA連接酶及麩胺醯基-CoA還原酶及麩胺酸-5-半醛還原酶或麩胺酸CoA轉移酶或麩胺醯基-CoA水解酶或麩胺醯基-CoA連接酶及形成醇之麩胺醯基-CoA還原酶或麩胺酸5-激酶及磷酸化麩胺酸-5-半醛去氫酶及麩胺酸-5-半醛還原酶；去胺2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2- 酮基戊酸去羧酶及4-羥基丁醛還原酶或去羧5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶及4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛還原酶；或去羧5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶及形成醇之4-羥基丁醯基-CoA還原酶。
在本發明之又一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含3-羥基丁醯基-CoA去氫酶；3-羥基丁醯基-CoA去水酶；乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶；4-羥基丁醯基-CoA去水酶；及4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)；或4-羥基丁醯基-CoA還原酶及1,4-丁二醇去氫酶。
在本發明之再一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含麩胺酸CoA轉移酶；麩胺醯基-CoA水解酶；麩胺醯基-CoA連接酶；麩胺酸5-激酶；麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化；麩胺醯基-CoA還原酶；麩胺酸-5-半醛還原酶；麩胺醯基-CoA還原酶(形成醇)；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)；2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)；及視情況4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。在另一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含麩胺酸CoA轉移酶；麩胺醯基-CoA水解酶；麩胺醯基-CoA連接酶；麩胺酸5-激酶；麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)；麩胺醯基-CoA還原酶；麩胺酸-5-半醛還原酶；麩胺醯基-CoA還原酶(形成醇)；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)；2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)；及視情況4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
在本發明之另一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含麩胺酸去氫酶；麩胺酸去羧酶；4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺)；及4-羥基丁酸去氫酶；且進一步包含(a)4-羥基丁酸激酶；磷 酸轉-4-羥基丁醯基酶；4-羥基丁醯基-CoA還原酶；及1,4-丁二醇去氫酶；(b)4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶，或4-羥基丁醯基-CoA連接酶；4-羥基丁醯基-CoA還原酶；及1,4-丁二醇去氫酶；(c)4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶或4-羥基丁醯基-CoA連接酶；及4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)；(d)4-羥基丁酸激酶；4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)；或(e)4-羥基丁酸激酶；磷酸轉-4-羥基丁醯基酶；及4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)。在又一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去氫酶及麩胺酸去羧酶及4-胺基丁酸轉胺酶；及4-羥基丁酸去氫酶；且進一步包含(a)4-羥基丁醯基-CoA連接酶；4-羥基丁醯基-CoA還原酶；及1,4-丁二醇去氫酶；(b)4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶或4-羥基丁醯基-CoA連接酶；及4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)；(c)4-羥基丁酸激酶；4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)；及1,4-丁二醇去氫酶；或(d)4-羥基丁酸激酶；磷酸轉-4-羥基丁醯基酶；及4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)。在再一實施例中，微生物可包含4-HB及/或BDO途徑，該途徑包含α-酮戊二酸去氫酶；CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；及4-羥基丁酸去氫酶；且進一步包含(a)4-羥基丁醯基-CoA連接酶；4-羥基丁醯基-CoA還原酶；及1,4-丁二醇去氫酶；(b)4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶或4-羥基丁醯基-CoA連接酶；及4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)；(c)4-羥基丁酸激酶；4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)；及1,4-丁二醇去氫酶；或(d)4-羥基丁酸激酶；磷酸轉-4-羥基丁醯基酶；及4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)。
在又一實施例中，微生物可包含4-HB及/或4-羥基丁醛及/或BDO途徑，該途徑包含琥珀醯基-CoA還原酶(形成醛)；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶，在本文中亦稱作羧酸還原酶。在另一實施 例中，微生物可包含4-HB及/或4-羥基丁醛及/或BDO途徑，該途徑包含α-酮戊二酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶，在本文中亦稱作羧酸還原酶。
在另一實施例中，BDO途徑可包含4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、4-丁酸激酶、磷酸轉丁醯基酶、α-酮戊二酸去羧酶、醛去氫酶、醇去氫酶或醛/醇去氫酶(參見圖1)。或者，BDO途徑可包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶或4-羥基丁醯基-CoA去氫酶(參見表17)。此一BDO途徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
另外，BDO途徑可包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-胺基丁醯基-CoA還原酶、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(參見表18)。此外，BDO途徑可包含4-胺基丁酸激酶、4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁-1-醇轉胺酶、[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺)、[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸轉胺酶、4-羥基丁醯基磷酸酯去氫酶或4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見表19)。此一途徑可進一步包含1,4-丁二醇去氫酶。
BDO途徑亦可包含α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二酮基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)、2,5-二酮基戊酸還原酶、α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二酸基-CoA水解酶、α-酮戊二酸基-CoA連接酶、α-酮戊二酸基-CoA還原酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶、α-酮戊二酸基-CoA還原酶(形成醇)、5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶或5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧 基)(去羧基)(參見表20)。此一BDO途徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。另外，BDO途徑可包含麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶、麩胺醯基-CoA連接酶、麩胺酸5-激酶、麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)、麩胺醯基-CoA還原酶、麩胺酸-5-半醛還原酶、麩胺醯基-CoA還原酶(形成醇)、2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)、2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶、5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(參見表21)。此一BDO途徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
另外，BDO途徑可包含3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、3-羥基丁醯基-CoA去水酶、乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶或4-羥基丁醯基-CoA去水酶(參見表22)。此外，BDO途徑可包含高絲胺酸去胺酶、高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶、高絲胺酸-CoA連接酶、高絲胺酸-CoA去胺酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶、4-羥基丁-2-烯酸還原酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶(參見表23)。此一BDO途徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
BDO途徑另外可包含琥珀醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶或4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見表15)。此一途徑可進一步包含琥珀醯基-CoA還原酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯基酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)或1,4-丁二醇去氫酶。此外，BDO途徑可包含麩胺酸 去氫酶、4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁酸轉胺酶、麩胺酸去羧酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶或4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見表16)。此一BDO途徑可進一步包含α-酮戊二酸去羧酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯基酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)或1,4-丁二醇去氫酶。
本發明另外提供包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含琥珀醯基-CoA還原酶(形成醛)；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶(參見圖58，步驟A-C-D)。本發明亦提供包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含α-酮戊二酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶(圖58，步驟B-C-D)。
本發明進一步提供包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含琥珀酸還原酶；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶(參見圖62，步驟F-C-D)。在再一實施例中，本發明提供包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去氫酶或麩胺酸轉胺酶及麩胺酸去羧酶及4-胺基丁酸去氫酶或4-胺基丁酸轉胺酶；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶(參見圖62，步驟B或((J或K)-L-(M或N))-C-D)。
本發明亦提供包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物，該途徑包含 至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶(參見圖62，步驟X-Y-Z)。在再一實施例中，本發明提供包含4-羥基丁醯基-CoA途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醯基-CoA途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醯基-CoA之量來表現，該4-羥基丁醯基-CoA途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(參見圖62，步驟X-Y-AA)。
本發明另外提供包含腐胺途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含琥珀酸還原酶；4-胺基丁酸去氫酶或4-胺基丁酸轉胺酶；4-胺基丁酸還原酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟F-M/N-C-D/E)。在又一實施例中，本發明提供包含腐胺途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含α-酮戊二酸去羧酶；4-胺基丁酸去氫酶或4-胺基丁酸轉胺酶；4-胺基丁酸還原酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟B-M/N-C-D/E)。本發明另外提供包含腐胺途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含麩胺酸去氫酶或麩胺酸轉胺酶；麩胺酸去羧酶；4-胺基丁酸還原酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟J/K-L-C-D/E)。
本發明在另一實施例中提供包含腐胺途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-胺基- 2-酮基戊酸去氫酶或5-胺基-2-酮基戊酸轉胺酶；5-胺基-2-酮基戊酸去羧酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟O-P/Q-R-D/E)。亦提供包含腐胺途徑之非天然微生物，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-胺基-2-酮基戊酸去氫酶或5-胺基-2-酮基戊酸轉胺酶；鳥胺酸去氫酶或鳥胺酸轉胺酶；及鳥胺酸去羧酶(參見圖63，步驟O-P/Q-S/T-U)。
在另一實施例中，本發明提供具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之非天然微生物，其中該非天然微生物包含至少一種編碼轉變本文所揭示任一途徑之受質之酶或蛋白質的外源性核酸(例如，參見實例及圖1、8-13、58、62及63)。在用於產生BDO之實例性實施例中，微生物可將受質轉變成產物，該轉變選自由以下組成之群：琥珀酸酯轉變成琥珀醯基-CoA；琥珀醯基-CoA轉變成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛轉變成4-羥基丁酸酯；4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基磷酸酯；4-羥基丁醯基磷酸酯轉變成4-羥基丁醯基-CoA；4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛；及4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。在用於產生4-HBal之途徑中，微生物可(例如)將琥珀酸酯轉變成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛轉變成4-羥基丁酸酯；及4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醛。此一生物體另外可包括將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇以產生BDO之活性。用於產生4-HBal之又一途徑可為(例如)α-酮戊二酸酯至琥珀酸半醛；琥珀酸半醛至4-羥基丁酸酯；及4-羥基丁酸酯至4-羥基丁醛。用於產生4-HBal之替代途徑可為(例如)α-酮戊二酸酯至2,5-二酮基戊酸；2,5-二酮基戊酸至5-羥基-2-酮基戊酸；及5-羥基-2-酮基戊酸至4-羥基丁醛。實例性4-羥基丁醯基-CoA途徑可為(例如)α-酮戊二酸酯至2,5-二酮基戊酸；2,5-二酮基戊酸至5-羥基-2-酮基戊酸；及5-羥基-2-酮基戊酸至4-羥基丁醯基-CoA。實例性腐胺途徑可為(例如) 琥珀酸酯至琥珀醯基-CoA；琥珀醯基-CoA至琥珀酸半醛；琥珀酸半醛至4-胺基丁酸酯；4-胺基丁酸酯至4-胺基丁醛；及4-胺基丁醛至腐胺。替代腐胺途徑可為(例如)琥珀酸酯至琥珀酸半醛；琥珀酸半醛至4-胺基丁酸酯；4-胺基丁酸酯至4-胺基丁醛；及4-胺基丁醛至腐胺。熟習此項技術者應理解，該等僅僅具有實例性且本文所揭示適於產生期望產物且合適活性可用於轉變之任一受質-產物對可容易地由熟習此項技術者基於本文中之教示測定。因此，本發明提供含有至少一種編碼酶或蛋白質之外源性核酸的非天然微生物，其中該酶或蛋白質轉變途徑之受質及產物(參見圖1、8-13、58、62及63)。
儘管本文通常闡述為含有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之微生物，但應理解，本發明另外提供包含至少一種編碼4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑酶或蛋白質之外源性核酸的非天然微生物，該外源性核酸以足以產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體之量來表現。例如，如本文所揭示，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及腐胺途徑例示於圖1、8-13、58、62及63中。因此，除含有(例如)產生BDO之BDO途徑之微生物以外，本發明另外提供包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸的非天然微生物，其中該微生物產生BDO途徑中間體作為該途徑之產物而非中間體。例如，在如圖62中所示之一個實例性實施例中，本發明提供產生琥珀醯基-CoA、琥珀酸半醛、4-羥基丁酸酯、4-羥基丁醯基磷酸酯、4-羥基丁醯基-CoA或4-羥基丁醛作為產物而非中間體之微生物。另一實例性實施例包括(例如)產生α-酮戊二酸酯、2,5-二酮基戊酸、5-羥基-2-酮基戊酸或4-羥基丁醛作為產物而非中間體之微生物。腐胺途徑中之實例性實施例包括(例如)產生麩胺酸酯、4-胺基丁酸酯或4-胺基丁醛作為產物而非中間體之微生物。腐胺途徑中之替代實施例可為(例如)產生2,5-二酮基戊酸酯、5-胺基-2-酮基戊酸酯或鳥胺酸 作為產物而非中間體之微生物。
應理解，可視需要利用本文所揭示、如實例中所述及圖中所例示之任何途徑(包括圖1、8-13、58、62及63之途徑)來生成產生任一途徑中間體或產物之非天然微生物。如本文所揭示，產生中間體之此一微生物可與表現下游途徑酶之另一微生物組合使用以產生期望產物。然而，應理解，可利用產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體之非天然微生物來產生中間體作為期望產物。
本發明係一般地參考代謝反應、其反應物或產物，或特定地參考一或多個編碼與所參考代謝反應、反應物或產物相關或催化所參考代謝反應、反應物或產物之酶的核酸或基因來闡述。除非本文另有明確說明，否則彼等熟習此項技術者應理解，對反應之參考亦構成對反應之反應物及產物之參考。相似地，除非本文另有明確說明，否則對反應物或產物之參考亦參考反應且對該等代謝組份中任一者之參考亦參考一或多個編碼催化所參考反應、反應物或產物之酶之基因。同樣，考慮到代謝生物化學、酶學及基因組學之熟知領域，本文對基因或編碼核酸之參考亦構成對相應所編碼酶及其催化之反應以及該反應之反應物及產物之參考。
如本文所揭示，產物4-羥基丁酸酯以及其他中間體係羧酸，其可以各種電離形式(包括完全質子化、部分質子化及完全去質子化形式)出現。因此，後綴「-酸酯」或酸形式可互換用於闡述游離酸形式以及任一去質子化形式二者，尤其由於已知離子化形式取決於發現該化合物之pH。應理解，羧酸酯產物或中間體包括羧酸酯產物或途徑中間體之酯形式，例如O-羧酸酯及S-羧酸酯。O-及S-羧酸酯可包括低碳烷基(亦即C1至C6)、具支鏈或直鏈羧酸酯。一些此等O-或S-羧酸酯包括(但不限於)O-或S-羧酸甲酯、O-或S-羧酸乙酯、O-或S-羧酸正丙酯、O-或S-羧酸正丁酯、O-或S-羧酸異丙酯、O-或S-羧酸第二丁基酯 及第三丁基酯、O-或S-羧酸戊酯、O-或S-羧酸己酯，該等酯中之任一者皆可進一步具有不飽和性，以提供(例如)O-或S-羧酸丙烯酯、O-或S-羧酸丁烯酯、O-或S-羧酸戊烯酯及O-或S-羧酸己烯酯。O-羧酸酯可為生物合成途徑產物。經由生物合成途徑獲取之實例性O-羧酸酯可包括(但不限於)4-羥基丁酸甲酯、4-羥基丁酸乙酯及4-羥基丁酸正丙酯。其他以生物合成方式獲取之O-羧酸酯可包括源自諸如以下等脂肪醇之中鏈至長鏈基團(亦即C7-C22)之O-羧酸酯：庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、月桂醇、十三醇、肉桂醇、十五醇、鯨蠟醇、棕櫚醇、十七醇、硬脂醇、十九醇、二十醇、二十一醇及山崳醇，該等酯中之任一者皆可視情況具支鏈及/或含有不飽和性。O-羧酸酯亦可經由生物化學或化學過程(例如游離羧酸產物之酯化或O-或S-羧酸酯之轉酯化)獲取。S-羧酸酯例示為CoA S-酯、半胱胺酸S-酯、烷基硫酯以及各種芳基及雜芳基硫酯。
使用本發明微生物經由生物合成模式產生4-HB尤其有用，此乃因其可產生單體4-HB。本發明之非天然微生物及其對4-HB及BDO家族化合物之生物合成亦尤其有用，此乃因4-HB產物可(1)被分泌；(2)可沒有諸如輔酶A等任何衍生形式；(3)避免生物合成期間之熱力學變化；(4)允許BDO之直接生物合成，及(5)允許在酸性pH介質中4-HB至γ-丁內酯(GBL)之自發化學轉變。例如，此後一特性亦尤其可用於諸如1,4-丁二醇及/或四氫呋喃(THF)等BDO家族化合物之有效化學合成或生物合成。
微生物通常缺乏合成4-HB及因此本文所揭示在1,4-丁二醇化合物家族內或彼等熟習此項技術者已知在1,4-丁二醇化合物家族內之任一化合物的能力。此外，已知具有所有必需之代謝酶促能力之生物體不會自所述酶及本文所例示生物化學途徑產生4-HB。而是，除了可能例外的幾種下文進一步闡述之厭氧性微生物，具有酶促能力之微生物 皆使用4-HB作為受質來產生(例如)琥珀酸酯。相比之下，本發明之非天然微生物可生成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺作為產物。如上文所述，以單體形式生物合成4-HB不僅尤其可用於化學合成BDO化合物家族，且其亦允許進一步生物合成BDO化合物家族並完全避免化學合成程序。
可產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺之本發明之非天然微生物係藉由確保宿主微生物包括完全生物化學合成本發明之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺生物合成途徑中之至少一者之功能能力來產生。確保至少一種必需之4-HB、4-HBal、4-HBCoA或BDO生物合成途徑使宿主微生物具有4-HB生物合成能力。
若干4-HB生物合成途徑例示於本文中且出於圖解說明之目的示於圖1中。其他4-HB及BDO途徑闡述於圖8-13中。一種4-HB生物合成途徑包括自琥珀酸酯生物合成4-HB(琥珀酸酯途徑)。參與此4-HB途徑之酶包括非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶。在此途徑中，非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶催化逆向示於圖1中之箭頭之反應。另一4-HB生物合成途徑包括經由琥珀醯基-CoA自琥珀酸酯之生物合成(琥珀醯基-CoA途徑)。參與此4-HB途徑之酶包括琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶。三種其他4-HB生物合成途徑包括自α-酮戊二酸酯生物合成4-HB(α-酮戊二酸酯途徑)。因此，第三種4-HB生物合成途徑係經由麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶及4-羥基丁酸去氫酶生物合成琥珀酸半醛。第四種4-HB生物合成途徑亦包括自α-酮戊二酸酯生物合成4-HB，但利用α-酮戊二酸去羧酶來催化琥珀酸半醛合成。4-羥基丁酸去氫酶催化琥珀酸半醛轉變成4-HB。第五種4-HB生物合成途徑包括經由琥珀醯基-CoA自α-酮戊二酸酯之生物合成且利用α-酮戊二酸去氫酶來產生琥珀醯基-CoA，該琥珀醯基-CoA流入上述琥珀醯基-CoA途徑 中。該等4-HB生物合成途徑、其受質、反應物及產物中之每一者進一步闡述於下文實例中。如本文所述，可藉由納入用以產生BDO之合適酶將4-HB進一步以生物合成方式轉變成BDO(參見實例)。因此，應理解，4-HB途徑可與用於將4-HB轉變成BDO之酶一起使用以生成BDO途徑。
本發明之非天然微生物可藉由引入編碼一或多種參與一或多種4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑之酶的可表現核酸來產生。端視選擇用於生物合成之宿主微生物而定，可表現用於一些或全部特定4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑之核酸。例如，若所選宿主缺乏期望生物合成途徑(例如，琥珀酸酯至4-HB途徑)中之一或多種酶，則將可表現缺乏該等酶(例如，此實例中之非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶與4-羥基丁酸去氫酶二者)之核酸引入宿主中，用於隨後外源性表現。或者，若所選宿主展現內源性表現一些途徑酶，但缺乏其他酶，則需要編碼該等缺乏酶之核酸，以達成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生物合成。例如，若所選宿主展現內源性非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶，但缺乏4-羥基丁酸去氫酶，則需要編碼此酶之核酸，以達成4-HB之生物合成。因此，本發明之非天然微生物可藉由引入外源性酶或蛋白質活性來產生，以獲得期望生物合成途徑，或所期望生物合成途徑可藉由引入一或多種外源性酶或蛋白質活性來產生，該生物合成途徑與一或多種內源性酶或蛋白質一起產生期望產物，例如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺。
依同樣方式，若4-HB生物合成經選擇經由琥珀酸酯至琥珀醯基-CoA途徑(琥珀醯基-CoA途徑)發生，則使針對宿主所缺乏琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及/或4-羥基丁酸去氫酶之編碼核酸在受體宿主中外源性表現。選擇經由α-酮戊二酸酯至琥珀酸 半醛途徑(α-酮戊二酸酯途徑)生物合成4-HB時，可利用缺乏一或多種麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶及/或4-羥基丁酸去氫酶或α-酮戊二酸去羧酶及4-羥基丁酸去氫酶之宿主的外源性表現。熟習此項技術者很容易即可決定用於產生4-HB或BDO之途徑酶，如本文所揭示。
端視所選宿主微生物之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑組份而定，本發明之非天然微生物將包括至少一種外源性表現之4-HB、4-HB、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑編碼核酸及一或多種4-HB或BDO生物合成途徑之最多全部編碼核酸。例如，可經由相應編碼核酸之外源性表現在缺乏途徑酶或蛋白質之宿主中建立4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成。在缺乏4-HB、4-HB、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之全部酶或蛋白質之宿主中，可包括該途徑中全部酶或蛋白質之外源性表現，但應理解，即使宿主含有至少一種途徑酶或蛋白質，仍可表現途徑之全部酶或蛋白質。若需要，可包括用於產生4-HB、4-HB、4-HBCoA、BDO或腐胺之途徑中全部酶或蛋白質之外源性表現。例如，可在缺乏4-羥基丁酸去氫酶之宿主中經由4-羥基丁酸去氫酶編碼核酸之外源性表現自全部五種途徑建立4-HB生物合成。相比之下，可在缺乏全部八種酶之宿主中經由全部八種非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶、α-酮戊二酸去羧酶、α-酮戊二酸去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶之外源性表現自全部五種途徑建立4-HB生物合成。
鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，以可表現形式引入之編碼核酸數至少應與所選擇宿主微生物之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑缺乏相應。因此，本發明之非天然微生物可具有一種、兩種、三種、四種、六種、七種、八種 或最多全部編碼本文所揭示酶之核酸，該等酶構成一或多種4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑。在一些實施例中，非天然微生物亦可包括促進或最佳化4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成或使宿主微生物具有有用功能的其他遺傳修飾。一種此類其他功能可包括(例如)增進諸如以下等4-HB途徑前體中一或多者之合成：琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸酯、4-胺基丁酸酯、麩胺酸酯、乙醯乙醯基-CoA及/或高絲胺酸。
通常，宿主微生物經選擇以使其產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之前體，作為天然產生之分子或作為經改造產物，以從頭產生期望前體或增加由宿主微生物天然產生之前體之產生。例如，在諸如大腸桿菌等宿主生物體中天然產生琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸酯、4-胺基丁酸酯、麩胺酸酯、乙醯乙醯基-CoA及高絲胺酸。宿主生物體可經改造以增加前體之產生，如本文所揭示。另外，已經改造以產生期望前體之微生物可用作宿主生物體並經進一步改造以表現4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之酶或蛋白質。
在一些實施例中，自含有合成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之酶促能力之宿主生成本發明之非天然微生物。在此具體實施例中，其可用於增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑產物之合成或累積以(例如)驅動4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑反應向4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生進行。可藉由(例如)編碼本文所揭示4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑酶中一或多者之核酸之過表現來增加合成或累積。4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑酶或酶之過表現可(例如)經由一或多種內源性基因之外源性表現或經由一或多種異源基因之外源性表現發生。因此，天然生物體可經由一種、兩種、三種、四種、五種、六種等等至 最多全部編碼4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑酶之核酸之過表現容易地生成為產生非天然4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之本發明微生物。另外，非天然生物體可藉由導致4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑中之酶活性增加之內源性基因的誘變生成。
在尤其有用之實施例中，採用編碼核酸之外源性表現。外源性表現賦予宿主及應用定製錶現及/或調節元件之能力，以達成由使用者控制之期望表現量。然而，亦可藉由(例如)去除負調節效應子或當連接至誘導型啟動子或另一調節元件時誘導基因之啟動子，在其他實施例中利用內源性表現。因此，具有天然誘導型啟動子之內源性基因可藉由提供合適的誘導劑來上調，或內源性基因之調節區可經改造以納入誘導型調節元件，藉此允許在期望時間調節內源性基因之增加表現。相似地，可包括誘導型啟動子作為引入非天然微生物中之外源性基因之調節元件(參見實例)。
本文所用「外源」意指將參考分子或參考活性引入宿主微生物中。例如，可藉由將編碼核酸引入宿主遺傳材料中來引入分子，例如藉由整合至宿主染色體中或作為非染色體遺傳材料(例如質粒)。因此，在參考編碼核酸之表現使用該術語時，其係指以可表現形式將編碼核酸引入微生物中。在參考生物合成活性使用該術語時，其係指引入宿主參考生物體中之活性。來源可為(例如)在引入宿主微生物中後可表現參考活性之同源或異源編碼核酸。因此，術語「內源」係指在宿主中存在之參考分子或活性。相似地，在參考編碼核酸之表現使用時，該術語係指微生物內所含編碼核酸之表現。術語「異源」係指源自除所參考物種外之來源的分子或活性，而「同源」係指源自宿主微生物之分子或活性。因此，本發明編碼核酸之外源表現可利用異源或同源編碼核酸中之任一者或二者。
應理解，當微生物中包括一個以上外源性核酸時，該一個以上外源性核酸係指所參考編碼核酸或生物合成活性，如上文所論述。應進一步理解，如本文所揭示，此一個以上外源性核酸可以單獨核酸分子、以多順反子核酸分子或其組合引入宿主微生物中，且仍視為一個以上外源性核酸。例如，如本文所揭示微生物可經改造以表現兩個或更多個編碼期望途徑酶或蛋白質之外源性核酸。在將兩個編碼期望活性之外源性核酸引入宿主微生物中之情況下，應理解，該兩個外源性核酸可作為單一核酸(例如，以單一質粒，以單獨質粒)引入，可於單一位點或多個位點整合至宿主染色體中，且仍視為兩個外源性核酸。相似地，應理解，兩個以上外源性核酸可以任一期望組合(例如，以單一質粒，以單獨質粒)引入宿主生物體中，可於單一位點或多個位點整合至宿主染色體中，且仍視為兩個或更多個外源性核酸，例如三個外源性核酸。因此，所參考外源性核酸或生物合成活性之數量係指編碼核酸之數量或生物合成活性之數量，而非引入宿主生物體中之單獨核酸之數量。
本文所用術語「基因破壞」或其語法等效內容意指使所編碼基因產物無活性或衰減之遺傳改變。遺傳改變可為(例如)整個基因之缺失、轉錄或轉譯所需調節序列之缺失、一部分導致截短基因產物之基因之缺失或使所編碼基因產物不活化之各種突變策略中之任一者。一種尤其有用之基因破壞方法係完全基因缺失，此乃因其減少或消除了本發明非天然微生物中遺傳回復之發生。基因破壞亦包括無效突變，其係指基因或含有基因之區內導致該基因未轉錄成RNA及/或轉譯成功能基因產物的突變。此一無效突變可起因於許多類型之突變，包括(例如)不活化點突變、一部分基因之缺失、整個基因之缺失或染色體區段之缺失。
本文所用術語「衰減」或其語法等效內容意指減弱、降低或減 小酶或蛋白質之活性或量。若衰減引起活性或量下降至低於給定途徑發揮功能所需之臨界水準，則酶或蛋白質活性或量之衰減可模擬完全破壞。然而，模擬一種途徑之完全破壞之酶或蛋白質之活性或量的衰減仍可足以使單獨途徑持續發揮功能。例如，內源性酶或蛋白質之衰減可足以模擬用於產生本發明4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之相同酶或蛋白質之完全破壞，但酶或蛋白質之殘留活性或量仍可足以維持其他途徑，例如對於宿主微生物存活、繁殖或生長至關重要之途徑。酶或蛋白質之衰減亦可以足以增加本發明4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產率之量減弱、降低或減小酶或蛋白質之活性或量，但未必模擬酶或蛋白質之完全破壞。
本文所用術語「生長偶合」在參考生物化學產物之產生使用時，意指所參考生物化學產物之生物合成係在微生物生長階段期間產生。在一特定實施例中，生長偶合產生可視情況為專性的，意指所參考生物化學之生物合成係在微生物生長階段期間產生之專性產物。
4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑酶之編碼核酸之來源可包括(例如)所編碼基因產物能夠催化所參考反應之任何物種。此等物種包括原核與真核生物體二者，包括(但不限於)細菌，包括古菌及真細菌；及真核生物，包括酵母菌、植物、昆蟲、動物及哺乳動物，包括人類。此等來源之實例性物種包括(例如)大腸桿菌、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、克氏酵母菌(Saccharomyces kluyveri)、克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、難辨梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、假破傷風梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、胺基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、史迪克蘭梭菌(Clostridium sticklandii)、富養產鹼菌(Ralstonia eutropha)、牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、牙齦卟啉單胞菌、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、假單胞菌(Pseudomonas species)(包括繡色假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens))、智人(Homo sapiens)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、類球紅桿菌(Rhodobacter spaeroides)、布氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brockii)、瑟杜生金屬球菌(Metallosphaera sedula)、腸膜樣明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜熱光合綠麴菌(Chloroflexus aurantiacus)、凱斯特玫瑰彎菌(Roseiflexus castenholzii)、赤桿菌屬(Erythrobacter)、蠟黃楊(Simmondsia chinensis)、不動桿菌(Acinetobacter species)(包括乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)及貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi))、牙齦卟啉單胞菌、托克達硫化葉菌(Sulfolobus tokodaii)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、仙人掌芽胞桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、短芽胞桿菌(Bacillus brevis)、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、奧克西托克雷白桿菌(Klebsiella oxytoca)、纖細裸藻(Euglena gracilis)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、熱乙酸爾氏菌(Moorella thermoacetica)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、嗜鹽桿菌(Halobacterium salinarum)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)、野豬(Sus scrofa)、秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans)、麩胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、發酵胺基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、假絲酵母菌屬(Candida)、土麯黴(Aspergillus terreus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurians)、乳酸克氏酵母菌(Kluyveromyces lactis)、巴克氏真細菌(Eubacterium barkeri)、多毛擬桿菌(Bacteroides capillosus)、科氏厭氧軀幹菌(Anaerotruncus colihominis)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus)、空腸曲桿菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血桿菌、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus)、黃色黏球菌(Myxococcus xanthus)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、產黃青黴(Penicillium chrysogenum)、海洋γ變形菌(marine gamma proteobacterium)、丁酸產生菌(butyrate-producing bacterium)、伊文思奴卡菌、皮疽奴卡菌(Nocardia farcinica)、灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、熱葡糖苷酶地芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、菸草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、地中海極嗜酯菌(Haloferax mediterranei)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)、具核梭桿菌、棒狀鏈黴菌(Streptomyces clavuligerus)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、家鼷鼠(Mus musculus)、克氏酵母菌(Lachancea kluyveri)、陰道滴蟲(Trichomonas vaginalis)、布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、施氏假單胞菌、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、百脈根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、歐洲牛(Bos taurus)、黏性菸草(Nicotiana glutinosa)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、反芻月形單胞菌(Selenomonas ruminantium)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、閃爍古球菌(Archaeoglobus fulgidus)、死海嗜鹽古細菌(Haloarcula marismortui)、嗜氣熱棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、恥垢分枝桿菌MC2 155、鳥分枝桿菌副結核亞種K-10、海棲分枝桿菌M、微變塚村氏菌DSM 20162(Tsukamurella paurometabola DSM 20162)、藍菌屬PCC7001(Cyanobium PCC7001)、盤基網柄菌AX4(Dictyostelium discoideum AX4)，以及本文所揭示之其他物種(參見實例)。例如，具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成產生之微生物參考大腸桿菌及酵母菌宿主例示於本文中。然而，對於可用於目前超過550個物種(其中該等物種中超過一半可在諸如NCBI等公共數據庫上獲得)之完全基因組序列，包括395個微生物基因組及多種酵母菌、真菌、植物及哺乳動物基因組，在相關或遠緣物種中之一或多個基因(包括(例如)已知基因之同源物、直系同源物、旁系同源物及非直系同源基因替換及生物體之間之遺傳改變之互換)中鑑別編碼必需之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成活性之基因為相關技藝常規程序且熟知。因此，可將允許參考諸如大腸桿菌或酵母菌等特定生物體生物合成本文所述本發明4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺及其他化合物之代謝改變容易地應用於其他微生物，同樣包括原核及真核生物體。鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應瞭解，以一種生物體例示之代謝改變同樣可適用於其他生物體。
在一些情況下，例如當在無關物種中存在替代4-HB、4-HBal、BDO或腐胺生物合成途徑時，可藉由(例如)外源性表現來自無關物種之一或多種旁系同源物使宿主物種具有4-HB、4-HBal、BDO或腐胺 生物合成，該旁系同源物催化類似但並不相同之代謝反應以置換所參考反應。由於在不同生物體之間存在某些代謝網絡間差異，因此彼等熟習此項技術者應理解，不同生物體之間之實際基因使用可能有所不同。然而，鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者亦應理解，本發明之教示及方法可應用於所有微生物，其中使用與彼等本文所例示之代謝改變同類者在所關注物種中構築將合成4-HB(例如單體4-HB)、4-HBal、BDO或腐胺之微生物。
宿主微生物可選自(例如)細菌、酵母菌、真菌或多種可適用於發酵過程之其他微生物中之任一者及其中生成之非天然微生物生成。實例性細菌包括任一物種選自腸桿菌目(Enterobacteriales)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，包括大腸桿菌屬及克雷伯氏菌屬；氣單胞菌目(Aeromonadales)，琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)，包括厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)；巴斯德菌目(Pasteurellales)，巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，包括放線桿菌屬(Actinobacillus)及曼氏桿菌屬(Mannheimia)；根瘤菌目(Rhizobiales)，慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)，包括根瘤菌屬(Rhizobium)；芽孢桿菌目(Bacillales)，芽孢桿菌目科(Bacillaceae)，包括芽孢桿菌屬；放線菌目(Actinomycetales)，棒桿菌科(Corynebacteriaceae)及鏈黴菌科(Streptomycetaceae)，分別包括棒桿菌屬及鏈黴菌屬(Streptomyces)；紅螺菌目(Rhodospirillales)，乙酸桿菌科(Acetobacteraceae)，包括葡萄桿菌屬(Gluconobacter)；鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)，鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)，包括發酵單胞菌屬(Zymomonas)；乳酸桿菌目(Lactobacillales)，乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)及鏈球菌科(Streptococcaceae)，分別包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)及乳球菌屬(Lactococcus)；梭菌目(Clostridiales)，梭菌科(Clostridiaceae)，梭菌屬(Clostridium)；及假單胞菌目(Pseudomonadales)，假單胞菌科 (Pseudomonadaceae)，包括假單胞菌屬。宿主細菌之非限制性物種包括大腸桿菌、奧克西托克雷白桿菌、產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、產琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimia succiniciproducens)、埃特裏根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢桿菌、麩胺酸棒桿菌、氧化葡萄桿菌(Gluconobacter oxydans)、運動發酵單胞菌、乳酸乳球菌、胚芽乳酸桿菌、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌、螢光假單胞菌及戀臭假單胞菌。
相似地，酵母菌或真菌之實例性物種包括選自以下之任何物種：酵母菌目(Saccharomycetales)，酵母菌科(Saccaromycetaceae)，包括酵母菌屬(Saccharomyces)、克氏酵母菌(Kluyveromyces)及畢赤酵母菌屬(Pichia)；酵母菌目，雙足囊菌科(Dipodascaceae)，包括亞羅酵母菌屬(Yarrowia)；裂殖酵母菌目(Schizosaccharomycetales)，裂殖酵母菌科(Schizosaccaromycetaceae)，包括裂殖酵母菌屬(Schizosaccharomyces)；散囊菌目(Eurotiales)，發菌科(Trichocomaceae)，包括麯黴屬(Aspergillus)；及毛黴菌目(Mucorales)，毛黴菌科(Mucoraceae)，包括根黴菌屬(Rhizopus)。宿主酵母菌或真菌之非限制性物種包括啤酒酵母菌、粟酒裂殖酵母菌、乳酸克氏酵母菌、馬克思克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、土麯黴、黑麯黴(Aspergillus niger)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、鬚根黴菌(Rhizopus arrhizus)、米根黴(Rhizopus oryzae)、解脂亞羅酵母菌(Yarrowia lipolytica)及諸如此類。大腸桿菌係尤其有用之宿主生物體，此乃因其係經充分表徵之適於遺傳改造之微生物。其他尤其有用之宿主生物體包括諸如啤酒酵母菌等酵母菌。應理解，可使用任一適宜的微生物宿主生物體來引入代謝及/或遺傳修飾以產生期望產物。
可藉由(例如)相關技藝所熟知之重組及檢測方法來實施構築及測試產生非天然4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之宿主之表現量的方法。此等方法可發現於例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Baltimore,MD(1999)。4-HB及GBL可藉由(例如)HPLC使用Spherisorb 5 ODS1管柱以及70% 10mM磷酸酯緩衝液(pH=7)及30%甲醇之移動相分離，並使用UV檢測器在215nm下檢測(Hennessy等人2004,J.Forensic Sci.46(6)：1-9)。BDO係藉由氣相層析或藉由HPLC及折射率檢測器使用Aminex HPX-87H管柱及0.5mM硫酸之移動相檢測(Gonzalez-Pajuelo等人，Met.Eng.7：329-336(2005))。
可使用相關技藝熟知技術將參與用於產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之途徑之外源性核酸序列穩定地或瞬時地引入宿主細胞中，該等技術包括(但不限於)偶聯、電穿孔、化學轉化、轉導、轉染及超音波轉化。對於大腸桿菌或其他原核細胞中之外源性表現而言，真核核酸中之基因或cDNA之一些核酸序列可編碼靶向信號，例如N端粒線體或另一靶向信號，若需要，該等信號可在轉化至原核宿主細胞中之前予以去除。例如，去除粒線體前導序列導致在大腸桿菌中之表現增加(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280：4329-4338(2005))。對於酵母菌或其他真核細胞中之外源性表現而言，基因可在細胞溶膠中表現而不添加前導序列，或可藉由添加適於宿主細胞之適宜靶向序列(例如粒線體靶向或分泌信號)靶向粒線體或其他細胞器，或靶向分泌。因此，應理解，可將核酸序列之用以去除或包括靶向序列之合適修飾納入外源性核酸序列中以賦予合意性質。此外，可利用相關技藝熟知技術使基因經過密碼子最佳化以達成蛋白質之最佳化表 現。
一或多種表現載體可經構築而具有一或多種4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑及/或如本文所例示一或多種生物合成編碼核酸，該等核酸可操作地連接至在宿主生物體中具有功能之表現控制序列。表現載體可適用於本發明微生物宿主生物體，包括(例如)質粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體及人工染色體，包括可操作用於穩定整合至宿主染色體中之載體及選擇序列或標記物。另外，表現載體可包括一或多種可選標記物基因及合適的表現控制序列。亦可包括可選標記物基因，其例如提供對抗生素或毒素之抗性，補充營養缺陷型不足，或供給培養基沒有的關鍵營養素。表現控制序列可包括組成型及誘導型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子及諸如此類為相關技藝所熟知者。當欲共表現兩種或更多種外源性編碼核酸時，可將兩種核酸插入(例如)單一表現載體或單獨表現載體中。對於單一載體表現而言，編碼核酸可以可操作地連接至一種常見表現控制序列或連接至不同表現控制序列，例如一種誘導型啟動子及一種組成型啟動子。參與代謝或合成途徑之外源性核酸序列之轉化可使用相關技藝熟知方法確認。此等方法包括(例如)對mRNA之核酸分析，例如北方墨點(Northern blot)或聚合酶鏈反應(PCR)擴增，或用於基因產物表現之免疫墨點法，或用以測試所引入核酸序列之表現或其對應基因產物之其他適宜分析方法。彼等熟習此項技術者應理解，外源性核酸係以足以產生期望產物之量表現，且應進一步理解，表現量可使用為相關技藝熟知及如本文所揭示之方法經最佳化以獲得足夠表現。
使用如本文所例示為相關技藝熟知之方法來構築本發明之非天然微生物以便以足以產生4-HB(例如單體4-HB)、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之量外源性地表現至少一種編碼4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑酶之核酸。應理解，在足以產生4- HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之條件下培養本發明微生物。用於各途徑中之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺酶之實例性表現量進一步闡述於下文實例中。依照本文提供之教示及指導，本發明之非天然微生物可達成4-HB(例如單體4-HB)、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生物合成，從而使細胞內濃度介於約0.1-200mM或更高(例如，0.1-25mM或更高)之間。通常，4-HB(例如單體4-HB)、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之細胞內濃度介於約3-150mM或更高(尤其約5-125mM或更高)之間，且更特定而言介於約8-100mM(例如，約3-20mM)之間，尤其介於約5-15mM之間且更特定而言介於約8-12mM之間，包括約10mM、20mM、50mM、80mM或更高。介於該等實例性範圍中每一者之間及高於其之細胞內濃度亦可自本發明之非天然微生物達成。在特定實施例中，本發明微生物、尤其諸如彼等本文所揭示菌株等菌株(參見實例XII-XIX及表28)可藉由增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生及/或減少不合意副產物來改良諸如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺等期望產物之產生。此等產生量包括(但不限於)彼等本文所揭示者且包括每升約1克至約25克，例如每升約2克、3克、4克、5克、6克、7克、8克、9克、10克、11克、12克、13克、14克、15克、16克、17克、18克、19克、20克、21克、22克、23克、24克或甚至更高量之產物。
除本文所揭示之培養及發酵條件以外，用於生物合成BDO、4-HB、4-HBCoA、4-HBal及/或腐胺之生長條件可包括將滲透保護劑添加至培養條件。在某些實施例中，本發明之非天然微生物可在滲透保護劑存在下如本文所述維持、培養或發酵。簡言之，滲透保護劑係指用作滲透物且有助於如本文所述微生物在滲透應力下存活之化合物。滲透保護劑包括(但不限於)甜菜鹼、胺基酸及海藻糖。此等保護劑之非限制性實例係甘胺酸甜菜鹼、果仁糖甜菜鹼、二甲基噻亭、二甲基 鋶基丙酸酯、3-二甲基鋶基-2-甲基丙酸酯、哌可酸(pipecolic acid)、二甲基鋶基乙酸酯、膽鹼、L-肉鹼及四氫嘧啶(ectoine)。在一個態樣中，滲透保護劑係甘胺酸甜菜鹼。熟習此項技術者應理解，適於保護本文所述微生物對抗滲透應力之滲透保護劑之量及類型將取決於所用微生物。培養條件中之滲透保護劑之量可為(例如)不超過約0.1mM，不超過約0.5mM，不超過約1.0mM，不超過約1.5mM，不超過約2.0mM，不超過約2.5mM，不超過約3.0mM，不超過約5.0mM，不超過約7.0mM，不超過約10mM，不超過約50mM，不超過約100mM或不超過約500mM。
在一些實施例中，培養條件包括厭氧性或實質上厭氧性之生長或維持條件。先前已闡述實例性厭氧性條件且其為相關技藝所熟知。 用於發酵過程之實例性厭氧性條件闡述於本文中且闡述於(例如)2007年8月10日提出申請之美國公開案2009/0047719中。該等條件中之任一者皆可與非天然微生物以及相關技藝熟知之其他厭氧性條件一起採用。在此等厭氧性條件或實質上厭氧性之條件下，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生者可以5-10mM或更高之細胞內濃度以及本文所例示之全部其他濃度合成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。應理解，即使上述說明係指細胞內濃度，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生微生物仍可在細胞內產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺及/或將產物分泌至培養基中。
實例性發酵過程包括(但不限於)分批補料發酵及分批分離；分批補料發酵及連續分離；以及連續發酵及連續分離。在實例性分批發酵方案中，使產生生物體在用合適氣體吹掃之適宜大小之生物反應器中生長。在厭氧性條件下，用惰性氣體或氣體組合(例如，氮、N2/CO2混合物、氬、氦及諸如此類)吹掃培養物。當細胞生長並利用碳源時，以大約平衡碳源及/或營養素消耗之速率將額外碳源及/或其他營 養素進料至生物反應器中。生物反應器之溫度維持在期望溫度下，通常在22-37℃範圍內，但該溫度可維持在更高或更低溫度下，此取決於產生生物體之生長特性及/或用於發酵過程之期望條件。生長持續期望時期以達成發酵器中之培養物之期望特性，例如，細胞密度、產物濃度及諸如此類。在分批發酵過程中，發酵時期通常在若干小時至若干天範圍內，例如，8小時至24小時或1天、2天、3天、4天或5天，或最長一週，此取決於期望培養條件。可視需要控制或不控制pH，在此情況下，不控制pH之培養物到運行結束時通常會降低至pH 3-6。 在完成培養期後，可使發酵器內含物經過細胞分離單元，例如，離心機、過濾單元及諸如此類，以去除細胞及細胞碎片。在細胞內表現期望產物之情況下，可視需要在自發酵營養液分離細胞之前及之後以酶促或化學方式裂解或破壞細胞，以釋放額外產物。可將發酵營養液轉移至產物分離單元。藉由相關技藝所用自稀水溶液分離期望產物之標準分離程序來分離產物。此等方法包括(但不限於)使用水不混溶有機溶劑(例如，甲苯或其他適宜溶劑，包括(但不限於)二乙醚、乙酸乙酯、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基第三丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞硯(DMSO)及諸如此類)提供產物之有機溶液之液液萃取、標準蒸餾方法(若合適)及諸如此類，此取決於發酵過程產物之化學特性。
在實例性完全連續發酵方案中，通常首先使產生生物體以分批模式成長以達成期望細胞密度。當碳源及/或其他營養素耗盡時，以期望速率連續供應相同組成之進料培養基，並以相同速率取出發酵液。在此等條件下，生物反應器中之產物濃度以及細胞密度通常保持恆定。發酵器之溫度維持在期望溫度，如上文所論述。在連續發酵階段期間，通常期望維持適宜pH範圍以進行最佳化產生。可使用常規方法監測並維持pH，包括添加適宜酸或鹼以維持期望pH範圍。連續 地操作生物反應器達延長時期，通常至少一週至若干週且最長一個月或更長，視需要及期望而定。視需要週期性地監測(包括最多每天取樣)發酵液及/或培養物，以確保產物濃度及/或細胞密度之一致性。在連續模式中，當供應新進料培養基時，不斷地去除發酵器內含物。通常使含有細胞、培養基及產物之排出流經過連續產物分離程序，視需要去除或不地段細胞及細胞碎片。可使用相關技藝所用連續分離方法自稀水溶液分離產物，此等方法包括(但不限於)使用水不混溶有機溶劑(例如，甲苯或其他適宜溶劑，包括(但不限於)二乙醚、乙酸乙酯、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基第三丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞硯(DMSO)及諸如此類)之連續液液萃取、標準連續蒸餾方法及諸如此類或相關技藝所熟知之其他方法。
在一些實施例中，碳原料及其他細胞吸收來源(例如磷酸酯、氨、硫酸酯、氯化物及其他鹵素)可經選擇以改變存在於4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或任一4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體中之原子的同位素分佈。上文所列舉之各種碳原料及其他吸收來源在本文中將統稱為「吸收來源」。吸收來源可為存在於產物4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體(包括於任一點背離該途徑生成之任何4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺雜質)中之任一原子提供同位素富集。可達成任一靶原子之同位素富集，該靶原子包括(例如)碳、氫、氧、氮、硫、硫、氯或其他鹵素。
在一些實施例中，吸收來源可經選擇以改變碳-12、碳-13及碳-14之比率。在一些實施例中，吸收來源可經選擇以改變氧-16、氧-17及氧-18之比率。在一些實施例中，吸收來源可經選擇以改變氫、氘及氚之比率。在一些實施例中，吸收來源可經選擇改變氮-14及氮-15 之比率。在一些實施例中，吸收來源可經選擇以改變硫-32、硫-33、硫-34及硫-35之比率。在一些實施例中，吸收來源可經選擇以改變磷-31、磷-32及磷-33之比率。在一些實施例中，吸收來源可經選擇以改變氯-35、氯-36及氯-37之比率。
在一些實施例中，可藉由選擇一或多個吸收來源將靶原子之同位素比率變成期望比率。吸收來源可源自如在自然界中發現之天然來源或源自人造來源，且熟習此項技術者可選擇天然來源、人造來源或其組合，以達成靶原子之期望同位素比率。人造吸收來源之實例包括(例如)至少部分地源自化學合成反應之吸收來源。此等經同位素富集之吸收來源可商購或在實驗室中製備及/或視情況與吸收來源之天然來源混合以達成期望之同位素比率。在一些實施例中，吸收來源之靶原子同位素比率可藉由選擇如在自然界中發現之期望吸收來源來達成。例如，如本文所論述，天然來源可為源自生物或由其合成之生物性來源或諸如基於石油之產物或大氣等來源。在一些此等實施例中，例如，碳源可選自化石燃料源碳源，其可相對缺乏碳-14；或環境或大氣碳源，例如CO2，其可比其石油源對等部分具有更大量之碳-14。
不穩定碳同位素碳-14或放射性碳大約佔地球大氣中碳原子的1/1012且具有約5700年之半衰期。藉由涉及宇宙射線及普通氮(14N)之核反應來重新補足上層大氣中之碳原料。化石燃料不含有碳-14，此乃因其在很早以前已衰變。燃燒化石燃料降低大氣碳-14分數，所謂的「蘇斯效應(Suess effect)」。
測定化合物中原子之同位素比率之方法為彼等熟習此項技術者所熟知。同位素富集可容易地藉由質譜使用相關技藝已知技術評價，例如加速質譜(AMS)、穩定同位素比率質譜(SIRMS)及位點特異性天然同位素分餾-核磁共振(SNIF-NMR)。此等質譜技術可與諸如液相層析(LC)、高效液相層析(HPLC)及/或氣相層析及諸如此類等分離技術 整合。
在碳之情況下，在美國由American Society for Testing and Materials(ASTM)International將ASTM D6866研發作為標準化分析方法以供使用放射性碳定年測定固體、液體及氣體試樣之生物性含量(biobased content)。該標準係基於用於測定產物之生物性含量之放射性碳定年之應用。ASTM D6866於2004年首次公佈，且該標準之現行版本係ASTM D6866-11(2011年4月1日生效)。放射性碳定年技術為彼等熟習此項技術者所熟知，包括彼等本文所述者。
藉由碳-14(14C)對碳-12(12C)之比率來估計化合物之生物性含量。具體而言，自以下表達式計算現代分數(Fraction Modern)(Fm)：Fm=(S-B)/(M-B)，其中B、S及M分別代表空白、試樣及現代參考之14C/12C比率。現代分數係試樣與「現代」之14C/12C比率之偏差的量度。現代定義為正規化成δ13CVPDB=-19/密爾之National Bureau of Standards(NBS)草酸I(即，標準參考材料(SRM)4990b)之95%放射性碳濃度(AD 1950)。Olsson,The use of Oxalic acid as a Standard.，Radiocarbon Variations and Absolute Chronology,Nobel Symposium,12th Proc.,John Wiley & Sons,New York(1970)。使用國際上商定之關於0.95倍正規化成δ13CVPDB=-19/密爾之NBS草酸I(SRM 4990b)之比活性的定義來計算藉由(例如)ASM量測之質譜結果。此等效於1.176±0.010×10-12之絕對(AD 1950)14C/12C比率(Karlen等人，Arkiv Geofysik,4：465-471(1968))。標準計算考慮一種同位素相對於另一種之差異吸收，例如，生物系統按以下優先吸收：C12優先於C13優先於C14，且該等校正反映為針對δ13校正之Fm。
草酸標準(SRM 4990b或HOx 1)係自1955糖用甜菜(sugar beet)作物製得。儘管製得了1000lbs，但此草酸標準不再能夠商購。草酸II標準(HOx 2；N.I.S.T名稱SRM 4990 C)係自1977 French甜菜糖蜜作物 製得。在1980年代早期，12個實驗室之群組量測了兩個標準之比率。草酸II對草酸I之活性之比率係1.2933±0.001(加權平均值)。HOx II之同位素比率係-17.8/密爾。ASTM D6866-11表明，現代標準使用可用草酸II標準SRM 4990 C(Hox2)(參見Mann,Radiocarbon,25(2)：519-527(1983)中對原始草酸標準對現行可用草酸標準之論述)。Fm=0%代表材料中完全缺乏碳-14原子，因此指示為化石(例如，基於石油)碳源。在針對1950年後自核彈測試注入大氣中之碳-14進行校正後，Fm=100%指示完全現代碳源。如本文所述，此一「現代」來源包括生物性來源。
如ASTM D6866中所述，現代碳百分比(pMC)因1950年代核測試程式之持續但減小之效應而可大於100%，該核測試程式導致碳-14顯著富集於大氣中，如ASTM D6866-11中所述。由於所有試樣之碳-14活性皆指「投彈前」標準，且由於幾乎所有新生物性產物(biobased products)皆係在投彈後環境中產生，因此所有pMC值(在針對同位素分數進行校正後)皆必須乘以0.95(截至2010年)以更好地反映試樣之真實生物性含量。大於103%之生物性含量表明，已發生分析誤差，或生物性碳之來源超過幾年。
ASTM D6866定量相對於材料之總有機物含量之生物性含量且不考慮存在之無機碳及其他不含碳物質。例如，為50%基於澱粉之材料及50%水之產物將基於ASTM D6866視為具有生物性含量=100%(50%為100%生物性之有機物含量)。在另一實例中，為50%基於澱粉之材料、25%基於石油及25%水之產物將具有生物性含量=66.7%(75%有機物含量，但僅50%產物為生物性)。在另一實例中，為50%有機碳且為基於石油之產物之產物將視為具有生物性含量=0%(50%有機碳，但來自化石來源)。因此，基於用於測定化合物或材料之生物性含量之熟知方法及已知標準，熟習此項技術者可容易地測定生物性含量及 /或利用具有期望生物性含量之本發明之所製備下游產物。
應用碳-14定年技術來定量材料之生物性含量為相關技藝已知(Currie等人，Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B,172：281-287(2000))。例如，碳-14定年已用於定量含對苯二甲酸酯材料中之生物性含量(Colonna等人，Green Chemistry,13：2543-2548(2011))。值得注意地，源自可再生1,3-丙二醇及石油源對苯二甲酸之聚對苯二甲酸丙二酯(PPT)聚合物產生接近30%之Fm值(即，由於3/11聚合碳源自可再生1,3-丙二醇且8/11來自化石終末成員對苯二甲酸)(Currie等人，見上文，2000)。相比之下，源自可再生1,4-丁二醚與可再生對苯二甲酸二者之聚對苯二甲酸丁二酯聚合物產生超過90%之生物性含量(Colonna等人，見上文，2011)。
因此，在一些實施例中，本發明提供4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體，其具有反映大氣碳吸收來源之碳-12、碳-13及碳-14比率。例如，在一些態樣中，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體之Fm值可為至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或多達100%。在一些此等實施例中，吸收來源係CO2。在一些實施例中，本發明提供4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體，其具有反映基於石油之碳吸收來源之碳-12、碳-13及碳-14比率。在此態樣中，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體之Fm值可小於95%、小於 90%、小於85%、小於80%、小於75%、小於70%、小於65%、小於60%、小於55%、小於50%、小於45%、小於40%、小於35%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於2%或小於1%。在一些實施例中，本發明提供4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體，其具有藉由大氣碳吸收來源與基於石油之吸收來源之組合獲得之碳-12、碳-13及碳-14比率。吸收來源之此一組合之使用係一種可改變碳-12、碳-13及碳-14比率之方式，且各別比率將反映吸收來源之比例。
此外，本發明係關於以生物方式產生之如本文所揭示4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體，且係關於源自其之產物，其中4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體具有大致與出現於環境中之CO2相同之值之碳-12、碳-13及碳-14同位素比率。例如，在一些態樣中，本發明提供：生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體具有大致與出現於環境中之CO2相同之值之碳-12對碳-13對碳-14同位素比率，或本文所揭示之任何其他比率。應理解，如本文所揭示，產物可具有大致與出現於環境中之CO2相同之值之碳-12對碳-13對碳-14同位素比率，或本文所揭示之任何比率，其中該產物係自如本文所揭示生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體生成，其中該生物衍生之產物經化學修飾以生成最終產物。化學修飾4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或其中間體之生物衍生產物以生成期望產物之 方法為彼等熟習此項技術者所熟知，如本文所述。本發明進一步提供具有大致與出現於環境中之CO2相同之值之碳-12對碳-13對碳-14同位素比率的塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)、尼龍(nylon)及諸如此類，其中該等塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)及尼龍係直接自以下生成或與其組合生成：如本文所揭示生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體。
產物4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺係通常用於許多商業及工業應用之化學品。此等應用之非限制性實例包括產生塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)及尼龍。此外，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺亦在寬範圍之產物之產生中用作原材料，該等產物包括塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)、尼龍。因此，在一些實施例中，本發明提供生物性塑 膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)、尼龍，其包含一或多種由本發明非天然微生物產生或使用本文所揭示方法產生之生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體。
本文所用術語「生物衍生」意指源自生物或由其合成且可視為可再生來源，此乃因其可由生物生成。此一生物、尤其本文所揭示本發明微生物可利用自農業、植物、細菌或動物來源獲得之原料或生物質，例如糖或碳水化合物。或者，生物可利用大氣碳。本文所用術語「生物性」意指完全或部分地由本發明生物衍生化合物構成之上述產物。生物性或生物衍生產物與石油源產物(其中此一產物係源自石油或石油化學原料或自其合成)不同。
在一些實施例中，本發明提供塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)、尼龍，其包含生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體，其中該生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體包括全部或部分用於產生塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基 醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)及尼龍之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體。因此，在一些態樣中，本發明提供生物性塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)及尼龍，其包含至少2%、至少3%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%如本文所揭示之生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體。另外，在一些態樣中，本發明提供生物性塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)及尼龍，其中用於其產生中之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體係生物衍生與石油源4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體之組合。例如，生物性塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚 脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)及尼龍可使用50%生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺及50%石油源4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或其他期望比率(例如60%/40%、70%/30%、80%/20%、90%/10%、95%/5%、100%/0%、40%/60%、30%/70%、20%/80%、10%/90%之生物衍生/石油源前體)產生，只要至少一部分產物包含由本文所揭示微生物產生之生物衍生產物即可。 應理解，使用本發明之生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或生物衍生之4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體產生塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯(包括聚羥基烷酸酯，例如聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)(亦稱作PTMO、聚四亞甲基氧化物)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)及聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物(稱作spandex、elastane或LycraTM)及尼龍之方法為相關技藝所熟知。
本發明另外提供培養基，其可為發酵營養液，包含生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇或本文所揭示其他產物，例如，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺，其中該生物衍生產物具有反映大氣二氧化碳吸收來源之碳-12、碳-13及碳-14同位素比率。此培養基可包含由如本文所揭示本發明微生物產生之生物衍生產物，例如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。在一特定實施例中，可將培養基與具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇途徑)之非天然微生物分離。在另一實施例中，本發明提供由(例如)本發明微生物產生之生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺，例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇，其具有反映大氣二氧化碳吸收來源之碳-12、碳-13及碳-14同位素比率。在一特定實施例中，技術方案4之生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)之Fm值可為至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。本發明之此等生物衍生產物可由如本文所揭示本發明之微生物或方法產生。
本發明進一步提供包含以下物質之組合物：生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)及除生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)以外之化合物。除生物衍生產物以外之化合物可為具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇途徑)之本發明之非天然微生物之細胞部分，例如，痕量細胞部分，或可為在該生物體存在下產生之發酵營養液或培養基或其經純化或部分純化之部分。當由如本文所揭示具有減少副產物形成之生物體產生時，該組合物可包含(例如)減少量之副產物。該組合物可包含(例如)生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)或本發明微生物之溶胞物或培養物上清液。
本發明另外提供包含生物性4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生物性產物，其中該生物性產物係塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯、聚羥基烷酸酯、聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物或尼龍。在一個實施例中，生物性產物可包含至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺，例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇。在另一實施例中，一部分生物性產物可單獨或與其他單體單元組合包含生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺(例如4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)作為重複單元，以形成聚合物。在另一實施例中，本發明提供藉由模製諸如以下等生物性產物獲得之模製產物：塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯、聚羥基烷酸酯、 聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物或尼龍或如本文所揭示之其他產物。本發明進一步提供產生生物性產物之方法，其係藉由使生物衍生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)與本身或另一化合物在產生該生物性產物之反應中發生化學反應來達成。本發明之此等生物衍生產物可由如本文所揭示本發明之微生物或方法產生。
培養條件可包括(例如)液體培養程序以及發酵及其他大規模培養程序。如本文所述，本發明生物合成產物之尤其有用之產率可在好氧性或實質上厭氧性之培養條件下獲得。
如本文所述，一種用於達成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生物合成之實例性生長條件包括厭氧性培養或發酵條件。在某些實施例中，本發明之非天然微生物可在好氧性或實質上厭氧性之條件下維持、培養或發酵。簡言之，厭氧性條件係指無氧環境。實質上厭氧性之條件包括(例如)使得培養基中之溶解氧濃度保持在介於0與10%飽和之間之培養、分批發酵或連續發酵。實質上厭氧性之條件亦包括在維持有小於1%氧之氣氛之密封室內部在液體培養基中或在固體瓊脂上生長或靜置細胞。氧之百分比可藉由(例如)用N2/CO2混合物或一或多種其他適宜之非氧氣體吹掃培養物來維持。
本發明亦提供非天然微生物生物觸媒，包括具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成途徑之微生物，該等途徑包括至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶、非CoA依賴性醛去氫酶、CoA依賴性醛去氫酶或醇去氫酶，其中該外源性核酸係以足以產生1,4-丁二醇(BDO)之量來表現。4-羥基 丁酸：CoA轉移酶亦稱為4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶。本文亦揭示其他4-HB或BDO途徑酶(參見實例及圖8-13)。
本發明進一步提供非天然微生物生物觸媒，包括具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成途徑之微生物，該等途徑包括至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、4-丁酸激酶、磷酸轉丁醯基酶、α-酮戊二酸去羧酶、醛去氫酶、醇去氫酶或醛/醇去氫酶，其中該外源性核酸係以足以產生1,4-丁二醇(BDO)之量來表現。
亦可生成生物合成BDO之非天然微生物。與本發明之產生4-HB之微生物一樣，產生BDO之微生物亦可在細胞內產生或將BDO分泌至培養基中。依照先前提供用於構築合成4-HB之微生物之教示及指導，可將其他BDO途徑納入產生4-HB之微生物中以生成亦合成BDO及其他BDO家族化合物之生物體。已知BDO及其下游產物之化學合成。能夠進行BDO生物合成之本發明之非天然微生物使用4-HB作為如圖1中所圖解說明之進入點避開該等化學合成。如下文所進一步闡述，例如，亦可使用4-HB產生者來將4-HB化學轉變成GBL且隨後轉化成BDO或THF。或者，4-HB產生者可經進一步遺傳修飾以包括將4-HB及/或GBL轉變成BDO之生物合成能力。
引入4-HB產生者之其他BDO途徑包括(例如)在圖1步驟9-13中例示之一或多種酶在宿主缺陷背景中之外源性表現或過表現。一種此類途徑包括(例如)實施如圖1中之步驟9、12及13所示之反應所必需之酶活性，其中醛去氫酶及醇去氫酶可為單獨酶或具有醛去氫酶及醇去氫酶活性二者之多功能酶。另一此類途徑包括(例如)實施如圖1中步驟10、11、12及13所示之反應所必需之酶活性，同樣其中醛去氫酶及醇去氫酶可為單獨酶或具有醛去氫酶及醇去氫酶活性二者之多功能酶。 因此，欲引入4-HB產生者中之其他BDO途徑包括(例如)以下一或多種酶在宿主缺陷背景中之外源性表現或過表現：4-羥基丁酸：CoA轉移酶、丁酸激酶、磷酸轉丁醯基酶、非CoA依賴性醛去氫酶、CoA依賴性醛去氫酶或醇去氫酶。在不存在能夠修飾4-HB之內源性醯基-CoA合成酶時，產生BDO之非天然微生物可進一步包括對4-HB具有選擇性之外源性醯基-CoA合成酶或具有多種將4-HB轉變成4-HB-CoA作為淨反應之酶之組合。如下文實例中所進一步例示，丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶展現BDO途徑活性且催化圖1中所圖解說明對4-HB受質之轉化。因此，該等酶在本文中亦可分別稱作4-羥基丁酸激酶及磷酸轉羥基丁醯基酶。
可用於該等自4-HB至BDO之活體內轉變之實例性醇及醛去氫酶列示於下表1中。
本文揭示其他實例性酶及途徑(參見實例)。此外，應理解，可利用酶來實施受質並非天然受質之反應。儘管非天然受質之活性可低於天然受質，但應理解，此等酶可以天然形式或使用定向進化或適應性進化修飾之形式利用，如本文所揭示(亦參見實例)。
經由本文所揭示任一途徑之BDO產生部分地基於對用於將前體轉變成BDO之合適酶之鑑別。已鑑別出諸多用於若干反應步驟之特異性酶。對於彼等未鑑別出對反應前體具有特異性之酶之轉化而言，已鑑別出最適於催化反應步驟之酶候選物。已顯示，酶對寬範圍之受質起作用，如下文所論述。另外，即使並非天然受質，蛋白質改造領域之進展亦使得改變酶以有效地作用於受質仍然可行。下文闡述來自多種類別之適於BDO途徑之廣泛特異性酶以及已用於進化酶以作用於非天然受質之方法的若干實例。
BDO途徑中關鍵類別之酶係使酮或醛與醇互變之氧化還原酶(1.1.1)。此類別中之諸多實例性酶可對寬範圍之受質起作用。據顯示，自土壤細菌短桿菌(Brevibacterium sp)KU 1309純化之醇去氫酶(1.1.1.1)(Hirano等人，J.Biosc.Bioeng.100：318-322(2005))以高活性對眾多脂肪族醇以及芳香醇起作用。表2顯示該酶對不同醇之活性及其Km。該酶係可逆的且亦對若干醛具有極高活性(表3)。
來自富養產鹼菌之乳酸去氫酶(1.1.1.27)係已證實對若干2-酮基酸(例如2-酮基丁酸酯、2-酮基戊酸酯及2-酮基戊二酸酯(C5化合物，類似至2-酮基己二酸酯))具有高活性之另一酶(Steinbuchel及Schlegel,Eur.J.Biochem.130：329-334(1983))。表4中之第2欄顯示來自富養產鹼菌(以前為A.eutrophus)之ldhA對不同受質之活性(Steinbuchel及Schlegel，見上文，1983)。
已顯示可將2-酮基酸轉變成其醯基-CoA對等部分(1.2.1)之氧化還原酶亦接受多種受質。例如，支鏈2-酮酸去氫酶複合物(BCKAD)，亦稱作2-酮基異戊酸去氫酶(1.2.1.25)參與支鏈胺基酸降解途徑，將纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之2-酮基酸衍生物轉變成其醯基-CoA衍生物及CO2。在包括褐鼠(Paxton等人，Biochem.J.234：295-303(1986))及啤酒酵母菌(Sinclair等人，Biochem.Mol Biol.Int.32：911-922(1993)在內的一些生物體中，已顯示，此複合物具有寬受質範圍，包括直鏈氧代酸，例如2-酮基丁酸酯及α-酮戊二酸酯，以及支鏈胺基酸前體。
已報導，再一類別之酶之成員(亦即胺基轉移酶(2.6.1))作用於多種受質。已自強烈火球菌(Pyrococcus fursious)鑑別出天冬胺酸酯胺基轉移酶(aspAT)，使其在大腸桿菌中表現並對重組蛋白質進行表徵以證實該酶對天冬胺酸酯及α-酮戊二酸酯具有最高活性，而對丙胺酸、麩胺酸酯及芳香族胺基酸具有較低但仍顯著之活性(Ward等人，Archaea 133-141(2002))。在另一情況下，報導自墨西哥利什曼原蟲(Leishmania mexicana)鑑別且在大腸桿菌中表現之胺基轉移酶(Vernal等人，FEMS Microbiol.Lett.229：217-222(2003))分別對酪胺酸(對酪胺酸之活性視為100%)、苯丙胺酸(90%)、色胺酸(85%)、天冬胺酸酯(30%)、白胺酸(25%)及甲硫胺酸(25%)具有廣泛受質特異性(Vernal等 人，Mol.Biochem.Parasitol 96：83-92(1998))。已報導來自克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi)之酪胺酸胺基轉移酶之相似的廣泛特異性，即使該等酶皆僅具有6%之序列同源性。後一酶可接受白胺酸、甲硫胺酸以及酪胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸及丙胺酸作為有效胺基供體(Nowicki等人，Biochim.Biophys.Acta 1546：268-281(2001))。
已顯示，CoA轉移酶(2.8.3)具有作用於超過一種受質之能力。具體而言，自丙酮丁醇梭菌純化CoA轉移酶且報導其對乙酸酯、丙酸酯及丁酸酯具有最高活性。其對戊酸酯、異丁酸酯及巴豆酸酯亦具有顯著活性(Wiesenborn等人，Appl.Environ.Microbiol.55：323-329(1989))。在另一研究中，已顯示，大腸桿菌酶醯基-CoA：乙酸-CoA轉移酶(亦稱作乙酸-CoA轉移酶(EC 2.8.3.8))將CoA自多種具支鏈及直鏈醯基-CoA受質部分轉移至乙酸酯，該等受質包括異丁酸酯(Matthies及Schink,App.Environm.Microbiol.58：1435-1439(1992))、戊酸酯(Vanderwinkel等人，Biochem.Biophys.Res Commun.33：902-908(1968b))及丁酸酯(Vanderwinkel等人，Biochem.Biophys.Res Commun.33：902-908(1968a)。
其他酶類別另外支持酶之廣泛受質特異性。亦已證明，一些異構酶(5.3.3)對多種受質起作用。例如，來自施氏假單胞菌之L-鼠李糖異構酶催化各種醛糖與酮糖之間之異構化(Yoshida等人，J.Mol.Biol.365：1505-1516(2007))。該等包括以下糖之間之異構化：L-鼠李糖與L-鼠李樹膠糖、L-甘露糖與L-果糖、L-木糖與L-木酮糖、D-核糖與D-核酮糖及D-阿洛糖與D-阿洛酮糖。
在再一類別之酶中，發現磷酸轉移酶(2.7.1)(來自大腸桿菌之高絲胺酸激酶(2.7.1.39)將L-高絲胺酸轉變成L-高絲胺酸磷酸酯)將諸多高絲胺酸類似物磷酸化。在該等受質中，R位處之羧基官能基已由酯或由羥基甲基置換(Huo及Viola，Biochemistry 35：16180-16185 (1996))。表5顯示此激酶之廣泛受質特異性。
可用於BDO途徑之另一類別之酶係酸-硫醇連接酶(6.2.1)。與其他類別中之酶一樣，已測定此類別中之某些酶具有廣泛受質特異性。例如，已證實，來自戀臭假單胞菌之醯基CoA連接酶對若干脂肪族受質(包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸及辛酸)且對諸如苯乙酸及苯氧乙酸等芳香族化合物起作用(Fernandez-Valverde等人，Appl.Environ.Microbiol.59：1149-1154(1993))。來自三葉草根瘤菌(Rhizobium trifolii)之相關酶丙二醯基CoA合成酶(6.3.4.9)可將若干二酸(亦即丙二酸乙酯、丙二酸丙基酯、丙二酸烯丙基酯、丙二酸異丙基酯、丙二酸二甲酯、丙二酸環丙基酯、丙二酸環丙基亞甲基酯、丙二酸環丁基酯及丙二酸苯甲基酯)轉變成其相應單硫酯(Pohl等人，J.Am.Chem.Soc.123：5822-5823(2001))。相似地，亦已發現去羧酶(4.1.1)具有寬受質範圍。丙酮酸酯去羧酶(PDC)(亦稱為酮酸去羧酶)係醇發酵中之關鍵酶，催化丙酮酸酯去羧成乙醛。自啤酒酵母菌分離 之酶對包括2-酮丁酸酯、2-酮戊酸酯及2-苯基丙酮酸酯在內之脂肪族2-酮酸具有寬受質範圍(Li及Jordan，Biochemistry 38：10004-10012(1999))。相似地，苯甲醯基甲酸酯去羧酶具有寬受質範圍且已成為酶改造研究之目標。已對來自戀臭假單胞菌之酶進行深入研究，且可獲得此酶之晶體結構(Polovnikova等人，Biochemistry 42：1820-1830(2003)；Hasson等人，Biochemistry 37：9918-9930(1998))。已顯示，支鏈α-酮酸去羧酶(BCKA)作用於鏈長度在3至6個碳之間變化之多種化合物(Oku及Kaneda,J.Biol.Chem.263：18386-18396(1998)；Smit等人，Appl.Environ.Microbiol.71：303-311(2005b))。已就多種具支鏈及直鏈受質對乳酸乳球菌中之酶進行表徵，該等受質包括2-酮基丁酸酯、2-酮基己酸酯、2-酮基戊酸酯、3-甲基-2-酮基丁酸酯、4-甲基-2-酮基丁酸酯及異己酸酯(Smit等人，Appl.Environ.Microbiol.71：303-311(2005a)。
有趣的是，亦已報導，已知具有一種主導活性之酶催化極不相同之功能。例如，已知，來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)及枯草芽孢桿菌之依賴輔因子之磷酸甘油酸酯變位酶(5.4.2.1)亦作為磷酸酶發揮功能(Rigden等人，Protein Sci.10：1835-1846(2001))。已知，來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之酶對若干受質具有活性，該等受質包括3-磷酸甘油酸酯、α-萘基磷酸酯、對硝基苯基磷酸酯、AMP、果糖-6-磷酸酯、核糖-5-磷酸酯及CMP。
與酶天然具有廣泛受質特異性之該等實例不同，已使用定向進化對諸多酶進行修飾以拓寬其對其非天然受質之特異性。或者，亦已使用定向進化來改變酶之受質傾向。因此，改造給定酶對天然受質(例如，改良效率)或非天然受質(例如，增加效率)之有效功能係可行的。例如，已報導，顯著改良來自繡色假單胞菌之脂肪酶之鏡像選擇性(Reetz等人，Agnew.Chem.Int.Ed Engl.36：2830-2832(1997))。此 酶水解僅具有2%有利於(S)-酸之鏡像異構物過量(ee)之2-甲基癸酸對硝基苯基酯。然而，在4輪易錯誘變及篩選後，產生具有81% ee之催化必需反應之變體(Reetz等人，Agnew.Chem.Int.Ed Engl.36：2830-2832(1997))。
已使用定向進化方法來修飾酶以對非天然受質陣列發揮功能。藉由對活性位點附近之胺基酸殘基進行隨機處理來拓寬繡色假單胞菌中之脂肪酶之受質特異性。此允許此酶接受α-取代羧酸酯(Reetz等人，Agnew.Chem.Int.Ed Engl.44：4192-4196(2005))。在對酶之另一成功的修飾中，採用DNA改組來產生接受β-支鏈受質之大腸桿菌胺基轉移酶，該等受質不被野生型酶充分接受(Yano等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.95：5511-5515(1998))。具體而言，在4輪改組結束時，天冬胺酸酯胺基轉移酶對纈胺酸及2-酮基纈胺酸之活性增加最多5個數量級，而將對天然受質天冬胺酸酯之活性降低最少29/30。最近，使用算法來設計可用於催化非天然及非生物受質4-羥基-4-(6-甲氧基-2-萘基)-2-丁酮中之碳-碳鍵斷裂之逆醛縮酶(Jiang等人，Science 319：1387-1391(2008))。該等算法使用4個不同催化基序之不同組合來設計新酶，且所選用於實驗表徵之設計中有20個相對於未催化反應具有4倍改良率(Jiang等人，Science 319：1387-1391(2008))。因此，該等改造方式不僅能夠擴大酶可作用之受質陣列，且其亦允許設計並構築極有效之酶。例如，據報導，DNA改組方法(在瞬時模板或RACHITT上進行隨機嵌合生長(chimeragenesis))產生對複合物受質之去硫率有所改良且對非天然受質之轉變快20倍之經改造單加氧酶(Coco等人，Nat.Biotechnol.19：354-359(2001))。相似地，遲鈍型突變磷酸丙糖異構酶之比活性自1.3倍改良最多19倍(Hermes等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87：696-700 1990))。此比活性增強係藉由在全長蛋白質內使用隨機誘變來達成且可將改良追溯至6個胺基酸殘基之突變。
亦已在若干研究中證實蛋白質改造方式改變酶對期望受質之受質特異性的有效性。藉由改變靠近活性位點之殘基來修飾來自嗜熱棲熱菌之異丙基蘋果酸去氫酶，以使得其現在可作用於作為受質之蘋果酸酯及D-乳酸酯(Fujita等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.65：2695-2700(2001))。在此研究以及其他中，已指出，一或幾個殘基可經遺傳修飾以改變受質特異性。例如，改變假定受質結合區中之單一胺基酸之二氫黃酮醇4-還原酶可優先還原二氫山萘酚(Johnson等人，Plant.J.25：325-333(2001))。藉由改變活性位點中之一個殘基使來自大腸桿菌之極特異性異檸檬酸去氫酶之受質特異性自異檸檬酸酯變成異丙基蘋果酸酯(Doyle等人，Biochemistry 40：4234-4241(2001))。相似地，藉由改變幾個靠近N末端之殘基將依賴NAD+之1,5-羥基前列腺素去氫酶之輔因子特異性變成NADP+(Cho等人，Arch.Biochem.Biophys.419：139-146(2003))。使用序列分析及分析建模分析來鑑別修飾用關鍵殘基，進一步藉由定點誘變來研究該等關鍵殘基。
存在橫跨多種類別之酶之諸多實例，其中改變酶之功能以相對於該酶之天然受質偏好一種非天然受質。藉由DNA改組及篩選在大腸桿菌中自半乳糖苷酶進化岩藻糖苷酶(Zhang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.94：4504-4509(1997))。相似地，使用同源性建模及定點誘變將來自大腸桿菌之天冬胺酸酯胺基轉移酶轉變成酪胺酸胺基轉移酶(Onuffer及Kirsch,Protein Sci.,4：1750-1757(1995))。據報導，來自戀臭假單胞菌之苯甲醯基甲酸酯去羧酶之兩個殘基活性位點之定點誘變改變對天然及非天然受質之親和力(Km)(Siegert等人，Protein Eng Des Sel 18：345-357(2005))。使來自啤酒酵母菌之細胞色素c過氧化物酶(CCP)經過定向分子進化以生成對經典過氧化物酶受質愈創木酚之活性增加之突變體，由此將CCP之受質特異性自蛋白質細胞色素c變成小有機分子。在3輪DNA改組及篩選後，分離出相對於對天然受質 對愈創木酚之活性增加300倍且對此受質之特異性增加最多1000倍之突變體(Iffland等人，Biochemistry 39：10790-10798(2000))。
在一些情況下，已獲得受質傾向不同於任一親本酶之酶。例如，藉由改組來自兩種細菌類產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)及洋蔥伯霍爾德桿菌(Burkholderia cepacia)之基因來改良聯苯雙加氧酶介導之多氯化聯苯之降解(Kumamaru等人，Nat.Biotechnol.16：663-666(1998))。所得嵌合聯苯加氧酶顯示不同於兩種親本酶之受質傾向，且增強對原本為該酶之差受質之相關聯苯化合物及單一芳香族環烴(例如甲苯及苯)之降解活性。
除改變酶特異性以外，亦可增強對受質之活性，該等酶天然對該等受體具有低活性。一項研究證實，可藉由隨機誘變顯著改良具有廣泛受質特異性(對離胺酸、精胺酸、丙胺酸、絲胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、白胺酸及組胺酸尤其)但對色胺酸活性較低之來自戀臭假單胞菌之胺基酸消旋酶(Kino等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.73：1299-1305(2007))。相似地，牛BCKAD之活性位點經改造以偏好替代受質乙醯基-CoA(Meng及Chuang，Biochemistry 33：12879-12885(1994))。該等方式之一個有趣態樣係即使已應用隨機方法來生成該等具有有效活性之突變酶，仍可鑑別賦予活性改良之實際突變或結構改變。例如，在上述研究中，將促進對色胺酸之活性改良之突變追溯至兩個不同位置。
亦已使用定向進化來表現難以表現之蛋白質。例如，藉由使辣根過氧化物酶經過隨機誘變及基因重組，鑑別出活性為野生型14倍以上之突變體(Lin等人，Biotechnol.Prog.15：467-471(1999))。
定向進化之另一實例顯示酶可接受為了達成一範圍之期望功能之廣泛修飾。使來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之酶乳酸去氫酶經過定點誘變，且於相信決定對不同羥酸之特異性之位點進行3個胺基酸取代 (Clarke等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.148：15-23(1987))。在該等突變後，相對於丙酮酸酯對草醯乙酸酯之特異性增加至500，此與野生型酶不同，該野生型酶相對於草醯乙酸酯對丙酮酸酯之催化特異性為1000。使用定點誘變進一步改造此酶以對支鏈取代之丙酮酸酯具有活性(Wilks等人，Biochemistry 29：8587-8591(1990))。具體而言，該酶對α-酮異己酸酯之Kcat改良55倍。在相同酶中進行三種結構修飾以將其受質特異性自乳酸酯變成蘋果酸酯。該酶對蘋果酸酯具有高活性及特異性(Wilks等人，Science 242：1541-1544(1988))。隨後對來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之相同酶進行改造以對具有帶正電側鏈之α-酮酸(例如彼等含有銨基者)具有高催化活性(Hogan等人，Biochemistry 34：4225-4230(1995))。於該酶之102位引入酸性胺基酸之突變體偏好結合此等側鏈銨基。所得結果證明，該等突變體顯示對ω-胺基-α-酮酸受質之kcat/Km值改良最高25倍。有趣的是，此酶亦在結構上經遺傳修飾以作為苯基乳酸去氫酶代替乳酸去氫酶發揮功能(Wilks等人，Biochemistry 31：7802-7806 1992)。將限制位點引入該酶之基因中，該酶允許切除該基因之區。此區編碼多肽之移動表面環(殘基98-110)，該環通常自大量溶劑密封活性位點且係受質特異性之主要決定因素。插入長度及序列可變之環，以生成具有改變之受質特異性之羥酸去氫酶。藉由構成一個更長之環，對丙酮酸酯之活性降低至1/1百萬，但對苯基丙酮酸酯之活性基本上沒有改變。達成特異性(kcat/Km)之390,000倍之轉換。此酶對苯基丙酮酸酯相對於丙酮酸酯之1700：1選擇性係苯基乳酸去氫酶中所需。上述研究指示，可使用各種酶改造方式來獲得用於如本文所揭示BDO途徑之酶。
如本文所揭示，可利用自諸多中心代謝中間體達成1,4-丁二醇之生物合成途徑，該等中間體包括乙醯基-CoA、琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸酯、麩胺酸酯、4-胺基丁酸酯及高絲胺酸。乙醯基-CoA、琥珀 醯基-CoA及α-酮戊二酸酯係三羧酸(TCA)循環之常見中間體，該循環係以整體形式存在於利用氧進行細胞呼吸之幾乎所有活細胞中且以截短形式存在於諸多厭氧性生物體中的一系列反應。麩胺酸酯係經由麩胺酸去氫酶或諸多轉胺反應中之任一者源自α-酮戊二酸酯之胺基酸(參見圖8B)。4-胺基丁酸酯可藉由麩胺酸酯之去羧(參見圖8B)或自乙醯乙醯基-CoA經由圖9C中所揭示途徑形成。乙醯乙醯基-CoA係藉助乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶或等效地乙醯乙醯基-輔酶A硫解酶源自兩個乙醯基-CoA分子之縮合。高絲胺酸係蘇胺酸及甲硫胺酸代謝中之中間體，其係經由天冬胺酸酯自草醯乙酸酯形成。草醯乙酸酯轉變成高絲胺酸需要一個NADH、兩個NADPH及一個ATP。
亦可採用除彼等上文所例示途徑外之途徑在非天然微生物中生成BDO之生物合成。在一個實施例中，生物合成可使用達成BDO途徑之L-高絲胺酸達成(參見圖13)。此途徑具有0.90mol/mol葡萄糖之莫耳產率，其似乎受還原當量之可用性限制。第二種途徑自乙醯乙醯基-CoA合成BDO且能夠達成1.091mol/mol葡萄糖之最大理論產率(參見圖9)。任一途徑之實施方案皆可藉由將兩種外源性酶引入諸如大腸桿菌等宿主生物體中來達成，且兩種途徑皆另外可經由琥珀醯基-CoA來補充BDO產生。下文進一步闡述途徑酶、熱力學、理論產率及總體可行性。
高絲胺酸途徑亦可經改造以生成產生BDO之微生物。高絲胺酸係蘇胺酸及甲硫胺酸代謝中之中間體，其係經由天冬胺酸酯自草醯乙酸酯形成。草醯乙酸酯轉變成高絲胺酸需要一個NADH、兩個NADPH及一個ATP(圖2)。在形成後，高絲胺酸提供給用於蘇胺酸與甲硫胺酸二者之生物合成途徑中。在多數生物體中，高含量蘇胺酸或甲硫胺酸反饋而阻抑高絲胺酸生物合成途徑(Caspi等人，Nucleic AcidsRes.34：D511-D516(1990))。
高絲胺酸轉化成4-羥基丁酸酯(4-HB)可在如本文所述兩個酶促步驟中達成。此途徑之第一步驟係藉由推定氨裂解酶將高絲胺酸去胺。在步驟2中，由推定還原酶以一個NADH之代價將產物烯烴4-羥基丁-2-烯酸酯還原成4-HB。然後可將4-HB轉變成BDO。
本文揭示可用於催化上述轉化之酶。例如，該途徑之步驟1中之氨裂解酶極其類似於天冬胺酸酯氨裂解酶(天冬胺酸酶)之化學性質。天冬胺酸酶係廣泛分佈於微生物中之酶，且已進行深入表徵(Viola,R.E.,Mol.Biol.74：295-341(2008))。已解析大腸桿菌天冬胺酸酶之晶體結構(Shi等人，Biochemistry 36：9136-9144(1997))，因此，可直接改造該酶之活性位點之突變，此會改變其受質特異性以包括高絲胺酸。在大腸桿菌TCA循環中，步驟2中之氧化還原酶具有類似於若干充分表徵之酶(包括富馬酸還原酶)之化學性質。由於此反應之熱力學高度有利，因此具有廣泛受質特異性之內源性還原酶將可能能夠還原4-羥基丁-2-烯酸酯。此途徑在厭氧性條件下之產率係0.9mol BDO/mol葡萄糖。
發現，琥珀醯基-CoA途徑因其更高能有效之事實而具有更高產率。一個草醯乙酸酯分子經由高絲胺酸途徑轉變成BDO將需要消耗2當量ATP。由於假定PEP羧基激酶可逆時葡萄糖轉變成兩個草醯乙酸酯分子可生成最大3個ATP分子，因此葡萄糖經由高絲胺酸總體轉變成BDO具有負能量產率。如所預計，若假定能量可經由呼吸生成，則高絲胺酸途徑之最大產率增加至1.05mol/mol葡萄糖，此係琥珀醯基-CoA途徑產率之96%。琥珀醯基-CoA途徑可引導一些碳通量經過丙酮酸去氫酶及TCA循環之氧化支路以生成還原當量與琥珀醯基-CoA二者，而不消耗能量。因此，其由於並未將全部通量皆引導經過草醯乙酸酯至琥珀醯基-CoA至BDO而不會遇到與高絲胺酸途徑相同之能量困難。總之，高絲胺酸途徑顯示達成BDO之高產率路徑。
乙醯乙酸酯途徑亦可經改造以生成產生BDO之微生物。乙醯乙酸酯可藉由參與脂肪酸代謝之酶(包括乙醯基-CoA乙醯基轉移酶及乙醯乙醯基-CoA轉移酶)自乙醯基-CoA形成。經由乙醯乙酸酯之生物合成路徑亦尤其可用於可代謝諸如一氧化碳、二氧化碳或甲醇等單碳化合物之微生物以形成乙醯基-CoA。
可使用自乙醯乙醯基-CoA至4-胺基丁酸酯之三步驟路徑(參見圖9C)經由乙醯乙醯基-CoA合成BDO。可將4-胺基丁酸酯轉變成琥珀酸半醛，如圖8B中所示。可在三個還原步驟後將琥珀酸半醛(其係一個自琥珀醯基-CoA去除之還原步驟或一個自α-酮戊二酸酯去除之去羧步驟)轉變成BDO(圖1)。簡言之，此途徑之步驟1涉及藉由(例如)由atoA及atoD基因編碼之大腸桿菌乙醯乙醯基-CoA轉移酶將乙醯乙醯基-CoA轉變成乙醯乙酸酯(Hanai等人，Appl.Environ.Microbiol.73：7814-7818(2007))。乙醯乙醯基-CoA生物途徑之步驟2需要藉由ω-胺基轉移酶將乙醯乙酸酯轉變成3-胺基丁酸酯。使來自反硝化產鹼桿菌(Alcaligens denitrificans)之ω-胺基酸：丙酮酸酯胺基轉移酶(ω-APT)在大腸桿菌中過表現且其顯示在活體外對3-胺基丁酸酯具有高活性(Yun等人，Appl.Environ.Microbiol.70：2529-2534(2004))。
在步驟2中，推定胺基變位酶將胺基自碳主鏈之3位移位至4位。對3-胺基丁酸酯之實施此功能之胺基變位酶尚未進行表徵，但來自史迪克蘭梭菌之酶具有極相似之機制。D-離胺酸-5,6-胺基變位酶參與離胺酸生物合成。
自乙醯乙醯基-CoA至BDO之合成路徑經過4-胺基丁酸酯，即大腸桿菌中通常自麩胺酸酯去羧形成之代謝物。在形成後，可藉由4-胺基丁酸轉胺酶(2.6.1.19)(即已進行生物化學表徵之酶)將4-胺基丁酸酯轉變成琥珀酸半醛。
關於選擇此途徑中之候選酶之一個考慮因素係參與步驟2及3之 酶之立體選擇性。反硝化產鹼桿菌中之ω-ABT對3-胺基丁酸酯之L-立體異構物具有特異性，而D-離胺酸-5,6-胺基變位酶可能需要D-立體異構物。若最初並未發現或改造具有互補立體選擇性之酶，則可將第三種酶添加該途徑，該第三種酶具有可將L-3-胺基丁酸酯轉變成D-3-胺基丁酸酯之消旋酶活性。儘管胺基酸消旋酶分佈廣泛，但不瞭解該等酶是否可對ω-胺基酸發揮功能。
此途徑在厭氧性條件下之最大理論莫耳產率係1.091mol/mol葡萄糖。為了生成自乙醯乙醯基-CoA至BDO之通量，必需假定，乙醯基-CoA：乙醯乙醯基-CoA轉移酶係可逆的。此酶在大腸桿菌中之功能係藉由首先將短鏈脂肪酸轉變成硫酯來代謝該等短鏈脂肪酸。
儘管乙醯基-CoA：乙醯乙醯基-CoA轉移酶在消耗乙酸酯之方向上之運作尚未在大腸桿菌中進行實驗證實，但對其他生物體中相似酶之研究支持此反應不可逆之假定。腸道微生物羅氏菌(Roseburia sp.)及普拉梭菌(F.prasnitzii)中之酶丁醯基-CoA：乙酸酯：CoA轉移酶在乙酸酯利用方向上作用以產生丁酸酯(Duncan等人，Appl.Environ.Microbiol 68：5186-5190(2002))。布魯氏錐蟲中另一極相似之酶乙醯基：琥珀酸CoA-轉移酶亦在乙酸酯利用方向上作用。此反應具有接近平衡之△rxnG，因此高濃度乙酸酯可驅動在所關注方向上之反應。在1.09mol/mol葡萄糖之最大理論BDO產生率下，模擬預測，大腸桿菌可生成1.098mol ATP/mol葡萄糖，而無發酵副產物。此ATP產率對於細胞生長、維持及產生應足夠。乙醯乙醯基-CoA生物途徑係自乙醯基-CoA達成BDO之高產率路徑。
因此，除先前所例示用於在所選宿主中建立4-HB生物合成之各種修飾中之任一者外，產生BDO之微生物亦可包括4-HB途徑代謝修飾之任一先前組合及排列，以及非CoA依賴性醛去氫酶、CoA依賴性醛去氫酶或醇去氫酶或本文所揭示用以生成GBL及/或BDO之生物合 成途徑之其他酶之表現的任一組合。因此，本發明之BDO產生者可具有(例如)對應於本文所揭示任一4-HB途徑酶及/或任一者BDO途徑酶之一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或最多全部酶之外源性表現。
經遺傳修飾之微生物之設計及構築係使用達成足以產生BDO之表現量之相關技藝熟知之方法來實施。特定而言，本發明之非天然微生物可達成BDO之生物合成，使細胞內濃度介於約0.1-200mM或更高之間，介於例如約0.1-25mM或更高之間，如上文所論述。例如，BDO之細胞內濃度介於約3-20mM之間，尤其介於約5-15mM之間且更特定而言介於約8-12mM之間，包括約10mM或更高。介於該等實例性範圍中每一者之間及高於其之細胞內濃度亦可自本發明之非天然微生物達成。與4-HB產生者一樣，BDO產生者亦可在厭氧性條件下維持、培養或發酵。
本發明進一步提供產生4-HB之方法。該方法包括在實質上厭氧性之條件下將具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成途徑之非天然微生物培養足以產生單體4-羥基丁酸(4-HB)之時間，該途徑包含至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去羧酶。該方法另外可包括(例如)4-HB至GBL及至BDO或THF之化學轉變。
另外提供產生4-HB之方法。該方法包括在實質上厭氧性之條件下將具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成途徑之非天然微生物培養足以產生單體4-羥基丁酸(4-HB)之時間，該途徑包括至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或α-酮戊二酸去羧酶。4-HB產物可分泌至培養基中。
進一步提供產生BDO之方法。該方法包括將非天然微生物生物觸媒或微生物培養足以產生1,4-丁二醇(BDO)之時間，該微生物包含具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成途徑之微生物，該等途徑包括至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉羥基丁醯基酶、α-酮戊二酸去羧酶、醛去氫酶、醇去氫酶或醛/醇去氫酶。BDO產物可分泌至培養基中。
另外提供藉由培養本發明之具有BDO途徑之非天然微生物來產生BDO之方法。該BDO途徑可包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該表現係在一定條件下進行且持續足以產生BDO之時間，該BDO途徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶或4-羥基丁醯基-CoA去氫酶(參見實例VII及表17)。
或者，BDO途徑可包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該表現係在一定條件下進行且持續足以產生BDO之時間，該BDO途徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-胺基丁醯基-CoA還原酶、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(參見實例VII及表18)。
另外，本發明提供產生BDO之方法，包含具有BDO途徑之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含4-胺基丁酸激酶、4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)、 4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁-1-醇轉胺酶、[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺)、[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸轉胺酶、4-羥基丁醯基磷酸酯去氫酶或4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見實例VII及表19)。
本發明進一步提供產生BDO之方法，包含具有BDO途徑之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二酮基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)、2,5-二酮基戊酸還原酶、α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二酸基-CoA水解酶、α-酮戊二酸基-CoA連接酶、α-酮戊二酸基-CoA還原酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶、α-酮戊二酸基-CoA還原酶(形成醇)、5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶或5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(參見實例VIII及表20)。
本發明另外提供產生BDO之方法，包含具有BDO途徑之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶、麩胺醯基-CoA連接酶，麩胺酸5-激酶、麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)、麩胺醯基-CoA還原酶，麩胺酸-5-半醛還原酶、麩胺醯基-CoA還原酶(形成醇)、2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)、2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶、5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶、5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(參見實例IX及表21)。
本發明另外包括產生BDO之方法，包含具有BDO途徑之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、3-羥基丁醯基-CoA 去水酶、乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶或4-羥基丁醯基-CoA去水酶(參見實例X及表22)。
亦提供產生BDO之方法，包含具有BDO途徑之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含高絲胺酸去胺酶、高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶、高絲胺酸-CoA連接酶、高絲胺酸-CoA去胺酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶、4-羥基丁-2-烯酸還原酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶(參見實例XI及表23)。
本發明另外提供產生BDO之方法，包含具有BDO途徑之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含琥珀醯基-CoA還原酶(形成醇)、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)。此一BDO途徑可進一步包含琥珀醯基-CoA還原酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯基酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)或1,4-丁二醇去氫酶。
亦提供產生BDO之方法，包含具有BDO途徑之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間，該途徑包含至少一種編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現，該BDO途徑包含麩胺酸去氫酶、4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺)、4-胺基丁酸轉胺酶、麩胺酸去羧酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)。
本發明另外提供使用本文所揭示經遺傳修飾之生物體產生期望產物之方法，該等生物體允許藉由增加產物或減少不合意副產物來改良產生例如BDO等期望產物。因此，本發明提供產生1,4-丁二醇(BDO)之方法，包含本文所揭示之非天然微生物在條件下培養足以產生BDO之時間。在一個實施例中，本發明提供使用非天然微生物(包含具有1,4-丁二醇(BDO)途徑之微生物)產生BDO之方法，該途徑包含至少一個編碼BDO途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生BDO之量來表現。在一個實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性琥珀醯基-CoA合成酶(參見實例XII)。例如，琥珀醯基-CoA合成酶可由大腸桿菌sucCD基因編碼。
在另一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性α-酮戊二酸去羧酶(參見實例XIII)。例如，α-酮戊二酸去羧酶可由牛分枝桿菌sucA基因編碼。在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性琥珀酸半醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶及視情況4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶(參見實例XIII)。例如，琥珀酸半醛去氫酶(CoA依賴性)、4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶可由牙齦卟啉單胞菌W83基因編碼。在另一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶(參見實例XIII)。例如，丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶可由丙酮丁醇梭菌buk1及ptb基因編碼。
在再一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性4-羥基丁醯基-CoA還原酶(參見實例XIII)。例如，4-羥基丁醯基-CoA還原酶可由拜氏梭菌ald基因編碼。另外，在本發明實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性4-羥基丁醛還原酶(參見實例XIII)。例如，4-羥基丁醛還原酶可由熱葡糖苷酶地芽孢桿菌adh1基因編碼。在另一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性丙酮酸去氫酶次單元(參見實例XIV)。例如，外源性丙酮酸去氫酶可對NADH不敏感。丙酮酸去氫酶 次單元可由肺炎克雷伯氏菌lpdA基因編碼。在一特定實施例中，微生物之丙酮酸去氫酶次單元基因可在丙酮酸甲酸裂解酶啟動子之控制下。
在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以破壞編碼好氧性呼吸控制調節系統之基因(參見實例XV)。例如，破壞可針對arcA基因。此一生物體可進一步包含破壞編碼蘋果酸去氫酶之基因。在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性對NADH不敏感之檸檬酸合成酶(參見實例XV)。例如，對NADH不敏感之檸檬酸合成酶可由gltA(例如gltA之R163L突變體)編碼。在又一實施例中，微生物經遺傳修飾以表現外源性磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶(參見實例XVI)。例如，磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶可由流感嗜血桿菌磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶基因編碼。應理解，可類似地使用具有合適修飾之本文所例示用於改良BDO產生之菌株，以產生其他期望產物，例如，4-羥基丁酸酯或本文所揭示其他期望產物。
本發明另外提供藉由培養包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物來產生4-羥基丁醛之方法，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含琥珀醯基-CoA還原酶(形成醛)；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶(參見圖58，步驟A-C-D)。本發明亦提供藉由培養包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物來產生4-羥基丁醛之方法，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含α-酮戊二酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶(圖58，步驟B-C-D)。
本發明進一步提供藉由培養包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物來產生4-羥基丁醛之方法，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑 酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含琥珀酸還原酶；4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁酸還原酶(參見圖62，步驟F-C-D)。在再一實施例中，本發明提供藉由培養包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物來產生4-羥基丁醛之方法，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去氫酶或麩胺酸轉胺酶及麩胺酸去羧酶及4-胺基丁酸去氫酶或4-胺基丁酸轉胺酶；4-羥基丁酸去氫酶；及4-羥基丁酸還原酶(參見圖62，步驟B或((J或K)-L-(M或N))-C-D)。
本發明亦提供藉由培養包含4-羥基丁醛途徑之非天然微生物來產生4-羥基丁醛之方法，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醛途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醛之量來表現，該4-羥基丁醛途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶(參見圖62，步驟X-Y-Z)。本發明進一步提供藉由培養包含4-羥基丁醯基-CoA途徑之非天然微生物來產生4-羥基丁醯基-CoA之方法，該途徑包含至少一種編碼4-羥基丁醯基-CoA途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生4-羥基丁醯基-CoA之量來表現，該4-羥基丁醯基-CoA途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶；及5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(參見圖62，步驟X-Y-AA)。
本發明另外提供藉由培養包含腐胺途徑之非天然微生物來產生腐胺之方法，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含琥珀酸還原酶；4-胺基丁酸去氫酶或4-胺基丁酸轉胺酶；4-胺基丁酸還原酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟F-M/N-C-D/E)。在又一實施例中，本發明提供藉由培養包含腐胺途徑之非天然微生物來產生腐 胺之方法，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含α-酮戊二酸去羧酶；4-胺基丁酸去氫酶或4-胺基丁酸轉胺酶；4-胺基丁酸還原酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟B-M/N-C-D/E)。本發明另外提供藉由培養包含腐胺途徑之非天然微生物來產生腐胺之方法，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含麩胺酸去氫酶或麩胺酸轉胺酶；麩胺酸去羧酶；4-胺基丁酸還原酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟J/K-L-C-D/E)。
本發明在另一實施例中提供藉由培養包含腐胺途徑之非天然微生物來產生腐胺之方法，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-胺基-2-酮基戊酸去氫酶或5-胺基-2-酮基戊酸轉胺酶；5-胺基-2-酮基戊酸去羧酶；及腐胺去氫酶或腐胺轉胺酶(參見圖63，步驟O-P/Q-R-D/E)。亦提供藉由培養包含腐胺途徑之非天然微生物來產生腐胺之方法，該途徑包含至少一種編碼腐胺途徑酶之外源性核酸，該外源性核酸以足以產生腐胺之量來表現，該腐胺途徑包含α-酮戊二酸還原酶；5-胺基-2-酮基戊酸去氫酶或5-胺基-2-酮基戊酸轉胺酶；鳥胺酸去氫酶或鳥胺酸轉胺酶；及鳥胺酸去羧酶(參見圖63，步驟O-P/Q-S/T-U)。應理解，可使用包含本文所揭示任一途徑之微生物來產生期望產物或中間體，包括4-HB、4-HBal、BDO或腐胺。
應理解，在本發明方法中，可將一或多種外源性核酸中之任一者引入微生物中以產生本發明之非天然微生物。可引入核酸以使(例如)微生物具有4-HB、BDO、THF或GBL生物合成途徑。或者，可引入編碼核酸以產生具有生物合成能力之中間體微生物以催化一些所需反應以賦予4-HB、BDO、THF或GBL生物合成能力。例如，具有4- HB生物合成途徑之非天然微生物可包含至少兩種編碼期望酶之外源性核酸，期望酶係例如以下之組合：4-羥基丁酸去氫酶及α-酮戊二酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶及非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；4-羥基丁酸去氫酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及琥珀醯基-CoA合成酶；琥珀醯基-CoA合成酶及麩胺酸去羧酶及諸如此類。因此，應理解，在本發明之非天然微生物中可包括兩種或更多種生物合成途徑酶之任一組合。相似地，應理解，在本發明之非天然微生物中可視需要包括三種或更多種生物合成途徑酶之任一組合，例如，4-羥基丁酸去氫酶、α-酮戊二酸去羧酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及琥珀醯基-CoA合成酶；4-羥基丁酸去氫酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶等等，只要期望生物合成途徑酶之組合可產生相應期望產物即可。
相似地，例如，對於任一或多種經引入以賦予BDO產生之外源性核酸而言，具有BDO生物合成途徑之非天然微生物可包含至少兩種編碼期望酶之外源性核酸，期望酶係例如以下之組合：4-羥基丁酸去氫酶及α-酮戊二酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶；4-羥基丁酸去氫酶及丁酸激酶；4-羥基丁酸去氫酶及磷酸轉丁醯基酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶及醛去氫酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶及醇去氫酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶及醛/醇去氫酶、4-胺基丁酸-CoA轉移酶及4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶；4-胺基丁酸激酶及4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)及諸如此類。因此，應理解，在本發明之非天然微生物中可包括兩種或更多種生物合成途徑酶之任一組合。相似地，應理解，在本發明之非天然微生物中可包括三種或更多種生物合成途徑酶之任一組合，例如，4-羥基丁酸去氫酶、α-酮戊二酸去羧酶及4-羥基丁醯基 CoA：乙醯基-CoA轉移酶；4-羥基丁酸去氫酶、丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶；4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶及醛去氫酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶、醛去氫酶及醇去氫酶；丁酸激酶、磷酸轉丁醯基酶及醛/醇去氫酶；4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁醯基-CoA還原酶及4-胺基丁-1-醇轉胺酶；3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、3-羥基丁醯基-CoA去水酶及4-羥基丁醯基-CoA去水酶及諸如此類。相似地，在本發明之非天然微生物中可視需要包括如本文所揭示四種、五種、或更多種生物合成途徑酶之任一組合，只要期望生物合成途徑酶之組合可產生相應期望產物即可。
本文所述任一非天然微生物可經培養以產生及/或分泌本發明之生物合成產物。例如，4-HB產生者可經培養用於生物合成產生4-HB。4-HB可如下文所述經分離或處理以生成GBL、THF及/或BDO。相似地，BDO產生者可經培養用於生物合成產生BDO。BDO可經分離或經過進一步處理用於化學合成BDO家族化合物，如本文所揭示。因此，本發明提供使用本發明微生物產生期望產物(例如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺，例如，4-HB或BDO)之方法。視情況，可應用純化或分離步驟，例如蒸餾，以純化諸如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺等產物，例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇。因此，本發明亦提供藉由以下步驟產生諸如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺等經分離或純化產物(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)之方法：本發明之非天然微生物在條件下培養足以產生諸如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺等產物(例如，4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇)之時間，及分離或純化該產物。分離或純化可包含諸如蒸餾等步驟。
生長培養基可包括(例如)可向非天然微生物供給碳源之任一碳水化合物來源。此等來源包括(例如)糖，例如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿 拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖及澱粉；或甘油，且應理解，碳源可單獨用作唯一碳源或與本文所述或相關技藝已知其他碳源組合使用。其他碳水化合物來源包括(例如)可再生原料及生物質。可在本發明方法中用作原料之生物質之實例性類型包括纖維素生物質、半纖維素生物質及木質素原料或部分原料。此等生物質原料含有(例如)可用作諸如以下碳源之碳水化合物受質：葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖及澱粉。鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，亦可使用除彼等上文所例示者外之可再生原料及生物質來培養本發明微生物用於產生本發明之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺及其他化合物。
因此，鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，可產生在諸如碳水化合物等碳源上生長時分泌本發明之生物合成化合物的非天然微生物。此等化合物包括(例如)4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑及/或經組合4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺以及任一中間代謝物。所需要的只是以圖1中所示之一或多種酶活性進行改造以達成期望化合物或中間體之生物合成，包括(例如)納入一些或全部4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑。因此，本發明提供非天然微生物，其當在碳水化合物上生長時分泌4-HB，當在碳水化合物上生長時分泌BDO及/或當在碳水化合物上生長時分泌圖1、8-13、58、62或63中所示之任一中間代謝物。本發明之產生BDO之微生物可起始自(例如)琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸酯、琥珀酸半醛、4-HB、4-羥基丁醯基磷酸酯、4-羥基丁醯基-CoA(4-HB-CoA)及/或4-羥基丁醛之合成。
在一些實施例中，培養條件包括好氧性或實質上厭氧性之生長或維持條件。實例性厭氧性條件先前已進行闡述且為相關技藝所熟 知。用於發酵過程之實例性厭氧性條件闡述於下文實例中。該等條件中之任一者皆可與非天然微生物以及相關技藝熟知之其他厭氧性條件一起採用。在此等厭氧性條件下，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生者可以5-10mM或更高之細胞內濃度以及先前所例示之全部其他濃度分別合成單體4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。
亦可生成諸多下游化合物用於本發明之產生之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之非天然微生物。對於本發明之產生4-HB之微生物而言，單體4-HB及GBL平衡存在於培養基中。4-HB轉變為GBL可藉由(例如)在酸性pH培養基中培養微生物有效地達成。小於或等於7.5(尤其在pH 5.5下或低於pH 5.5)之pH自發地將4-HB轉變成GBL。
可使用相關技藝所熟知之多種方法將所得GBL與培養物中之4-HB及其他組份分離。此等分離方法包括(例如)實例以及方法中例示之萃取程序，其包括連續液液萃取、滲透蒸發、膜過濾、膜分離、逆滲透、電透析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離心交換層析、分子大小篩選層析、吸附層析及超濾。所有上述方法皆為相關技藝所熟知。所分離GBL可進一步藉由(例如)蒸餾純化。
可自本發明之產生4-HB之非天然微生物產生之另一下游化合物包括(例如)BDO。此化合物可藉由(例如)GBL之化學氫化合成。化學氫化反應為相關技藝所熟知。一個實例性程序包括使用異相或均相氫化觸媒連同氫，或以化學計量方式或催化方式使用之基於氫化物之還原劑將源自培養物之4-HB及/或GBL或該兩種組份之混合物化學還原，以產生1,4-丁二醇。
相關技藝所熟知之其他程序同樣可適用於上述化學反應且包括(例如)WO第82/03854號(Bradley等人)，其闡述氣相中γ-丁內酯經由氧化銅及氧化鋅觸媒之氫解。英國專利第1,230,276號，其闡述使用氧化 銅-氧化鉻觸媒對γ-丁內酯之氫化。在液相中實施氫化。亦例示具有高總反應器壓力之分批反應。反應器中之反應物及產物分壓遠高於各別露點。英國專利第1,314,126號，其闡述液相中之γ-丁內酯經由鎳-鈷-釷氧化物觸媒之氫化。分批反應例示為具有高總壓力及遠高於各別組份露點之組份分壓。英國專利第1,344,557號，其闡述液相中之γ-丁內酯經由氧化銅-氧化鉻觸媒之氫化。氣相或含蒸氣混合相指示為在一些情況下適宜。例示使用高總反應器壓力之連續流動管狀反應器。英國專利第1,512,751號，其闡述液相中之γ-丁內酯至1,4-丁二醇經由氧化銅-氧化鉻觸媒之氫化。例示具有高總反應器壓力之分批反應，且其中可測定反應物及產物分壓遠高於各別露點。美國專利第4,301,077號，其闡述γ-丁內酯經由Ru-Ni-Co-Zn觸媒氫化成1,4-丁二醇。可在液相或氣相中或在混合液-氣相中實施該反應。例示高總反應器壓力及相對較低之反應器生產率下之連續流動液相反應。美國專利第4,048,196號，其闡述藉由經由氧化銅-氧化鋅觸媒將γ-丁內酯液相氫化來產生1,4-丁二醇。進一步例示在高總反應器壓力以及高反應物及產物分壓下操作之連續流動管狀反應器。及美國專利第4,652,685號，其闡述內酯至二酶之氫化。
可自本發明之產生4-HB之微生物產生之又一下游化合物包括(例如)THF。此化合物可藉由(例如)GBL之化學氫化合成。一個相關技藝所熟知可適用於將GBL轉變成THF之實例性程序包括(例如)使用異相或均相氫化觸媒連同氫，或以化學計量方式或催化方式使用之基於氫化物之還原劑將源自培養物之4-HB及/或GBL或該兩種組份之混合物化學還原，以產生四氫呋喃。相關技藝所熟知之其他程序同樣可適用於上述化學反應且包括(例如)美國專利第6,686,310號，其闡述高表面積溶膠-凝膠路徑製備之氫化觸媒。亦闡述將馬來酸還原成四氫呋喃(THF)及1,4-丁二醇(BDO)以及將γ丁內酯還原成四氫呋喃及1,4-丁二醇 之方法。
培養條件可包括(例如)液體培養程序以及發酵及其他大規模培養程序。如下文實例中所進一步闡述，本發明生物合成產物之尤其有用之產率可在好氧性或實質上厭氧性之培養條件下獲得。
用以測試4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生之適宜純化及/或分析可使用熟知方法實施。對於欲測試之各改造菌株，可使諸如一式三份培養物等適宜重複生長。例如，可監測經改造產生宿主中之產物及副產物形成。最終產物及中間體以及其他有機化合物可藉由諸如HPLC(高效液相層析)、GC-MS(氣相層析-質譜)及LC-MS(液相層析-質譜)等方法或其他適宜分析方法使用相關技藝所熟知之常規程序來分析。亦可利用培養物上清液來測試發酵營養液中之產物之釋放。副產物及殘餘葡萄糖可藉由HPLC使用(例如)用於葡萄糖及醇之折射率檢測器及用於有機酸之UV檢測器(Lin等人，Biotechnol.Bioeng.90：775-779(2005))或相關技藝所熟知之其他適宜分析及檢測方法來定量。來自外源性DNA序列之個別酶或蛋白質活性亦可使用相關技藝所熟知之方法分析。
可使用相關技藝所熟知之多種方法將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產物與培養物中之其他組份分離。此等分離方法包括(例如)萃取程序以及方法，包括連續液液萃取、滲透蒸發、膜過濾、膜分離、逆滲透、電透析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離心交換層析、分子大小篩選層析、吸附層析及超濾。所有上述方法皆為相關技藝所熟知。
本發明進一步提供製造4-HB之方法。該方法包括在實質上厭氧性之條件下使具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成途徑之非天然微生物發酵足以產生單體4-羥基丁酸(4-HB)之時間，該途徑包含至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、非CoA依賴性琥珀酸半醛 去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去羧酶，該製程包含分批補料發酵及分批分離；分批補料發酵及連續分離或連續發酵及連續分離。
上述培養及化學氫化亦可連續按比例放大並生長，用於製造4-HB、4-HBal、4-HBCoA、GBL、BDO及/或THF或腐胺。實例性生長程序包括(例如)分批補料發酵及分批分離；分批補料發酵及連續分離或連續發酵及連續分離。所有該等製程皆為相關技藝所熟知。採用4-HB產生者允許藉由同時採用上述氫化程序與諸如發酵等連續培養方法同時進行4-HB生物合成及至GBL、BDO及/或THF之化學轉變。其他氫化程序亦為相關技藝所熟知且可同樣應用於本發明方法。
發酵程序尤其可用於生物合成產生商業量之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。通常，且與非連續培養程序一樣，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之連續及/或接近連續產生將包括在充足營養素及培養基中培養本發明之產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之非天然生物體以維持及/或接近維持指數期內之生長。在此等條件下之連續培養可包括(例如)生長或培養1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更長。另外，連續培養可包括1週、2週、3週、4週或5週或更多週及長達數月之更長時期。或者，若適於特定應用，則本發明生物體可培養數小時。應理解，連續及/或接近連續培養條件亦可包括該等實例性時期之間之所有時間間隔。應進一步理解，培養本發明微生物之時間係足以產生足量期望目的用產物之時間。
發酵程序為相關技藝所熟知。簡言之，用於生物合成產生本發明之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或其他4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺源產物(包括中間體)之發酵可用於(例如)分批補料發酵及分批分離；分批補料發酵及連續分離或連續發酵及連續分 離。相關技藝所熟知之分批及連續發酵程序之實例進一步例示於下文實例中。
除了上述使用本發明之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生者分別連續產生大量4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺(包括單體4-HB)之發酵程序外，4-HB產生者亦可(例如)同時進行化學合成程序以將產物轉變成其他化合物或如先前所述用於將單體4-HB化學轉變成(例如)GBL、BDO及/或THF之產物。相似地，BDO產生者可(例如)同時進行如先前針對BDO至(例如)THF、GBL、吡咯啶酮及/或其他BDO家族化合物之化學轉變所述之化學合成程序。另外，若需要，可自發酵培養物分離4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生者之產物且使其依序進行化學或酶促轉變以將產物轉變成其他化合物，如本文所揭示。
簡言之，發酵營養液中之GBL之氫化可如Frost等人，Biotechnology Progress 18：201-211(2002)所闡述來實施。在發酵期間用於氫化之另一程序包括(例如)闡述於(例如)美國專利第5,478,952號中之方法。此方法進一步例示於下文實例中。
因此，本發明另外提供製造γ-丁內酯(GBL)、四氫呋喃(THF)或1,4-丁二醇(BDO)之方法。該方法包括在實質上厭氧性之條件下使具有4-羥基丁酸(4-HB)及/或1,4-丁二醇(BDO)生物合成途徑之非天然微生物發酵足以產生1,4-丁二醇(BDO)、GBL或THF之時間，該等途徑包含至少一種編碼以下酶之外源性核酸：4-羥基丁酸去氫酶、非CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶、麩胺酸去羧酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉丁醯基酶、CoA依賴性1,4-丁二醇半醛去氫酶、CoA依賴性1,4-丁二醇半醛去氫酶、CoA依賴性1,4-丁二醇醇去氫酶或CoA依賴性1,4-丁二醇醇去氫 酶，該發酵包含分批補料發酵及分批分離；分批補料發酵及連續分離或連續發酵及連續分離。
除如本文所述本發明之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺及其他產物之生物合成外，本發明之非天然微生物及方法亦可彼此及/或與相關技藝所熟知之其他微生物及方法進行各種組合利用以藉由其他路徑達成產物生物合成。例如，一種除使用4-HB產生者及化學步驟外或除使用BDO產生者外產生BDO之替代方式係直接經由添加能夠將本文所例示4-HB或4-HB產物轉變成BDO之另一微生物。
一種此類程序包括(例如)使本發明之產生4-HB之微生物發酵以產生4-HB，如上文及下文所述。然後，4-HB可用作第二種微生物之受質，其將4-HB轉變成(例如)BDO、GBL及/或THF。可直接將4-HB添加至第二生物體之另一培養物，或可藉由(例如)細胞分離耗盡4-HB產生者之原始培養物中之該等微生物，且然後可營養液將第二生物體添加至發酵肉汁中以不經中間純化步驟即產生最終產物。具有以生物化學方式利用4-HB作為用於轉變成BDO之受質之能力的一種實例性第二生物體係(例如)丙酮丁醇梭菌(例如，參見Jewell等人，Current Microbiology,13：215-19(1986))。
因此，此一程序包括(例如)產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體之微生物之發酵。然後，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體可用作用於將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體轉變成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之第二種微生物的受質。可直接將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體添加至第二生物體之另一培養物，或可藉由(例如)細胞分離耗盡4-HB、4-HBal、4-HBCoA BDO或腐胺途徑中間體產生者之原始培養物中之該等微生物，且然後可將營養液第二生物體添加至發酵肉汁中以不經中間純化步驟即產生最終產物。
在其他實施例中，本發明之非天然微生物及方法可以眾多種亞途徑組裝以達成(例如)如本文所述4-HB及/或BDO之生物合成。在該等實施例中，用於本發明期望產物之生物合成途徑可分隔在不同微生物中且不同微生物可經共培養以產生最終產物。在此一生物合成方案中，一種微生物之產物係第二種微生物之受質，直至合成最終產物為止。例如，BDO之生物合成可如先前所述藉由構築含有用於將一種途徑中間體轉變成另一途徑中間體或產物之生物合成途徑之微生物來達成，例如，諸如內源性琥珀酸酯等受質經由4-HB至最終產物BDO。或者，BDO亦可經由使用兩種生物體在相同容器中共培養或共發酵自微生物以生物合成方式產生。第一種微生物為具有自琥珀酸產生4-HB之基因之4-HB產生者，且第二種微生物為具有將4-HB轉變成BDO之基因之BDO產生者。例如，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生物合成可藉由構築含有用於將一種途徑中間體轉變成另一途徑中間體或產物之生物合成途徑的微生物來達成。或者，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺亦可經由使用兩種生物體在相同容器中共培養或共發酵自微生物以生物合成方式產生，其中第一種微生物產生4-HB中間體、4-HBal中間體、4-HBCoA中間體、BDO中間體或腐胺中間體且第二種微生物將該中間體轉變成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。
鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，本發明之非天然微生物及方法連同其他微生物、具有亞途徑之其他非天然微生物之共培養物、及相關技藝所熟知用以產生本發明之4-HB、4-HBal、BDO、GBL、THF及腐胺產物之其他化學及/或生物化學程序之組合存在眾多種組合及排列。
相似地，彼等熟習此項技術者應理解，可基於用於引入一或多個基因破壞以增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生之 期望特性來選擇宿主生物體。因此，應理解，若欲將遺傳修飾引入宿主生物體中以破壞基因，則可以相似方式破壞催化相似但不相同之代謝反應之任何同源物、直系同源物或旁系同源物，以確保充分破壞期望代謝反應。由於在不同生物體之代謝網絡內存在某些差異，因此彼等熟習此項技術者應理解，給定生物體中受到破壞之實際基因可在生物體之間有所不同。然而，鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者亦應理解，本發明方法可應用於任何適宜宿主微生物以鑑別在所關注物種中構築將增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成之生物體所需的同類代謝改變。在一特定實施例中，產生增加將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生物合成與生物體之生長偶合，且可專性地將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生與生物體之生長偶合，若需要且如本文所揭示。
應理解，在本發明方法中，可將一或多種外源性核酸中之任一者引入微生物中以產生本發明之非天然微生物。可引入核酸以使微生物具有(例如)4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑。或者，可引入編碼核酸以產生具有生物合成能力之中間體微生物以催化一些所需反應以賦予4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成能力。例如，具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑之非天然微生物可包含至少兩種編碼期望酶或蛋白質(例如如本文所揭示酶之組合(參見實例及圖1、8-13、58、62及63)及諸如此類)之外源性核酸。因此，應理解，在本發明之非天然微生物中可包括兩種或更多種生物合成途徑酶或蛋白質之任一組合。相似地，應理解，例如，在本發明之非天然微生物中可視需要及本文所揭示包括三種或更多種生物合成途徑酶或蛋白質之任一組合，等等，只要期望生物合成途徑酶及/或蛋白質之組合可產生相應期望產物即可。相似地，在本發明之非天然微生物中可視需要包括如本文所揭示 四種或更多種生物合成途徑酶或蛋白質之任一組合，只要期望生物合成途徑酶及/或蛋白質之組合可產生相應期望產物即可。
如本文所揭示，利用酯酶將γ-丁內酯轉變成4-羥基丁酸酯。實例性酯酶包括(但不限於)來自中間耶氏桿菌(Yersinia intermedia)29909(基因座yinte0001_13710)及根癌土壤桿菌菌株C58之酯酶(Carlier等人，Mol.Plant Microbe Interact.17(9)：951-957(2004))(參見實例XXXIV)。耶氏桿菌屬基因(基因座yinte0001_13710)之核苷酸序列及胺基酸序列示於圖89中(亦參見GenBank ZP_04636075.1；GI：238792441)。來自根癌土壤桿菌之基因之核苷酸及胺基酸序列示於圖90中。另外，實例性酯酶包括大腸桿菌KTE10之AttM(GenBank ZP_19612688.1,GI：432369596)及非共生發光桿菌(Photorhabdus asymbiotica)之attM(GenBank YP_003039319.1 GI：253987963)。
本發明另外提供藉由在細胞中表現γ-丁內酯酯酶來減少細胞或細胞培養物中之γ-丁內酯產生之方法。γ-丁內酯酯酶可為(例如)耶氏桿菌屬之γ-丁內酯酯酶或與耶氏桿菌屬之γ-丁內酯酯酶具有至少90%一致性之多肽。在一特定實施例中，γ-丁內酯酯酶係由編碼胺基酸序列SEQ ID NO：179之核酸或編碼與SEQ ID NO：179具有至少90%一致性之多肽之核酸編碼。本發明進一步提供利用γ-丁內酯酯酶來降低活體外試樣中γ-丁內酯之量。
在某些態樣中，編碼本文所揭示胺基酸序列之核酸分子(例如，編碼本發明之4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺途徑酶或蛋白質之核酸分子)可與本文所揭示核苷酸序列具有至少某一一致性。因此，在一些實施例中，核酸分子之核苷酸序列可與本文所揭示核苷酸序列具有至少65%一致性、至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少 95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性或至少99%一致性。在其他態樣中，編碼胺基酸序列之核酸分子可編碼與本文所揭示胺基酸序列具有至少65%一致性、至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性或至少99%一致性之胺基酸序列。因此，在本發明之一些態樣中，編碼4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺途徑酶或蛋白質之核酸分子之核苷酸序列與本文由SEQ ID NO、GenBank及/或GI編號所揭示之核酸或與本文由SEQ ID NO、GenBank及/或GI編號所揭示編碼胺基酸序列之核酸分子雜交的核酸分子具有至少65%一致性、至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性或至少99%一致性。
可在含有本文所揭示核酸分子之載體中提供此等核酸分子。在一些態樣中，載體可為如本文所揭示之表現載體。在宿主細胞中可含有載體。在一些態樣中，宿主細胞可為具有產生4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺之途徑之非天然微生物。含於宿主細胞中之核酸分子可使用熟習此項技術者所熟知之方法(例如使用允許核酸分子在期望宿主細胞中表現之啟動子及/或增強子)表現。多種誘導型啟動子或增強子中之任一者亦可包括在載體中用於調節核酸分子之表現。
本發明宿主細胞可具有整合至宿主染色體中之核酸分子。核酸分子之整合可使用熟習此項技術者所熟知之方法(例如彼等本文所揭示者)進行。例如，用於將核酸整合至本文所述宿主染色體中之方法 並不限於所整合之精確核酸分子。應理解，熟習此項技術者能夠應用該等相同方法於宿主細胞基因組內之相同或替代位點整合期望核酸。在一些態樣中，本發明核酸分子之整合可具有位點特異性。在一些態樣中，位點特異性整合將針對最低量之核酸分子，例如期望多肽之編碼區，其可由內源性宿主啟動子表現。位點特異性整合方法為彼等熟習此項技術者所熟知，可使用任一數目之該等方法來生成本發明宿主細胞。或者，核酸分子可在細胞中表現，其中該核酸分子並未整合至宿主染色體中，例如，自質粒或另一載體在細胞中表現，如本文所揭示。
在一些實施例中，本發明宿主細胞係能夠發酵之微生物物種。本文闡述能夠發酵之實例性微生物。此外，在一些實施例中，本發明提供具有本發明一或多種宿主細胞之培養基。在一些態樣中，培養基可在培養用於產生4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺之宿主細胞後自本發明宿主細胞純化或實質上純化。純化或實質上純化培養基之方法為熟習此項技術者所熟知且可使用其任一者來生成本發明培養基，包括彼等本文所揭示之方法。
在一些實施例中，本發明提供宿主菌株、構築宿主菌株之方法或利用宿主菌株發酵以產生4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺之方法，其中該宿主菌株包括使一或多個、最多全部天然宿主基因之表現或活性衰減之缺失及/或修飾，該等天然宿主基因編碼催化本文所揭示4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺途徑中之相同反應之多肽(酶)。在一些態樣中，宿主菌株相較於缺失及/或修飾之前之親本菌株提供發酵中之4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺之改良產率。
「同源性」或「一致性」或「相似性」係指兩條多肽之間或兩個核酸分子之間之序列相似性。同源性可藉由比較各序列中可出於比 較目的比對之位置來測定。當比較序列中之位置由相同鹼基或胺基酸佔據時，則分子在該位置處同源。序列間之同源性程度隨序列所共有之匹配或同源位置之數量而變化。
多肽或多肽區(或多核苷酸或多核苷酸區)與另一序列具有某一百分比(例如，65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)之「序列一致性」意指，在比對時在比較兩種序列時，胺基酸(或核苷酸鹼基)之百分比係相同的。序列一致性(亦稱作同源性或相似性)係指兩個核酸分子之間或兩條多肽之間之序列相似性。一致性可藉由比較各序列中可出於比較目的比對之位置來測定。當比較序列中之位置由相同鹼基或胺基酸佔據時，則分子在該位置處一致。序列間之一致性程度隨序列所共有之匹配或同源位置之數量而變化。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用相關技藝已知軟體程式(例如彼等闡述於Ausubel等人(見上文)中者)測定。可使用預設參數進行比對。一種熟知相關技藝所比對程式係BLAST，其可與預設參數一起使用。特定而言，程式係BLASTN及BLASTP，使用以下預設參數：遺傳密碼=標準；篩選=無；鏈=兩條；截止=60；預期=10；矩陣=BLOSUM62；描述=50個序列；分類依據=高評分；數據庫=非冗餘，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS轉譯+SwissProtein+SPupdate+PIR。該等程式之細節可參見National Center for Biotechnology Information(NCBI)。
編碼本發明之4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺途徑酶或蛋白質之核酸分子亦可包括與本文由SEQ ID NO、GenBank及/或GI編號所揭示核酸雜交之核酸分子或與本文由SEQ ID NO、GenBank及/或GI編號所揭示編碼胺基酸序列之核酸分子雜交的核酸分子。雜交條件可包括為熟習此項技術者所熟知之高度嚴格、中度嚴格或低嚴格性雜交條件，例如彼等本文所述者。相似地，可用於本發明 中之核酸分子可闡述為與本文由SEQ ID NO、GenBank及/或GI編號所揭示之核酸或與本文由SEQ ID NO、GenBank及/或GI編號所揭示編碼胺基酸序列之核酸分子雜交之核酸分子具有某一序列一致性百分比。例如，核酸分子可與本文所述核酸具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
嚴格雜交係指經雜交多核苷酸穩定之條件。如彼等熟習此項技術者已知，經雜交多核苷酸之穩定性以雜合體之解鏈溫度(Tm)反映。一般而言，經雜交多核苷酸之穩定性隨鹽濃度(例如，鈉離子濃度)及溫度而變化。雜交反應可在較低嚴格性之條件下實施，之後進行不同但較高嚴格性之洗滌。對雜交嚴格性之提及係指此等洗滌條件。高度嚴格之雜交包括允許僅彼等在65℃下在0.018M NaCl中形成穩定經雜交多核苷酸之核酸序列雜交之條件，例如，若雜合體在65℃下在0.018M NaCl中不穩定，則其將在高嚴格性條件下不穩定，如本文所涵蓋。可藉由(例如)以下方式提供高嚴格性條件：在42℃下在50%甲醯胺、5×登哈特氏溶液(Denhart's solution)、5×SSPE、0.2% SDS中雜交，之後在65℃下在0.1×SSPE及0.1% SDS中洗滌。亦可使用除高度嚴格雜交條件以外之雜交條件來闡述本文所揭示之核酸序列。例如，片語中度嚴格雜交係指等效於在42℃下在50%甲醯胺、5×登哈特氏溶液、5×SSPE、0.2% SDS中雜交，之後在42℃下在0.2×SSPE、0.2% SDS中洗滌之條件。片語低嚴格性雜交係指等效於在22℃下在10%甲醯胺、5×登哈特氏溶液、6×SSPE、0.2% SDS中雜交，之後在37℃下在1×SSPE、0.2% SDS中洗滌之條件。登哈特氏溶液含有1% Ficoll、1%聚乙烯基吡咯啶酮及1%牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化鈉、磷酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化鈉、0.2M磷酸鈉及0.025M(EDTA)。其他適宜之低度、中度及高嚴格性雜交緩衝液及條件為 彼等熟習此項技術者所熟知且闡述於(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Baltimore,MD(1999)中。
若需要，所編碼多肽可藉由相關技藝所熟知之多種方法分離，該等方法係(例如)重組表現系統、沈澱、凝膠過濾、離子交換、反相及親和力層析及諸如此類。其他熟知方法闡述於Deutscher等人，Guide to Protein Purification：Methods in Enzymology，第182卷(Academic Press,(1990))中。或者，本發明之所分離多肽可使用熟知重組方法獲得(例如，參見Sambrook等人，見上文，1989；Ausubel等人，見上文，1999)。用於本發明多肽之生物化學純化之方法及條件可由彼等熟習此項技術者選擇，且可藉由(例如)功能分析來監測純化。
製備多肽之方法之一個非限制性實例係使用相關技藝所熟知之方法在適宜宿主細胞(例如細菌細胞、酵母菌細胞或另一適宜細胞)中表現編碼多肽之核酸及再次使用熟知純化方法回收所表現多肽，如本文所述。多肽可直接自已經如本文所述表現載體轉化之細胞分離。重組表現多肽亦可表現為與合適親和力標籤(例如麩胱甘肽S轉移酶(GST)或聚His)之融合蛋白質，且若需要可經親和力純化。因此，多肽可由宿主細胞產生，如本文所揭示。多肽亦可使用熟習此項技術者所熟知之多肽合成方法藉由化學合成產生。
在一些實施例中，本發明提供使用本文所揭示多肽作為生物觸媒。本文所用「生物觸媒」係指起始或修改化學反應之速率之生物物質。生物觸媒可為酶。可使用多肽來增加受質至產物之轉變率，如本文所揭示。在工業反應之背景下，可使用不存在宿主細胞之多肽，來 改良生成4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO及/或腐胺之反應，例如，使用活體外方法達成。
在一些實施例中，本發明提供構築宿主菌株之方法，其尤其可包括將本文所揭示載體引入能夠發酵之宿主細胞中之步驟。可使用相關技藝所熟知之技術將載體穩定或瞬時地引入宿主細胞中，該等技術包括(但不限於)偶聯、電穿孔、化學轉化、轉導、轉染及超音波轉化。本文揭示其他方法，其任一者皆可用於本發明方法中。
為了生成更佳產生者，可利用代謝建模來將生長條件最佳化。亦可使用建模來設計另外將途徑之利用最佳化之基因敲除(例如，參見美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466以及美國專利第7,127,379號)。建模分析允許可靠預測使代謝向更有效地產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺轉變對細胞生長之效應。
一種鑑別及設計有助於期望產物生物合成之代謝改變之計算方法係OptKnock計算框架(Burgard等人，Biotechnol.Bioeng.84：647-657(2003))。OptKnock係代謝建模及模擬程式，其提出得到過度產生靶產物之遺傳穩定微生物之基因缺失或破壞策略。具體而言，該框架檢查微生物之完整代謝及/或生物化學網絡以促成迫使期望生物化學變成細胞生長之專性副產物之遺傳操縱。藉由經由策略性地放置之基因缺失或其他功能基因破壞將生物化學產生與細胞生長偶合，在生物反應器中經過長時期後施加於經改造菌株之生長選擇壓力可因強制性生長偶合性生物化學產生而改良性能。最後，當構築基因缺失時，所設計菌株回復至其野生型狀態之可能性係可忽略的，此乃因將自基因組完全去除藉由OptKnock選擇之基因。因此，此計算方法可用於鑑別生物合成期望產物之替代途徑或結合非天然微生物使用，用於將期望 產物之生物合成進一步最佳化。
簡言之，OptKnock係在本文中用於指用於對細胞代謝建模之計算方法及系統的術語。OptKnock程式係指將特定約束條件納入通量平衡分析(FBA)模型中之模型及方法之框架。該等約束條件包括(例如)定性動力學資訊、定性調節資訊及/或DNA微陣列實驗數據。OptKnock亦藉由(例如)以下方式來計算各種代謝問題之解決方案：緊縮經由通量平衡模型獲得之通量邊界且隨後探測在基因添加或缺失存在下代謝網絡之性能限制。OptKnock計算框架允許構築允許有效查詢代謝網絡之性能限制之模型制定且提供對所得混合整數線性程式化問題求解之方法。本文中稱作OptKnock之代謝建模及模擬方法闡述於(例如)2002年1月10日提出申請之美國公開案2002/0168654、2002年1月10日提出申請之國際專利第PCT/US02/00660號及2007年8月10日提出申請之美國公開案2009/0047719中。
鑑別及設計有助於產物生物合成產生之代謝改變的另一計算方法係稱為SimPheny®之代謝建模及模擬系統。此計算方法及系統闡述於(例如)2002年6月14日提出申請之美國公開案2003/0233218及2003年6月13日提出申請之國際專利申請案第PCT/US03/18838號中。SimPheny®係可用於產生電腦上之網絡模型及用於模擬經過生物系統之化學反應之質量、能量或電荷之通量的計算系統，用以界定含有該系統中之化學反應之任何及所有可能功能性的解空間，藉此測定該生物系統之所允許活性範圍。此方式稱作基於約束條件之建模，此乃因解空間係藉由諸如以下等約束條件界定：所包括反應之已知化學計量以及與經過反應之最大通量相關之反應熱力學及能力約束條件。藉由該等約束條件界定之空間可經外推以測定生物系統或其生物化學組份之表型能力及性質。
該等計算方式與生物真實性一致，此乃因生物系統具有靈活性 且可以許多不同方式達成相同結果。生物系統係經由已受到所有活系統必須面對之基本約束條件限制之進化機制來設計。因此，基於約束條件之建模策略涵蓋該等一般真實性。此外，經由緊縮約束條件對網絡模型連續施加進一步限制之能力可減小解空間之大小，藉此增強可預測生理性能或表型之精確度。
鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應能夠應用用於代謝建模及模擬之各種計算框架來設計並實施在宿主微生物中生物合成期望化合物。此等代謝建模及模擬方法包括(例如)上文例示為SimPheny®及OptKnock之計算系統。在說明本發明時，本文參考用於建模及模擬之OptKnock計算框架來闡述一些方法。彼等熟習此項技術者應瞭解，如何將使用OptKnock鑑別、設計及實施代謝改變應用於相關技藝所熟知之此等其他代謝建模及模擬計算框架及方法中之任一者。
上述方法將提供一組用以破壞之代謝反應。該組或代謝修飾內各反應之消除可產生作為生物體生長階段期間之專性產物之期望產物。由於已知該等反應，因此雙重OptKnock問題之解決方案亦將提供一或多種編碼一或多種催化該組反應內各反應之酶之相關基因。一組反應及其編碼參與各反應之酶之相應基因的鑑別通常為經由分析該等反應與具有酶與編碼基因間之關係之反應數據庫之相關性來達成的自動過程。
在鑑別後，藉由在功能上破壞至少一種編碼該組反應內各代謝反應之基因在靶細胞或生物體中實施欲經破壞以達成期望產物之產生的該組反應。一種用以達成反應組之功能破壞的尤其有用之手段係藉由各編碼基因之缺失。然而，在一些情況下，藉由其他遺傳畸變破壞反應可能有益，該等畸變包括(例如)諸如啟動子或調節因子之順式結合位點等調節區之突變、缺失或諸多位置中任一者處之編碼序列之截 短。例如，當期望對產物之偶合進行快速評價時或當不太可能發生遺傳回復時，產生小於完全缺失之基因集之該等較後畸變可能有用。
為了鑑別上述雙重OptKnock問題之其他富有成效之解決方案，該等方案產生其他組用以破壞之反應或可產生期望產物之生物合成(包括生長偶合性生物合成)之代謝修飾，可實施稱為整數分割(integer cut)之最佳化方法。此方法藉由於各次迭代納入稱作整數分割之另一約束條件對上文所例示之OptKnock問題迭代求解來進行。整數分割約束條件有效地防止求解程序選擇在專性地將產物生物合成與生長偶合之任一先前迭代中鑑別之實際相同的反應組。例如，若先前所鑑別之生長偶合性代謝修飾指定反應1、2及3用於破壞，則以下以下約束條件防止在隨後求解中同時考慮相同反應。整數分割方法為相關技藝所熟知且可發現於例如Burgard等人，Biotechnol.Prog.17：791-797(2001)。與所有本文參考與用於代謝建模及模擬之OptKnock計算框架組合使用之方法一樣，減少迭代計算分析冗餘之整數分割方法亦可與相關技藝所熟知之其他計算框架(包括例如SimPheny®)一起應用。
本文所例示方法允許構築生物合成產生期望產物之細胞及生物體，包括將靶生物化學產物之產生與經改造而具有所鑑別遺傳改變之細胞或生物體之生長專性地偶合。因此，本文所述計算方法允許鑑別及實施藉由選自OptKnock或SimPheny®之電腦上方法鑑別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括(例如)一或多種生物合成途徑酶之添加及/或一或多種代謝反應之功能破壞，包括(例如)藉由基因缺失之破壞。
如上文所論述，OptKnock方法係基於以下前提研發：當經過長期生長選擇時，突變微生物網絡可向其以計算方式預測之最大生長表型進化。換言之，該方式利用生物體在選擇壓力下自我最佳化之能力。OptKnock框架允許基於網絡化學計量窮盡性枚舉迫使生物化學產生與細胞生長之間之偶合之基因缺失組合。最佳基因/反應敲除之 鑑別需要雙重最佳化問題之解決方案，其選擇活性反應組以使得所得網絡之最佳生長溶液過度產生所關注生物化學品(Burgard等人，Biotechnol.Bioeng.84：647-657(2003))。
可採用大腸桿菌代謝之電腦上化學計量模型來鑑別用於如先前所例示及(例如)以下專利中所述之代謝途徑之基本基因：美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466及美國專利第7,127,379號。如本文所揭示，可應用OptKnock數據框架來準確找到產生期望產物之生長偶合性產生之基因缺失。此外，雙重OptKnock問題之解決方案僅提供一組缺失。為枚舉所有有意義之解決方案，亦即，所有導致生長偶合性產生形成之敲除組，可實施稱為整數分割之最佳化技術。此需要藉由於各迭代納入稱作整數分割之另一約束條件對OptKnock問題迭代求解，如上文所論述。
上文所例示及下文實例中進一步說明之方法允許構築生物合成產生之細胞及生物體，包括將靶生物化學產物之產生與經改造而具有所鑑別遺傳改變之細胞或生物體之生長專性地偶合。就此而言，已鑑別出可生物合成4-HB及1,4-丁二醇之代謝改變。依所鑑別代謝改變所構築之微生物菌株相較於未經修飾微生物可產生較高量之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。該等菌株有利於在沒有負選擇壓力下，可在(例如)連續發酵過程中商業生產4-HB、BDO、THF、GBL、4-HBal、4-HBCoA或腐胺。
因此，本文所述計算方法允許鑑別及實施藉由選自OptKnock或SimPheny®之電腦上方法鑑別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括(例如)一或多種生物合成途徑酶之添加及/或一或多種代謝反應之功能破壞，包括(例如)藉由基因缺失之破壞。
應理解，不會實質上影響本發明各實施例之作用的修改亦包含於本文所提供之本發明定義內。因此，以下實例意欲說明但並不限制本發明。
本文所述任一非天然微生物可經培養以產生及/或分泌本發明之生物合成產物。例如，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生者可經培養用於生物合成產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。因此，在一些實施例中，本發明提供具有本文所述4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體之培養基。在一些態樣中，亦可將培養基與產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中間體之本發明之非天然微生物分離。自培養基分離微生物之方法為相關技藝所熟知。實例性方法包括過濾、絮凝、沈澱、離心、沉降及諸如此類。
對於4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生而言，在具有碳源及其他必需營養素之培養基中培養重組菌株。有時且可能非常需要維持發酵器中之厭氧性條件以降低總過程之成本。可由例如首先用氮噴灑培養基且然後用帶有隔膜及卷邊之蓋密封燒瓶獲得此等條件。對於未觀察到厭氧性生長之菌株而言，可藉由將隔膜穿孔成帶有小孔以有限通氣來施用微好氧性或實質上厭氧性之條件。厭氧性條件實例先前已闡述且為相關技藝所熟知。實例性好氧性及厭氧性之條件闡述於例如2007年8月10日申請之美國公開案2009/0047719中。發酵可以分批、分批補料或連續方式實施，如本文所揭示。若需要，發酵亦可分兩個階段實施。第一個階段可為好氧性以允許高度生長及因此高生產率，之後為高4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產率之厭氧性階段。
若需要，可視需要藉由添加鹼(例如NaOH或其他鹼)或酸將培養 基之pH維持在期望pH，尤其中性pH，例如約7之pH，以將培養基維持在合意pH。可藉由使用分光光度計(600nm)測量光密度來測定生長速率，且可藉由隨時間監測碳源消耗來測定葡萄糖吸收速率。
除可再生原料(例如上文例示者)以外，亦可修飾本發明之產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之微生物以在作為碳源之合成氣上生長。在此特定實施例中，使一或多種蛋白質或酶在4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生之生物體中表現以提供利用合成氣或其他氣體碳源之代謝途徑。
合成氣體(亦稱作合成氣或產生氣)係煤及含碳材料(諸如生物質材料，包括農業作物及殘餘物)氣化之主要產物。合成氣係主要為H2及CO之混合物且可自任何有機原料氣化獲得，該有機原料包括(但不限於)煤、煤油、天然氣、生物質及廢棄有機物質。氣化通常在高燃料對氧之比例下實施。儘管主要為H2及CO，但合成氣亦可包括較小量之CO2及其他氣體。因此，合成氣體提供成本有效之氣體碳來源，例如CO及另外CO2。
Wood-Ljungdahl途徑催化CO及H2轉變成乙醯基-CoA及其他產物，例如乙酸酯。能夠利用CO及合成氣之生物體亦通常具有經由Wood-Ljungdahl途徑涵蓋之相同基本酶組及轉化利用CO2及CO2/H2混合物之能力。在揭示CO亦可由相同生物體使用且涉及相同途徑之前很久即已識別出依賴H2之CO2至乙酸酯之微生物轉變。已顯示，許多產乙酸菌在CO2存在下生長並產生諸如乙酸酯等化合物，只要存在氫以供給必需還原當量即可(例如，參見Drake,Acetogenesis，第3-60頁，Chapman及Hall,New York,(1994))。此可匯總為以下反應式：2 CO2+4 H2+n ADP+n Pi → CH3COOH+2 H2O+n ATP。
因此，具有Wood-Ljungdahl途徑之非天然微生物亦可利用CO2及H2混合物來產生乙醯基-CoA及其他期望產物。
Wood-Ljungdahl途徑為相關技藝所熟知且由12個反應組成，該等反應可分成兩個支路：(1)甲基支路及(2)羰基支路。甲基支路將合成氣轉變成甲基-四氫葉酸酯(甲基-THF)，而羰基支路將甲基-THF轉變成乙醯基-CoA。甲基支路中之反應按順序由以下酶或蛋白質催化：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、甲酸酯去氫酶、甲醯基四氫葉酸酯合成酶、次甲基四氫葉酸酯環化去水酶、亞甲基四氫葉酸酯去氫酶及亞甲基四氫葉酸酯還原酶。羰基支路中之反應按順序由以下酶或蛋白質催化：甲基四氫葉酸酯：類咕啉蛋白質甲基轉移酶(例如，AcsE)、類咕啉鐵-硫蛋白質、鎳-蛋白質組裝蛋白質(例如，AcsF)、鐵氧化還原蛋白、乙醯基-CoA合成酶、一氧化碳去氫酶及鎳-蛋白質組裝蛋白質(例如，CooC)。依照本文所提供用於引入足量編碼核酸以生成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，亦可針對至少引入編碼不存在於宿主生物體中之Wood-Ljungdahl酶或蛋白質之核酸實施相同改造設計。因此，將一或多種編碼核酸引入本發明微生物中以使得所修飾生物體含有完整Wood-Ljungdahl途徑將賦予合成氣利用能力。
另外，亦可使用與一氧化碳去氫酶及/或氫化酶活性偶合之還原性(反向)三羧酸循環將CO、CO2及/或H2轉變成乙醯基-CoA及其他產物，例如乙酸酯。能夠經由還原性TCA途徑固定碳之生物體可利用一或多種以下酶：ATP檸檬酸裂解酶、檸檬酸裂解酶、順烏頭酸酶、異檸檬酸去氫酶、α-酮戊二酸酯：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、琥珀醯基-CoA合成酶、琥珀醯基-CoA轉移酶、富馬酸還原酶、富馬酸酶、蘋果酸去氫酶、NAD(P)H：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、一氧化碳去氫酶及氫化酶。具體而言，利用由一氧化碳去氫酶及氫化酶自CO及/或H2萃取之還原當量經由還原性TCA循環將CO2固定成乙醯基-CoA或乙酸酯。可藉由諸如乙醯基-CoA轉移酶、乙酸激酶/磷酸轉乙醯基酶 及乙醯基-CoA合成酶等酶將乙酸酯轉變成乙醯基-CoA。可藉由丙酮酸酯：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶及葡萄糖新生酶將乙醯基-CoA轉變成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺前體、甘油醛-3-磷酸酯、磷酸烯醇丙酮酸酯及丙酮酸酯。依照本文所提供用於引入足量編碼核酸以生成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，亦可針對至少引入編碼不存在於宿主生物體中之還原性TCA途徑酶或蛋白質之核酸實施相同改造設計。因此，將一或多種編碼核酸引入本發明微生物中以使得所修飾生物體含有完整還原性TCA途徑將賦予合成氣利用能力。
因此，鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，可產生在諸如碳水化合物等碳源上生長時分泌本發明之生物合成化合物的非天然微生物。此等化合物包括(例如)4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺以及任一中間代謝物。所需要的只是以一或多種所需酶或蛋白質活性進行改造以達成期望化合物或中間體之生物合成，包括(例如)納入一些或全部4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物合成途徑。因此，本發明提供非天然微生物，其當在碳水化合物或另一碳源上生長時產生及/或分泌4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺，且當在碳水化合物或另一碳源上生長時產生及/或分泌4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中所示之任一中間代謝物。本發明之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生微生物可起始自4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑中之中間體之合成，如本文所揭示。
為了生成更佳產生者，可利用代謝建模來將生長條件最佳化。亦可使用建模來設計另外將途徑之利用最佳化之基因敲除(例如，參見美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466以及美國專利第7,127,379號)。建模分析允許可靠預測使代謝向更有效地產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺轉變對細胞生長之效應。
一種鑑別及設計有助於期望產物生物合成之代謝改變之計算方法係OptKnock計算框架(Burgard等人，Biotechnol.Bioeng.84：647-657(2003))。OptKnock係提議導致過度產生靶產物之遺傳穩定微生物之基因缺失策略的代謝建模及模擬程式。具體而言，該框架檢查微生物之完整代謝及/或生物化學網絡以促成迫使期望生物化學變成細胞生長之專性副產物之遺傳操縱。藉由經由策略性地放置之基因缺失或其他功能基因破壞將生物化學產生與細胞生長偶合，在生物反應器中經過長時期後施加於經改造菌株之生長選擇壓力可因強制性生長偶合性生物化學產生而改良性能。最後，當構築基因缺失時，所設計菌株回復至其野生型狀態之可能性係可忽略的，此乃因將自基因組完全去除藉由OptKnock選擇之基因。因此，此計算方法可用於鑑別生物合成期望產物之替代途徑或結合非天然微生物使用，用於將期望產物之生物合成進一步最佳化。
簡言之，OptKnock係在本文中用於指用於對細胞代謝建模之計算方法及系統的術語。OptKnock程式係指將特定約束條件納入通量平衡分析(FBA)模型中之模型及方法之框架。該等約束條件包括(例如)定性動力學資訊、定性調節資訊及/或DNA微陣列實驗數據。OptKnock亦藉由(例如)以下方式來計算各種代謝問題之解決方案：緊縮經由通量平衡模型獲得之通量邊界且隨後探測在基因添加或缺失存在下代謝網絡之性能限制。OptKnock計算框架允許構築允許有效查詢代謝網絡之性能限制之模型制定且提供對所得混合整數線性程式化問題求解之方法。本文中稱作OptKnock之代謝建模及模擬方法闡述 於(例如)2002年1月10日提出申請之美國公開案2002/0168654、2002年1月10日提出申請之國際專利第PCT/US02/00660號及2007年8月10日提出申請之美國公開案2009/0047719中。
鑑別及設計有助於產物生物合成產生之代謝改變的另一計算方法係稱為SimPheny®之代謝建模及模擬系統。此計算方法及系統闡述於(例如)2002年6月14日提出申請之美國公開案2003/0233218及2003年6月13日提出申請之國際專利申請案第PCT/US03/18838號(WO/2003/106998)中。SimPheny®係可用於產生電腦上之網絡模型及用於模擬經過生物系統之化學反應之質量、能量或電荷之通量的計算系統，用以界定含有該系統中之化學反應之任何及所有可能功能性的解空間，藉此測定該生物系統之一範圍之所允許活性。此方式稱作基於約束條件之建模，此乃因解空間係藉由諸如以下等約束條件界定：所包括反應之已知化學計量以及與經過反應之最大通量相關之反應熱力學及能力約束條件。藉由該等約束條件界定之空間可經外推以測定生物系統或其生物化學組份之表型能力及性質。
該等計算方式與生物真實性一致，此乃因生物系統具有靈活性且可以許多不同方式達成相同結果。生物系統係經由已受到所有活系統必須面對之基本約束條件限制之進化機制來設計。因此，基於約束條件之建模策略涵蓋該等一般真實性。此外，經由緊縮約束條件對網絡模型連續施加進一步限制之能力可減小解空間之大小，藉此增強可預測生理性能或表型之精確度。
鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應能夠應用用於代謝建模及模擬之各種計算框架來設計並實施在宿主微生物中生物合成期望化合物。此等代謝建模及模擬方法包括(例如)上文例示為SimPheny®及OptKnock之計算系統。在說明本發明時，本文參考用於建模及模擬之OptKnock計算框架來闡述一些方法。彼等熟習此項 技術者應瞭解，如何將使用OptKnock鑑別、設計及實施代謝改變應用於相關技藝所熟知之此等其他代謝建模及模擬計算框架及方法中之任一者。
上述方法將提供一組用以破壞之代謝反應。該組或代謝修飾內各反應之消除可產生作為生物體生長階段期間之專性產物之期望產物。由於已知該等反應，因此雙重OptKnock問題之解決方案亦將提供一或多種編碼一或多種催化該組反應內各反應之酶之相關基因。一組反應及其編碼參與各反應之酶之相應基因的鑑別通常為經由分析該等反應與具有酶與編碼基因間之關係之反應數據庫之相關性來達成的自動過程。
在鑑別後，藉由在功能上破壞至少一種編碼該組反應內各代謝反應之基因在靶細胞或生物體中實施欲經破壞以達成期望產物之產生的該組反應。一種用以達成反應組之功能破壞的尤其有用之手段係藉由各編碼基因之缺失。然而，在一些情況下，藉由其他遺傳畸變破壞反應可能有益，該等畸變包括(例如)諸如啟動子或調節因子之順式結合位點等調節區之突變、缺失或諸多位置中任一者處之編碼序列之截短。例如，當期望對產物之偶合進行快速評價時或當不太可能發生遺傳回復時，產生小於完全缺失之基因集之該等較後畸變可能有用。
為了鑑別上述雙重OptKnock問題之其他富有成效之解決方案，該等方案產生其他組破壞用反應或可產生期望產物之生物合成(包括生長偶合性生物合成)之代謝修飾，可實施稱為整數分割(integer cut)之最佳化方法。此方法藉由於各次迭代納入稱作整數分割之另一約束條件對上文所例示之OptKnock問題迭代求解來進行。整數切割約束條件有效地防止求解程序選擇在專性地將產物生物合成與生長偶合之任一先前迭代中鑑別之實際相同的反應組。例如，若先前所鑑別之生長偶合性代謝修飾指定反應1、2及3用於破壞，則以下以下約束條件 防止在隨後求解中同時考慮相同反應。整數分割方法為相關技藝所熟知且可發現於例如Burgard等人，Biotechnol.Prog.17：791-797(2001)。與所有本文參考與用於代謝建模及模擬之OptKnock計算框架組合使用之方法一樣，減少迭代計算分析冗餘之整數分割方法亦可與相關技藝所熟知之其他計算框架(包括例如SimPheny®)一起應用。
本文所例示方法允許構築生物合成產生期望產物之細胞及生物體，包括將靶生物化學產物之產生與經改造而具有所鑑別遺傳改變之細胞或生物體之生長專性地偶合。因此，本文所述計算方法允許鑑別及實施藉由選自OptKnock或SimPheny®之電腦上方法鑑別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括(例如)一或多種生物合成途徑酶之添加及/或一或多種代謝反應之功能破壞，包括(例如)藉由基因缺失之破壞。
如上文所論述，OptKnock方法係基於以下前提研發：當經過長期生長選擇時，突變微生物網絡可向其以計算方式預測之最大生長表型進化。換言之，該方式利用生物體在選擇壓力下自我最佳化之能力。OptKnock框架允許基於網絡化學計量窮盡性枚舉迫使生物化學產生與細胞生長之間之偶合之基因缺失組合。最佳基因/反應敲除之鑑別需要雙重最佳化問題之解決方案，其選擇活性反應組以使得所得網絡之最佳生長溶液過度產生所關注生物化學品(Burgard等人，Biotechnol.Bioeng.84：647-657(2003))。
可採用大腸桿菌代謝之電腦上化學計量模型來鑑別用於如先前所例示及(例如)以下專利中所述之代謝途徑之基本基因：美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466及美國專利第7,127,379號。如本文所揭示，可應用OptKnock數據框架來準確找到產生期望產物之生長偶合性產生之基因缺失。此外，雙重OptKnock問題之解決方案僅提供一組缺失。為 枚舉所有有意義之解決方案，亦即，所有導致生長偶合性產生形成之敲除組，可實施稱為整數分割之最佳化技術。此需要藉由於各迭代納入稱作整數分割之另一約束條件對OptKnock問題迭代求解，如上文所論述。
採用上文及本文所例示之方法，本發明方法允許構築增加期望產物產生之細胞及生物體，例如，藉由將期望產物之產生與經改造而具有所鑑別遺傳改變之細胞或生物體之生長偶合來達成。如本文所揭示，已鑑別出將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生與生物體之生長偶合的代謝改變。經構築具有所鑑別代謝改變之微生物菌株相對於不存在代謝改變之菌株在指數生長階段期間產生升高量之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。該等菌株有利於在沒有先前所述負選擇壓力下，可在連續發酵過程中用於商業生產4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺。儘管本文例示為賦予4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生長偶合性產生之代謝改變、尤其一或多個基因破壞，但應理解，可視需要將增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生之任一基因破壞引入宿主微生物中。
因此，本發明方法提供一組藉由諸如OptKnock等電腦上方法鑑別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括一或多種代謝反應之功能破壞，包括(例如)藉由基因缺失之破壞。對於4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生而言，代謝修飾可選自一組本文(包括實例)所述之代謝修飾。
亦提供產生具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之穩定生長偶合性產生之非天然微生物的方法。該方法可包括在電腦上鑑別一組增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生(例如，增加指數生長期間之產生)之代謝修飾；對生物體進行遺傳修飾以含有增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生之該組代謝修飾；及培 養該經遺傳修飾之生物體。若需要，培養可包括在需要產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之條件下適應性地進化經遺傳修飾之生物體。本發明方法可適用於細菌、酵母菌及真菌以及多種其他細胞及微生物，如本文所揭示。
因此，本發明提供包含一或多個增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生之基因破壞的非天然微生物。在一個實施例中，一或多個基因破壞賦予4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生長偶合性產生，且可例如賦予4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之穩定生長偶合性產生。在另一實施例中，一或多個基因破壞可將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生與微生物之生長專性地偶合。此一或多個基因破壞降低各別的一或多種所編碼酶之活性。
非天然微生物可具有一或多個包括在如本文所述代謝修飾中之基因破壞。如本文所揭示，可缺失一或多個基因破壞。本發明之此等非天然微生物包括細菌、酵母菌、真菌或多種可適用於發酵過程之其他微生物中之任一者，如本文所揭示。
因此，本發明提供包含一或多個基因破壞之非天然微生物，其中該一或多個基因破壞發生於編碼蛋白質或酶之基因中，其中該一或多個基因破壞增加生物體中4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生。4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生可與生長偶合或不與生長偶合。在一特定實施例中，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生可與生物體之生長專性地偶合，如本文所揭示。
本發明提供具有增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生(例如，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生長偶合性產生)之遺傳改變(例如基因破壞)的非天然微生物。可(例如)藉由遺傳改 變細胞之代謝途徑將產物產生與微生物之指數生長階段專性地關聯，如本文所揭示。遺傳改變可增加期望產物之產生或甚至使期望產物成為生長階段期間之專性產物。本文闡述使4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺生物之產生增加及合成量升高之數組代謝改變或轉化。一組內之各改變對應於應進行功能破壞之必需代謝反應。各組內所有反應之功能破壞可使生長階段期間經改造菌株對4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生增加。
本文闡述諸多包括基因破壞之代謝修飾。彼等熟習此項技術者應理解，一或多種代謝修飾(包括基因破壞)可經組合以增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺或以其他方式改良本發明微生物之特性。相較於不含有此等代謝改變之菌株，在合適培養條件下，該等非天然改變中之每一者皆可(例如)在微生物之指數生長階段期間增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生且提高其產生量，或以其他方式改良產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之微生物之生長或產生特性。合適條件包括(例如)彼等本文所揭示者，包括諸如特定碳源或反應物可用性及/或適應性進化等條件。
鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者應理解，為了引入諸如酶或酶促反應之破壞或衰減等代謝改變，可能需要破壞一或多種參與該反應之酶之催化活性。或者，代謝改變可包括破壞酶活性或最大活性所必需之調節蛋白質或輔因子之表現。此外，酶促反應所必需之輔因子之遺傳損失亦可與編碼該酶之基因之破壞具有相同之效應。破壞可藉由多種方法發生，包括(例如)在一或多個編碼基因序列中缺失編碼基因或納入遺傳改變。靶向破壞之編碼基因可為一個、一些或全部編碼參與催化活性之酶之基因。例如，倘若單一酶參與所靶向催化活性，則破壞可藉由降低或消除所編碼基因產物之催化活性之遺傳改變發生。相似地，倘若單一酶係多聚物，包括雜聚物， 則破壞可藉由降低或破壞所編碼基因產物之一個或全部次單元之功能的遺傳改變發生。活性之破壞可藉由損失形成活性複合物所需一或多個次單元之結合活性、藉由破壞多聚複合物之催化次單元或藉由二者達成。亦可靶向多聚蛋白質締合及活性之其他功能以破壞本發明之代謝反應。此等其他功能為彼等熟習此項技術者所熟知。相似地，可藉由破壞修飾及/或活化靶酶之蛋白質或酶(例如，將去輔基酶轉變成全酶所需之分子)之表現來降低或消除靶酶活性。此外，可根據本發明破壞單一多肽或多聚複合物之一些或全部功能以降低或廢除一或多種參與本發明反應或代謝修飾之酶之催化活性。相似地，可破壞參與本發明反應或代謝修飾之一些或全部酶，只要減少或消除所靶向反應即可。
鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者亦應理解，可藉由減少或消除由常見基因及/或由該基因之一或多種展現相似或實質上相同之活性之直系同源物編碼之反應來破壞酶促反應。減少常見基因與全部直系同源物二者可完成廢除所靶向反應之任何催化活性。然而，破壞常見基因或一或多種直系同源物可降低所靶向反應之足以促進生長與產物生物合成偶合之催化活性。本文例示編碼多種代謝修飾之催化活性之常見基因以及其直系同源物。彼等熟習此項技術者應理解，編碼所靶向代謝反應之酶之一些或全部基因之破壞可在本發明方法中實施且納入本發明之非天然微生物中以達成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之增加產生或生長偶合性產物產生。
鑒於本文所提供之教示及指導，彼等熟習此項技術者亦應理解，可使用熟知方法使酶促活性或表現衰減。若降低引起酶活性下降至低於途徑發揮功能通常所需之臨界水準，則酶活性或量之降低可模擬基因之完全破壞。藉由各種不使用基因破壞之技術來降低酶促活性可能對於生物體之活力較為重要。降低酶促活性從而導致基因破壞之 相似或相同效應之方法包括(但不限於)：減少基因轉錄或轉譯；使mRNA、蛋白質或催化性RNA去穩定；及使影響酶活性或動力學之基因突變(參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Baltimore,MD(1999))。天然或施加之調節控制亦可達成酶衰減，包括：啟動子置換(參見Wang等人，Mol.Biotechnol.52(2)：300-308(2012))；損失或改變轉錄因子(Dietrick等人，Annu.Rev.Biochem.79：563-590(2010)；及Simicevic等人，Mol.Biosyst.6(3)：462-468(2010))；引入抑制性RNA或肽，例如siRNA、反義RNA、RNA或肽/小分子結合適配體、核酶、適配體酶及核開關(Wieland等人，Methods 56(3)：351-357(2012)；O’Sullivan,Anal.Bioanal.Chem.372(1)：44-48(2002)；及Lee等人，Curr.Opin.Biotechnol.14(5)：505-511(2003))；及添加降低或破壞酶促活性之藥物或其他化學品，例如酶抑制劑、抗生素或靶特異性藥物。
熟習此項技術者亦應理解並認識到，酶之衰減可於各個層面進行。例如，在基因層面，可使用引起部分或完全無效表型之突變(例如基因破壞)或引起遮蔽基因產物活性之上位遺傳效應之突變(Miko,Nature Education 1(1)(2008))來衰減酶。在基因表現層面，衰減方法包括：在產生階段期間將轉錄與諸如異丙基硫基-β-半乳糖苷(IPTG)等內源性或外源性誘導物偶合，然後添加低量誘導物或不添加誘導物(Donovan等人，J.Ind.Microbiol.16(3)：145-154(1996)；及Hansen等人，Curr.Microbiol.36(6)：341-347(1998))；引入或修改基因之正或負調節物；修改真核染色體區中整合有基因之區中之組蛋白乙醯基化/去乙醯基化(Yang等人，Curr.Opin.Genet.Dev.13(2)：143-153(2003)及Kurdistani等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(4)：276-284(2003))；引 入轉位以破壞啟動子或調節基因(Bleykasten-Brosshans等人，C.R.Biol.33(8-9)：679-686(2011)；及McCue等人，PLoS Genet.8(2)：e1002474(2012))；轉換可轉位元件或啟動子區之定向以調節毗鄰基因之基因表現(Wang等人，Genetics 120(4)：875-885(1988)；Hayes,Annu.Rev.Genet.37：3-29(2003)；在二倍體生物體中，缺失一個等位基因，從而導致異型接合性損失(Daigaku等人，Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 600(1-2)177-183(2006))；引入增加RNA降解之核酸(Houseley等人，Cell,136(4)：763-776(2009)；或在細菌中，例如，引入轉移信使RNA(tmRNA)標籤，此可導致RNA降解及核糖體失速(Sunohara等人，RNA 10(3)：378-386(2004)；及Sunohara等人，J.Biol.Chem.279：15368-15375(2004))。在轉譯層面，衰減可包括：引入罕見密碼子以限制轉譯(Angov,Biotechnol.J.6(6)：650-659(2011))；引入阻斷轉譯之RNA干擾分子(Castel等人，Nat.Rev.Genet.14(2)：100-112(2013)；及Kawasaki等人，Curr.Opin.Mol.Ther.7(2)：125-131(2005)；修改編碼序列外側之區，例如將二級結構引入未轉譯區(UTR)以阻斷轉譯或降低轉譯效率(Ringnér等人，PLoS Comput.Biol.1(7)：e72(2005))；添加用於快速轉錄本降解之RNAase位點(Pasquinelli,Nat.Rev.Genet.13(4)：271-282(2012)；及Arraiano等人，FEMS Microbiol.Rev.34(5)：883-932(2010)；引入反義RNA寡聚物或反義轉錄本(Nashizawa等人，Front.Biosci.17：938-958(2012))；引入RNA或肽適配體、核酶、適配體酶、核開關(Wieland等人，Methods 56(3)：351-357(2012)；O’Sullivan,Anal.Bioanal.Chem.372(1)：44-48(2002)；及Lee等人，Curr.Opin.Biotechnol.14(5)：505-511(2003))；或引入涉及RNA結構之轉譯調節元件，其可防止或減少轉譯且可藉由小分子之存在或不存在來控制(Araujo等人，Comparative and Functional Genomics，物件編號475731，8頁(2012)。在酶定位及/或長壽層面，酶衰減可包括：添加用於較快蛋白質轉換之降解標籤(Hochstrasser,Annual Rev.Genet.30：405-439(1996)；及Yuan等人，PLoS One 8(4)：e62529(2013))；或添加使酶分泌或定位於真核細胞中之亞細胞隔室之定位標籤，其中該酶將不能夠與其正常受質反應(Nakai等人Genomics 14(4)：897-911(1992)；及Russell等人，J.Bact.189(21)7581-7585(2007))。在轉譯後調節層面，酶衰減可包括：增加已知抑制劑之細胞內濃度；或修改轉譯後修飾位點(Mann等人，Nature Biotech.21：255-261(2003))。在酶活性層面，酶衰減可包括：添加內源性或外源性抑制劑，例如酶抑制劑、抗生素或靶特異性藥物，以降低酶活性；限制諸如維生素B12等必需輔因子對需要該輔因子之酶之可用性；螯合酶活性所需之金屬離子；或引入顯性負突變。用於上述衰減之技術之適用性可取決於給定宿主微生物為原核抑或真核，且應理解，熟習此項技術者可容易地測定用於給定宿主之合適技術。
在一些實施例中，可基於期望產物之生長偶合性形成來使用微好氧性設計。為了對此進行檢查，可藉由以網絡中可行之不同生物質形成速率將產物產率首先最大化且隨後最小化來構築各策略之產生錐(production cone)。若突變網絡之所有可能表型之最右邊界係單點，則其暗示，在網絡中可能之最大生物質形成速率下存在產物之獨特最佳產率。在其他情況下，可行表型之最右邊界係垂直線，指示在最大生物質之點處，網絡可製備計算範圍內任一量(包括垂直線之最低點處之最低量)之產物。此等設計具有低優先僅。
藉由本文所揭示方法(例如OptKnock框架)鑑別之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生策略通常係基於其(i)理論產率及視情況(ii)生長偶合之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺形成特性來分級。
因此，本發明亦提供具有一組代謝修飾之非天然微生物，該等代謝修飾增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產率(視情況將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生與生物體之生長偶合)，或以其他方式改良產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之微生物之特性，其中該組代謝修飾包括如本文所述一或多個基因之破壞。
若測定菌株設計不充分地增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之產生及/或不充分地將產物之形成與生物質形成偶合，則可向各菌株補加其他缺失。或者，已知在生長條件下不具有顯著活性的一些其他酶可因適應性進化或隨機誘變而變得具有活性。亦可敲除此等活性。然而，本文所揭示基因缺失組列表允許構築展現4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之高產率產生(包括4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之生長偶合性產生)之菌株。
4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺可在微生物培養期間(例如，在連續及/或接近連續培養期中)之任一時間點收穫或分離，如本文所揭示。通常，微生物在連續及/或接近連續生長階段中維持愈長，可產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之量之比例愈大。
因此，本發明另外提供產生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之方法，包括培養具有一或多個基因破壞之非天然微生物，如本文所揭示。當一或多個編碼增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生之酶之基因之破壞降低或消除該酶之活性時，破壞可發生於該基因，包括視情況將4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生與微生物之生長偶合。例如，破壞可使非天然微生物具有4-HB、4HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺之穩定生長偶合性產生。
在一些實施例中，基因破壞可包括完全缺失基因。在一些實施 例中，用以破壞基因之其他方法包括(例如)藉由遺漏或添加寡核苷酸或藉由使基因不可操作之突變達成之移碼。然而，熟習此項技術者應認識到基因缺失的優點，其使非天然生物體穩定且不會回復至未發生基因破壞之親本表型。特定而言，基因破壞選自如本文所揭示之基因集。
一旦計算或其他預測係由用以增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生之一或多個基因集破壞構成，則可構築、進化並測試菌株。藉由相關技藝所熟知之方法將基因破壞(包括基因缺失)引入宿主生物體中。尤其可用於基因破壞之方法係藉由同源重組，如本文所揭示。
經改造菌株可藉由量測生長速率、受質吸收速率及/或產物/副產物分泌速率來描述。可使培養物生長並用作在指數生長期間實施量測之新鮮分批培養用接種物。可藉由使用分光光度計(A600)量測光密度來測定生長速率。培養物上清液中葡萄糖及其他有機酸副產物之濃度可藉由如本文所揭示熟知方法(例如HPLC、GC-MS或適於分析期望產物之其他熟知分析方法)測定，且用於計算吸收及分泌速率。
含有基因破壞之菌株可展現次最佳生長速率，直至其代謝網絡已調節至其失去之功能性。為了輔助此調節，可使菌株適應性地進化。藉由使菌株經過適應性進化，細胞生長速率成為主要選擇壓力且迫使突變細胞重新分配其代謝通量以提高其生長速率。最近已證實若干大腸桿菌突變體之此代謝再程式化，該等突變體已在各種受質上適應性地進化而達成藉由電腦上模型先驗預測之生長速率(Fong及Palsson，Nat.Genet.36：1056-1058(2004))。藉由適應性進化引起之生長改良可伴有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生率之提高。菌株可視情況以一式兩份適應性地進化，平行運行，以說明宿主生物體可展現之可潛在地導致一種菌株具有優於其他之極佳產生品質 的進化模式差異的原因(Fong及Palsson，Nat.Genet.36：1056-1058(2004)；Fong等人，J.Bacteriol.185：6400-6408(2003)；Ibarra等人，Nature 420：186-189(2002))。進化可運行一段時期，通常為2-6週，此取決於所得生長速率改良。一般而言，在獲得穩定表型後終止進化。
在適應性進化過程後，再次藉由量測生長速率、受質吸收速率及產物/副產物分泌速率來表徵新菌株。藉由繪製實際生長及產生產率以及來自代謝建模之產生概況來比較該等結果與理論預測。選擇最成功之設計/進化組合進行進一步研究，且其特徵在於實驗室規模之分批及連續發酵。支持本文所揭示方法(例如OptKnock方式)之生長偶合性生物化學產生概念亦應可生成遺傳穩定過度產生者。因此，將培養物以連續模式維持延長時期，例如，一個月或更長，以評估長期穩定性。可定期取樣以確保維持產率及生產率。
適應性進化係可用於增加在非天然環境條件下生長之突變體或經改造微生物菌株或野生型菌株之生長速率之強大技術。其尤其可用於經由諸如可使生長偶合性產物形成之OptKnock等方法設計之菌株。因此，向最佳生長菌株進化亦將間接地使產生最佳化。經由基因敲除及適應性進化產生大腸桿菌K-12 MG1655之獨特菌株。(Fong及Palsson，Nat.Genet.36：1056-1058(2004))。在此工作中，藉由在達成靜止期之前將分批培養物連續傳代至新鮮培養基中使所有適應性進化培養物維持在延長之指數生長，由此使生長速率成為主要選擇壓力。在補加有不同碳受質(各敲除菌株有4種)之最低培養基上構築並進化敲除菌株。以一式兩份或一式三份實施進化培養，得到總共50種進化敲除菌株。使進化培養物維持在指數生長直至達成穩定生長速率。計算預測可準確(在10%內)預測所檢查50例中之38例中敲除菌株之進化後生長速率。此外，OptKnock設計與適應性進化之組合已改良乳酸產生菌株。(Fong等人，Biotechnol.Bioeng.91：643-648(2005))。相似 方法可應用於本文所揭示菌株並應用於各種宿主菌株。
存在諸多用於實施適應性進化之經研發技術。本文揭示實例性方法。在一些實施例中，本發明非天然生物體之最佳化包括利用適應性進化技術來增加產生菌株之4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺產生及/或穩定性。
連續培養涉及將小體積之生長培養物重複轉移至含有新鮮生長培養基之大得多之容器中。當所培養生物體已在新容器中生長至飽和時，重複該過程。已在明確顯示數年時期內繁殖率一致改良之實驗中在文獻(Lenski及Travisano，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6808-6814(1994))中使用此方法達成最長之持續培養顯示。通常，培養物之轉移一般係在指數期期間實施，因此每天精確地計算轉移體積以維持下一個24小時時期內之指數生長。手工連續稀釋便宜且易於平行設置。
在連續培養中，細胞在恒化器中之生長代表極端稀釋情形，其中保持極高部分之細胞群體。當培養物生長並變得飽和時，用新鮮培養基替換一小部分生長培養物，從而允許培養物靠近其最大群體大小連續地生長。恒化器已用於證實繁殖率之短期快速改良(Dykhuizen,Methods Enzymol.613-631(1993))。儘管已認識到該等器件之潛在有用性，但傳統恒化器而因不期望地選擇抗稀釋(固定)變體不能持續用於增加繁殖率之長期選擇。該等變體能夠藉由黏附至恒化器表面來對抗稀釋，且藉此勝過較少黏附之個體，包括彼等具有較高繁殖率者，因此消除該器件之預期目的(Chao及Ramsdell，J.Gen.Microbiol 20：132-138(1985))。一種克服此缺陷之可能方式係具有兩個生長室之器件之實施方案，該等生長室週期性地經歷瞬時滅菌階段，如先前所述(Marliere及Mutzel，美國專利第6,686,194號)。
EvolugatorTM係由Evolugate,LLC(Gainesville,FL)研發之連續培養器件且相對於傳統進化技術顯著節省時間及精力(de Crecy等人， Appl.Microbiol.Biotechnol.77：489-496(2007))。藉由在達到靜止期之前將分批培養物連續傳代至新鮮培養基中使細胞維持延長之指數生長。藉由使光密度量測及液體處置自動化，EvolugatorTM可使用大培養體積實施高速率連續轉移，因此在細胞適合度之進化中接近恒化器之效率。例如，將缺乏轉譯裝置組件且生長嚴重受阻之不動桿菌屬ADP1突變體在200代內進化至野生型生長速率之80%。然而，與在單一容器中維持細胞之恒化器不同，該機器藉由在管道圈之細分區中自一個「反應器」移動至下一個反應器來操作，因此消除對壁生長之任何選擇。轉移體積可調節，且通常設定為約50%。此器件之缺陷係其較大且成本高，因此平行運行大量進化係不實際的。此外，不好調節氣體添加，且利用現行器件組態不能維持嚴格厭氧性條件。然而，此係適應性地進化產生菌株之替代方法。
如本文所揭示，可將編碼4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑之期望活性之核酸引入宿主生物體中。在一些情況下，可能需要修改4-HB、4-Hbal、4-HBCoA BDO或腐胺途徑酶或蛋白質之活性以增加4-HB、4-Hbal、4-HBCoA BDO或腐胺之產生。例如，可將增加蛋白質或酶之活性之已知突變引入編碼核酸分子中。另外，可應用最佳化方法來增加酶或蛋白質之活性及/或降低抑制活性，例如，降低負調節物之活性。
一種此類最佳化方法係定向進化。定向進化係涉及引入靶向特定基因之突變以改良及/或改變酶之性質的強大方式。經改良及/或改變酶可經由研發及實施允許自動化篩選許多酶變體(例如，>104)之靈敏高通量篩選分析來鑑別。通常實施迭代輪次之誘變及篩選以提供具有最佳化性質之酶。亦已研發出可幫助鑑別基因之誘變用區域之計算算法且其可顯著減少需要生成及篩選之酶變體之數量。已研發出諸多定向進化技術(綜述參見Hibbert等人，Biomol.Eng 22：11-19(2005)； Huisman及Lalonde,In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs.717-742(2007),Patel(編輯),CRC Press；Otten及Quax.Biomol.Eng 22：1-9(2005)；及Sen等人，Appl Biochem.Biotechnol 143：212-223(2007))，以有效地建立多樣變體文庫，且已將該等方法成功地應用於改良許多酶類別之寬範圍之性質。已藉由定向進化技術改良及/或改變之酶特性包括(例如)：選擇性/特異性，用於轉變非天然受質；溫度穩定性，用於穩健高溫處理；pH穩定性，用於在較低或較高pH條件下之生物處理；受質或產物耐受性，以使得可達成高產物效價；結合(Km)，包括拓寬受質結合，以包括非天然受質；抑制(Ki)，以去除產物、受用質或關鍵中間體之抑制；活性(kcat)，用以增加酶促反應速率，從而達成期望通量；表現量，用以增加蛋白質產率及總體途徑通量；氧穩定性，用於在好氧性條件下操作空氣敏感性酶；及厭氧活性，用於在氧不存在下操作好氧性酶。
已研發出諸多實例性方法用於基因之誘變及多樣化以靶向特異性酶之期望性質。此等方法為彼等熟習此項技術者所熟知。該等中之任一者皆可用於改變及/或最佳化4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺途徑酶或蛋白質之活性。此等方法包括(但不限於)EpPCR，其藉由降低DNA聚合酶在PCR反應中之忠實性來引入隨機點突變(Pritchard等人，J Theor.Biol.234：497-509(2005))；易錯滾環擴增(epRCA)，其與epPCR相似，只是使用完整環形質粒作為模板且使用在最後2個核苷酸上具有抗外切核酸酶之硫代磷酸酯連接之隨機6聚物來擴增質粒，之後轉化至細胞中，其中該質粒以串聯重複再環化(Fujii等人，Nucleic AcidsRes.32：e145(2004)；及Fujii等人，Nat.Protoc.1：2493-2497(2006))；DNA或家族改組，其通常涉及用諸如Dnase I或EndoV等核酸酶消化兩個或更多個變體基因以生成隨機片段庫，在DNA聚合 酶存在下藉由數次退火及延伸循環來再組裝該等庫，以產生嵌合基因文庫(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA 91：10747-10751(1994)；及Stemmer,Nature 370：389-391(1994))；交錯延伸(步驟)，其需要模板引發，之後重複具有變性及極短退火/伸延持續時間(短至5sec)之2步PCR循環(Zhao等人，Nat.Biotechnol.16：258-261(1998))；隨機引發重組(RPR)，其中使用隨機序列引子來生成許多與模板之不同區段互補之短DNA片段(Shao等人，Nucleic Acids Res 26：681-683(1998))。
其他方法包括異源雙鏈重組，其中使用線性化質粒DNA形成藉由錯配修復來修復之異源雙鏈(Volkov等人，Nucleic AcidsRes.27：e18(1999)；及Volkov等人，Methods Enzymol.328：456-463(2000))；瞬時模板上之隨機嵌合生長(RACHITT)，其採用單鏈DNA(ssDNA)之Dnase I片段化及大小分級(Coco等人，Nat.Biotechnol.19：354-359(2001))；截短模板上之重組延伸(RETT)，其需要在用作模板庫之單向ssDNA片段存在下自引子之單向生長鏈之模板轉換(Lee等人，J.Molec.Catalysis 26：119-129(2003))；簡併寡核苷酸基因改組(DOGS)，其中使用簡併引子來控制分子間之重組(Bergquist及Gibbs，Methods Mol.Biol 352：191-204(2007)；Bergquist等人，Biomol.Eng 22：63-72(2005)；Gibbs等人，Gene 271：13-20(2001))；用於產生雜交酶之增量截短(ITCHY)，其產生具有一或多個所關注基因片段之1個鹼基對缺失之增生組合文庫(Ostermeier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：3562-3567(1999)；及Ostermeier等人，Nat.Biotechnol.17：1205-1209(1999))；用於產生雜交酶之硫-增量截短(THIO-ITCHY)，其與ITCHY相似，只是使用硫代磷酸酯dNTP來生成截短(Lutz等人，Nucleic Acids Res 29：E16(2001))；SCRATCHY，其組合兩種用於組合基因之方法ITCHY及DNA改組(Lutz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：11248-11253(2001))；隨機漂移誘變(RNDM)，其中 經由epPCR產生突變，之後篩選/選擇彼等保持可用活性者(Bergquist等人，Biomol.Eng.22：63-72(2005))；序列飽和誘變(SeSaM)，一種隨機誘變方法，其藉由隨機納入硫代磷酸酯核苷酸及斷裂來生成隨機長度片段庫，該庫用作模板以在諸如肌苷等「通用」鹼基存在下延伸，且含肌苷補體之複製可產生隨機鹼基納入及隨後誘變(Wong等人，Biotechnol.J.3：74-82(2008)；Wong等人，Nucleic Acids Res.32：e26(2004)；及Wong等人，Anal.Biochem.341：187-189(2005))；合成改組，其使用經設計用以編碼「靶標中之所有遺傳多樣性」之重疊寡核苷酸且允許經改組子代之極高多樣性(Ness等人，Nat.Biotechnol.20：1251-1255(2002))；核苷酸交換及切除技術NexT，其組合dUTP納入、之後用尿嘧啶DNA糖基化酶及隨後六氫吡啶處理以實施端點DNA片段化(Muller等人，Nucleic Acids Res.33：e117(2005))。
其他方法包括依賴序列同源性之蛋白質重組(SHIPREC)，其中使用連接體來促進兩個關係較遠或無關基因間之融合，且在該兩個基因之間生成一範圍之嵌合體，從而產生單交換雜合體文庫(Sieber等人，Nat.Biotechnol.19：456-460(2001))；Gene Site Saturation MutagenesisTM(GSSMTM)，其中起始材料包括含有插入及兩個引子之超螺旋雙鏈DNA(dsDNA)質粒，該等引子在期望突變位點簡併(Kretz等人，Methods Enzymol.388：3-11(2004))；組合式盒誘變(CCM)，其涉及使用短寡核苷酸盒來置換具有大量可能胺基酸序列改變之限制區(Reidhaar-Olson等人Methods Enzymol.208：564-586(1991)；及Reidhaar-Olson等人Science 241：53-57(1988))；組合式多盒誘變(CMCM)，其與CCM基本上相似且使用高突變率epPCR來鑑別熱點及熱區且然後藉由CMCM延伸以覆蓋蛋白質序列空間之界定區(Reetz等人，Angew.Chem.Int.Ed Engl.40：3589-3591(2001))；突變菌株技術，其中利用編碼DNA聚合酶III之突變體次單元之mutD5基因之條件 ts突變體質粒允許選擇期間之隨機及天然突變頻率增加20×至4000×並在無需選擇時阻斷有害突變累積(Selifonova等人，Appl.Environ.Microbiol.67：3645-3649(2001))；Low等人，J.Mol.Biol.260：359-3680(1996))。
其他實例性方法包括徹查型(Look-Through)誘變(LTM)，其係評價及最佳化所選胺基酸之組合式突變之多維誘變方法(Rajpal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：8466-8471(2005))；基因重新組裝，其係可一次應用於多個基因或用以產生單一基因之大嵌合體文庫(多個突變)之DNA改組方法(由Verenium公司供應之Tunable GeneReassemblyTM(TGRTM)技術)；電腦上蛋白質設計自動化(PDA)，其係錨定具有特定摺疊之結構界定蛋白質主鏈之最佳化算法，並搜索用於胺基酸取代之可穩定摺疊及總體蛋白質通量學之序列空間，且通常對具有已知三維結構之蛋白質最有效地起作用(Hayes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：15926-15931(2002))；及迭代飽和誘變(ISM)，其涉及利用結構/功能知識來選擇可能的酶改良用位點，使用諸如Stratagene QuikChange(Stratagene；San Diego CA)等誘變方法在所選位點實施飽和誘變，篩選/選擇期望性質，及使用改良純系於另一位點開始，並持續重複直至達成期望活性為止(Reetz等人，Nat.Protoc.2：891-903(2007)；及Reetz等人，Angew.Chem.Int.Ed Engl.45：7745-7751(2006))。
上述誘變用方法中之任一者可單獨使用或以任一組合使用。另外，定向進化方法中之任一者或組合可結合適應性進化技術使用，如本文所述。
應理解，不會實質上影響本發明各實施例之作用的修改亦提供於本文所提供之本發明定義內。因此，以下實例意欲說明但並不限制本發明。
實例I 4-羥基丁酸之生物合成
此實例闡述用於4-HB產生之實例性生物化學途徑。
微生物中之4-HB合成之先前報導集中於此化合物作為生物可降解塑膠聚羥基烷酸酯(PHA)之產生中之中間體(美國專利第6,117,658號)。相對於聚-3-羥基丁酸酯聚合物(PHB)使用4-HB/3-HB共聚物可產生較小脆性之塑膠(Saito及Doi，Intl.J.Biol.Macromol.16：99-104(1994))。本文所述單體4-HB之產生出於若干原因係根本不同之過程：(1)該產物係分泌的，此與PHA相反，其係在細胞內產生且保留在細胞內；(2)對於產生羥基丁酸酯聚合物之生物體而言，不產生游離4-HB，而是由聚羥基烷酸酯合成酶使用輔酶A衍生物；(3)在聚合物之情況下，粒狀產物之形成改變熱力學；及(4)細胞外pH並非產生聚合物之問題，而其將影響4-HB係以游離酸抑或共軛鹼狀態存在，且亦影響4-HB與GBL之間之平衡。
4-HB可在兩個酶促還原步驟中以琥珀酸半醛作為中間體自TCA循環之中心代謝物琥珀酸酯產生(圖1)。該等酶中之第一種琥珀酸半醛去氫酶係包括大腸桿菌在內之許多生物體所固有，其中已發現依賴NADH及NADPH之酶(Donnelly及Cooper，Eur.J.Biochem.113：555-561(1981)；Donnelly及Cooper,J.Bacteriol.145：1425-1427(1981)；Marek及Henson，J.Bacteriol.170：991-994(1988))。亦有證據支持啤酒酵母菌中之琥珀酸半醛去氫酶活性(Ramos等人，Eur.J.Biochem.149：401-404(1985))，且已藉由序列同源性鑑別推定基因。然而，多數報導指示，此酶在琥珀酸酯合成之方向上進行，如圖1中所示(Donnelly及Cooper，見上文；Lutke-Eversloh及Steinbuchel，FEMS Microbiol.Lett.181：63-71(1999))，參與4-HB及γ-胺基丁酸酯之降解途徑。琥珀酸半醛亦由諸如大腸桿菌等某些微生物經由TCA循環中間 體α-酮戊二酸酯經由兩種酶(麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸去羧酶)之作用天然地產生。由專性厭氧菌克氏羧菌用於降解琥珀酸酯之替代途徑將琥珀酸酯活化成琥珀醯基-CoA，然後使用已知在此方向上發揮功能之替代性琥珀酸半醛去氫酶將琥珀醯基-CoA轉變成琥珀酸半醛(Sohling及Gottschalk，Eur.J.Biochem.212：121-127(1993))。然而，此路徑具有將琥珀酸酯轉變成琥珀醯基-CoA所需ATP之能量成本。
該途徑之第二種酶4-羥基丁酸去氫酶並非大腸桿菌或酵母菌所固有，而是在諸如克氏羧菌及富養產鹼菌等各種細菌中發現(Lutke-Eversloh及Steinbuchel，見上文；Sohling及Gottschalk，J.Bacteriol.178：871-880(1996)；Valentin等人，Eur.J.Biochem.227：43-60(1995)；Wolff及Kenealy，Protein Expr.Purif.6：206-212(1995))。已知該等酶依賴NADH，但亦存在依賴NADPH之形式。在大腸桿菌中證實使聚(4-羥基丁酸)累積之自α-酮戊二酸酯達成4-HB之另一途徑(Song等人，Wei Sheng Wu Xue.Bao.45：382-386(2005))。重組菌株需要三個異源基因(PHA合成酶(富養產鹼菌)、4-羥基丁酸去氫酶(富養產鹼菌)及4-羥基丁酸：CoA轉移酶(克氏羧菌))連同兩個天然大腸桿菌基因(麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸去羧酶)一起過表現。或者，圖1中之步驟4及5可由α-酮戊二酸去羧酶(例如在纖細裸藻中鑑別者)來實施(Shigeoka等人，Biochem.J.282(Pt2)：319-323(1992)；Shigeoka及Nakano，Arch.Biochem.Biophys.288：22-28(1991)；Shigeoka及Nakano，Biochem J.292(Pt 2)：463-467(1993))。然而，先前尚未應用此酶來影響任一生物體中4-HB或相關聚合物之產生。
使用各生物體之電腦上代謝模型在兩種微生物(大腸桿菌及啤酒酵母菌)中探索微生物產生4-羥基丁酸酯之能力。達成4-HB之潛在途徑經由琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA或α-酮戊二酸酯中間體進行，如圖1 中所示。
自琥珀酸酯產生4-HB之途徑中之第一步驟涉及經由依賴NADH-或NADPH之琥珀酸半醛去氫酶將琥珀酸酯轉變成琥珀酸半醛。在大腸桿菌中，gabD係依賴NADP之琥珀酸半醛去氫酶且係參與4-胺基丁酸酯吸收及降解之基因簇之一部分(Niegemann等人，Arch.Microbiol.160：454-460(1993)；Schneider等人，J.Bacteriol.184：6976-6986(2002))。相信sad編碼依賴NAD之琥珀酸半醛去氫酶活性之酶(Marek及Henson，見上文)。啤酒酵母菌僅含有推定地指配為UGA2之依賴NADPH之琥珀酸半醛去氫酶，其定位於細胞溶膠(Huh等人，Nature 425：686-691(2003))。假定在大腸桿菌與啤酒酵母菌二者中達成4-HB之琥珀酸酯途徑之最大產率計算僅需要假定，已將非天然4-HB去氫酶添加至其代謝網絡。
自琥珀醯基-CoA至4-羥基丁酸酯之途徑闡述於美國專利第6,117,658號中，作為製備包含4-羥基丁酸酯單體單位之聚羥基烷酸酯之製程之一部分。克氏羧菌係一個已知具有CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶活性之實例性生物體(Sohling及Gottschalk，見上文；Sohling及Gottschalk，見上文)。在此研究中，假定來自克氏酵母菌或另一生物體之此酶係連同非天然或異源4-HB去氫酶一起在大腸桿菌或啤酒酵母菌中表現以完成自琥珀醯基-CoA至4-HB之途徑。在大腸桿菌中證實使聚(4-羥基丁酸)累積至30%乾細胞重量之自α-酮戊二酸酯至4-HB之途徑(Song等人，見上文)。由於大腸桿菌及啤酒酵母菌天然地或內源性地具有麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶與麩胺酸去羧酶二者(Coleman等人，J.Biol.Chem.276：244-250(2001))，因此可藉由僅假定存在非天然4-HB去氫酶在兩種生物體中完成自AKG至4-HB之途徑。
實例II 自琥珀酸酯及α-酮戊二酸酯生物合成1,4-丁二醇
此實例說明自微生物構築及生物合成產生4-HB及BDO。本文揭示用於4-HB及BDO之途徑。
存在若干可用於上述途徑中之替代酶。用於將琥珀酸酯轉變成琥珀醯基-CoA(圖1中之步驟1)之天然或內源性酶可由CoA轉移酶(例如由cat1基因克氏羧菌所編碼者)置換(Sohling及Gottschalk,Eur.J Biochem.212：121-127(1993))，該CoA轉移酶以與步驟9相似之方式發揮功能。然而，由此酶產生乙酸酯可能並非最佳，此乃因其可能被分泌而非轉變回乙醯基-CoA。就此而言，消除步驟9中之乙酸酯形成亦可能有益。作為此CoA轉移酶之一個替代，可採用以下機制：首先藉由ATP將4-HB磷酸化且隨後將其轉變成CoA衍生物，此與大腸桿菌中用於將乙酸酯轉變成乙醯基-CoA之乙酸激酶/磷酸轉乙醯基酶途徑相似。此路徑之淨成本係一個ATP，此與自乙酸酯再生乙醯基-CoA所需要相同。已知磷酸轉丁醯基酶(ptb)及丁酸激酶(bk)對用於在丙酮丁醇梭菌中產生丁酸酯之非羥基化分子實施該等步驟(Cary等人，Appl Environ Microbiol 56：1576-1583(1990)；Valentine,R.C.及R.S.Wolfe,J Biol Chem.235：1948-1952(1960))。該等酶係可逆的，允許合成在4-HB之方向上進行。
BDO亦可經由α-酮戊二酸酯以及或代替經由琥珀酸酯產生。如先前所述及下文所進一步例示，一種達成產物生物合成之途徑係使用內源性酶經由α-酮戊二酸酯產生琥珀酸半醛(圖1，步驟4-5)。替代方式係使用可在一個步驟中實施此轉變之α-酮戊二酸去羧酶(圖1，步驟8；Tian等人，Proc Natl Acad Sci U S.A 102：10670-10675(2005))。
為了構築產生BDO之微生物之不同菌株，組裝確證用可適用基因列表。簡言之，使用可用文獻來源、NCBI遺傳數據庫及同源性搜索來鑑別圖1中所示完整BDO產生途徑之各步驟中4-HB及/或BDO生物合成途徑內之一或多個基因。此研究中選殖及評價之基因連同多肽序 列之合適參考文獻及URL引述一起呈現於下表6中。如下文所進一步論述，合成一些基因用於密碼子最佳化，而其他則經由PCR自天然或野生型生物體之基因組DNA選殖。對於一些基因而言，使用兩種方式，且在此情況下，當用於實驗中時，天然基因指示為基因標識號之「n」後綴。注意，僅DNA序列不同；蛋白質係相同的。
1Sohling及Gottschalk，Eur.J.Biochem.212：121-127(1993)；Sohling及Gottschalk,J.Bacteriol.178：871-880(1996)
2Nolling等人，J.,J.Bacteriol.183：4823-4838(2001)
3Pohlmann等人，Nat.Biotechnol.24：1257-1262(2006)
4Kosaka等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.71：58-68(2007)
5Brosch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104：5596-5601(2007)
6Henne等人，Appl.Environ.Microbiol.65：3901-3907(1999)
用於BDO途徑之表現載體構築。載體主鏈及一些菌株係自Rolf Lutz博士之Expressys(expressys.de/)獲得。載體及菌株係基於由Rolf Lutz博士及Hermann Bujard教授研發之pZ表現系統(Lutz,R.及H.Bujard，Nucleic Acids Res 25：1203-1210(1997))。所得載體係pZE13luc、pZA33luc、pZS*13luc及pZE22luc且含有螢光素酶基因作為填充片段。為了用側接有合適限制酶位點之lacZ-α片段置換螢光素酶填充片段，首先藉由用EcoRI及XbaI消化自各載體去除螢光素酶填充片段。利用以下引子自pUC19藉由PCR擴增lacZ-α片段：lacZalpha-RI 5’GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3’(SEQ ID NO：1)
lacZalpha 3'BB 5’-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3’(SEQ ID NO：2)。
此生成5’末端具有EcoRI位點、NheI位點、核糖體結合位點、SalI位點及起始密碼子之片段。在該片段之3’末端上含有終止密碼子、XbaI位點、HindIII位點及AvrII位點。用EcoRI及AvrII消化PCR產物且將其連接至用EcoRI及XbaI消化之基礎載體中(XbaI及AvrII具有相容末端且生成非位點)。由於NheI及XbaI限制酶位點生成可連接在一起之相容末端(但生成不被任一酶消化之NheI/XbaI非位點)，因此選殖至載體中之基因可以「生物積塊(Biobrick)」形式在一起(openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology：BioBricks)。簡言之，此方法允許使用2個相同的限制位點將無限數量之基因接合至載體中(只要該等位點不出現在該基因內部即可)，此乃因在每次添加後會破壞該
所有載體皆依次具有指示複製起點、抗生素抗性標記物及啟動子/調節單元之pZ標號以及字母及數字。複製起點係第二個字母且基於起點表示為：E(對於ColE1而言)、A(對於p15A而言)及S(對於pSC101而言)。第一個數字代表抗生素抗性標記物(1為胺苄青黴素(Ampicillin)，2為康黴素(Kanamycin)，3為氯黴素，4為觀黴素(Spectinomycin)且5為四環素)。最後數字界定調節所關注基因之啟動子(1為PLtetO-1，2為PLlacO-1，3為PA1lacO-1且4為Plac/ara-1)。MCS及所關注基因緊隨其後。對於本文所論述之工作，採用兩種針對如上文所論述生物積塊插入進行修改之基礎載體pZA33及pZE13。在已將所關注基因選殖至其中後，使用表6中給出之4數位基因代碼(例如，pZA33-XXXX-YYYY-...)指示所得質粒。
宿主菌株構築。本文所述所有研究中之親本菌株皆係大腸桿菌K-12菌株MG1655。由第三方依照服務合同使用redET方法構築缺失adhE、gabD及aldA之無標記物菌株(Datsenko,K.A.及B.L.Wanner,Proc Natl Acad Sci U S.A 97：6640-6645(2000))。經由噬菌體P1介導之轉導構築後續菌株(Miller,J.Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratories,New York(1973))。自Expressys獲得菌株C600Z1(laciq、PN25-tetR、SpR、lacY1、leuB6、mcrB+、supE44、thi-1、thr-1、tonA21)且將其用作lacIq等位基因來源以供P1轉導。使噬菌體P1vir在觀黴素抗性基因連接至lacIq之C600Z1大腸桿菌菌株上生長。使用在C600Z1上生長之P1裂解物來感染MG1655以選擇觀黴素抗性。然後藉由測定轉導子阻抑連接至PA1lacO-1啟動子之基因表現之能力來針對所連接lacIq篩選觀黴素抗性菌落。所得菌株命名為MG1655 lacIq。使用相似程序將lacIQ引入缺失菌株中。
自琥珀酸酯產生4-HB。為了自琥珀酸酯構築4-HB產生者，將編碼自琥珀酸酯至4-HB及4-HB-CoA之步驟(圖1中之1、6、7及9)之基因 組裝至pZA33及pZE13載體上，如下文所述。評價各種基因組合，以及帶有不完全途徑作為對照之構築體(表7及8)。然後將質粒轉化至含有lacIQ之宿主菌株中，該等菌株允許藉由添加異丙基β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)進行誘導型表現。測試野生型與缺失編碼天然琥珀酸半醛去氫酶(圖1中之步驟2)之基因之宿主二者。
首先在活體外分析使用菌株MG1655 lacIQ作為含有途徑基因之質粒構築體之宿主測試異源酶之活性。使細胞在含有用於各構築體之合適抗生素之LB培養基(Difco)中在好氧性下生長，且當光密度(OD600)達到約0.5時藉由添加1mM IPTG進行誘導。在6小時後收穫細胞，且如下文所論述實施酶分析。
活體外酶分析。為了獲得用於活性分析之粗製萃取物，藉由以4,500rpm離心(Beckman-Coulter,Allegera X-15R)10min來收穫細胞。 將沈澱再懸浮於0.3mL含有Benzonase核酸酶及溶菌酶之BugBuster(Novagen)試劑中，且在室溫下輕輕振盪的同時進行15分鐘裂解。藉由在4℃下以14,000rpm離心(Eppendorf離心機5402)30min獲得無溶胞物。使用Bradford等人，Anal.Biochem.72：248-254(1976)之方法測定試樣中之細胞蛋白質，且如下文所述實施特定酶分析。活性報告為單位數/mg蛋白質，其中活性單位定義為在室溫下在1min內轉變1μmol受質所需酶量。一般而言，報告值係至少3個重複分析之平均值。
藉由依照先前所述程序監測乙醯基-CoA自琥珀醯基-CoA及乙酸酯之形成來測定琥珀醯基-CoA轉移酶(Cat1)活性(Sohling及Gottschalk，J.Bacteriol.178：871-880(1996))。藉由依照在ATP存在下琥珀醯基-CoA自琥珀酸酯及CoA之形成來測定琥珀醯基-CoA合成酶(SucCD)活性。實驗依照Cha及Parks,J.Biol.Chem.239：1961-1967(1964)所述之程序。藉由依照在琥珀酸半醛及CoA存在下在340nm下 (1964)所述之程序。藉由依照在琥珀酸半醛及CoA存在下在340nm下NAD轉變為NADH來測定CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶(SucD)活性(Sohling及Gottschalk，Eur.J.Biochem.212：121-127(1993))。藉由在琥珀酸半醛存在下在340nm下監測NADH至NAD之氧化來測定4-HB去氫酶(4-HBd)酶活性。該實驗依照已公佈程序(Gerhardt等人Arch.Microbiol.174：189-199(2000))。使用來自Scherf及Buckel,Appl.Environ.Microbiol.57：2699-2702(1991)之經修改程序來測定4-HB CoA轉移酶(Cat2)活性。使用HPLC測定4-HB-CoA或丁醯基-CoA自乙醯基-CoA及4-HB或丁酸酯之形成。
在還原方向上使用自若干文獻來源改編之程序分析醇(ADH)及醛(ALD)去氫酶(Durre等人，FEMS Microbiol.Rev.17：251-262(1995)；Palosaari及Rogers，J.Bacteriol.170：2971-2976(1988)及Welch等人，Arch.Biochem.Biophys.273：309-318(1989)。在使NADH氧化後，在室溫下每4秒讀取340nM下之吸光度，總共240秒。 在100mM MOPS(用KOH調節至pH 7.5)、0.4mM NADH及1至50μl細胞萃取物中實施還原分析。藉由添加以下試劑開始反應：100μl 100mM乙醛或丁醛(對於ADH而言)或100μl 1mM乙醯基-CoA或丁醯基-CoA(對於ALD而言)。快速使分光光度計變為空白且隨後開始動力學讀數。所得每分鐘340nM下之吸光度降低之斜率連同340nM下之NAD(P)H之莫耳消光係數(6000)及萃取物之蛋白質濃度可用於測定比活性。
在丁醯基-CoA至丁醯基-磷酸酯方向上如Cary等人J.Bacteriol.170：4613-4618(1988)中所述量測PTB之酶活性。其提供轉變用無機磷酸酯，且利用試劑5,5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)或DTNB來追蹤游離CoA之增加。DTNB迅速與諸如CoA等硫醇基反應而釋放黃色2-硝基-5-巰基苯甲酸(TNB)，TNB在412nm下吸光，且莫耳消光係數為 14,140M cm-1。分析緩衝液含有150mM磷酸鉀(pH 7.4)、0.1mM DTNB及0.2mM丁醯基-CoA，且藉由添加2μL至50μL細胞萃取物開始反應。在丁酸酯至丁醯基-磷酸酯形成方向上以ATP為代價量測BK之酶活性。該程序與先前由Rose等人，J.Biol.Chem.211：737-756(1954)所述用於乙酸激酶之分析相似。然而，已發現，由Sigma提供之另一乙酸激酶分析方案更為有用且靈敏。此分析將以下轉變關聯：ATP由乙酸激酶轉變成ADP，與ADP及磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)由丙酮酸激酶關聯轉變成ATP及丙酮酸酯，之後丙酮酸酯及NADH由乳酸去氫酶轉變成乳酸酯及NAD+。用丁酸酯取代乙酸酯係允許分析追蹤BK酶活性之唯一重要修飾。分析混合物含有80mM三乙醇胺緩衝液(pH 7.6)、200mM丁酸鈉、10mM MgCl2、0.1mM NADH、6.6mM ATP、1.8mM磷酸烯醇丙酮酸酯。根據製造商說明書添加丙酮酸激酶、乳酸去氫酶及肌激酶。藉由添加2μL至50μL細胞萃取物開始反應，且基於指示NADH氧化之340nm下之吸光度降低來監測反應。
藉由HPLC分析CoA衍生物。研發基於HPLC之分析來監測涉及輔酶A(CoA)轉移之酶促反應。所研發方法允許藉由定量測定存在於活體外反應混合物中之CoA、乙醯基CoA(AcCoA)、丁醯基CoA(BuCoA)及4-羥基丁酸CoA(4-HBCoA)進行酶活性表徵。達成低至低μM之敏感性，以及所有所關注CoA衍生物之極佳解析。
化學品及試樣製備實施如下。簡言之，CoA、AcCoA、BuCoA及所有其他化學品皆自Sigma-Aldrich獲得。溶劑、甲醇及乙腈為HPLC級。標準校準曲線在0.01-1mg/mL濃度範圍內展現極佳線性度。酶促反應混合物含有100mM Tris HCl緩衝液(pH 7)，在不同時間點取等分試樣，用甲酸(0.04%最終濃度)淬滅且直接藉由HPLC分析。
使用配備有二元幫浦、除氣器、恒溫自動進樣器及管柱隔室之Agilent 1100 HPLC系統實施HPLC分析，並使用二極體陣列檢測器 (DAD)進行該分析。採用反相管柱Kromasil 100 5um C18,4.6×150mm(Peeke Scientific)。使用25mM磷酸鉀(pH 7)及甲醇或乙腈作為水性及有機溶劑，流動速率為1mL/min。研發出兩種方法：短時方法，其具有較快梯度用於分析經充分解析之CoA、AcCoA及BuCoA；及較長時方法，其用於區分接近溶析之AcCoA與4-HBCoA。短時方法採用乙腈梯度(0min-5%、6min-30%、6.5min-5%、10min-5%)且使CoA、AcCoA及BuCoA之滯留時間分別為2.7min、4.1min及5.5min。在長時方法中，使用甲醇與以下線性梯度：0min-5%、20min-35%、20.5min-5%、25min-5%。CoA、AcCoA、4-HBCoA及BuCoA之滯留時間分別為5.8min、8.4min、9.2min及16.0min。注射體積係5μL，管柱溫度為30℃，且在260nm下監測UV吸光度。
結果顯示4個途徑步驟中每一者之活性(表7)，但活性明確地取決於基因來源、基因在載體中之位置及與其一起表現之其他基因之背景。例如，基因0035所編碼琥珀酸半醛去氫酶之活性強於由0008所編碼者，且0036及0010n係活性強於0009之4-HB去氫酶基因。當在相同操縱子上在基因之前存在另一基因時，亦似乎存在更佳4-HB去氫酶活性。
表7.來自MG1655 lacIQ之細胞萃取物中之活體外酶活性，該MG1655 lacIQ含有表現4-HB-CoA途徑中之基因之質粒.活性報告為單位數/mg蛋白質，其中活性單位定義為在室溫下在1min內轉變1μmol受質所需酶量。
自pZE13上之Plac表現之基因，pZE13係具有colE1起點及胺苄青黴素抗性之高拷貝質粒。基因標識號係如表6中所給出
自pZA33上之Plac表現之基因，pZA33係具有pACYC起點及氯黴素抗性之中度拷貝質粒。
(c)細胞蛋白質以mg蛋白質/mL萃取物給出。
然後評估含有4-HB途徑中之基因之重組菌株在活體內自中心代謝中間體產生4-HB之能力。使細胞在LB培養基中在厭氧性下生長至OD600為約0.4，然後利用1mM IPTG進行誘導。1小時後，琥珀酸鈉添加至10mM，且在另一24小時及48小時後，取樣進行分析。藉由GC-MS分析培養營養液中之4-HB，如下文所述。結果指示，在24小時後，重組菌株可產生超過2mM之4-HB，相比之下，對照菌株中基本上為0(表8)。
表8.在具有表現各種4-HB途徑基因組合之質粒之大腸桿菌菌株中自琥珀酸酯產生4-HB.
(a)正規化4-HB濃度，μM/OD600單位
使用CoA轉移酶(cat1)自琥珀酸酯產生琥珀醯基-CoA之替代方式係使用編碼琥珀醯基-CoA合成酶之天然大腸桿菌sucCD基因。將此基因簇連同用於達成4-HB之剩餘步驟之候選基因一起選殖至pZE13上以產生pZE13-0038-0035-0036。
自葡萄糖產生4-HB。儘管上述實驗顯示自中心代謝中間體(琥珀酸酯)達成4-HB之功能途徑，但工業製程將需要自諸如葡萄糖或蔗糖等低成本碳水化合物原料產生化學品。因此，下一組實驗之目的在於測定細胞在葡萄糖上生長期間產生之內源性琥珀酸酯是否可向4-HB途徑供給燃料。使細胞在補加有20g/L葡萄糖、100mM用以改良緩衝能力之3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、10μg/mL硫胺素及合適抗生素之M9最低培養基(6.78g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中在厭氧性下生長。當OD600達到約0.2時，添加0.25mM IPTG，且在誘導後每24小時取樣進行4-HB分析。在所有情況下，4-HB在24小時後達到平穩，其中最佳菌株中最大為約1mM(圖3a)，而琥珀酸酯濃度持續上升(圖3b)。此指示，向該途徑供給琥珀酸酯可能不受限制，且瓶頸可在於酶本身之活性或NADH可用性。0035及0036分別明確地係CoA依賴性琥珀酸半 醛去氫酶及4-HB去氫酶之最佳基因候選物。消除編碼已知(gabD)或推定(aldA)之天然琥珀酸半醛去氫酶之基因中一者或二者對性能幾乎沒有效應。最終，應注意，細胞在產生4-HB之菌株中生長達成之OD遠遠低於在對照中所達成者(圖3c)。
自葡萄糖產生4-HB之替代途徑係經由α-酮戊二酸酯。吾人探索了使用來自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶(Tian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：10670-10675(2005))自α-酮戊二酸酯直接產生琥珀酸半醛(圖1中之步驟8)。為了證實此基因(0032)在活體內具有功能，吾人使其在與pZA33上之4-HB去氫酶(基因0036)相同之宿主中在pZE13上表現。此菌株能夠在用1mM IPTG誘導後24小時內產生超過1.0mM之4-HB(圖4)。由於此菌株不表現CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶，因此消除經由琥珀醯基-CoA產生琥珀酸半醛之可能性。負責產生琥珀酸半醛之天然基因亦可能在此途徑中發揮功能(圖1中之步驟4及5)；然而，當宿主不包括pZE13-0032質粒時所產生4-HB之量係可忽略的。
自4-HB產生BDO。自4-HB產生BDO需要兩個由去氫酶催化之還原步驟。醇及醛去氫酶(分別為ADH及ALD)係依賴NAD+/H及/或NADP+/H之酶，其一起可還原分子上之羧酸基至醇基，或相反，可實施醇至羧酸之氧化。已在野生型丙酮丁醇梭菌中證實此生物轉化(Jewell等人，Current Microbiology,13：215-19(1986))，但未鑑別出相關酶與相關基因。另外，尚不瞭解，是否首先需要活化成4-HB-CoA(圖1中之步驟9)，或是否醛去氫酶(步驟12)可直接作用於4-HB。吾人基於對4-HB之非羥基化類似物及途徑中間體之已知活性或藉由與該等經表徵基因(表6)之相似性研發了來自丙酮丁醇梭菌及相關生物體之候選酶列表。由於一些候選物係多官能去氫酶，因此其可潛在地催化依賴NAD(P)H之酸(或衍生自CoA)至醛之還原及醛至醇之還原。在 開始在大腸桿菌中處理該等基因之前，吾人首先使用丙酮丁醇梭菌ATCC 824驗證上文引用之結果。在30℃下使細胞在補加有10mM 4-HB之Schaedler營養液(Accumedia,Lansing,MI)中在10% CO2、10% H2及80% N2之厭氧性大氣中生長。取週期性培養試樣，進行離心，且藉由GC-MS分析營養液之BDO，如下文所述。分別在1天、2天及7天培育後檢測到0.1mM、0.9mM及1.5mM之BDO濃度。在未4-HB添加而生長之培養物中未檢測到BDO。為了證實所產生BDO係源自葡萄糖，使產生BDO之最佳菌株MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036在補加有4g/L均勻標記13C-葡萄糖之M9最低培養基中生長。利用1mM IPTG在0.67之OD下誘導細胞，且在24小時後取樣。藉由質譜實施對培養物上清液之分析。
接下來測試4-HB至BDO轉變途徑之基因候選物當在大腸桿菌宿主MG1655 lacIQ中表現時之活性。在37℃下使含有pZA33上表現之各基因候選物之重組菌株在0.25mM IPTG存在下生長4小時以完全誘導酶之表現。在誘導後4小時，收穫細胞並分析ADH及ALD活性，如上文所述。由於4-HB-CoA及4-羥基丁醛非市面有售，因此使用非羥基化受質(表9)實施分析。丙酮丁醇梭菌adhE2(0002)及大腸桿菌adhE(0011)之4-碳受質與2-碳受質之間之活性比率與彼等先前於文獻(Atsumi等人，Biochim.Biophys.Acta.1207：1-11(1994))中所報導者相似。
對於BDO產生實驗而言，在用於將4-HB轉變成4-HB-CoA之pZA33上包括來自牙齦卟啉單胞菌W83之cat2(基因0034)，而使候選去氫酶基因在pZE13上表現。宿主菌株係MG1655 lacIQ。因受質之相似性，因此亦連同醇及醛去氫酶候選物一起，測試CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶(sucD)在此步驟中發揮功能之能力。使細胞在補加有10mM 4-HB之LB培養基中生長至約0.5之OD，用1mM IPTG誘導，且在24小時後取培養營養液試樣並分析BDO，如下文所述。使用來自丙酮丁醇梭菌之adhE2、來自克氏羧菌之sucD或來自牙齦卟啉單胞菌之sucD發生最佳BDO產生(圖5)。有趣的是，所產生BDO之絕對量在好氧性條件下較高；然而，此主要歸因於在厭氧性培養中達成之較低細胞密度。當正規化成細胞OD時，BDO產生/單位生物質在厭氧性條件下較高(表10)。
如上文所論述，可有利地使用用於將4-HB轉變成4-HB-CoA之路徑，該等路徑不生成乙酸酯作為副產物。為達成此目標，測試使用來自丙酮丁醇梭菌之磷酸轉丁醯基酶(ptb)及丁酸激酶(bk)經由圖1中之步驟10及11實施此轉變。將來自丙酮丁醇梭菌之天然ptb/bk操縱子(基因0020及0021)選殖於pZA33中並使其在其中表現。獲取來自含有所得構築體之細胞之萃取物且分析兩種酶活性，如本文所述。BK之比活性係約65U/mg，而PTB之比活性係約5U/mg。一單位(U)活性定義為在1分鐘內在室溫下1μM受質之轉變。最終，測試構築體在4-HB轉變為BDO中之參與。用所述pZA33-0020-0021構築體及pZE13-0002轉化宿主菌株，且將其與cat2在使用圖5中之上文所用好氧性程序產生BDO中之使用比較。BK/PTB菌株產生1mM BDO，相比之下，當使用cat2時，產生2mM(表11)。有趣的是，結果取決於宿主菌株是否含有天然adhE基因缺失。
自葡萄糖產生BDO。途徑確證之最終步驟係表現大腸桿菌中之途徑之4-HB與BDO區段二者且顯示在葡萄糖最低培養基中產生BDO。構築新質粒以將所有所需基因皆裝配於兩種質粒上。一般而言，cat1、adhE及sucD基因係自pZE13表現，且cat2及4-HBd係自pZA33表現。在MG1655 lacIQ背景中測試基因來源及基因順序之各種組合。使細胞在補加有20g/L葡萄糖、100mM用以改良緩衝能力之3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、10μg/mL硫胺素及合適抗生素之M9最低培養基(6.78g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/LNH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中在厭氧性下生長。在接種後約15小時添加0.25mM IPTG，且在誘導後24小時及48小時取培養物上清液試樣進行BDO、4-HB及琥珀酸酯分析。BDO之產生似乎顯示對基因順序之依賴性(表12)。利用在pZA33上首先表現cat2、之後表現4-HBd及在pZE13上表現cat1、之後表現牙齦卟啉單胞菌sucD獲得超過0.5mM之最高BDO產生。在pZE13上之最後位置添加丙酮丁醇梭菌adhE2產生輕微改良。亦產生較高濃度之4-HB及琥珀酸酯。
藉由GCMS對BDO、4-HB及琥珀酸酯之分析。藉由矽烷基化將發酵及細胞培養試樣中之BDO、4-HB及琥珀酸酯衍生化且藉由GCMS使用自文獻報導改編之方法實施定量分析((Simonov等人，J.Anal Chem.59：965-971(2004))。所研發方法顯示低至1μM之良好敏感性、最高至少25mM之線性度，以及極佳選擇性及重現性。
試樣製備實施如下：在環境溫度下在Speed Vac濃縮器(Savant SVC-100H)中將100μL過濾(0.2μm或0.45μm針筒過濾器)試樣(例如發酵營養液、細胞培養物或標準溶液)徹底乾燥約1小時，之後添加二甲基甲醯胺中之20μL 10mM環己醇溶液作為內標。對混合物實施渦旋且在水浴(Branson 3510)中實施15min音波處理以確保均質性。添加100μL矽烷基化衍生化試劑具有1%三甲基氯矽烷之N,O-雙(三甲基矽烷基)三氟-乙醯胺(BSTFA)，在70℃下將混合物培育30min。將衍生化試樣離心5min，並將透明溶液直接注入GCMS中。除購自J.T.Baker之BDO之外，所有化學品及試劑皆來自Sigma-Aldrich。
在Agilent氣相層析儀6890N上實施GCMS，介面連接至以電子衝擊電離(EI)模式操作之質量選擇性檢測器(MSD)5973N以進行分析。使用30m×0.25mm i.d.×0.25μm膜厚度之DB-5MS毛細管管柱(J&W Scientific,Agilent Technologies)。GC以分流注射模式操作，以20：1分流比引入1μL試樣。注射口溫度係250℃。使用氦作為載氣，且流動速率維持在1.0mL/min。將溫度梯度程式最佳化以確保對所關注分析物之良好解析及最低矩陣干擾。首先使烘箱在80℃下保持1min，然後以2℃/min線性變化至120℃，之後以100℃/min快速線性變化至320℃且在320℃下最終保持6min。MS介面轉移線維持在280℃。使用‘輕質’MS調整設定及30-400m/z質量範圍掃描獲取數據。總分析時間係29min，包括3min溶劑延遲。BSTFA-衍生化環己醇、BDO、4-HB及琥珀酸酯之滯留時間分別對應於5.2min、10.5min、14.0min及 18.2min。對於定量分析而定，選擇以下比質量片段(萃取離子層析圖)：m/z157(對於內標環己醇而言)，116(對於BDO而言)及147(對於4-HB及琥珀酸酯二者而言)。在相應細胞培養或發酵培養基中使用分析物溶液構築標準校準曲線以儘可能接近地匹配試樣矩陣。使用Environmental Data Analysis ChemStation軟體(Agilent Technologies)處理GCMS數據。
結果指示，用13C標記所產生多數4-HB及BDO(圖6，右側)。顯示在未經標記葡萄糖中生長之平行培養物之質譜用於比較(圖6，左側)。注意，所見到之峰係關於來自代謝物之含有不同碳原子數量之衍生化分子片段。由於衍生化試劑亦貢獻該天然標記分佈之一些碳及矽原子，因此結果並非嚴格定量。
使用替代途徑自4-HB產生BDO。亦測試各種替代途徑之BDO產生。此包括使用天然大腸桿菌SucCD酶將琥珀酸酯轉變成琥珀醯基-CoA(表13，第2-3列)，在α-酮戊二酸酯途徑中使用α-酮戊二酸去羧酶(表13，第4列)，及使用PTB/BK作為替代手段來生成4HB之CoA衍生物(表13，第1列)。構築含有表現表13中所示基因之質粒之菌株，其涵蓋該等變體。結果顯示，在所有情況下，皆可產生4-HB及BDO(表13)。
實例III 4-羥基丁酸、γ-丁內酯及1,4-丁二醇之生物合成
此實例闡述使用發酵及其他生物過程生物合成產生4-羥基丁酸、γ-丁內酯及1,4-丁二醇。
下文闡述將4-HB發酵步驟整合至完整製程中用於產生經純化GBL、1,4-丁二醇(BDO)及四氫呋喃(THF)之方法。由於4-HB及GBL處於平衡狀態，因此發酵營養液將含有兩種化合物。在低pH下，此平衡經轉移而有利於GBL。因此，發酵可在pH 7.5或更小(通常為pH 5.5或更小)下操作。在去除生物質後，產物流進入分離步驟中，其中去除GBL且使富集於4-HB中之剩餘流再循環。最終，蒸餾GBL以去除任何雜質。該製程以三種方式中之一者操作：1)分批補料發酵及分批分離；2)分批補料發酵及連續分離；3)連續發酵及連續分離。該等模式中之前兩種示意性地示於圖7中。亦將下文所述整合發酵程序用於本發明之產生BDO之細胞，用於生物合成BDO及後續BDO家族產物。
用以產生4-HB/GBL之發酵方案(分批)：使產生生物體在用N2/CO2混合物吹掃之10L生物反應器中生長，其中使用含有5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米浸液且初始葡萄糖濃度為20g/L之5L營養液。當細胞生長並利用葡萄糖時，以大致平衡葡萄糖消耗之速率將額外70%葡萄糖進料至生物反應器中。生物反應器之溫度維持在30℃。生長持續約24小時，直至4-HB達到介於20-200g/L之間之濃度，且細胞密度介於5g/L與10g/L之間。不控制pH，且到運行結束時通常將降低至pH 3-6。在培養期完成後，使發酵器內含物經過細胞分離單元(例如，離心機)以去除細胞及細胞碎片，且將發酵營養液轉移至產物分離單元。4-HB及/或GBL之分離將藉由相關技藝所用自稀水溶液分離有機產物之標準分離程序發生，例如使用水不 混溶有機溶劑(例如，甲苯)進行液液萃取以提供4-HB/GBL之有機溶液。然後使所得溶液進行標準蒸餾方法以去除及再循環有機溶劑並提供GBL(沸點為204-205℃)，該GBL作為經純化液體分離。
產生4-HB/GBL之發酵方案(完全連續式)：首先使用上述裝置及培養基組成，使產生生物體以分批模式成長，但初始葡萄糖濃度改為30-50g/L。當葡萄糖耗盡時，以介於0.5L/hr至1L/hr之間之速率連續供應相同組成之進料培養基，且以相同速率排出液體。生物反應器中之4-HB濃度保持恆定在30-40g/L，且細胞密度保持恆定介於3-5g/L之間。溫度維持在30℃，且視需要使用濃NaOH及HCl使pH維持在4.5。將生物反應器連續操作一個月，其中每天取樣，以確保4-HB保持恆定濃度。在連續模式中，當供應新進料培養基時，應不斷排出發酵器內容物。然後在去除或不去除細胞及細胞碎片之情況下，使含有細胞、培養基及產物4-HB及/或GBL之排出流經過連續產物分離程序，其作法為藉由相關技藝所採用之標準連續分離方法，自稀水溶液中分離有機產物，例如使用水不混溶有機溶劑(例如，甲苯)進行連續液體-液體萃取法，提供4-HB/GBL之有機溶液。隨後使所得溶液經過標準連續蒸餾方法，以去除及再循環有機溶劑，並產生GBL(沸點為204℃-205℃)，該GBL係呈純化之液體單離出。
GBL還原方案：一旦如上述分離並純化GBL後，即可接著進行還原法，例如彼等相關技藝所熟知者(參見所引用參考文獻)，以產生1,4-丁二醇或四氫呋喃(THF)或其混合物。相關技藝熟知，在氫壓力下，異相或均相氫化觸媒與GBL之組合可提供產物1,4-丁二醇或四氫呋喃(THF)或其混合物。重要的是應注意，如上文所述自發酵營養液分離之4-HB/GBL產物混合物可能在GBL分離及純化之前直接進行該等相同還原法，產生產物1,4-丁二醇或四氫呋喃或其混合物。然後藉由相關技藝所熟知之程序分離並純化所得產物1,4-丁二醇及THF。
直接產生BDO或THF之發酵及氫化方案(分批式)：使細胞在用N2/CO2混合物吹掃之10L生物反應器中生長，其中使用含有5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米浸液，且初始葡萄糖濃度為20g/L之5L營養液。當細胞生長並利用葡萄糖時，以大致平衡葡萄糖消耗之速率，將額外70%葡萄糖進料至生物反應器中。生物反應器之溫度維持在30℃。生長持續約24小時，直至4-HB達到介於20-200g/L之間之濃度，且細胞密度介於5g/L與10g/L之間。不控制pH，且到運行結束時通常將降低至pH 3-6。在培養期完成後，使發酵器內含物經過細胞分離單元(例如，離心機)以去除細胞及細胞碎片，且將發酵營養液轉移至還原單元(例如，氫化容器)，其中將混合物4-HB/GBL直接還原成1,4-丁二醇或THF或其混合物。在還原程序完成後，將反應器內含物轉移至產物分離單元。1,4-丁二醇及/或THF之分離將藉由相關技藝所用自稀水溶液分離有機產物之標準分離程序發生，例如使用水不混溶有機溶劑(例如，甲苯)進行液液萃取以提供1,4-丁二醇及/或THF之有機溶液。然後使所得溶液進行標準蒸餾方法以去除及再循環有機溶劑並提供1,4-丁二醇及/或THF，該1,4-丁二醇及/或THF作為經純化液體分離。
用以直接產生BDO或THF之發酵及氫化方案(完全連續式)：首先使用上述裝置及培養基組成使細胞以分批模式成長，只是初始葡萄糖濃度為30-50g/L。當葡萄糖耗盡時，以介於0.5L/hr與1L/hr之間之速率連續供應相同組成之進料培養基，且以相同速率取出液體。生物反應器中之4-HB濃度保持恆定在30-40g/L，且細胞密度保持恆定介於3-5g/L之間。溫度維持在30℃，且視需要使用濃NaOH及HCl使pH維持在4.5。將生物反應器連續地操作一個月，其中每天取樣以確保4-HB濃度之一致性。在連續模式中，當供應新進料培養基時，不斷地去除發酵器內含物。然後使含有細胞、培養基及產物4-HB及/或 GBL之排出流經過細胞分離單元(例如，離心機)以去除細胞及細胞碎片，且將發酵營養液轉移至連續還原單元(例如，氫化容器)，其中將混合物4-HB/GBL直接還原成1,4-丁二醇或THF或其混合物。在還原程序完成後，將反應器內含物轉移至連續產物分離單元。1,4-丁二醇及/或THF之分離將藉由相關技藝所用自稀水溶液分離有機產物之標準連續分離程序發生，例如使用水不混溶有機溶劑(例如，甲苯)進行液液萃取以提供1,4-丁二醇及/或THF之有機溶液。然後使所得溶液進行標準連續蒸餾方法以去除及再循環有機溶劑並提供1,4-丁二醇及/或THF，該1,4-丁二醇及/或THF作為經純化液體分離。
用以直接產生BDO之發酵方案(分批式)：使產生生物體在用N2/CO2混合物吹掃之10L生物反應器中生長，其中使用含有5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米浸液且初始葡萄糖濃度為20g/L之5L營養液。當細胞生長並利用葡萄糖時，以大致平衡葡萄糖消耗之速率將額外70%葡萄糖進料至生物反應器中。生物反應器之溫度維持在30℃。生長持續約24小時，直至BDO達到介於20-200g/L之間之濃度，其中細胞密度通常介於5g/L與10g/L之間。在培養期完成後，使發酵器內含物經過細胞分離單元(例如，離心機)以去除細胞及細胞碎片，且將發酵營養液轉移至產物分離單元。BDO之分離將藉由相關技藝所用自稀水溶液分離有機產物之標準分離程序發生，例如使用水不混溶有機溶劑(例如，甲苯)進行液液萃取以提供BDO之有機溶液。然後使所得溶液進行標準蒸餾方法以去除及再循環有機溶劑並提供BDO(沸點為228-229℃)，該BDO作為經純化液體分離。
用以直接產生BDO之發酵方案(完全連續式)：首先使用上述裝置及培養基組成使產生生物體以分批模式成長，只是初始葡萄糖濃度為30-50g/L。當葡萄糖耗盡時，以介於0.5L/hr與1L/hr之間之速率連續供應相同組成之進料培養基，且以相同速率取出液體。生物反應器 中之BDO濃度保持恆定在30-40g/L，且細胞密度保持恆定介於3-5g/L之間。溫度維持在30℃，且視需要使用濃NaOH及HCl使pH維持在4.5。將生物反應器連續地操作一個月，其中每天取樣以確保BDO濃度之一致性。在連續模式中，當供應新進料培養基時，不斷地去除發酵器內含物。然後在去除或不去除細胞及細胞碎片之情況下使含有細胞、培養基及產物BDO之排出流進行連續產物分離程序，且將藉由相關技藝所用自稀水溶液分離有機產物之標準連續分離方法發生，例如使用水不混溶有機溶劑(例如，甲苯)進行連續液液萃取以提供BDO之有機溶液。隨後使所得溶液進行標準連續蒸餾方法以去除及再循環有機溶劑並提供BDO(mpt為20℃)，該BDO作為經純化液體分離。
實例IV 實例性BDO途徑
此實例闡述用於1,4-丁二醇(BDO)合成途徑之實例性酶及相應基因。
實例性BDO合成途徑示於圖8-13中。繪示於圖8-13中之途徑係來自達成1,4-丁二醇之常見中心代謝中間體。繪示於圖8-13中之所有轉化屬於示於表14中之18個一般轉化類別。下文闡述各類別中之諸多以化學方式表徵之候選基因。具體而言，列示可應用於在宿主生物體中選殖及表現時催化圖9-13中之合適轉化之基因。圖9-13中各關鍵步驟之前三個實例性基因提供於表15-23中(參見下文)。本文闡述提供用於圖8所示途徑之實例性基因。
1.1.1.a-氧化還原酶(醛至醇或酮至羥基)
醛至醇。編碼催化醛轉變為醇之酶(亦即，醇去氫酶或等效醛還原酶)之實例性基因包括編碼C2-C14中鏈醇去氫酶之alrA(Tani等人Appl.Environ.Microbiol.66：5231-5235(2000))、來自啤酒酵母菌之ADH2(Atsumi等人Nature 451：86-89(2008))、來自對長於C(3)之分子具有傾向之大腸桿菌之yqhD(Sulzenbacher等人Journal of Molecular Biology 342：489-502(2004))及來自將丁醛轉變成丁醇之丙酮丁醇梭菌之bdh I及bdh II(Walter等人Journal of Bacteriology 174：7149-7158(1992))。若可用，則該等實例性基因產物中每一者之蛋白質序列可使用以下GenBank登記號找到：
展現4-羥基丁酸去氫酶活性之酶(EC 1.1.1.61)亦屬於此類別。此等酶已在富養產鹼菌(Bravo等人J.Forensic Sci.49：379-387(2004)、克氏羧菌(Wolff等人Protein Expr.Purif.6：206-212(1995))及擬南芥(Breitkreuz等人J.Biol.Chem.278：41552-41556(2003))中進行表徵。
另一實例性酶係催化3-羥基異丁酸酯至甲基丙二酸酯半醛之可逆氧化的3-羥基異丁酸去氫酶。此酶參與纈胺酸、白胺酸及異白胺酸降解且已在細菌、真核生物及哺乳動物中進行鑑別。由來自嗜熱棲熱菌HB8之P84067編碼之酶已在結構上進行表徵(Lokanath等人J Mol Biol 352：905-17(2005))。使用同位素標記之受質證實人類3-羥基異丁酸去氫酶之可逆性(Manning等人Biochem J 231：481-484(1985))。編碼此酶之其他基因包括智人(Hawes等人Methods Enzymol.324：218-228(2000))及穴兔(Chowdhury等人Biosci.Biotechnol Biochem.60：2043-2047(1996)；Hawes等人Methods Enzymol.324：218-228(2000))中之3hidh、繡色假單胞菌中之mmsb及戀臭假單胞菌中之dhat(Aberhart等人J Chem.Soc.[Perkin 1]6：1404-1406(1979)；Chowdhury等人Biosci.Biotechnol Biochem.67：438-441(2003)；Chowdhury等人Biosci.Biotechnol Biochem.60：2043-2047(1996))。
亦已顯示，若干3-羥基異丁酸去氫酶將丙二酸半醛轉變成3-羥基丙酸(3-HP)。三種展現此活性之基因候選物係來自繡色假單胞菌PAO1(62)之mmsB、來自戀臭假單胞菌KT2440之mmsB(Liao等人，美國公開案2005/0221466)及來自戀臭假單胞菌E23之mmsB(Chowdhury等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.60：2043-2047(1996))。亦已在糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)M3A中鑑別出具有3-羥基丁酸去氫酶活性之酶(Gokam等人，美國專利第7,393,676號；Liao等人，美國公開案第2005/0221466號)。來自其他生物體(包括類球紅桿菌)之其他基因候選物可藉由序列相似性推測。
丙二酸半醛轉變為3-HP亦可藉由兩種其他酶達成：依賴NADH之3-羥基丙酸去氫酶及依賴NADPH之丙二酸酯半醛還原酶。認為依賴NADH之3-羥基丙酸去氫酶參與細菌及植物中自丙酸酯之β-丙胺酸生物合成途徑(Rathinasabapathi,B.Journal of Plant Pathology 159：671-674(2002)；Stadtman,E.R.J.Am.Chem.Soc.77：5765-5766(1955))。迄今尚未將此酶與任一生物體中之基因相關。依賴NADPH之丙二酸酯半醛還原酶催化自營CO2-固定細菌中之逆反應。儘管已在瑟杜生金屬 球菌中檢測到該酶活性，但對基因一致性不瞭解(Alber等人J.Bacteriol.188：8551-8559(2006))。
酮至羥基。存在若干將酮轉變成羥基官能基之實例性醇去氫酶。來自大腸桿菌之兩種此酶係由蘋果酸去氫酶(mdh)及乳酸去氫酶(ldhA)編碼。另外，已顯示，來自富養產鹼菌之乳酸去氫酶對不同鏈長之受質(例如乳酸酯、2-酮基丁酸酯、2-酮基戊酸酯及2-酮基戊二酸酯)顯示高活性(Steinbuchel及Schlegel，Eur.J.Biochem.130：329-334(1983))。可由2-酮己二酸酯還原酶催化將α-酮己二酸酯轉變成α-羥基己二酸酯，該酶被報導在大鼠及人類胎盤中發現(Suda等人Arch.Biochem.Biophys.176：610-620(1976)；Suda等人Biochem.Biophys.Res.Commun.77：586-591(1977))。用於此步驟之另一候選物係已經選殖及表徵之來自人類心臟之粒線體3-羥基丁酸去氫酶(bdh)(Marks等人J.Biol.Chem.267：15459-15463(1992))。此酶係作用於3-羥酸之去氫酶。另一實例性醇去氫酶將丙酮轉變成異丙醇，如拜氏梭菌(Ismaiel等人J.Bacteriol.175：5097-5105(1993))及布氏嗜熱厭氧桿菌(Lamed等人Biochem.J.195：183-190(1981)；Peretz及Burstein Biochemistry 28：6549-6555(1989))中所示。
將乙醯乙醯基-CoA轉變成3-羥基丁醯基-CoA之實例性3-羥基醯基去氫酶包括來自丙酮丁醇梭菌之hbd(Boynton等人Journal of Bacteriology 178：3015-3024(1996))、來自拜氏梭菌之hbd(Colby等人 Appl Environ.Microbiol 58：3297-3302(1992))及諸多來自瑟杜生金屬球菌之相似酶(Berg等人Archaea.Science 318：1782-1786(2007))。
1.1.1.c-氧化還原酶(2步，醯基-CoA至醇)
將醯基-CoA轉變成醇之實例性2步氧化還原酶包括彼等轉化諸如以下等受質者：乙醯基-CoA至乙醇(例如，來自大腸桿菌之adhE(Kessler等人FEBS.Lett.281：59-63(1991))及丁醯基-CoA至丁醇(例如，來自丙酮丁醇梭菌之adhE2(Fontaine等人J.Bacteriol.184：821-830(2002))。除將乙醯基-CoA還原成乙醇外，亦已顯示，由腸膜樣明串珠菌中之adhE編碼之酶將支鏈化合物異丁醛氧化成異丁醯基-CoA(Kazahaya等人J.Gen.Appl.Microbiol.18：43-55(1972)；Koo等人Biotechnol Lett.27：505-510(2005))。
另一實例性酶可將丙二醯基-CoA轉變成3-HP。具有此活性之依賴NADPH之酶已在嗜熱光合綠麴菌中進行表徵，其中其參與3-羥基丙酸酯循環(Hugler等人，J.Bacteriol.184：2404-2410(2002)；Strauss及Fuchs，Eur.J.Biochem.215：633-643(1993))。此酶之質量為300kDa，具有高度受質特異性且幾乎不顯示與其他已知氧化還原酶之序 列相似性(Hugler等人，J.Bacteriol.184：2404-2410(2002))。已顯示，其他生物體中之酶皆不催化此特異性反應；然而，有生物資訊學證據表明，其他生物體可具有相似途徑(Klatt等人，Environ.Microbiol.9：2067-2078(2007))。其他生物體(包括凱斯特玫瑰彎菌、赤桿菌N4Pl及海洋γ變形菌HTCC2080)中之酶候選物可藉由序列相似性推測。
較長鏈醯基-CoA分子可由諸如編碼形成醇之脂肪醯基-CoA還原酶之荷荷巴(jojoba)(蠟黃楊)FAR等酶還原。其在大腸桿菌中之過表現產生FAR活性及脂肪醇累積(Metz等人Plant Physiology 122：635-644(2000))。
1.2.1.b-氧化還原酶(醯基-CoA至醛)
若干醯基-CoA去氫酶能夠將醯基-CoA還原成其對應醛。編碼此等酶之實例性基因包括編碼以下酶之乙酸鈣不動桿菌acrl：脂肪醯基-CoA還原酶(Reiser及Somerville，J.Bacteriology 179：2969-2975(1997))、不動桿菌M-1脂肪醯基-CoA還原酶(Ishige等人Appl.Environ.Microbiol.68：1192-1195(2002))及由克氏羧菌中之sucD基因編碼之CoA依賴性及NADP依賴性之琥珀酸半醛去氫酶(Sohling及Gottschalk J Bacteriol 178：871-80(1996)；Sohling及Gottschalk J Bacteriol.178：871-880(1996))。牙齦卟啉單胞菌之SucD係另一琥珀酸半醛去氫酶(Takahashi等人J.Bacteriol.182：4704-4710(2000))。假單孢 菌中之由bphG編碼之醯化乙醛去氫酶係再一酶，此乃因已顯示其氧化並醯化乙醛、丙醛、丁醛、異丁醛及甲醛(Powlowski等人J Bacteriol.175：377-385(1993))。
將醯基-CoA轉變成其對應醛之另一酶類型係丙二醯基-CoA還原酶，其將丙二醯基-CoA轉化成丙二酸半醛。丙二醯基-CoA還原酶係嗜熱嗜酸古細菌中經由3-羥基丙酸酯循環進行自營碳固定中之關鍵酶(Berg等人Science 318：1782-1786(2007)；Thauer,R.K.Science 318：1732-1733(2007))。該酶利用NADPH作為輔因子且已在金屬球菌及硫化葉菌中進行表徵(Alber等人J.Bacteriol.188：8551-8559(2006)；Hugler等人J.Bacteriol.184：2404-2410(2002))。該酶係由瑟杜生金屬球菌中之Msed_0709編碼(Alber等人J.Bacteriol.188：8551-8559(2006)；Berg等人Science 318：1782-1786(2007))。將編碼來自托克達硫化葉菌之丙二醯基-CoA還原酶之基因選殖於大腸桿菌中並使其在其中異源表現(Alber等人J.Bacteriol.188：8551-8559(2006))。儘管該等酶之醛去氫酶功能與來自嗜熱光合綠麴菌之雙功能去氫酶相似，但幾乎沒有序列相似性。兩種丙二醯基-CoA還原酶候選物皆與天冬胺酸-半醛去氫酶具有高度序列相似性，該酶催化天冬胺醯基-4-磷酸酯至天冬胺酸半醛之還原及同時去磷酸化。其他基因候選物可藉由與其他生物體(包括硫磺礦硫化葉菌及嗜酸熱硫化葉菌)中之蛋白質之序列同源性發現。
1.2.1.c-氧化還原酶(2-酮基酸至醯基-CoA，去羧基)
此家族中之酶包括1)支鏈2-酮酸去氫酶、2)α-酮戊二酸去氫酶及3)丙酮酸去氫酶多酶複合物(PDHC)。該等酶係催化一系列導致2-酮酸醯化氧化去羧之部分反應之多酶複合物。各2-酮酸去氫酶複合物皆佔據中間代謝中之關鍵位置，且酶活性通常受到嚴格調節(Fries等人Biochemistry 42：6996-7002(2003))。該等酶共有由以下三種催化組份之多拷貝構成之複雜但常見之結構：α-酮酸去羧酶(E1)、二氫硫辛醯胺醯基轉移酶(E2)及二氫硫辛醯胺去氫酶(E3)。生物體中所有2-酮酸去氫酶複合物皆共有E3組份，而E1及E2組份係由不同基因編碼。酶組份以諸多拷貝存在於複合物中且利用多個輔因子經由受質溝道效應(channeling)催化定向序列反應。該等去氫酶複合物之總體大小極大，其中分子質量介於4百萬Da與1千萬Da之間(亦即，大於核糖體)。
在大腸桿菌中之厭氧性條件下，2-酮酸去氫酶家族中之酶之活性通常較低或有限。增加NADH(或NADPH)之產生可導致氧化還原失衡，且NADH本身用作酶功能抑制劑。改造努力已增加大腸桿菌丙酮酸去氫酶複合物之厭氧活性(Kim等人Appl.Environ.Microbiol.73：1766-1771(2007)；Kim等人J.Bacteriol.190：3851-3858(2008)；Zhou等人Biotechnol.Lett.30：335-342(2008))。例如，NADH之抑制效應可藉由改造E3組份中之H322Y突變來克服(Kim等人J.Bacteriol.190：3851-3858(2008))。對個別組份之結構研究及其如何在複合物中一起作用有助於深刻理解此家族中之酶之催化機制及架構(Aevarsson等人 Nat.Struct.Biol.6：785-792(1999)；Zhou等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：14802-14807(2001))。去氫酶複合物之受質特異性在不同生物體中有所不同，但支鏈酮酸去氫酶通常具有最寬之受質範圍。
α-酮戊二酸去氫酶(AKGD)將α-酮戊二酸酯轉變成琥珀醯基-CoA且係經過TCA循環之代謝通量之主要控制位點(Hansford,R.G.Curr.Top.Bioenerg.10：217-278(1980))。由大腸桿菌中之基因sucA、sucB及lpd編碼之AKGD基因表現在厭氧性條件下且在葡萄糖上生長期間下調(Park等人Mol.Microbiol.15：473-482(1995))。儘管AKGD之受質範圍較窄，但對E2組份之催化核心之結構研究準確找到負責受質特異性之特定殘基(Knapp等人J.Mol.Biol.280：655-668(1998))。由odhAB(E1及E2)及pdhD(E3，共有結構域)編碼之枯草芽孢桿菌AKGD係在轉錄層面上調節，且依賴於碳源及生物體之生長階段(Resnekov等人Mol.Gen.Genet.234：285-296(1992))。在酵母菌中，編碼E3組份之LPD1基因係在轉錄層面上由葡萄糖調節(Roy及Dawes J.Gen.Microbiol.133：925-933(1987))。由KGD1編碼之E1組份亦係由葡萄糖調節且由HAP2與HAP3之產物活化(Repetto及Tzagoloff Mol.Cell Biol.9：2695-2705(1989))。已在哺乳動物系統中對受副產物NADH及琥珀醯基-CoA抑制之AKGD酶複合物進行充分研究，此乃因受損功能已與若干神經疾病關聯(Tretter及dam-Vizi Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci.360：2335-2345(2005))。
支鏈2-酮酸去氫酶複合物(BCKAD)(亦稱作2-酮基異戊酸去氫酶)參與支鏈胺基酸降解途徑，將纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之2-酮酸衍生物轉變成其醯基-CoA衍生物及CO2。已在許多生物體中研究該複合物，該等生物體包括枯草芽孢桿菌(Wang等人Eur.J.Biochem.213：1091-1099(1993))、褐鼠(Namba等人J.Biol.Chem.244：4437-4447(1969))及戀臭假單胞菌(Sokatch J.Bacteriol.148：647-652(1981))。在枯草芽孢桿菌中，該酶係由基因pdhD(E3組份)、bfmBB(E2組份)、bfmBAA及bfmBAB(E1組份)編碼(Wang等人Eur.J.Biochem.213：1091-1099(1993))。在哺乳動物中，該複合物係藉由特定磷酸酶及蛋白質激酶磷酸化來調節。已在大鼠肝細胞中研究該複合物(Chicco等人J.Biol.Chem.269：19427-19434(1994))且其係由基因Bckdha(E1 α)、Bckdhb(E1β)、Dbt(E2)及Dld(E3)編碼。已結晶出戀臭假單胞菌BCKAD複合物之E1及E3組份(Aevarsson等人Nat.Struct.Biol.6：785-792(1999)；Mattevi Science 255：1544-1550(1992))且已對酶複合物進行研究(Sokatch等人J.Bacteriol.148：647-652(1981))。戀臭假單胞菌BCKAD基因之轉錄係由bkdR之基因產物活化(Hester等人Eur.J.Biochem.233：828-836(1995))。在包括褐鼠(Paxton等人Biochem.J.234：295-303(1986))及啤酒酵母菌(Sinclair等人Biochem.Mol.Biol.Int.31：911-922(1993))在內之一些生物體中，已顯示，此複合物具有寬受質範圍，該範圍除包括支鏈胺基酸前體以外，亦包括諸如2-酮基丁酸酯及α-酮戊二酸酯等線性氧代酸。牛BCKAD之 活性位點經改造以偏好替代受質乙醯基-CoA(Meng及Chuang，Biochemistry 33：12879-12885(1994))。
亦已深入研究催化丙酮酸酯轉變為乙醯基-CoA之丙酮酸去氫酶複合物。在大腸桿菌酶中，E1組份中之特定殘基負責受質特異性(Bisswanger,H.J Biol Chem.256：815-822(1981)；Bremer,J.Eur.J Biochem.8：535-540(1969)；Gong等人J Biol Chem.275：13645-13653(2000))。如先前所述，酶改造努力已改良厭氧性條件下之大腸桿菌PDH酶活性(Kim等人Appl.Environ.Microbiol.73：1766-1771(2007)；Kim J.Bacteriol.190：3851-3858(2008)；Zhou等人Biotechnol.Lett.30：335-342(2008))。與大腸桿菌PDH不同，枯草芽胞桿菌複合物在厭氧性條件下具有活性且係生長所需(Nakano J.Bacteriol.179：6749-6755(1997))。在甘油上生長期間表徵之肺炎克雷伯氏菌PDH亦在厭氧性條件下具有活性(Menzel等人J.Biotechnol.56：135-142(1997))。可獲得來自牛腎之酶複合物(Zhou等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：14802-14807(2001))及來自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)之E2催化結構 域(Mattevi等人Science 255：1544-1550(1992))之晶體結構。一些哺乳動物PDH酶複合物可對諸如2-酮基丁酸酯等替代受質起反應，但褐鼠PDH及BCKAD之比較動力學指示，BCKAD對作為受質之2-酮基丁酸酯具有更高活性(Paxton等人Biochem.J.234：295-303(1986))。
作為上述大的多酶2-酮酸去氫酶複合物之替代，一些厭氧生物體利用2-酮酸氧化還原酶家族(OFOR)中之酶來催化2-酮酸之醯化氧化去羧。與去氫酶複合物不同，該等酶含有鐵-硫簇，利用不同輔因子，且使用鐵氧化還原蛋白或黃素氧化還原蛋白作為電子受體替代NAD(P)H。儘管此家族中之多數酶特異性對丙酮酸酯作為受質(POR)，但已顯示，一些2-酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶接受寬範圍之2-酮酸作為受質，包括α-酮戊二酸酯及2-酮基丁酸酯(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2002)；Zhang等人J.Biochem.120：587-599(1996))。一種此類酶係來自嗜熱嗜酸古菌托 克達硫化葉菌7之OFOR，其含有由基因ST2300編碼之α及β次單元(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2002)；Zhang等人J.Biochem.120：587-599(1996))。已研發基於質粒之表現系統用於在大腸桿菌中有效表現此蛋白質(Fukuda等人Eur.J.Biochem.268：5639-5646(2001))並測定參與受質特異性之殘基(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2002))。最近已亦將兩種來自敏捷氣熱菌菌株K1之OFOR選殖至大腸桿菌中，進行表徵，且發現其與寬範圍之2-酮基酸反應(Nishizawa等人FEBS Lett.579：2319-2322(2005))。可獲得該等OFOR候選物之基因序列，但迄今尚未對其指配GenBank標識符。有生物資訊學證據表明，在所有古菌、一些厭氧細菌及粒線體真核生物中存在相似酶(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2005))。此類酶自能量角度亦引人關注，此乃因可使用經還原鐵氧化還原蛋白藉由鐵氧化還原蛋白-NAD還原酶生成NADH(Petitdemange等人Biochim.Biophys.Acta 421：334-337(1976))。此外，由於多數酶經設計以在厭氧性條件下作用，因此對於厭氧性環境中之活性而言，可能相對於2-酮酸去氫酶複合物家族中之酶需要更少酶改造。
1.2.1.d-氧化還原酶(磷酸化/去磷酸化)
此類中之實例性酶包括將甘油醛-3-磷酸酯轉變成D-甘油酸酯1,3-雙磷酸酯之甘油醛3-磷酸去氫酶(例如，大腸桿菌gapA(Branlant及Branlant Eur.J.Biochem.150：61-66(1985))、將L-天冬胺酸-4-半醛轉變成L-4-天冬胺醯基-磷酸酯之天冬胺酸-半醛去氫酶(例如，大腸桿菌asd(Biellmann等人Eur..J.Biochem.104：53-58(1980))、將N-乙醯基-L-麩胺酸酯-5-半醛轉變成N-乙醯基-L-麩胺醯基-5-磷酸酯之N-乙醯基-γ- 麩胺醯基-磷酸還原酶(例如，大腸桿菌argC(Parsot等人Gene 68：275-283(1988))及將L-麩胺酸酯-5-半醛轉變成L-麩胺醯基-5-磷酸酯之麩胺酸-5-半醛去氫酶(例如，大腸桿菌proA(Smith等人J.Bacteriol.157：545-551(1984))。
1.3.1.a-對CH-CH供體作用之氧化還原酶
實例性烯醯基-CoA還原酶係來自丙酮丁酶梭菌之bcd之基因產物(Atsumi等人Metab Eng(2007)；Boynton等人Journal of Bacteriology 178：3015-3024(1996)，其天然催化巴豆醯基-CoA至丁醯基-CoA之還原。此酶之活性可藉由結合編碼電子轉移黃素蛋白之丙酮丁醇梭菌etfAB基因之表現使bcd表現來增強。烯醯基-CoA還原酶步驟之另一候選物係來自纖細裸藻之粒線體烯醯基-CoA還原酶(Hoffmeister等人Journal of Biological Chemistry 280：4329-4338(2005))。將去除粒線體靶向前導序列後自此序列獲得之構築體選殖於大腸桿菌中，從而產生活性酶(Hoffmeister等人，見上文，(2005))。此方式為彼等熟習表現原核生物體中之原核基因(尤其彼等具有可使基因產物靶向特定細胞內區室之前導序列者)之技術者所熟知。來自原核齒垢密螺旋體之此基因之親密同源物TDE0597代表已在大腸桿菌中選殖及表現之第三種烯醯基-CoA還原酶(Tucci及Martin FEBS Letters 581：1561-1566(2007))。
已知實例性2-烯酸還原酶(EC 1.3.1.31)催化對眾多種α,β-不飽和羧酸及醛之依賴NADH之還原(Rohdich等人J.Biol.Chem.276：5779-5787(2001))。2-烯酸還原酶係由若干梭菌中之enr編碼(Giesel及Simon Arch Microbiol.135(1)：第51-57頁(2001)，該等梭菌包括酪丁酸梭菌及熱乙酸梭菌(C.thermoaceticum)(現在稱為熱乙酸爾氏菌)(Rohdich等人，見上文，(2001))。在最近公開之基因組序列克氏羧菌中，已報導烯酸還原酶之9個編碼序列，其中之一已進行表徵(Seedorf等人Proc Natl Acad Sci U.S.A.105(6)：2128-33(2008))。已對來自酪丁酸梭菌與熱乙酸梭菌二者之enr基因進行選殖及定序且其彼此顯示59%一致性。亦發現，前一基因與克氏羧菌中之所表徵基因具有約75%相似性(Giesel及Simon Arch Microbiol 135(1)：51-57(1983))。已基於該等序列結果報導，enr與大腸桿菌中之二烯醯基CoA還原酶(fadH)極其相似(163 Rohdich等人，見上文(2001))。亦已使熱乙酸梭菌enr基因以酶促活性形式在大腸桿菌中表現(163 Rohdich等人，見上文(2001))。
1.4.1.a-對胺基酸作用之氧化還原酶
作用於胺基酸之多數氧化還原酶以NAD+或NADP+作為受體催化α-胺基酸之氧化去胺。作用於胺基酸之實例性氧化還原酶包括由gdhA編碼之麩胺酸去氫酶(去胺)、由ldh編碼之白胺酸去氫酶(去胺)及由 nadX編碼之天冬胺酸去氫酶(去胺)。來自大腸桿菌之gdhA基因產物(Korbcr等人J.Mol.Biol.234：1270-1273(1993)；McPherson及Wootton Nucleic.Acids Res.11：5257-5266(1983))、來自海棲熱袍菌之gdh(Kort等人Extremophiles 1：52-60(1997)；Lebbink等人J.Mol.Biol.280：287-296(1998))；Lebbink等人J.Mol.Biol.289：357-369(1999))及來自嗜鹽桿菌之gdhA1(Ingoldsby等人Gene 349：237-244(2005))催化麩胺酸酯至2-酮基戊二酸酯及氨之可逆互變，同時分別偏好NADP(H)、NAD(H)或二者。仙人掌芽孢桿菌之ldh基因編碼具有寬範圍受質之LeuDH蛋白質，該等受質包括白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及2-胺基丁酸酯(Ansorge and Kula Biotechnol Bioeng.68：557-562(2000)；Stoyan等人J.Biotechnol 54：77-80(1997))。來自海棲熱袍菌之編碼天冬胺酸去氫酶之nadX基因參與NAD之生物合成(Yang等人J.Biol.Chem.278：8804-8808(2003))。
由lysDH基因編碼之離胺酸6-去氫酶(去胺)催化L-離胺酸之ε-胺基之氧化去胺以形成2-胺基己二酸酯-6-半醛，該半醛進而以非酶促方式環化以形成△1-六氫吡啶-6-羧酸酯(Misono及Nagasaki J.Bacteriol.150：398-401(1982))。來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌之lysDH基因編碼依賴NAD之嗜熱性離胺酸6-去氫酶(Heydari等人Appl Environ.Microbiol 70：937-942(2004))。另外，自基因組計劃經由同源性鑑別來自敏捷氣熱菌K1之lysDH基因。
2.3.1.a-醯基轉移酶(轉移磷酸酯基)
實例性磷酸酯轉移性醯基轉移酶包括由pta編碼之磷酸轉乙醯基酶及由ptb編碼之磷酸轉丁醯基酶。來自大腸桿菌之pta基因編碼可將乙醯基-CoA轉變成乙醯基-磷酸酯之酶，且反之亦然(Suzuki,T.Biochim.Biophys.Acta 191：559-569(1969))。此酶亦可利用丙醯基-CoA代替乙醯基-CoA在此製程中形成丙酸酯(Hesslinger等人Mol.Microbiol 27：477-492(1998))。相似地，來自丙酮丁醇梭菌之ptb基因編碼可將丁醯基-CoA轉變成丁醯基-磷酸酯之酶(Walter等人Gene 134(1)：第107-11頁(1993))；Huang等人J Mol Microbiol Biotechnol 2(1)：第33-38頁(2000)。其他ptb基因可在丁酸產生菌L2-50(Louis等人J.Bacteriol.186：2099-2106(2004))及巨大芽孢桿菌(Vazquez等人Curr.Microbiol 42：345-349(2001))中發現。
2.6.1.a-胺基轉移酶
天冬胺酸酯胺基轉移酶將胺基自天冬胺酸酯轉移至α-酮戊二酸酯，形成麩胺酸酯及草醯乙酸酯。此轉變係由(例如)以下基因之基因產物催化：來自大腸桿菌之aspC(Yagi等人FEBS Lett.100：81-84(1979)；Yagi等人Methods Enzymol.113：83-89(1985))、來自啤酒酵母菌之AAT2(Yagi等人J Biochem.92：35-43(1982))及來自擬南芥之ASP5(48,108,225 48.de la等人Plant J 46：414-425(2006)；Kwok及Hanson J Exp.Bot.55：595-604(2004)；Wilkie及Warren Protein Expr.Purif.12：381-389(1998))。纈胺酸胺基轉移酶催化纈胺酸及丙酮酸酯轉變為2-酮異戊酸酯及丙胺酸。大腸桿菌基因avtA編碼一種此類酶(Whalen及Berg J.Bacteriol.150：739-746(1982))。此基因產物亦催化α-酮丁酸酯之胺化以生成α-胺基丁酸酯，但尚未鑑別出此反應中之胺供體(Whalen及Berg J.Bacteriol.158：571-574(1984))。大腸桿菌serC之基因產物催化兩種反應，即磷酸絲胺酸胺基轉移酶及磷酸羥基蘇胺酸胺基轉移酶(Lam及Winkler J.Bacteriol.172：6518-6528(1990))，且不能檢測到對非磷酸化受質之活性(Drewke等人FEBS.Lett.390：179-182(1996))。
Cargill已研發出用於經由丙二醯基-半醛自β-丙胺酸產生3-HP之β-丙胺酸/α-酮戊二酸酯胺基轉移酶(PCT/US2007/076252(Jessen等人))。亦顯示，克氏酵母菌中之SkPYD4之基因產物優先使用β-丙胺酸作為胺基供體(Andersen等人FEBS.J.274：1804-1817(2007))。SkUGA1編碼啤酒酵母菌GABA胺基轉移酶UGA1之同源物(Ramos等人Eur.J.Biochem.149：401-404(1985))，而SkPYD4編碼參與β-丙胺酸與GABA轉胺二者之酶(Andersen等人FEBS.J.274：1804-1817(2007))。3-胺基-2-甲基丙酸酯轉胺酶催化自甲基丙二酸酯半醛至3-胺基-2-甲基丙酸酯之轉化。該酶已在褐鼠及野豬中進行表徵且係由Abat編碼(Kakimoto等人Biochim.Biophys.Acta 156：374-380(1968)；Tamaki等人 Methods Enzymol.324：376-389(2000))。其他生物體中之與3-胺基-2-甲基丙酸酯轉胺酶具有高序列同源性之酶候選物包括秀麗隱桿線蟲中之Gta-1及枯草芽孢桿菌中之gabT。另外，已顯示，大腸桿菌中之由基因gabT編碼之天然GABA胺基轉移酶中之一者具有廣泛受質特異性(Liu等人Biochemistry 43：10896-10905(2004)；Schulz等人Appl Environ Microbiol 56：1-6(1990))。puuE之基因產物催化大腸桿菌中之另一4-胺基丁酸轉胺酶(Kurihara等人J.Biol.Chem.280：4602-4608(2005))。
已報導未結合及結合至抑制劑之大腸桿菌4-胺基丁酸轉胺酶之X射線晶體結構(Liu等人Biochemistry 43：10896-10905(2004))。研究並表明受質結合及受質特異性。藉由定點誘變及X射線結晶學來研究活性位點殘基之作用(Liu等人Biochemistry 44：2982-2992(2005))。基於結構資訊，嘗試改造具有新穎酶促活性之大腸桿菌4-胺基丁酸轉胺酶。該等研究提供進化用於BDO途徑之轉胺酶活性之基礎。
2.7.2.a-磷酸轉移酶羧基受體
實例性激酶包括由ackA編碼之大腸桿菌乙酸激酶(Skarstedt及Silverstein J.Biol.Chem.251：6775-6783(1976))、由buk1及buk2編碼之 丙酮丁醇梭菌丁酸激酶(Walter等人Gene 134(1)：107-111(1993)(Huang等人J Mol Microbiol Biotechnol 2(1)：33-38(2000)]及由proB編碼之大腸桿菌γ-麩胺醯基激酶(Smith等人J.Bacteriol.157：545-551(1984))。該等酶分別將乙酸酯、丁酸酯及麩胺酸酯磷酸化。來自大腸桿菌之ackA基因產物亦將丙酸酯磷酸化(Hesslinger等人Mol.Microbiol 27：477-492(1998))。
2.8.3.a-輔酶-A轉移酶
在CoA-轉移酶家族中，已顯示，大腸桿菌酶醯基-CoA：乙酸-CoA轉移酶(亦稱作乙酸-CoA轉移酶(EC 2.8.3.8))將CoA部分自多種具支鏈及直鏈醯基-CoA受質轉移至乙酸酯，該等受質包括異丁酸酯(Matthies及Schink Appl Environ Microbiol 58：1435-1439(1992))、戊酸酯(Vanderwinkel等人Biochem.Biophys.Res Commun.33：902-908(1968))及丁酸酯(Vanderwinkel，見上文(1968))。此酶係由大腸桿菌K12中之atoA(α次單元)及atoD(β次單元)(Korolev等人Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58：2116-2121(2002)；Vanderwinkel，見上文(1968))及麩胺酸棒桿菌ATCC 13032中之actA及cg0592(Duncan等人Appl Environ Microbiol 68：5186-5190(2002))編碼。藉由序列同源性發現之其他基因包括大腸桿菌UT189中之atoD及atoA。
克氏羧菌之cat1、cat2及cat3之基因產物催化相似轉化，已顯示，該等基因產物分別展現琥珀醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA及丁醯基-CoA乙醯基轉移酶活性(Seedorf等人Proc Natl Acad Sci U.S.A.105(6)：2128-2133(2008)；Sohling及Gottschalk J Bacteriol 178(3)：871-880(1996)]。
來自厭氧細菌發酵胺基酸球菌之戊烯二酸-CoA-轉移酶(EC 2.8.3.12)與二酸戊烯二醯基-CoA及3-丁烯醯基-CoA反應(Mack及Buckel FEBS Lett.405：209-212(1997))。編碼此酶之基因係gctA及gctB。此酶對其他CoA衍生物具有降低但可檢測之活性，其他CoA衍生物包括戊二醯基-CoA、2-羥基戊二醯基-CoA、己二醯基-CoA及丙烯醯基-CoA(Buckel等人Eur.J.Biochem.118：315-321(1981))。已在大腸桿菌中選殖並表現該酶(Mac等人Eur.J.Biochem.226：41-51(1994))。
3.1.2.a-硫醇酯水解酶(CoA特異性)
在CoA水解酶家族中，酶3-羥基異丁酶基-CoA水解酶對3-HIBCoA具有特異性且已闡述其可在纈胺酸降解期間有效地催化期望轉化(Shimomura等人J Biol Chem 269：14248-14253(1994))。編碼此酶之基因包括褐鼠(Shimomura等人，見上文(1994)；Shimomura等人 Methods Enzymol.324：229-240(2000)及智人(Shimomura等人，見上文，2000)之hibch。藉由序列同源性確定之候選基因包括啤酒酵母菌之hibch及仙人掌芽孢桿菌之BC_2292。
己二醯基-CoA轉變為己二酸酯可藉由醯基-CoA水解酶或等效硫酯酶實施。最高大腸桿菌基因候選物係tesB(Naggert等人J Biol Chem.266(17)：11044-11050(1991)]，其與對己二醯基-CoA具有活性之二羧酸乙醯基轉移酶之人類acot8顯示高度相似性(Westin等人J Biol Chem 280(46)：38125-38132(2005)。此活性亦已在大鼠肝中進行表徵(Deana,Biochem Int.26(4)：第767-773頁(1992))。
其他潛在大腸桿菌硫醇酯水解酶包括以下基因之基因產物：tesA(Bonner及Bloch，J Biol Chem.247(10)：3123-3133(1972))、ybgC(Kuznetsova等人，FEMS Microbiol Rev.29(2)：263-279(2005)；Zhuang等人，FEBS Lett.516(1-3)：161-163(2002))、paaI(Song等人，J Biol Chem.281(16)：11028-11038(2006))及ybdB(Leduc等人，J Bacteriol.189(19)：7112-7126(2007))。
若干真核乙醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)具有廣泛受質特異性。來自褐鼠腦之酶(Robinson等人Biochem.Biophys.Res.Commun.71：959-965(1976))可與丁醯基-CoA、己醯基-CoA及丙二醯基-CoA反應。
4.1.1.a-羧基-裂解酶
實例性羧基-裂解酶係參與檸檬酸酯分解代謝及支鏈胺基酸生物合成之乙醯乳酸去羧酶，其將2-乙醯乳酸酯轉變成乙偶姻。在乳酸乳球菌中，該酶係由基因aldB編碼之6個次單元構成，且係由纈胺酸、白胺酸及異白胺酸活化(Goupil等人Appl.Environ.Microbiol.62：2636-2640(1996)；Goupil-Feuillerat等人J.Bacteriol.182：5399-5408(2000))。此酶已在大腸桿菌中過表現並表徵(Phalip等人FEBS Lett.351：95-99(1994))。在其他生物體中，該酶係由以下基因編碼之二聚體：嗜熱鏈球菌中之aldC(Monnet等人Lett.Appl.Microbiol.36：399-405(2003))、短芽孢桿菌中之aldB(Diderichsen等人J.Bacteriol.172：4315-4321(1990)；Najmudin等人Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59：1073-1075(2003))及來自產氣腸桿菌之budA(Diderichsen等人J.Bacteriol.172：4315-4321(1990))。在枯草芽孢桿菌中選殖來自短芽孢桿菌之酶並使其在其中過表現且進行結晶學表徵(Najmudin等人Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59：1073-1075(2003))。另外，已對來自乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)之酶進行純化並表徵，但尚未分離出該基因(O'Sullivan等人FEMS Microbiol.Lett.194：245-249(2001))。
烏頭酸去羧酶催化假絲酵母菌屬菌株以及絲狀真菌土麯黴中之衣康酸酯生物合成中之最終步驟(Bonnarme等人J Bacteriol.177：3573-3578(1995)；Willke及Vorlop Appl Microbiol Biotechnol 56：289-295(2001))。儘管衣康酸酯係引起生物技術關注之化合物，但迄今尚未報導烏頭酸去羧酶基因或蛋白質序列。
已自諸多生物體分離並表徵4-草醯巴豆酸去羧酶。編碼此酶之基因包括假單孢菌(菌株600)中之dmpH及dmpE(Shingler等人J Bacteriol.174：711-724(1992))、來自戀臭假單胞菌之xylII及xylIII(Kato及Aaano Arch.Microbiol 168：457-463(1997)；Lian及Whitman J.Am.Chem.Soc.116：10403-10411(1994)；Stanley等人Biochemistry 39：3514(2000))及來自富養產鹼菌JMP134之Reut_B5691及Reut_B5692(Hughes等人J Bacteriol.158：79-83(1984))。來自假單孢菌(菌株600)之編碼此酶之基因已在大腸桿菌中選殖並表現(Shingler等人J Bacteriol.174：711-724(1992))。
已對另一類去羧酶進行表徵，其催化肉桂酸酯(丙烯酸苯酯)及取代肉桂酸酯衍生物轉變為對應苯乙烯衍生物。該等酶在多種生物體中常見且編碼該等酶之已在大腸桿菌中選殖及表現之特定基因係：來自啤酒酵母菌之pad 1(Clausen等人Gene 142：107-112(1994))、來自胚芽 乳酸桿菌之pdc(Barthelmebs等人Appl Environ Microbiol 67：1063-1069(2001)；Qi等人Metab Eng 9：268-276(2007)；Rodriguez等人J.Agric.Food Chem.56：3068-3072(2008))、來自奧克西托克雷白桿菌(Hashidoko等人Biosci.Biotech.Biochem.58：217-218(1994)；Uchiyama等人Biosci.Biotechnol.Biochem.72：116-123(2008))、戊糖片球菌(Barthelmebs等人Appl Environ Microbiol 67：1063-1069(2001))之pofK(pad)及來自枯草芽孢桿菌及短小芽孢桿菌之padC(Lingen等人Appl Environ Microbiol 67：1063-1069(2001))及來自枯草芽孢桿菌及短小芽孢桿菌之padC(Lingen等人Protein Eng 15：585-593(2002))。亦已對來自螢光假單胞菌之阿魏酸去羧酶進行純化及表徵(Huang等人J.Bacteriol.176：5912-5918(1994))。重要地，已顯示，此類酶係穩定的且無需外源性或內部結合之輔因子，因此使該等酶理想地適於生物轉化(Sariaslani,Annu.Rev.Microbiol.61：51-69(2007))。
其他去羧酶可自α-酮戊二酸酯形成琥珀酸半醛。該等包括來自纖細裸藻(Shigeoka等人Biochem.J.282(Pt 2)：319-323(1992)；Shigeoka 及Nakano Arch.Biochem.Biophys.288：22-28(1991)；Shigeoka及Nakano Biochem.J.292(Pt 2)：463-467(1993))(其對應基因序列有待測定)及來自結核分枝桿菌(Tian等人Proc Natl Acad Sci U.S.A.102：10670-10675(2005))之α-酮戊二酸去羧酶。另外，麩胺酸去羧酶可將麩胺酸酯轉變成4-胺基丁酸酯，例如大腸桿菌gadA及gadB基因之產物(De Biase等人Protein.Expr.Purif.8：430-438(1993))。
酮酸去羧酶
丙酮酸酯去羧酶(PDC,EC 4.1.1.1)(亦稱為酮酸去羧酶)係醇發酵中之關鍵酶，催化丙酮酸酯去羧成乙醛。此酶對脂肪族2-酮酸具有寬受質範圍，包括2-酮丁酸酯、2-酮戊酸酯、3-羥基丙酮酸酯及2-苯基丙酮酸酯(Berg等人Science 318：1782-1786(2007))。由pdc編碼之來自運動發酵單胞菌之PDC已成為改變對不同受質之親和力之定向改造研究之主題(Siegert等人Protein Eng Des Sel 18：345-357(2005))。亦已對來自啤酒酵母菌之PDC進行深入研究，針對其經改變活性進行改造，且使其在大腸桿菌中進行功能表現(Killenberg-Jabs等人Eur.J.Biochem.268：1698-1704(2001)；Li及Jordan Biochemistry 38：10004-10012(1999)；ter Schure等人Appl.Environ.Microbiol.64：1303-1307(1998))。可獲得此酶之晶體結構(Killenberg-Jabs Eur.J.Biochem.268：1698-1704(2001))。其他經充分表徵之PDC候選物包括來自巴斯德醋酸桿菌(Chandra等人Arch.Microbiol.176：443-451(2001))及乳酸克氏酵母菌(Krieger等人Eur.J.Biochem.269：3256-3263(2002))之酶。
與PDC一樣，苯甲醯基甲酸酯去羧酶(EC 4.1.1.7)具有寬受質範圍且已成為酶改造研究之目標。已對來自戀臭假單胞菌之酶進行深入研究且可獲得此酶之晶體結構(Hasson等人Biochemistry 37：9918-9930(1998)；Polovnikova等人Biochemistry 42：1820-1830(2003))。戀臭假單胞菌酶之活性位點中兩個殘基之定點誘變改變對天然及非天然受質之親和力(Km)(Siegert Protein Eng Des Sel 18：345-357(2005))。此酶之性質已藉由定向改造進一步修改(Lingen等人Protein Eng 15：585-593(2002))；Lingen Chembiochem 4：721-726(2003))。由mdlC編碼之來自繡色假單胞菌之酶亦已以實驗方式進行表徵(Barrowman等人FEMS Microbiology Letters 34：57-60(1986))。來自施氏假單胞菌、螢光假單胞菌及其他生物體之其他基因候選物可藉由序列同源性推測或使用在戀臭假單胞菌中產生之生長選擇系統鑑別(Henning等人Appl.Environ.Microbiol.72：7510-7517(2006))。
4.2.1.a-水裂解酶
巴克氏真細菌之2-(羥基甲基)戊二酸去水酶係實例性水裂解酶。已在菸酸酯分解代謝之背景下研究此酶且其係由hmd編碼(Alhapel等人Proc Natl Acad Sci U S A 103：12341-12346(2006))。在多毛擬桿菌、科氏厭氧軀幹菌及嗜熱鹽鹼厭氧菌中發現具有高度序列同源性之 相似酶。
第二個實例性水裂解酶係富馬酸水合酶，該酶催化蘋果酸酯至富馬酸酯之去水。可獲得關於此酶之大量結構資訊且研究者已成功地改造該酶以改變活性、抑制及定位(Weaver,T.Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.61：1395-1401(2005))。其他富馬酸水合酶包括彼等由以下基因編碼者：來自大腸桿菌(Estevez等人Protein Sci.11：1552-1557(2002)；Hong及Lee Biotechnol.Bioprocess Eng.9：252-255(2004)；Rose及Weaver Proc Natl Acad Sci U S.A 101：3393-3397(2004))、空腸曲桿菌(Smith等人Int.J Biochem.Cell Biol 31：961-975(1999))及嗜熱棲熱菌(Mizobata等人Arch.Biochem.Biophys.355：49-55(1998))之fumC及來自褐鼠之fumH(Kobayashi等人J Biochem.89：1923-1931(1981))。具有高度序列同源性之相似酶包括來自擬南芥之fum1及來自麩胺酸棒桿菌之fumC。
檸蘋酸酯水解酶(亦稱為2-甲基蘋果酸去水酶)將2-甲基蘋果酸酯轉變成中康酸酯。在麩胺酸酯降解VI途徑之背景下在假破傷風梭菌、 摩氏摩根菌(Morganella morganii)、無丙二酸檸檬酸桿菌中檢測到2-甲基蘋果酸去水酶活性(Kato及Asano Arch.Microbiol 168：457-463(1997))；然而，迄今尚未對編碼此酶之基因定序。
來自丙酮丁醇梭菌之crt之基因產物催化3-羥基丁醯基-CoA至巴豆醯基-CoA之去水(Atsumi等人Metab Eng.；29(2007))；Boynton等人Journal of Bacteriology 178：3015-3024(1996))。相信戀臭假單胞菌之烯醯基-CoA水合酶(phaA及phaB)在苯基乙酸酯分解代謝期間實施對雙鍵之羥基化(Olivera等人Proc Natl Acad Sci U S A 95(11)：6419-6424(1998))。來自螢光假單胞菌之paaA及paaB催化類似轉化(14 Olivera等人，見上文，1998)。最後，已顯示，諸多大腸桿菌基因顯示烯醯基-CoA水合酶功能，包括maoC(Park及Lee J Bacteriol 185(18)：5391-5397(2003))、paaF(Park及Lee Biotechnol Bioeng.86(6)：681-686(2004a))；Park及Lee Appl Biochem Biotechnol.113-116：335-346(2004b))；Ismail等人Eur J Biochem 270(14)：第3047-3054頁(2003)及paaG(Park及Lee，見上文，2004；Park及Lee，見上文，2004b；Ismail等人，見上文，2003)。
大腸桿菌基因fadA及fadB編碼展現酮醯基-CoA硫解酶、3-羥基醯基-CoA去氫酶及烯醯基-CoA水合酶活性之多酶複合物(Yang等人 Biochemistry 30(27)：第6788-6795頁(1991)；Yang等人J Biol Chem 265(18)：第10424-10429頁(1990)；Yang等人J Biol Chem 266(24)：第16255頁(1991)；Nakahigashi及Inokuchi Nucleic Acids Res 18(16)：第4937頁(1990))。fadI及fadJ基因編碼相似功能且僅在厭氧性下天然表現(Campbell等人Mol Microbiol 47(3)：第793-805頁(2003)。先前已闡述在大腸桿菌中產生聚[(R)-3-羥基丁酸酯]之方法，其涉及活化fadB(藉由敲除負調節物，fadR)及共表現非天然酮硫解酶(來自富養產鹼菌之phaA)(Sato等人J Biosci Bioeng 103(1)：38-44(2007))。此研究明確地證實，β-氧化酶、尤其編碼3-羥基醯基-CoA去氫酶及烯醯基-CoA水合酶活性二者之fadB之基因產物可作為用以自乙醯基-CoA前體產生較長鏈分子之途徑之一部分發揮功能。
4.3.1.a-氨-裂解酶
催化天冬胺酸酯至富馬酸酯之去胺之天冬胺酸酶(EC 4.3.1.1)係廣泛分佈於微生物中之酶，且已進行深入表徵(Viola,R.E.Adv.Enzymol.Relat Areas Mol.Biol 74：295-341(2000))。已解析由aspA編碼之大腸桿菌天冬胺酸酶之晶體結構(Shi等人Biochemistry 36：9136-9144(1997))。亦已顯示，大腸桿菌酶與替代受質天冬胺酸苯基甲基酯、天冬醯胺、苯甲基-天冬胺酸酯及蘋果酸酯反應(Ma等人Ann N.Y.Acad Sci 672：60-65(1992))。在單獨研究中，已對此酶採用定向進化來改變受質特異性(Asano等人Biomol.Eng 22：95-101(2005))。具有 天冬胺酸酶功能之酶亦已在流感嗜血桿菌(Sjostrom等人Biochim.Biophys.Acta 1324：182-190(1997))、螢光假單胞菌(Takagi等人J.Biochem.96：545-552(1984))、枯草芽孢桿菌(Sjostrom等人Biochim.Biophys.Acta 1324：182-190(1997))及黏質沙雷氏菌(Takagi及Kisumi J Bacteriol.161：1-6(1985))中進行表徵。
3-甲基天冬胺酸酶(EC 4.3.1.2)(亦稱作β-甲基天冬胺酸酶或3-甲基天冬胺酸酯氨-裂解酶)催化蘇-3-甲基天冬胺酸酯至中康酸酯之去胺。來自假破傷風梭菌之3-甲基天冬胺酸酶已在大腸桿菌中選殖，進行功能表現，並結晶(Asuncion等人Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.57：731-733(2001)；Asuncion等人J Biol Chem.277：8306-8311(2002)；Botting等人Biochemistry 27：2953-2955(1988)；Goda等人Biochemistry 31：10747-10756(1992)。在無丙二酸檸檬酸桿菌中，此酶係由BAA28709編碼(Kato及Asano Arch.Microbiol 168：457-463(1997))。亦已使3-甲基天冬胺酸酶自大腸桿菌YG1002結晶(Asano及Kato FEMS Microbiol Lett.118：255-258(1994))，但蛋白質序列於諸如GenBank等公開數據庫中未有列示。可使用序列同源性來鑑別其他候選基因，包括破傷風梭菌中之CTC_02563及大腸桿菌O157：H7中之ECs0761。
形成烯醯基-CoA產物之氨-裂解酶候選物包括β-丙胺醯基-CoA氨-裂解酶(EC 4.3.1.6)，其將β-丙胺醯基-CoA及3-胺基丁醯基-CoA氨-裂解酶脫去胺(EC 4.3.1.14)。兩種β-丙胺醯基-CoA氨裂解酶已在丙酸梭菌中進行鑑別並表徵(Herrmann等人FEBS J.272：813-821(2005))。迄今尚未對其他β-丙胺醯基-CoA氨裂解酶進行研究，但基因候選物可藉由序列相似性鑑別。一種此類候選物係黃色黏球菌中之MXAN_4385。
5.3.3.a-異構酶
來自胺基丁酸梭菌及克氏羧菌二者之4-羥基丁醯基-CoA去水酶催化4-羥基丁醯基-CoA至巴豆醯基-CoA之可逆轉變且具有固有乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶活性(Scherf及Buckel Eur.J Biochem.215：421-429(1993)；Scherf等人Arch.Microbiol 161：239-245(1994))。對兩種天然酶進行純化及表徵，包括N端胺基酸序列(Scherf及Buckel，見上文，1993；Scherf等人，見上文，1994)。來自胺基丁酸梭菌及克氏羧菌之abfD基因與該等N端胺基酸序列準確匹配，因此編碼4-羥基丁醯基-CoA去水酶/乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶。另外，自基因組計劃經由同源性來鑑別來自牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277之abfD基因。
5.4.3.a-胺基變位酶
離胺酸2,3-胺基變位酶(EC 5.4.3.2)係將離胺酸轉變成(3S)-3,6-二胺基己酸酯之實例性胺基變位酶，其將胺基自2位移位至3位。在將離胺酸發酵成乙酸酯及丁酸酯之細菌中發現該酶，該等細菌包括例如具核梭桿菌(kamA)(Barker等人J.Bacteriol.152：201-207(1982))及近端梭菌(kamA)(Chirpich等人J.Biol.Chem.245：1778-1789(1970))。已結晶出來自近端梭菌之酶(Lepore等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102：13819-13824(2005))。編碼此功能之酶亦由枯草芽孢桿菌中之yodO編碼(Chen等人Biochem.J.348 Pt 3：539-549(2000))。該酶利用吡多醛5’-磷酸酯作為輔因子，需要由S-腺苷甲硫胺酸活化，且具有立體選擇性，僅與L-離胺酸反應。尚未顯示，該酶與替代受質反應。
第二種胺基變位酶β-離胺酸5,6-胺基變位酶(EC 5.4.3.3)催化離胺酸發酵成乙酸酯及丁酸酯之下一步驟，其將(3S)-3,6-二胺基己酸酯轉化成(3S,5S)-3,5-二胺基己酸酯，將末端胺基自6位移位至5位。此酶亦催化離胺酸轉變成2,5-二胺基己酸酯且亦稱為離胺酸-5,6-胺基變位酶(EC 5.4.3.4)。已在史迪克蘭梭菌(kamD,kamE)中結晶該酶(Berkovitch等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101：15870-15875(2004))。亦已對來自牙齦卟啉單胞菌之酶進行表徵(Tang等人Biochemistry 41：8767-8776(2002))。
鳥胺酸4,5-胺基變位酶(EC 5.4.3.5)將D-鳥胺酸轉變成2,4-二胺基戊酸酯，亦將末端胺移位至毗鄰碳。來自史迪克蘭梭菌之酶係由兩個基因oraE及oraS編碼，且已經選殖，定序且在大腸桿菌中表現(Chen等人J.Biol.Chem.276：44744-44750(2001))。迄今尚未在其他生物體中對此酶進行表徵。
酪胺酸2,3-胺基變位酶(EC 5.4.3.6)參與酪胺酸生物合成，藉由將胺自2位移位至3位將酪胺酸可逆地轉變成3-胺基-3-(4-羥基苯基)丙酸酯。在球孢鏈黴菌(Streptomyces globisporus)中，亦已顯示，該酶與酪胺酸衍生物反應(Christenson等人Biochemistry 42：12708-12718(2003))。無法獲得序列資訊。
在白胺酸降解及生物合成期間，白胺酸2,3-胺基變位酶(EC 5.4.3.7)將L-白胺酸轉變成β-白胺酸。用於白胺酸2,3-胺基變位酶之分析檢測許多生物體中之活性(Poston,J.M.Methods Enzymol.166：130-135(1988))，但尚未迄今鑑別出編碼該酶之基因。
Cargill已研發出將L-丙胺酸轉變成β-丙胺酸之新穎2,3-胺基變位酶，由此產生在4個生物化學步驟中自丙酮酸酯至3-HP之途徑(Liao等人，美國公開案第2005-0221466號)。
6.2.1.a-酸-硫醇連接酶
實例性酸-硫醇連接酶係大腸桿菌之sucCD之基因產物，其一起催化自琥珀酸酯形成琥珀醯基-CoA，同時消耗一個ATP，該反應在活體內係可逆的(Buck等人Biochemistry 24(22)：第6245-6252頁(1985))。其他實例性CoA-連接酶包括尚未表徵序列之大鼠二羧酸-CoA連接酶 ((Vamecq等人Biochem J.230(3)：第683-693頁(1985))、來自產黃青黴之兩種經表徵苯基乙酸-CoA連接酶中之任一者(Lamas-Maceiras等人Biochem J 395(1)：147-155(2006)；Wang等人Biochem Biophys Res Commun,360(2)：453-458(2007))、來自戀臭假單胞菌之苯基乙酸-CoA連接酶(Martinez-Blanco等人J Biol Chem.265(12)：7084-7090(1990))及來自枯草芽孢桿菌之6-羧基己酸-CoA連接酶(Bower等人J Bacteriol 178(14)：4122-4130(1996))。
實例V 自琥珀醯基-CoA之實例性BDO途徑
此實例闡述自琥珀醯基-CoA之實例性BDO途徑。
自琥珀醯基-CoA之BDO途徑闡述於本文中且先前已闡述(參見2008年3月14日提出申請之美國申請案第12/049,256號及2008年3月14日提出申請之PCT申請案第US08/57168號，其每一者皆以引用方式併入本文中)。其他途徑示於圖8A中。此等實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表15中。
簡言之，可藉由琥珀醯基-CoA還原酶(或琥珀酸半醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將琥珀醯基-CoA轉變成琥珀酸半醛。可藉由如先前所述4-羥基丁酸去氫酶(EC 1.1.1.a)將琥珀酸半醛轉變成4-羥基丁酸酯。或者，可藉由琥珀醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將琥珀醯基-CoA轉變成4-羥基丁酸酯。可藉由如先前所述4-羥基丁醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)或藉由4-羥基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基-CoA。或者，可藉由如先前所述4-羥基丁酸激酶(EC 2.7.2.a)將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基磷酸酯。可藉由如先前所述磷酸轉-4-羥基丁醯基酶(EC 2.3.1.a)將4-羥基丁醯基磷酸酯轉變成4-羥基丁醯基-CoA。或者，可藉由4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)將4-羥基丁醯基磷酸酯轉變成4-羥基丁醛。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成1,4-丁二醇。可藉由如先前所述1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。
實例VI 自α-酮戊二酸酯之其他實例性BDO途徑
此實例闡述自α-酮戊二酸酯之實例性BDO途徑。
自琥珀醯基-CoA之BDO途徑闡述於本文中且先前已闡述(參見2008年3月14日提出申請之美國申請案第12/049,256號及2008年3月14日提出申請之PCT申請案第US08/57168號，其每一者皆以引用方式併入本文中)。其他途徑示於圖8B中。此等實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表16中。
簡言之，可藉由如先前所述α-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.a)將α-酮戊二酸酯轉變成琥珀酸半醛。或者，可藉由麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.a)將α-酮戊二酸酯轉變成麩胺酸酯。可藉由4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁酸轉胺酶(EC 2.6.1.a)將4-胺基丁酸酯轉變成琥珀酸半醛。可藉由麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.a)將麩胺酸酯轉變成4-胺基丁酸酯。可藉由如先前所述4-羥基丁酸去氫酶(EC 1.1.1.a)將琥珀酸半醛轉變成4-羥基丁酸酯。可藉由如先前所述4-羥基丁醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)或藉由4-羥基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁酸激酶(EC 2.7.2.a)將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基磷酸酯。可藉由如先前所述磷酸轉-4-羥基丁醯基酶(EC 2.3.1.a)將4-羥基丁醯基磷酸酯轉變成4-羥基丁醯基-CoA。或者，可藉由4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)將4-羥基丁醯基磷酸酯轉變成4-羥基丁醛。可藉由如先前所述4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成1,4-丁二醇。可藉由如先前所述1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。
實例VII 自4-胺基丁酸酯之BDO途徑
此實例闡述自4-胺基丁酸酯之實例性BDO途徑。
圖9A繪示將4-胺基丁酸酯轉變成BDO之實例性BDO途徑。此一實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表17中。
簡言之，可藉由4-胺基丁酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-胺基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-胺基丁酸-CoA連接酶(或4-胺基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將4-胺基丁酸酯轉變成4-胺基丁醯基-CoA。可藉由4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶(EC 2.6.1.a)將4-胺基丁醯基-CoA轉變成4-酮基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-酮基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成1,4-丁二醇。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。
用於將4-胺基丁酸酯轉變成BDO之另一實例性BDO途徑之酶示於圖9A中。此一實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表18中。
簡言之，可藉由4-胺基丁酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-胺基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-胺基丁酸-CoA連接酶(或4-胺基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將4-胺基丁酸酯轉變成4-胺基丁醯基-CoA。可藉由4-胺基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將4-胺基丁醯基-CoA轉變成4-胺基丁-1-醇。或者，可藉由4-胺基丁醯基-CoA還原酶(或4-胺基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將4-胺基丁醯基-CoA轉變成4-胺基丁醛，且可藉由4-胺基丁-1-醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-胺基丁醛轉變成4-胺基丁-1-醇。可藉由4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(EC 2.6.1.a)將4-胺基丁-1-醇轉變成4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。
圖9B繪示將4-胺基丁酸酯轉變成BDO之實例性BDO途徑。此一實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表19中。
簡言之，可藉由4-胺基丁酸激酶(EC 2.7.2.a)將4-胺基丁酸酯轉變成[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸。可藉由4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)將[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸轉變成4-胺基丁醛。可藉由4-胺基丁-1-醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-胺基丁醛轉變成4-胺基丁-1-醇。可藉由4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(EC 2.6.1.a)將4-胺基丁-1-醇轉變成4-羥基丁醛。或者，可藉由[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺)(EC 1.4.1.a)或[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸轉胺酶(EC 2.6.1.a)將[(4-胺基丁醯基)氧基]膦酸轉變成[(4-酮基丁醯基)氧基]膦酸。可藉由4-羥基丁醯基磷酸酯去氫酶(EC 1.1.1.a)將[(4-酮基丁醯基)氧基]膦酸轉變成4-羥基丁醯基磷酸酯。可藉由4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)將4-羥基丁醯基磷酸酯轉變成4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。
圖9C顯示經由乙醯乙酸酯之實例性途徑。
實例VIII 自α-酮戊二酸酯之實例性BDO途徑
此實例闡述自α-酮戊二酸酯之實例性BDO途徑。
圖10繪示將α-酮戊二酸酯轉變成BDO之實例性BDO途徑。此一實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表20中。
簡言之，可藉由α-酮戊二酸5-激酶(EC 2.7.2.a)將α-酮戊二酸酯轉變成α-酮戊二醯基磷酸酯。可藉由2,5-二酮基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)將α-酮戊二醯基磷酸酯轉變成2,5-二酮基戊酸。可藉由2,5-二酮基戊酸還原酶(EC 1.1.1.a)將2,5-二酮基戊酸轉變成5-羥基-2-酮基戊酸。或者，可藉由α-酮戊二酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、α-酮戊二酸基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或α-酮戊二酸基-CoA連接酶(或α-酮戊二酸基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將α-酮戊二酸酯轉變成α-酮戊二酸基-CoA。可藉由α-酮戊二酸基-CoA還原酶(或2,5-二酮基戊酸去氫酶)(EC 1.2.1.b)將α-酮戊二酸基-CoA轉變成2,5-二酮基戊酸。可藉由5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶將2,5-二酮基戊酸轉變成5-羥基-2-酮基戊酸。或者，可藉由α-酮戊二酸基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將α-酮戊二酸基-CoA轉變成5-羥基-2-酮基戊酸。可藉由5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶(EC 4.1.1.a)將5-羥基-2-酮基戊酸轉變成4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。可藉由5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(EC 1.2.1.c)將5-羥基-2-酮基戊酸轉變成4-羥基丁醯基-CoA。
實例IX 自麩胺酸酯之實例性BDO途徑
此實例闡述自麩胺酸酯之實例性BDO途徑。
圖11繪示將麩胺酸酯轉變成BDO之實例性BDO途徑。此一實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表21中。
簡言之，可藉由麩胺酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、麩胺醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或麩胺醯基-CoA連接酶(或麩胺醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將麩胺酸酯轉變成麩胺醯基-CoA。或者，可藉由麩胺酸5-激酶(EC 2.7.2.a)將麩胺酸酯轉變成麩胺酸酯-5-磷酸酯。可藉由麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)將麩胺酸酯-5-磷酸酯轉變成麩胺酸酯-5-半醛。可藉由麩胺醯基-CoA還原酶(或麩胺酸-5-半醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將麩胺醯基-CoA轉變成麩胺酸酯-5-半醛。可藉由麩胺酸-5-半醛還原酶(EC 1.1.1.a)將麩胺酸酯-5-半醛轉變成2-胺基-5-羥基戊酸。或者，可藉由麩胺醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將麩胺醯基-CoA轉變成2-胺基-5-羥基戊酸。可藉由2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺)(EC 1.4.1.a)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶(EC 2.6.1.a)將2-胺基-5-羥基戊酸轉變成5-羥基-2-酮基戊酸。可藉由5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶(EC 4.1.1.a)將5-羥基-2-酮基戊酸轉變成4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。或者，可藉由5-羥基-2-酮基戊酸去氫酶去羧基)(去羧基)(EC 1.2.1.c)將5-羥基-2-酮基戊酸轉變成4-羥基丁醯基-CoA。
實例X 自乙醯乙醯基-CoA之實例性BDO
此實例闡述自乙醯乙醯基-CoA之實例性BDO途徑。
圖12繪示將乙醯乙醯基-CoA轉變成BDO之實例性BDO途徑。此一實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表22中。
簡言之，可藉由3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.1.1.a)將乙醯乙醯基-CoA轉變成3-羥基丁醯基-CoA。可藉由3-羥基丁醯基-CoA去水酶(EC 4.2.1.a)將3-羥基丁醯基-CoA轉變成巴豆醯基-CoA。可藉由乙烯基乙醯基-CoA △-異構酶(EC 5.3.3.3)將巴豆醯基-CoA轉變成乙烯基乙醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA去水酶(EC 4.2.1.a)將乙烯基乙醯基-CoA轉變成4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成1,4-丁二醇。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。
實例XI 自高絲胺酸之實例性BDO途徑
此實例闡述自高絲胺酸之實例性BDO途徑。
圖13繪示將高絲胺酸轉變成BDO之實例性BDO途徑。此一實例性BDO途徑之酶連同編碼該等酶之實例性基因一起列示於表23中。
簡言之，可藉由高絲胺酸去胺酶(EC 4.3.1.a)將高絲胺酸轉變成4-羥基丁-2-烯酸酯。或者，可藉由高絲胺酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、高絲胺酸-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或高絲胺酸-CoA連接酶(或高絲胺酸-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將高絲胺酸轉變成高絲胺酸-CoA。可藉由高絲胺酸-CoA去胺酶(EC 4.3.1.a)將高絲胺酸-CoA轉變成4-羥基丁-2-烯醯基-CoA。可藉由4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將4-羥基丁-2-烯酸酯轉變成4-羥基丁-2-烯醯基-CoA。或者，可藉由4-羥基丁-2-烯酸還原酶(EC 1.3.1.a)將4-羥基丁-2-烯酸酯轉變成4-羥基丁酸酯。可藉由4-羥基丁醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-羥基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基-coA。可藉由4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶(EC 1.3.1.a)將4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉變成4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(形成醇)(EC 1.1.1.c)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成1,4-丁二醇。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。
實例XII 表現琥珀醯基-CoA合成酶之產生BDO之菌株
此實例闡述BDO在表現琥珀醯基-CoA合成酶之產生BDO之菌株中之增加產生。
如上文所論述，琥珀酸酯可為藉由轉變成琥珀醯基-CoA用於產生BDO之前體(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國公開案2009/0075351)。因此，宿主菌株經遺傳修飾以過表現編碼琥珀醯基-CoA合成酶之大腸桿菌sucCD基因。大腸桿菌sucCD操縱子之核苷酸序列示於圖14A中，且所編碼琥珀醯基-CoA合成酶次單元之胺基酸序列示於圖14B及14C中。簡言之，藉由PCR自大腸桿菌染色體DNA選殖大腸桿菌sucCD基因且使用標準分子生物學程序在PA1lacO-1啟動子後面將其引入多拷貝質粒pZS*13、pZA13及pZE33中(Lutz及Bujard，Nucleic Acids Res.25：1203-1210(1997))。
使編碼琥珀醯基-CoA合成酶之大腸桿菌sucCD基因過表現。結果顯示，向菌株中引入sucCD以表現琥珀醯基-CoA合成酶相較於cat1之天然表現量或表現改良各種菌株中之BDO產生，cat1係琥珀醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶。因此，藉由過表現編碼琥珀醯基-CoA合成醇之天然大腸桿菌sucCD基因改良BDO產生。
實例XIII 編碼BDO途徑酶之異源基因之表現
此實例闡述各種非天然途徑酶之表現以改良BDO之產生。
α-酮戊二酸去羧酶。使編碼α-酮戊二酸去羧酶之牛分枝桿菌sucA基因在宿主菌株中表現。牛分枝桿菌sucA之過表現改良BDO產生(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國公開案2009/0075351)。牛分枝桿菌sucA之核苷酸及胺基酸序列及 所編碼α-酮戊二酸去羧酶示於圖15中。
為了構築牛分枝桿菌sucA表現菌株，使用下文所示引子自牛分枝桿菌BCG(ATCC 19015；美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas VA)之基因組DNA擴增編碼α-酮戊二酸去羧酶之sucA基因片段。藉由4個擴增DNA片段之連接反應來組裝全長基因，且在PA1lacO-1啟動子後將其選殖至表現載體pZS*13及pZE23中(Lutz及Bujard,Nucleic Acids Res.25：1203-1210(1997))。藉由DNA定序來驗證所組裝基因之核苷酸序列。
用於片段1之引子：5’-ATGTACCGCAAGTTCCGC-3’(SEQ ID NO：3)
5’-CAATTTGCCGATGCCCAG-3’(SEQ ID NO：4)
用於片段2之引子：5’-GCTGACCACTGAAGACTTTG-3’(SEQ ID NO：5)
5’-GATCAGGGCTTCGGTGTAG-3’(SEQ ID NO：6)
用於片段3之引子：5’-TTGGTGCGGGCCAAGCAGGATCTGCTC-3’(SEQ ID NO：7)
5’-TCAGCCGAACGCCTCGTCGAGGATCTCCTG-3’(SEQ ID NO：8)
用於片段4之引子：5’-TGGCCAACATAAGTTCACCATTCGGGCAAAAC-3’(SEQ ID NO：9)
5’-TCTCTTCAACCAGCCATTCGTTTTGCCCG-3’(SEQ ID NO：10)
使用活體外分析與活體內分析二者來證實α-酮戊二酸去羧酶之功能表現。藉由依照先前所報導之方法來量測SucA酶活性(Tian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：10670-10675(2005))。反應混合物含有 50mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)、0.2mM焦磷酸硫胺素、1mM MgCl2、0.8mM鐵氰化物、1mM α-酮戊二酸酯及細胞粗製裂解物。藉由鐵氰化物之還原在430nm下監測酶活性。使用大腸桿菌全細胞培養物來驗證SucA酶之活體內功能。將經編碼SucA酶及4-羥基丁酸去氫酶(4Hbd)之質粒轉化之大腸桿菌MG1655 lacIq單菌落接種至含有合適抗生素之5mL LB培養基中。在37℃下將該等細胞在好氧性下培養過夜。將200μL此過夜培養物引入補加有20g/L葡萄糖、100mM用以改良緩衝能力之3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、10μg/mL硫胺素及合適抗生素之8mL M9最低培養基(6.78g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中。藉由在接種後首先用氮將加蓋厭氧瓶沖洗5分鐘、然後用23G針刺穿隔膜來建立微好氧性條件。在生長期間使針保持在瓶中以允許少量空氣進入瓶中。當培養物達到對數生長中期時，用0.2mM異丙基β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)誘導蛋白質表現。作為對照，在相同條件下培養用僅編碼4-羥基丁酸去氫酶之質粒及僅空載體轉化之大腸桿菌MG1655 lacIq菌株(參見表23)。使用LCMS方法監測培養基中4-羥基丁酸酯(4HB)之累積。僅表現分枝桿菌α-酮戊二酸去羧酶之大腸桿菌菌株產生大量4HB(參見圖16)。
單獨實驗證實，α-酮戊二酸去羧酶途徑獨立於還原性TCA循環發揮功能。使用大腸桿菌菌株ECKh-401(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA)作為宿主菌株(參見表25)。所有3種構築體皆含有編碼4HB去氫酶(4Hbd)之基因。構築體1亦含有編碼α-酮 戊二酸去羧酶之基因(sucA)。構築體2含有編碼琥珀醯基-CoA合成酶(sucCD)及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶(sucD)之基因，該等酶係經由還原性TCA循環合成4HB所需。構築體3含有來自1及2之所有基因。 在與上文所述相同之條件下培養該3種大腸桿菌菌株，只是第二種培養係在微好氧性條件下進行。藉由表現SucA酶，構築體3產生比構築體2更多之4HB，構築體2依賴於還原性TCA循環來合成4HB(參見圖17)。
藉由通量分析實驗來提供α-酮戊二酸去羧酶對於4HB及BDO產生之貢獻的進一步支持。使在染色體上含有sucCD-sucD及sucA之ECKh-432之培養物在含有1-13C-葡萄糖(60%)及U-13C-葡萄糖(40%)之混合物之M9最低培養基中生長。收穫生物質，分離蛋白質並將其水解成胺基酸，且藉由氣相層析-質譜(GCMS)分析胺基酸之標記分佈，如先前所述(Fischer及Sauer，Eur.J.Biochem.270：880-891(2003))。另外，藉由GCMS分析所分泌4HB及BDO之標記分佈，如WO2008115840 A2中所述。使用此數據利用既定方法來計算細胞內通量分佈(Suthers等人，Metab.Eng.9：387-405(2007))。結果指示，介於56%與84%之間之α-酮戊二酸酯引導經過α-酮戊二酸去羧酶至BDO之途徑。其餘部分由α-酮戊二酸去氫酶氧化，隨後經由琥珀醯基-CoA路徑進入BDO。
該等結果證實含有在質粒上表現之來自牛分枝桿菌BCG之sucA基因的4-羥基丁酸酯產生菌株。當編碼此基因之質粒不存在時，當sucD(CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)不表現時，4-羥基丁酸酯產生係可忽略的。牛分枝桿菌基因係先前已表徵酶產物之結核分枝桿菌基因之親密同源物(Tian等人，見上文，2005)。
琥珀酸半醛去氫酶(CoA依賴性)、4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶。來自牙齦卟啉單胞菌W83之基因可為 1,4-丁二醇產生用途徑之有效組份(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國公開案2009/0075351)。來自牙齦卟啉單胞菌之CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶(sucD)之核苷酸序列示於圖18A中，且所編碼胺基酸序列示於圖18B中。來自牙齦卟啉單胞菌之4-羥基丁酸去氫酶(4hbd)之核苷酸序列示於圖19A中，且所編碼胺基酸序列示於圖19B中。來自牙齦卟啉單胞菌之4-羥基丁酸CoA轉移酶(cat2)之核苷酸序列示於圖20A中，且所編碼胺基酸序列示於圖20B中。
簡言之，藉由PCR自牙齦卟啉單胞菌染色體DNA選殖來自牙齦卟啉單胞菌W83之編碼琥珀酸半醛去氫酶(CoA依賴性)及4-羥基丁酸去氫酶且在一些情況下另外4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA之基因，且使用標準分子生物學程序在PA1lacO-1啟動子後面將其引入多拷貝質粒pZS*13、pZA13及pZE33中(Lutz及Bujard，Nucleic Acids Res.25：1203-1210(1997))。然後將該等質粒引入宿主菌株中。
將牙齦卟啉單胞菌W83基因引入產生菌株中，如上文所述。一些菌株僅包括琥珀酸半醛去氫酶(CoA依賴性)及4-羥基丁酸去氫酶，而無4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶。
丁酸激酶及磷酸轉丁醯基酶。可利用丁酸激酶(BK)及磷酸轉丁醯基酶(PTB)來產生4-羥基丁醯基-CoA(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國公開案2009/0075351)。特定而言，可利用丙酮丁醇梭菌基因buk1及ptb作為功能BDO途徑之一部分。
初始實驗涉及天然丙酮丁醇梭菌PTB(020)及BK(021)基因在大腸桿菌中之選殖及表現。倘若需要，則將各基因之起始密碼子及終止密碼子分別遺傳修飾成「ATG」及「TAA」，以供在大腸桿菌中進行更佳地表現。丙酮丁醇梭菌基因序列(020N及021N)及其相應經轉譯肽 序列示於圖21及22中。
PTB及BK基因作為操縱子存在於丙酮丁醇梭菌中，其中PTB(020)基因首先表現。該兩個基因由序列「atta aagttaagtg gaggaatgtt aac」(SEQ ID NO：11)連結，該序列包括下游BK(021)基因之再起始核糖體結合位點。在此背景下，該兩個基因融合至表現載體中之由lac控制之啟動子用於在大腸桿菌中表現(Lutz及Bujard，Nucleic Acids Res.25：1203-1210(1997))。
發現，兩種來自該等載體構築體之蛋白質之表現因在大腸桿菌中僅極少出現之密碼子在丙酮丁醇梭菌基因中大量出現而低於其他外源表現基因。因此，預測新020及021基因將罕見密碼子改變為於大腸桿菌基因序列中更常呈現之替代密碼子。此密碼子最佳化方法依照先前所述之算法(Sivaraman等人，Nucleic Acids Res.36：e16(2008))。此方法基於在任一側側接有某些密碼子時之出現頻率預測密碼子置換。測定020(圖23)及021(圖24)之替代基因序列，其中基於罕見密碼子在鄰近密碼子背景中之發生率，經更常見密碼子置換之該等罕見密碼子之數目遞增(A<B<C<D)。相較於天然020及021肽序列，該等預測序列之實際肽序列中未引入變化。
因密碼子最佳化所致BK及PTB蛋白質之表現改良示於圖25A中。天然基因序列之表現示於泳道2中，而020B-021B及020C-021C之表現分別示於泳道3及4中。相較於等效表現之大腸桿菌粗製萃取物中之天然操縱子(2021n)，密碼子最佳化操縱子020B-021B(2021B)及020C-021C(2021C)之更高蛋白質表現量亦可增加活性(圖25B)。
密碼子最佳化操縱子係在菌株ECKh-432(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L fimD：：大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd fimD：：牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd)之質粒上連同丙酮丁醇梭菌醛去氫酶一起表現以提供 完整BDO途徑。在含有20g/L葡萄糖之M9最低培養基中培養細胞，使用23G針來維持微好氧性條件，如上文所述。量測葡萄糖至最終產物BDO之所得轉變。亦量測γ-丁內酯(GBL)之累積，該γ-丁內酯係源自PTB-BK酶對之直接產物4Hb-CoA之自發重排分子。圖26顯示，天然2021n操縱子之表現產生與替代酶功能Cat2(034)相當之BDO量，該Cat2(034)能夠將4HB及游離CoA轉變成4HB-CoA。034之GBL量顯著高於2021n，表明前一酶比自天然基因表現之PTB-BK具有更高活性。 然而，當密碼子最佳化變體2021B及2021C表現時，BDO及GBL二者之量高於034或2021n，指示PTB及BK之基因之密碼子最佳化顯著增加其對在大腸桿菌中之BDO合成之貢獻。
該等結果證實，可採用丁酸激酶(BK)及磷酸轉丁醯基酶(PTB)酶將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基-CoA。此消除對諸如4-羥基丁醯基-CoA/乙醯基-CoA轉移酶等轉移酶之需要，該轉移酶可生成1莫耳乙酸酯/mol所產生4-羥基丁醯基-CoA。來自丙酮丁醇梭菌之酶存在於用於BDO產生之諸多經改造菌株中。
4-羥基丁醯基-CoA還原酶。可利用拜氏梭菌ald基因作為功能BDO途徑之一部分(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國公開案2009/0075351)。拜氏梭菌ald亦可用於降低BDO產生菌株中之乙醇產生。另外，發現特定密碼子最佳化ald變體(GNM0025B)改良BDO產生。
該酶之天然拜氏梭菌ald基因(025n)及所預測蛋白質序列示於圖27中。如丙酮丁醇梭菌PTB及BK基因所發現，天然拜氏梭菌ald基因在大腸桿菌中之表現極低。因此，預測到此基因之4種密碼子最佳化變體。圖28A-28D顯示025之替代基因序列，其中增加數目之罕見密碼子基於在鄰近密碼子之發生率(25A,P=0.05；25B,P=0.1；25C,P=0.15；25D,P=1)經更常見密碼子置換(A<B<C<D)。實際肽序列相 較於天然025肽序列沒有變化引入該等預測中。密碼子最佳化顯著增加拜氏梭菌ald之表現(參見圖29)，此導致表現整個BDO途徑之細胞中葡萄糖顯著較高轉變成BDO(圖30A)。
使天然及密碼子最佳化基因連同牙齦卟啉單胞菌Cat2一起在宿主菌株ECKh-432(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L △ackA fimD：：大腸桿菌sucCD，牙齦卟啉單胞菌sucD,牙齦卟啉單胞菌4hbd fimD：：牛分枝桿菌sucA,克氏羧菌4hbd)中之質粒上表現，由此含有完整BDO途徑。在含有20g/L葡萄糖之M9最低培養基中微好氧性培養細胞，如上文所述。比較拜氏梭菌Ald酶(自密碼子最佳化變體基因025B表現)與丙酮丁醇梭菌AdhE2酶於BDO及乙醇之相對產生(參見圖30B)。丙酮丁醇梭菌AdhE2酶(002C)產生較BDO多接近4倍之乙醇。相比之下，拜氏梭菌Ald(025B)(結合內源性ADH活性)產生相等量BDO，但相較於002C，此酶之BDO對乙醇之產生比率相反。此表明，拜氏梭菌Ald與丙酮丁醇梭菌AdhE2相比對4HB-CoA之特異性高於乙醯基-coA，因此前者係納入BDO途徑中之較佳酶。
測試拜氏梭菌ald基因(Toth等人，Appl.Environ.Microbiol.65：4973-4980(1999))作為用於催化4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛之候選物。篩選超過50種醛去氫酶催化4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛之能力。選擇拜氏梭菌ald基因用於BDO-產生菌株中實施，因為相對於乙醯基-CoA，此酶偏好4-羥基丁醯基-CoA作為受質。此係重要的，因為大多數具有醛去氫酶功能之其他酶(例如丙酮丁醇梭菌之adhE2(Fontaine等人，J Bacteriol.184：821-830(2002))優先將乙醯基-CoA轉變成乙醛，該乙醛進而轉變成乙醇。利用該拜氏梭菌基因可產生BDO之生物體中降低成為副產物之乙醇產量。此外，此基因之密碼子最佳化形式在大腸桿菌中極佳表現(Sivaraman等人，Nucleic Acids Res.36：e16(2008))。
4-羥基丁醛還原酶。利用來自熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(M10EXG)之adh1之4-羥基丁醛還原酶活性。此可藉由相對於內源性量增加4-羥基丁醛還原酶活性來改良BDO產生。
篩選多種醇去氫酶催化4-羥基丁醛還原成BDO之能力。多數對丁醛具有高活性之醇去氫酶展現遠低之對4-羥基丁醛之活性。一個顯著例外係來自熱葡糖苷酶地芽孢桿菌M10EXG之adh1基因(Jeon等人，J.Biotechnol.135：127-133(2008))(GNM0084)，其對4-羥基丁醛與丁醛二者皆展現高活性。
來自熱葡糖苷酶地芽孢桿菌之adh1基因之天然基因序列及所編碼蛋白質序列示於圖31中。使熱葡糖苷酶地芽胞桿菌ald1基因在大腸桿菌中表現。
Adh1酶(084)在大腸桿菌中自其天然基因極佳表現(參見圖32A)。 在ADH酶分析中，當使用丁醛或4HB-醛作為受質時，大腸桿菌表現之酶顯示極高還原活性(參見圖32B)。所測定對該等受質之Km值分別係1.2mM及4.0mM。該等活性值顯示，Adh1酶係對所有所測試候選物中之4HB-醛之還原活性最強。
測試084酶在與拜氏梭菌ald偶合時增強BDO產生之能力。在拜氏梭菌ald變體025B基因後面插入084基因以產生使兩個基因偶合表現之合成操縱子。相似構築體將025B與其他ADH候選基因連接，並測試包括各ADH與025B對BDO產生之效應。所用宿主菌株係ECKh-459(△adhE ldhA △pflB △lpdA：：fnr-pflB6-K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L fimD：：大腸桿菌sucCD，牙齦卟啉單胞菌sucD,牙齦卟啉單胞菌4hbd fimD：：牛分枝桿菌sucA,克氏羧菌4hbd fimD：：丙酮丁醇梭菌buk1,丙酮丁醇梭菌ptb)，其在染色體上含有BDO途徑之其餘部分。當相較於僅025B(圖33中之左箭頭)且結合內源性ADH功能時，結合025B表現之084 ADH顯示最高BDO量(圖33中之右箭頭)。當與 025B配對時，其亦產生多於其他ADH酶之BDO，其他ADH酶指示如下：026A-C，丙酮丁醇梭菌丁醇去氫酶之密碼子最佳化變體；050，運動發酵單胞菌醇去氫酶I；052，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)1,3-丙二醇去氫酶；053，短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)1,3-丙二醇去氫酶；057，脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)乳醛還原酶；058，大腸桿菌1,3-丙二醇去氫酶；071，枯草芽孢桿菌168 α-酮戊二酸酯半醛去氫酶。標記「PT5lacO」之構築體係彼等由PT5lacO啟動子驅動基因者。在所有其他情況下，使用PA1lacO-1啟動子。此顯示，在BDO途徑中納入084 ADH增加BDO產生。
實例XIV 表現丙酮酸去氫酶之BDO產生菌株
此實例闡述利用丙酮酸去氫酶(PDH)來增強BDO產生。使用肺炎克雷伯氏菌lpdA基因之異源表現來增強BDO產生。
在計算上，需要丙酮酸酯至乙醯基-CoA之生成NADH之轉變來達成1,4-丁二醇之最大理論產率(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國公開案2009/0075351；WO 2008/018930；Kim等人，Appl.Environ.Microbiol.73：1766-1771(2007)；Kim等人，J.Bacteriol.190：3851-3858(2008)；Menzel等人，J.Biotechnol.56：135-142(1997))。據顯示，缺乏PDH活性將BDO之最大厭氧性理論產率降低11%(若不能獲得磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶(PEPCK)活性)及3%(若可獲得PEPCK活性)。然而，更重要地，若不存在或存在PEPCK活性，則439號OptKnock菌株(闡述於WO 2009/023493及美國公開案2009/0047719中，已敲除ADHEr、ASPT、LDH_D、MDH及PFLi)中不存在PDH活性可將BDO之最大厭氧性產率分別降低54%或43%。在存在外部電子受體時，假定不存在或存在PEPCK活性，則缺乏PDH活性可將敲除菌株之最大產率分別降低10% 或3%。
PDH係最複雜的中心代謝酶之一且由24拷貝丙酮酸酯去羧醇(E1)及12分子二氫硫辛醯基去氫酶(E3)構成，該等分子結合至二氫硫辛醯基轉乙醯基酶(E2)核心外部。PDH受高NADH/NAD、ATP/ADP及乙醯基-CoA/CoA比率抑制。在諸如大腸桿菌等生物體中之氧受限或厭氧性條件下，該酶主要因由lpdA編碼之E3之NADH敏感性而天然展現極低活性。為此，對來自肺炎克雷伯氏菌之lpdA基因之NADH不敏感形式進行選殖及表現以增加在預計NADH/NAD比率較高之條件下PDH之活性。
天然lpdA之置換。肺炎克雷伯氏菌之丙酮酸去氫酶操縱子在核苷酸層面與大腸桿菌之等效操縱子具有介於78%與95%之間一致。先前顯示，肺炎克雷伯氏菌具有在甘油存在下在厭氧性下生長之能力(Menzel等人，J.Biotechnol.56：135-142(1997)：Menzel等人，Biotechnol.Bioeng.60：617-626(1998))。亦已顯示，大腸桿菌操縱子之lpdA基因中之兩個突變可增強其在厭氧性下生長之能力(Kim等人.Appl.Environ.Microbiol.73：1766-1771(2007)；Kim等人，J.Bacteriol.190：3851-3858(2008))。藉由PCR使用基因組DNA(ATCC700721D)作為模板及引子KP-lpdA-Bam(5’-acacgcggatccaacgtcccgg-3’)(SEQ ID NO：12)及KP-lpdA-Nhe(5’-agcggctccgctagccgcttatg-3’)(SEQ ID NO：13)來擴增肺炎克雷伯氏菌之lpdA基因。將所得片段選殖至載體pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen；Carlsbad CA)中，從而產生質粒pCR-KP-lpdA。
使用非複製質粒及來自枯草芽孢桿菌之sacB基因作為反選擇手段實施染色體基因置換(Gay等人，J.Bacteriol.153：1424-1431(1983))。所用載體係缺失oriT及IS序列之pRE118(ATCC87693)，其大小為3.6kb且攜帶康黴素抗性基因。確認該序列，且將該載體稱為pRE118-V2 (參見圖34)。
藉由PCR使用以下引子組合來擴增側接lpdA基因之大腸桿菌片段：EC-aceF-Pst(5’-aagccgttgctgcagctcttgagc-3’)(SEQ ID NO：14)+EC-aceF-Bam2(5’-atctccggcggtcggatccgtcg-3’)(SEQ ID NO：15)及EC-yacH-Nhe(5’-aaagcggctagccacgccgc-3’)(SEQ ID NO：16)+EC-yacH-Kpn(5’-attacacgaggtacccaacg-3’)(SEQ ID NO：17)。自質粒pCR-KP-lpdA分離含有肺炎克雷伯氏菌之lpdA基因之BamHI-XbaI片段且然後將其連接至分別用PstI +BamHI及NheI-KpnI消化之上述大腸桿菌片段及用KpnI及PstI消化之pRE118-V2質粒。使所得質粒(稱為pRE118-M2.1 lpdA yac)經過使用以下組合之定點誘變(SDM)：引子KP-lpdA-HisTyr-F(5’-atgctggcgtacaaaggtgtcc-3’)(SEQ ID NO：18)及(5’-ggacacctttgtacgccagcat-3’)(SEQ ID NO：19)，用於使His 322殘基突變成Tyr殘基；或引子KP-lpdA-GluLys-F(5’-atcgcctacactaaaccagaagtgg-3’)(SEQ ID NO：20)及KP-lpdA-GluLys-R(5’-ccacttctggtttagtgtaggcgat-3’)(SEQ ID NO：21)，用於使殘基Glu 354突變成Lys殘基。利用Polymerase Pfu Turbo(Stratagene；San Diego CA)實施PCR。驗證整個片段之序列以及僅期望突變之存在。藉由轉化將所得質粒引入大腸桿菌△adhE：：Frt-△ldhA：：Frt之電勝任細胞中。染色體中之第一個整合事件係在含有康黴素(25或50mg/L)之LB瓊脂板上進行選擇。藉由PCR使用以下2個引子來驗證正確插入：一個定位於插入區外部且一個在康黴素基因中(5’-aggcagttccataggatggc-3’)(SEQ ID NO：22)。選擇具有正確插入之純系用於解析。在普通液體LB中在期望溫度下將其繼代培養兩次且將連續稀釋物平鋪於LB-無鹽-蔗糖10%板上。篩選在含有蔗糖之板上生長之純系在LB-低鹽瓊脂培養基上之康黴素抗性基因之損失，且藉由涵蓋區之PCR及定序來驗證lpdA基因置換。驗證插入區之序列，且其係如下文所述。選擇一個具有突變Glu354Lys之純系(稱 為4-4-P1)。然後用大腸桿菌△PflB：：Frt之P1裂解物轉導此純系，產生菌株ECKh-138(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322)。
涵蓋ace及lpdA基因之ECKh-138區之序列示於圖35中。肺炎克雷伯氏菌lpdA基因加下劃線，且Glu354Lys突變體中改變之密碼子帶陰影。天然大腸桿菌lpdA與突變肺炎克雷伯氏菌lpdA之蛋白質序列比較示於圖36中。
為了評估在BDO產生菌株中使用肺炎克雷伯氏菌lpdA之益處，用自強誘導型啟動子表現整個BDO途徑之質粒轉化宿主菌株AB3及ECKh-138。具體而言，在中度拷貝質粒pZA33上表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，且在高度拷貝質粒pZE13上表現牙齦卟啉單胞菌Cat2及丙酮丁醇梭菌AdhE2。該等質粒已闡述於文獻(Lutz及H.Bujard，Nucleic Acids Res 25：1203-1210(1997))中，且其用於BDO途徑表現之用途闡述於實例XIII及WO2008/115840中。
在37℃下使細胞在補加有20g/L葡萄糖、100mM用以改良緩衝能力之3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、10μg/mL硫胺素及合適抗生素之M9最低培養基(6.78g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中在厭氧性下生長。藉由在接種後首先用氮將加蓋厭氧瓶沖洗5分鐘、然後用23G針刺穿隔膜來建立微好氧性條件。在生長期間使針保持在瓶中以允許少量空氣進入瓶中。當OD600達到約0.2時，添加0.25mM IPTG以誘導途徑基因，且在誘導後每24小時取試樣進行分析。分析培養物上清液之BDO、4HB及其他副產物，如實例II及WO2008/115840中所述。在48小時後，ECKh-138中之BDO及4HB產生顯著高於AB3或用於先前工作之宿主MG1655 △ldhA中之產生(圖37)。
PDH啟動子置換。先前顯示，由含有Fnr結合位點、一個pflB啟 動子及其核糖體結合位點(RBS)之轉錄融合物置換pdhR阻抑子，由此藉由厭氧性啟動子使aceEF-lpd操縱子表現，應可在厭氧性下增加pdh活性(Zhou等人，Biotechnol.Lett.30：335-342(2008))。藉由重疊PCR構築含有Fnr結合位點、pflB-p6啟動子及RBS結合位點之融合物。擴增兩個片段，一個使用引子aceE-上游-RC(5’-tgacatgtaacacctaccttctgtgcctgtgccagtggttgctgtgatatagaag-3’)(SEQ ID NO：23)及pflBp6-Up-Nde(5’-ataataatacatatgaaccatgcgagttacgggcctataagccaggcg-3’)(SEQ ID NO：24)且另一個使用引子aceE-EcoRV-EC(5’-agtttttcgatatctgcatcagacaccggcacattgaaacgg-3’)(SEQ ID NO：25)及aceE-上游(5’-ctggcacaggcacagaaggtaggtgttacatgtcagaacgtttacacaatgacgtggatc-3’)(SEQ ID NO：26)。藉由重疊PCR組裝tw片段，且用限制酶NdeI及BamHI消化最終DNA片段。隨後使用如上文所述pRE118-V2將此片段引入大腸桿菌操縱子之aceE基因上游。在菌株ECKh-138及ECKh-422中進行置換。驗證涵蓋aceE基因之5’區之核苷酸序列且示於圖37中。圖37顯示融合至pflB-p6啟動子及核糖體結合位點(RBS)之aceE基因之5’末端的核苷酸序列。5’斜體序列顯示在與pdh操縱子相反之方向上轉錄之aroP基因之起點。3’斜體序列顯示aceE基因之起點。大寫體：pflB RBS。加下劃線：FNR結合位點。粗體：pflB-p6啟動子序列。
lpdA啟動子置換。藉由PCR使用染色體DNA模板以及引子aceF-pflBp6-fwd(5’-agacaaatcggttgccgtttgttaagccaggcgagatatgatctatatc-3’)(SEQ ID NO：27)及lpdA-RBS-B-rev(5’-gagttttgatttcagtactcatcatgtaacacctaccttcttgctgtgatatag-3’)(SEQ ID NO：28)擴增含有fnr結合位點、pflB-p6啟動子及RBS之pflB基因之啟動子區。藉由PCR使用引子B-RBS-lpdA fwd(5’- ctatatcacagcaagaaggtaggtgttacatgatgagtactgaaatcaaaactc-3’)(SEQ ID NO：29)及pflBp6-aceF-rev(5’-gatatagatcatatctcgcctggcttaacaaacggcaaccgatttgtct-3’)(SEQ ID NO：30)擴增質粒2-4a。使用BPS選殖套組(BPS Bioscience；San Diego CA)來組裝兩個所得片段。對所得構築體定序，驗證並使用上述pRE118-V2方法將其引入菌株ECKh-439中。涵蓋所得菌株ECKh-456中之aceF-lpdA區之核苷酸序列示於圖39中。
測試宿主菌株ECKh-439(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322△mdh △arcA gltAR163L ackA fimD：：大腸桿菌sucCD,牙齦卟啉單胞菌sucD,牙齦卟啉單胞菌4hbd fimD：：牛分枝桿菌sucA,克氏羧菌4hbd)(其構築闡述於下文中)以及pdhR及lpdA啟動子置換衍生物ECKh-455及ECKh-456之BDO產生。用含有牙齦卟啉單胞菌Cat2及拜氏梭菌Ald之pZS*13轉化該等菌株以提供完整BDO途徑。在補加有20g/L葡萄糖之M9最低培養基中培養細胞，如上文所述。在用0.2mM IPTG誘導後48小時，BDO、4HB及丙酮酸酯之濃度如圖40中所示。啟動子置換菌株產生比同基因型親本略多之BDO。
該等結果證實，丙酮酸去氫酶之表現增加BDO產生菌株中BDO之產生。
實例XV 表現檸檬酸合成酶及順烏頭酸酶之BDO產生菌株
此實例闡述增加檸檬酸合成酶及順烏頭酸酶之活性以增加BDO產生。發現R163L突變成gltA改良BDO產生。另外，使用arcA敲除來改良BDO產生。
在計算上測定，需要經過檸檬酸合成酶(CS)及順烏頭酸酶(ACONT)之通量以達成1,4-丁二醇之最大理論產率(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國 公開案2009/0075351)。在厭氧性條件下，缺乏CS或ACONT活性可將最大理論產率降低14%。在外部電子受體存在下，假定不存在或存在PEPCK活性，則將最大產率分別降低9%或6%，而無經過CS或ACONT之通量。與丙酮酸去氫酶(PDH)一樣，在敲除ADHEr、ASPT、LDH_D、MDH及PFLi之敲除菌株背景下，CS及ACONT之重要性顯著增大(439號設計)(參見WO 2009/023493及美國公開案2009/0047719，其以引用方式併入本文中)。
除ECKh-138外，闡述於WO 2009/023493及美國公開案2009/0047719中之最小OptKnock菌株設計具有一個額外缺失，即編碼蘋果酸去氫酶之mdh基因。此基因之缺失意欲防止經由還原性TCA循環至琥珀酸酯之通量。使用λ red同源重組方法實施mdh缺失(Datsenko及Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000))。使用以下寡核苷酸來PCR擴增側接有來自pKD3之FRT位點之氯黴素抗性基因(CAT)：S-mdh-Kan 5'-TAT TGT GCA TAC AGA TGA ATT TTT ATG CAA ACA GTC AGC CCT GAA GAA GGG TGT AGG CTG GAG CTG CTT C-3'(SEQ ID NO：31)AS-mdh-Kan 5'-CAA AAA ACC GGA GTC TGT GCT CCG GTT TTT TAT TAT CCG CTA ATC AAT TAC ATA TGA ATA TCC TCC TTA G-3'(SEQ ID NO：32).
加下劃線區指示與pKD3質粒之同源性且粗體序列係指mdh ORF上游及下游之序列同源性。純化後，將PCR產物電穿孔至ECKh-138電勝任細胞中，該等ECKh-138電勝任細胞已經pRedET(tet)轉化且根據製造商說明書製得(www.genebridges.com/gb/pdf/K001%20Q%20E%20BAC%20Modification%20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)。設計PCR產物以將其在mdh基因上游區整合至ECKh-138基因組中，如圖41中所示。
針對氯黴素抗性選擇重組體且進行劃線純化。藉由診斷PCR驗證 mdh基因之損失及CAT之插入。為了去除CAT基因，在30℃下將含有FLP重組酶之溫度敏感性質粒pCP20(Datsenko及Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000))轉化至細胞中且針對胺苄青黴素抗性(AMP)進行選擇。在42℃下使轉化體非選擇性地生長過夜以熱誘導FLP合成並引起質粒損失。然後劃線純化培養物，且測試個別菌落之所有抗生素抗性之損失。大多數同時損失FRT側接之抗性基因及FLP輔助質粒。亦存在「FRT」疤痕殘留物。所得菌株稱為ECKh-172。
CS及ACONT在厭氧性條件下不具有高活性或無高表現。為此，使編碼TCA循環之全局調節物之arcA基因缺失。ArcA在微好氧性條件下起作用以誘導基因產物aceE、pflB及adhE之表現，從而使中心代謝酶活性對低氧量敏感。據顯示，就微好氧性而言，缺失arcA/arcB增加ldh、icd、gltA、mdh及gdh基因之比活性(Salmon等人，J.Biol.Chem.280：15084-15096(2005)；Shalel-Levanon等人，Biotechnol.Bioeng.92(2)：147-159(2005)。藉由PCR分別使用以下引子擴增大腸桿菌MG1655之arcA基因之上游及下游區：具有ArcA-上游-KpnI(5’-tattattatggtaccaatatcatgcagcaaacggtgcaacattgccg-3’)(SEQ ID NO：34)之ArcA-上游-EcoRI(5’-ataataatagaattcgtttgctacctaaattgccaactaaatcgaaacagg-3’)(SEQ ID NC：33)及具有ArcA-下游-PstI(5’-ataaaaccctgcagcggaaacgaagttttatccatttttggttacctg-3’)(SEQ ID NO：36)之ArcA-下游-EcoRI(5’-tgatctggaagaattcatcggctttaccaccgtcaaaaaaaacggcg-3’)(SEQ ID NO：35)。隨後用限制酶EcoRI及KpnI(上游片段)及EcoRI及PstI(下游)消化該等片段。然後將其連接至pRE118-V2質粒並用PstI及KpnI消化，從而產生質粒pRE118-△arcA。驗證質粒pRE118-△arcA之序列。將pRE118-△arcA引入大腸桿菌菌株ECKh-172(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh)之電勝任細胞中。在如上文所述對LB-無鹽-蔗糖板進行整合及解析後，藉由定序驗證所得菌株ECKh-401之染色體中arcA基因之缺失且將其示於圖42中。
大腸桿菌之gltA基因編碼檸檬酸合成酶。先前顯示，此基因受NADH異位抑制，且已鑑別參與此抑制之胺基酸(Pereira等人，J.Biol.Chem.269(1)：412-417(1994)；Stokell等人，J.Biol.Chem.278(37)：35435-35443(2003))。藉由PCR使用引子gltA-上游(5’-ggaagagaggctggtacccagaagccacagcagga-3’)(SEQ ID NO：37)及gltA-PstI(5’-gtaatcactgcgtaagcgccatgccccggcgttaattc-3’)(SEQ ID NO：38)來擴增大腸桿菌MG1655之gltA基因。將經擴增片段在用KpnI及PstI消化後選殖至pRE118-V2中。所得質粒稱為pRE118-gltA。然後使此質粒經過使用引子R163L-f(5’-attgccgcgttcctcctgctgtcga-3’)(SEQ ID NO：39)及R163L-r(5’-cgacagcaggaggaacgcggcaat-3’)(SEQ ID NO：40)之定點誘變(SDM)以將殘基Arg 163變成Lys殘基。藉由定序來驗證整個片段之序列。使用λ red同源重組方法之變化形式(Datsenko及Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000))用R163L突變體等位基因置換天然gltA基因，而不留下Frt疤痕。一般重組程序與用於造成上述mdh缺失者相同。首先，藉由使用λ red同源重組方法引入rpsL無效突變使菌株ECKh-172具有鏈黴素抗性。接下來，進行重組以用包括康黴素抗性基因(kanR)及大腸桿菌rpsL基因野生型拷貝之盒置換此菌株中之整個野生型gltA編碼區。當引入具有rpsL無效突變之大腸桿菌菌株中時，該盒使細胞自對藥物鏈黴素之抗性變成鏈黴素敏感性。然後引入包括gltA基因之各突變形式以及合適同源末端之DNA片段，且在鏈黴素存在下測試所致菌落生長。此選擇kanR/rpsL盒已由突變gltA基因置換之菌株。藉由PCR及DNA定序分析來確認正確基因座中突變基因之插入。所得菌株稱為ECKh-422，且具有基因型△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L。藉由定序驗證涵蓋菌株ECKh-422之突變gltA基因之區，如圖43中所示。
然後評估菌株ECKh-401及gltAR163L突變ECKh-422之粗製萃取物之檸檬酸合成酶活性。藉由以4,500rpm離心(Beckman-Coulter,Allegera X-15R；Fullerton CA)10min來收穫細胞。將沈澱再懸浮於0.3mL具有Benzonase核酸酶及溶菌酶之BugBuster(Novagen/EMD；San Diego CA)試劑中，且在室溫下輕輕振盪的同時進行15分鐘裂解。藉由在4℃下以14,000rpm離心(Eppendorf離心機5402；Hamburg Germany)30min獲得無溶胞物。使用Bradford之方法(Bradford,Anal.Biochem.72：248-254(1976))來測定試樣中之細胞蛋白質。
藉由依照自乙醯基-CoA與草醯乙酸酯之反應釋放之游離輔酶A(HS-CoA)之形成來測定檸檬酸合成酶活性。HS-CoA之游離硫醇基與5,5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反應以形成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)。然後藉由量測410nm下之吸光度(在412nm下最大)以分光光度計測量方式監測TNB之濃度。分析混合物含有100mM Tris/HCl緩衝液(pH 7.5)、20mM乙醯基-CoA、10mM DTNB及20mM草醯乙酸酯。對於NADH抑制之評估而言，亦將0.4mM NADH添加至反應。藉由添加5微升細胞萃取物來開始分析，且藉由依照吸光度隨時間之變化來量測反應速率。比活性單位定義為每分鐘每mg蛋白質所轉變產物之μmol數。
圖44顯示野生型gltA基因產物及R163L突變體之檸檬酸合成酶活性。在不存在或存在0.4mM NADH下實施分析。
用表現整個BDO途徑之質粒轉化菌株ECKh-401及ECKh-422。在低度拷貝質粒pZS*13上表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd及牛分枝桿菌sucA，且在中度拷貝質粒pZE23上表現牙齦卟啉單胞菌Cat2及丙酮丁醇梭菌AdhE2。使該等菌株之培養 物在補加有20g/L葡萄糖及合適抗生素之M9最低培養基中，在微好氧性下生長，如上文所述。兩種相同培養物在誘導後48小時之4HB平均濃度及BDO平均濃度示於圖45中。ECKh-422中之4HB平均濃度及BDO平均濃度皆高於ECKh-401，從而證實因gltA突變所致檸檬酸合成酶活性增強可增加至BDO途徑之通量。
此部分中所述宿主菌株修飾意欲重新引導經過氧化TCA循環之碳通量，此與闡述於WO 2009/023493及美國公開案2009/0047719中之OptKnock菌株設計一致。為了證實通量實際上途經此路徑，使用菌株實施13C通量分析，該ECKh-432係ECKh-422之上游途徑整合至染色體中之形式(如實例XVII中所述)。為了完成BDO途徑，自pZS*13表現牙齦卟啉單胞菌Cat2及拜氏梭菌Ald。使4種平行培養物在含有以下4種不同標記比率(1-13C，葡萄糖分子中僅第一個碳原子經13C標記；均勻-13C，所有碳原子皆為13C)之4g/L總葡萄糖之M9最低培養基(6.78g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中生長：
1. 80mol%未經標記，20mol%均勻-13C
2. 10mol%未經標記，90mol%均勻-13C
3. 90mol% 1-13C，10mol%均勻-13C
4. 40mol% 1-13C，60mol%均勻-13C
使未經標記平行培養物一式兩份生長，自其頻繁地取樣以評估生長速率、葡萄糖吸收速率及產物形成速率。在指數期晚期，收穫經標記培養物，分離蛋白質並將其水解成胺基酸，且藉由氣相層析-質譜(GCMS)分析胺基酸之標記分佈，如先前所述(Fischer及Sauer，Eur.J.Biochem.270：880-891(2003))。另外，藉由GCMS分析來自經標記培養物之營養液中所分泌4HB及BDO之標記分佈，如WO2008115840中所述。全體地使用此數據利用既定方法來計算細胞內通量分佈 (Suthers等人，Metab.Eng.9：387-405(2007))。所得中心代謝通量及相關95%信賴區間示於圖46中。值係正規化成1mmol/hr之葡萄糖吸收速率之莫耳通量。結果指示，碳通量在氧化方向上途經檸檬酸合成酶，且多數碳進入BDO途徑，而非完成TCA循環。此外，其證實，在蘋果酸酯與草醯乙酸酯之間因此菌株中缺失mdh基本上而不存在通量。
可藉由比較ECKh-422之典型發酵概況與原始菌株ECKh-138(其中經由還原性TCA循環自琥珀酸酯產生BDO)觀察使用敲除菌株(例如使用OptKnock設計之菌株)用於BDO產生之優點(參見WO 2009/023493及美國公開案2009/0047719)(參見圖47)。利用1L初始培養體積在2L Biostat B+生物反應器(Sartorius；Cedex France)中使用補加有20g/L葡萄糖之M9最低培養基實施發酵。溫度控制在37℃，且使用2M NH4OH或Na2CO3將pH控制在7.0。使細胞在好氧性下生長至約10之OD600，此時用0.2mM IPTG誘導培養物。在誘導後1小時，對於微好氧性條件而言，將空氣流動速率降至0.02標準升/分鐘。將攪拌速率設定在700rpm。進料濃縮葡萄糖以維持容器中之葡萄糖濃度介於0.5g/L與10g/L之間。用帶有整個BDO途徑之質粒轉化兩種菌株，如上文實例中所述。在ECKh-138中，乙酸酯、丙酮酸酯及4HB在發酵中佔優勢，而對於ECKh-422而言，BDO係主要產物。
實例XVI 表現磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之BDO菌株
此實例闡述利用磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)來增強BDO產生。使用流感嗜血桿菌PEPCK基因進行異源表現。
在計算上證實，需要草醯乙酸酯至磷酸烯醇丙酮酸酯之生成ATP之轉變以達成1,4-丁二醇之最大理論產率(亦參見WO2008/115840、WO 2009/023493、美國公開案2009/0047719、美國公開案 2009/0075351)。據顯示，缺乏PEPCK活性將BDO之最大理論產率降低12%(假定為厭氧性條件)及3%(假定存在諸如硝酸根或氧等外部電子受體)。
在諸如大腸桿菌等生物體中，PEPCK在自草醯乙酸酯向磷酸烯醇丙酮酸酯之葡萄糖異生性及消耗ATP之方向上作用。已假設，大腸桿菌之PEPCK之動力學限制阻止其有效地催化自PEP形成草醯乙酸酯。大腸桿菌天然地利用PEP羧化酶(PPC)(其不生成ATP但係有效生長所需)以自磷酸烯醇丙酮酸酯形成草醯乙酸酯。因此，測試三種非天然PEPCK酶(表26)補充大腸桿菌之PPC突變菌株在葡萄糖最低培養基中之生長之能力。
生長補充研究涉及在自Keio collection之獲得之△ppc突變體大腸桿菌JW3978中候選基因之基於質粒之表現(Baba等人，Molecular Systems Biology 2：2006.0008(2006))。在PA1lacO-1啟動子後將該等基因選殖於表現載體pZA23(中度拷貝)及pZE13(高度拷貝)中。先前已闡述該等質粒(Lutz及Bujard，Nucleic Acids Res.25：1203-1210(1997))，且其在表現BDO途徑基因中之用途先前已闡述於WO2008115840中。
使預培養物在具有4g/L葡萄糖之M9最低培養基中進行好氧性生長。向所有預培養物補加天冬胺酸酯(2mM)以向△ppc突變體提供用於獨立於PEPCK表現生成TCA循環中間體之來源。亦將M9最低培養基用於具有4g/L葡萄糖之測試條件中，但未添加天冬胺酸酯且將IPTG 添加至0.5mM。表27顯示生長補充研究之結果。
發現在基於質粒之篩選中測試之基因中，流感嗜血桿菌PEPCK最好地補充△ppc突變大腸桿菌中之生長。然後使用SacB反選擇方法利用上述pRE118-V2將此基因整合至野生型大腸桿菌(MG1655)之PPC基因座中(Gay等人，J.Bacteriol.153：1424-1431(1983))。保持大腸桿菌天然PPC啟動子但利用非天然PEPCK終止子來整合PEPCK。在由流感嗜血桿菌pepck置換ppc後，此區之序列示於圖48中。pepck編碼區加下劃線。
適用用於適應性進化之技術來改良大腸桿菌突變體(△ppc：：H.inf pepCK)之生長速率。使用具有4g/L葡萄糖及50mM碳酸氫鈉之M9最低培養基在厭氧性環境中培養並進化此菌株。利用高碳酸氫鈉濃度來驅動向草醯乙酸酯形成之PEPCK反應之平衡。為了維持指數生長，在達成0.5之OD600時將培養物稀釋2倍。在經3週適應性進化約100代後，厭氧性生長速率相對於野生型自約8h改良至約2h。在進化後，分離個別菌落，且比較其與初始突變及野生型菌株在厭氧瓶中之生長(參見圖49)。使用具有4g/L葡萄糖及50mM碳酸氫鈉之M9培養基。
然後重複上述ppc/pepck基因置換程序，此時使用BDO-產生菌株 ECKh-432(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L △ackA fimD：：大腸桿菌sucCD,牙齦卟啉單胞菌sucD,牙齦卟啉單胞菌4hbd fimD：：牛分枝桿菌sucA,克氏羧菌4hbd)及ECKh-439作為宿主。該等菌株含有上述TCA循環增強以及整合在染色體中之上游途徑。ECKh-439係缺乏編碼乙酸激酶之ackA基因之ECKh-432衍生物。使用上述sacB反選擇方法實施此缺失。
在發酵中運行ECKh-439之△ppc：：H. inf pepCK衍生物(稱為ECKh-453)。藉由含有牙齦卟啉單胞菌Cat2及拜氏梭菌Ald之pZS*13供應下游BDO途徑。此係利用1L初始培養體積在2L Biostat B+生物反應器(Sartorius)中使用補加有20g/L葡萄糖及50mM NaHCO3之M9最低培養基中實施。溫度控制在37℃，且使用2M NH4OH或Na2CO3將pH控制在7.0。使細胞在好氧性下生長至約2之OD600，此時用0.2mM IPTG誘導培養物。在誘導後1小時，對於微好氧性條件而言，將空氣流動速率降至0.01標準升/分鐘。將攪拌速率初始設定在700rpm。當培養密度增加時，在整個發酵期間逐漸增加通氣速率。進料濃縮葡萄糖溶液以將容器中之葡萄糖濃度維持在介於0.5g/L與10g/L之間。產物概況示於圖50中。觀察到之以約1對1莫耳比產生BDO及乙酸酯之表型與WO 2009/023493中針對439號設計(ADHEr、ASPT、LDH_D、MDH、PFLi)所預測者高度相似。認為無需靶向ASPT反應之缺失，此乃因經過天冬胺酸酯氨-裂解酶之天然通量較低。
OptKnock菌株之關鍵特徵在於所關注代謝物之產生通常與生長偶合且進一步在於產生應發生在指數生長期間以及靜止期。藉由在微好氧性瓶中生長同時在指數期期間頻繁地取樣來評估ECKh-432及ECKh-453之生長偶合潛力。使用含有4g/L葡萄糖及10mM NaHCO3(對於ECKh-432而言)或50mM NaHCO3(對於ECKh-453而言)之M9培養基，且自接種包括0.2mM IPTG。使用18G針進行ECKh-432之微好 氧性生長，而對於ECKh-453而言，測試18G針與27G針二者。較高號針產生較少通氣。如圖51中所示，ECKh-432直至5g/L葡萄糖已消耗才開始產生BDO，對應於靜止期起始。在整個實驗內，ECKh-453皆更均勻地產生BDO。另外，當培養物通氣減少時，改良生長偶合。
實例XVII 編碼BDO途徑之基因於特定整合位點之整合
此實例闡述將各種BDO途徑基因整合至fimD基因座中以提供更有效之表現及穩定性。
產生4HB之整個上游BDO途徑已於fimD基因座處整合至大腸桿菌染色體中。使用λ red同源重組方法將上游途徑之琥珀酸酯支路整合至大腸桿菌染色體中(Datsenko及Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000))。受體大腸桿菌菌株係ECKh-422(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L)。將含有啟動子、sucCD基因、sucD基因及4hbd基因及終止子序列之多順反子DNA片段插入pKD3質粒之AflIII位點中。使用以下引子來擴增來自質粒之操縱子以及氯黴素標記物。加下劃線序列與靶插入位點同源。
5’-GTTTGCACGCTATAGCTGAGGTTGTTGTCTTCCAGCAACGTACCGTATACAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC-3’(SEQ ID NO：41)
5’-GCTACAGCATGTCACACGATCTCAACGGTCGGATGACCAATCTGGCTGGTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’(SEQ ID NO：42)
在DpnI處理及DNA電泳後，使用經純化PCR產物來轉化具有質粒pKD46之大腸桿菌菌株。在含有氯黴素之板上選擇候選菌株。純化候選菌株之基因組DNA。擴增插入序列且藉由DNA定序確認。藉由翻轉酶自染色體去除抗氯黴素標記物。插入及去除標記物後之區之核苷酸序列示於圖52中。
藉由同源重組將上游途徑之α-酮戊二酸酯支路整合至染色體中。用於此修飾中之質粒源自載體pRE118-V2，如實例XIV中所提及，該 載體含有抗康黴素基因、編碼聚果糖蔗糖酶之基因(sacB)及R6K條件複製起點。整合質粒亦含有具有啟動子、sucA基因、克氏羧菌4hbd基因及終止子之多順反子序列，該序列插入兩個與靶插入位點之側接區同源之1.5-kb DNA片段之間。使用所得質粒來轉化大腸桿菌菌株。在含有康黴素之板上選擇整合候選物。藉由PCR來驗證正確整合位點。為了解析來自染色體之抗生素標記物，選擇細胞用於在含有蔗糖之培養基上生長。藉由PCR及DNA定序來驗證最終菌株。插入及去除標記物後之染色體區之核苷酸序列示於圖53中。
用具有下游途徑基因之質粒轉化所得上游途徑整合菌株ECKh-432。構築體能夠在最低培養基中自葡萄糖產生BDO(參見圖54)。
實例XVIII 使用非磷酸轉移酶蔗糖吸收系統來減少丙酮酸酯副產物形成
此實例闡述利用非磷酸轉移酶(PTS)蔗糖吸收系統來減少蔗糖轉變為BDO中作為副產物之丙酮酸酯。
經改造用於經由磷酸轉移酶(PTS)系統利用蔗糖之菌株產生大量作為副產物之丙酮酸酯。因此，使用非PTS蔗糖系統可用來減少丙酮酸酯形成，此乃因輸入蔗糖不會伴有磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)轉化成丙酮酸酯。此將增加PEP庫及經過PPC或PEPCK至草醯乙酸酯之通量。
將非PTS蔗糖操縱子插入rrnC區中。為生成含有側接有與rrnC區同源之區之非PTS蔗糖基因之PCR產物，使用兩個寡核苷酸來PCR擴增來自Mach1TM(Invitrogen,Carlsbad,CA)之csc基因。此菌株係W菌株之派生物，W菌株係已知能夠使蔗糖分解代謝之大腸桿菌菌株(Orencio-Trejo等人，Biotechnology Biofuels 1：8(2008))。該序列源自大腸桿菌W菌株KO11(登記號AY314757)(Shukla等人，Biotechnol.Lett.26：689-693(2004))且包括編碼蔗糖通透酶(cscB)、D-果糖激酶 (cscK)、蔗糖水解酶(cscA)、及LacI相關性蔗糖特異性阻製子(cscR)之基因。藉由置放AS引子來有效去除cscR之前53個胺基酸。寡核苷酸之序列係：rrnC 23S del S-CSC 5’-TGT GAG TGA AAG TCA CCT GCC TTA ATA TCT CAA AAC TCA TCT TCG GGT GAC GAA ATA TGG CGT GAC TCG ATA C-3'(SEQ ID NO：43)及rrnC 23S del AS-CSC 5’-TCT GTA TCA GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC CGC CAA AAC AGC TTC GGC GTT AAG ATG CGC GCT CAA GGA C-3’(SEQ ID NO：44)。加下劃線區指示與csc操縱子之同源性，且粗體序列係指序列rrnC區之上游及下游同源性。整個PCR產物之序列示於圖55中。
純化後，將PCR產物電穿孔至MG1655電勝任細胞中，該等MG1655電勝任細胞已經pRedET(tet)轉化且根據製造商說明書製得(www.genebridges.com/gb/pdf/K001%20Q%20E%20BAC%20Modification%20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)。設計PCR產物以將其整合至染色體基因組之rrnC區域中。其有效地缺失rrlC(23S rRNA)上游之191個核苷酸、所有rrlC rRNA基因及rrlC下游之3個核苷酸並用蔗糖操縱子將其置換，如圖56中所示。
使轉化體在具有0.4%蔗糖之M9最低鹽培養基上生長，並藉由診斷PCR測試個別菌落中蔗糖操縱子之存在。藉由P1轉導將整個rrnC：：crcAKB區轉移至BDO宿主菌株ECKh-432中(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001))，從而得到ECKh-463(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L fimD：：大腸桿菌sucCD，牙齦卟啉單胞菌sucD，牙齦卟啉單胞菌4hbd fimD：：牛分枝桿菌sucA，克氏羧菌4hbd rrnC：：cscAKB)。藉由在蔗糖上生長來選擇重組體且藉由診斷PCR來驗證。
用含有牙齦卟啉單胞菌Cat2及拜氏梭菌Ald之pZS*13轉化ECKh- 463以提供完整BDO途徑。在補加有10g/L蔗糖之M9最低培養基(6.78g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中培養細胞。自開始培養物中即存在0.2mM IPTG。使用具有23G針之瓶維持厭氧性條件。作為對照，在相同培養基上培養含有相同質粒之ECKh-432，只是用10g/L葡萄糖代替蔗糖。 圖57顯示生長48小時後正規化成培養物OD600之平均產物濃度。數據係關於各菌株之6個相同培養物。此證實，在蔗糖上自ECKh-463之BDO產生與蔗糖上之親本菌株之BDO產生相似。
實例XIX BDO產生菌株之匯總
此實例闡述各種BDO產生菌株。
表28匯總上文實例XII-XVIII中所揭示之各種BDO產生菌株。
表28中匯總之菌株如下。菌株1：大腸桿菌MG1655之單缺失衍生物，其中缺失內源性ldhA；質粒表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭 菌adhE 2。菌株2：宿主菌株AB3，其係產生琥珀酸酯之菌株，係大腸桿菌MG1655之衍生物，其中缺失內源性adhE ldhA pflB；質粒表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌adhE2。
菌株3：宿主菌株ECKh-138，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA；質粒表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌adhE2；菌株提供lpdA之改良以增加丙酮酸去氫酶通量。菌株4：宿主菌株ECKh-138，缺失內源性adhE、ldhA、pflB及lpdA，染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA；質粒表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb、丙酮丁醇梭菌adhE2。
菌株5：宿主菌株ECKh-401，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA；質粒表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌adhE2；菌株缺失mdh及arcA以引導經過氧化性TCA循環之通量。菌株6：宿主菌株ECKh-401，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA；質粒表現牛分枝桿菌sucA、大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌adhE2。
菌株7：宿主菌株ECKh-422，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變 體進行染色體置換；質粒表現大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌adhE2；菌株在檸檬酸合成酶中存在突變以改良厭氧活性。菌株8：菌株ECKh-422，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換；質粒表現牛分枝桿菌sucA、大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌adhE2。菌株9：宿主菌株ECKh-422，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，使用gltA Arg163Leu突變體染色體置換gltA；質粒表現牛分枝桿菌sucA、大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd、牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald。
菌株10：宿主菌株ECKh-426，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd；質粒表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald；菌株在fimD基因座處具有整合至菌株ECKh-422中之上游途徑的琥珀酸酯支路。菌株11：宿主菌株ECKh-432，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌suc4、克氏羧 菌4hbd；質粒表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald；菌株具有整合至ECKh-422中之琥珀酸酯及α-酮戊二酸酯上游路徑分支。菌株12：宿主菌株ECKh-432，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd；質粒表現丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb、拜氏梭菌Ald。
菌株13：宿主菌株ECKh-439，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，缺失內源性ackA，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd；質粒表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald；菌株使菌株ECKh-432中之乙酸激酶缺失。菌株14：宿主菌株ECKh-453，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，缺失內源性ackA，缺失內源性ppc且在ppc基因座處插入流感嗜血桿菌ppck，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd；質粒表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald；菌株具有菌株ECKh-432中之乙酸激酶缺失及PPC/PEPCK置換。
菌株15：宿主菌株ECKh-456，缺失內源性adhE、ldhA、pflB， 缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd，使用fnr結合位點、pflB-p6啟動子及pflB之RBS置換lpdA啟動子；質粒表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald；菌株使用菌株ECKh-432中之厭氧性啟動子置換lpdA啟動子。菌株16：宿主菌株ECKh-455，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbdI，使用fnr結合位點、pflB-p6啟動子及pflB之RBS置換pdhR及aceEF啟動子；質粒表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald；菌株使用ECKh-432中之厭氧性啟動子置換pdhR及aceEF啟動子。
菌株17：宿主菌株ECKh-459，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb；質粒表現拜氏梭菌Ald；菌株使BK/PTB整合至菌株ECKh-432中。菌株18：宿主菌株ECKh-459，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺 失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb；質粒表現拜氏梭菌Ald、熱葡糖苷酶地芽孢桿菌adhl。
菌株19：宿主菌株ECKh-463，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd，在rrnC基因座處插入非PTS蔗糖操縱子基因蔗糖通透酶(cscB)、D-果糖激酶(cscK)、蔗糖水解酶(cscA)、及LacI相關性蔗糖特異性阻抑子(cscR)；質粒表現牙齦卟啉單胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald；菌株具有插入至菌株ECKh-432中之非PTS蔗糖基因。菌株20：宿主菌株ECKh-463，缺失內源性adhE、ldhA、pflB，缺失內源性lpdA且在lpdA基因座處染色體插入具有Glu354Lys突變之肺炎克雷伯氏菌lpdA，缺失內源性mdh及arcA，gltA用gltA Arg163Leu突變體進行染色體置換，在fimD基因座處染色體插入大腸桿菌sucCD、牙齦卟啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd，在fimD基因座處染色體插入牛分枝桿菌sucA、克氏羧菌4hbd，在rrnC基因座處插入非PTS蔗糖操縱子；質粒表現丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb、拜氏梭菌Ald。
應理解，除本文所揭示之BDO產生菌株(包括彼等表28中所揭示者)以外，亦可納入進一步增加BDO之產生及/或降低不合意副產物的其他修飾。例如，BDO產生菌株或表28之菌株可納入其他敲除以進一 步增加BDO之產生或降低不合意副產物。先前已闡述實例性敲除(參見美國公開案2009/0047719)。此等敲除菌株包括(但不限於)一或多個選自以下之基因：ADHEr、NADH6；ADHEr、PPCK；ADHEr、SUCD4；ADHEr、ATPS4r；ADHEr、FUM；ADHEr、MDH；ADHEr、PFLi、PPCK；ADHEr、PFLi、SUCD4；ADHEr、ACKr、NADH6；ADHEr、NADH6、PFLi；ADHEr、ASPT、MDH；ADHEr、NADH6、PPCK；ADHEr、PPCK、THD2；ADHEr、ATPS4r、PPCK；ADHEr、MDH、THD2；ADHEr、FUM、PFLi；ADHEr、PPCK、SUCD4；ADHEr、GLCpts、PPCK；ADHEr、GLUDy、MDH；ADHEr、GLUDy、PPCK；ADHEr、FUM、PPCK；ADHEr、MDH、PPCK；ADHEr、FUM、GLUDy；ADHEr、FUM、HEX1；ADHEr、HEX1、PFLi；ADHEr、HEX1、THD2；ADHEr、FRD2、LDH_D、MDH；ADHEr、FRD2、LDH_D、ME2；ADHEr、MDH、PGL、THD2；ADHEr、G6PDHy、MDH、THD2；ADHEr、PFLi、PPCK、THD2；ADHEr、ACKr、AKGD、ATPS4r；ADHEr、GLCpts、PFLi、PPCK；ADHEr、ACKr、ATPS4r、SUCOAS；ADHEr、GLUDy、PFLi、PPCK；ADHEr、ME2、PFLi、SUCD4；ADHEr、GLUDy、PFLi、SUCD4；ADHEr、ATPS4r、LDH_D、SUCD4；ADHEr、FUM、HEX1、PFLi；ADHEr、MDH、NADH6、THD2；ADHEr、ATPS4r、MDH、NADH6；ADHEr、ATPS4r、FUM、NADH6；ADHEr、ASPT、MDH、NADH6；ADHEr、ASPT、MDH、THD2；ADHEr、ATPS4r、GLCpts、SUCD4；ADHEr、ATPS4r、GLUDy、MDH；ADHEr、ATPS4r、MDH、PPCK；ADHEr、ATPS4r、FUM、PPCK；ADHEr、ASPT、GLCpts、MDH；ADHEr、ASPT、GLUDy、MDH；ADHEr、ME2、SUCD4、THD2；ADHEr、FUM、PPCK、THD2；ADHEr、MDH、PPCK、THD2； ADHEr、GLUDy、MDH、THD2；ADHEr、HEX1、PFLi、THD2；ADHEr、ATPS4r、G6PDHy、MDH；ADHEr、ATPS4r、MDH、PGL；ADHEr、ACKr、FRD2、LDH_D；ADHEr、ACKr、LDH_D、SUCD4；ADHEr、ATPS4r、FUM、GLUDy；ADHEr、ATPS4r、FUM、HEX1；ADHEr、ATPS4r、MDH、THD2；ADHEr、ATPS4r、FRD2、LDH_D；ADHEr、ATPS4r、MDH、PGDH；ADHEr、GLCpts、PPCK、THD2；ADHEr、GLUDy、PPCK、THD2；ADHEr、FUM、HEX1、THD2；ADHEr、ATPS4r、ME2、THD2；ADHEr、FUM、ME2、THD2；ADHEr、GLCpts、GLUDy、PPCK；ADHEr、ME2、PGL、THD2；ADHEr、G6PDHy、ME2、THD2；ADHEr、ATPS4r、FRD2、LDH_D、ME2；ADHEr、ATPS4r、FRD2、LDH_D、MDH；ADHEr、ASPT、LDH_D、MDH、PFLi；ADHEr、ATPS4r、GLCpts、NADH6、PFLi；ADHEr、ATPS4r、MDH、NADH6、PGL；ADHEr、ATPS4r、G6PDHy、MDH、NADH6；ADHEr、ACKr、FUM、GLUDy、LDH_D；ADHEr、ACKr、GLUDy、LDH_D、SUCD4；ADHEr、ATPS4r、G6PDHy、MDH、THD2；ADHEr、ATPS4r、MDH、PGL、THD2；ADHEr、ASPT、G6PDHy、MDH、PYK；ADHEr、ASPT、MDH、PGL、PYK；ADHEr、ASPT、LDH_D、MDH、SUCOAS；ADHEr、ASPT、FUM、LDH_D、MDH；ADHEr、ASPT、LDH_D、MALS、MDH；ADHEr、ASPT、ICL、LDH_D、MDH；ADHEr、FRD2、GLUDy、LDH_D、PPCK；ADHEr、FRD2、LDH_D、PPCK、THD2；ADHEr、ACKr、ATPS4r、LDH_D、SUCD4；ADHEr、ACKr、ACS、PPC、PPCK；ADHEr、GLUDy、LDH_D、PPC、PPCK；ADHEr、LDH_D、PPC、PPCK、THD2；ADHEr、ASPT、ATPS4r、GLCpts、MDH；ADHEr、G6PDHy、MDH、NADH6、THD2； ADHEr、MDH、NADH6、PGL、THD2；ADHEr、ATPS4r、G6PDHy、GLCpts、MDH；ADHEr、ATPS4r、GLCpts、MDH、PGL；ADHEr、ACKr、LDH_D、MDH、SUCD4。
表29顯示欲自諸如大腸桿菌等宿主生物體敲除之對應基因之反應。對應於表29中之縮寫之對應代謝物示於表30中。
實例XX 用於產生BDO之實例性途徑
此實例闡述使用羧酸還原酶作為BDO途徑酶產生4-羥基丁醛(4-HBal)及/或BDO之實例性途徑。
用於產生BDO之實例性途徑包括使用NAD+或NADP+芳基醛去氫酶(E.C.：1.2.1.29及1.2.1.30)將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醛及使用醇去氫酶將4-羥基丁醛轉變成1,4-丁二醇。4-羥基丁酸酯可源自三羧酸循環中間體琥珀醯基-CoA及/或α-酮戊二酸酯，如圖58中所述。
芳基醛去氫酶(或羧酸還原酶)。芳基醛去氫酶或等效地羧酸還原酶可在伊文思奴卡菌中發現。羧酸還原酶催化羧酸至其對應醛之依賴鎂、ATP及NADPH之還原(Venkitasubramanian等人，J.Biol.Chem.282：478-485(2007))且能夠催化4-羥基丁酸酯轉變為4-羥基丁醛。使 由car編碼之此酶在大腸桿菌中選殖並進行功能表現(Venkitasubramanian等人，J.Biol.Chem.282：478-485(2007))。npt基因產物之表現經由轉錄後修飾改良酶之活性。npt基因編碼將無活性去輔基酶轉變成活性全酶之特異性磷酸泛醯巰基乙胺轉移酶(PPTase)。此酶之天然受質係香草酸，且該酶展現對芳香族及脂肪族受質之廣泛接受性(Venkitasubramanian等人，Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industires，R.N.Patel編輯，第15章，第425-440頁，CRC Press LLC,Boca Raton,FL.(2006))。
可基於序列同源性鑑別其他car及npt基因。
在灰色鏈黴菌中發現之另一酶候選物係由griC及griD基因編碼。相信此酶將3-胺基-4-羥基苯甲酸轉變成3-胺基-4-羥基苯甲酸代謝之分路產物3-胺基-4-羥基苯甲醛，此乃因缺失griC或griD導致細胞外3-乙醯基胺基-4-羥基苯甲酸累積(Suzuki等人，J.Antibiot.60(6)：380-387(2007))。griC及griD與SGR_665(序列與伊文思奴卡菌npt相似之酶)共表現可能有益。
具有相似特性之酶α-胺基己二酸酯還原酶(AAR,EC 1.2.1.31)參與一些真菌物種中之離胺酸生物合成途徑。此酶天然將α-胺基己二酸酯還原成α-胺基己二酸酯半醛。羧基首先經由腺苷酸酯之依賴ATP之形成來活化，其隨後由NAD(P)H還原，生成醛及AMP。與CAR一樣，此酶利用鎂且需要由PPTase活化。在啤酒酵母菌(Morris等人，Gene 98：141-145(1991))、白色假絲酵母菌(Candida albicans)(Guo等人， Mol.Genet.Genomics 269：271-279(2003))及粟酒裂殖酵母菌(Ford等人，Curr.Genet.28：131-137(1995))中發現AAR之酶候選物及其對應PPTase。當在大腸桿菌中表現時，來自粟酒裂殖酵母菌之AAR展現顯著活性(Guo等人，Yeast 21：1279-1288(2004))。來自產黃青黴之AAR接受S-羧基甲基-L-半胱胺酸作為替代受質，但不與己二酸酯、L-麩胺酸酯或二胺基庚二酸酯反應(Hijarrubia等人，J.Biol.Chem.278：8250-8256(2003))。迄今尚未鑑別編碼產黃青黴PPTase之基因。
使用羧酸還原酶用於BDO產生存在若干優點。相較於經由醯基-CoA或醯基-磷酸還原酶自4-羥基丁酸酯之活化形式(例如，4-羥基丁醯基-CoA、4-羥基丁醯基-Pi)形成4-羥基丁醛，經由羧酸還原酶自4-羥基丁酸酯形成4-羥基丁醛存在至少兩個優點。首先，顯著減少作為副產物之γ-丁內酯(GBL)之形成。相信，4-羥基丁酸酯之活化形式比未經活化之4-羥基丁酸酯更容易環化成GBL。羧酸還原酶之使用消除對經過游離活化之4-羥基丁酸酯中間體之需要，因此減少伴隨BDO產生作為副產物之GBL之形成。其次，顯著減少作為副產物之乙醇之形成。當分別使用形成醛或醇之4-羥基丁醯基-CoA還原酶將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛或1,4-丁二醇時，經常形成不同量之乙醇。此乃因多數(若非全部)形成醛或醇之4-羥基丁醯基-CoA還原酶除可接受4-羥基丁醯基-CoA外亦可接受乙醯基-CoA作為受質。例如，形成 醛之酶經常催化乙醯基-CoA轉變為乙醛，該乙醛隨後由天然或非天然醇去氫酶還原成乙醇。接受乙醯基-CoA作為受質之形成醇之4-羥基丁醯基-CoA還原酶可將乙醯基-CoA直接轉變成乙醇。羧酸還原酶對乙醯基-CoA之活性似乎遠小於形成醛或醇之醯基-CoA還原酶對乙醯基-CoA之活性，且因此其應用於BDO產生獲得最少乙醇副產物形成(參見下文)。
實例XXI 使用A羧酸還原酶生物合成1,4-丁二醇
此實例闡述使用羧酸還原酶產生1,4-丁二醇之微生物之生成。
使用大腸桿菌作為靶生物體來改造闡述於圖58中之用於1,4-丁二醇合成之途徑。大腸桿菌提供用於生成能夠產生1,4-丁二醇之非天然微生物的良好宿主。大腸桿菌適於遺傳操縱且已知能夠在各種含氧條件下有效地產生各種產物，如乙醇、乙酸、甲酸、乳酸及琥珀酸。
將4-羥基丁酸酯途徑基因整合至染色體中：ECKh-432之構築。在命名為ECKh-432之大腸桿菌菌株中表現羧酸還原酶，ECKh-432之構築闡述於實例XVII中。此菌株含有產生4HB之BDO途徑之組份，該途徑於fimD基因座處整合至大腸桿菌之染色體中。
如實例XVII中所述，使用λ red同源重組方法將上游途徑之琥珀酸酯支路整合至大腸桿菌染色體中(Datsenko及Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000))。將含有啟動子、大腸桿菌之編碼琥珀醯基-CoA連接酶之sucCD基因、牙齦卟啉單胞菌之編碼琥珀醯基-CoA還原醇(形成醛)(圖58之步驟A)之sucD基因、牙齦卟啉單胞菌之編碼4-羥基丁酸去氫酶(圖58之步驟C)之4hbd基因及終止子序列的多順反子DNA片段插入pKD3質粒之AflIII位點中。
如實例XVII中所述，藉由同源重組將上游途徑之α-酮戊二酸酯支路整合至染色體中。用於此修飾中之質粒係pRE118-V2(缺失oriT及IS 序列之pRE118(ATCC87693))，其含有抗康黴素基因、編碼聚果糖蔗糖酶之基因(sacB)及R6K條件複製起點。整合質粒亦含有具有啟動子、來自牛分枝桿菌之編碼α-酮戊二酸去羧酶(圖58之步驟B)之sucA基因、編碼4-羥基丁酸去氫酶(圖58之步驟C)之克氏羧菌4hbd基因及終止子的多順反子序列，該序列插入兩個與靶插入位點之側接區同源之1.5-kb DNA片段之間。使用所得質粒來轉化大腸桿菌菌株。在含有康黴素之板上選擇整合候選物。藉由PCR來驗證正確整合位點。為了解析來自染色體之抗生素標記物，選擇細胞用於在含有蔗糖之培養基上生長。藉由PCR及DNA定序來驗證最終菌株。
受體大腸桿菌菌株係ECKh-422(△adhE △ldhA △pflB △lpdA：：K.p.lpdA322 △mdh △arcA gltAR163L)，其構築闡述於實例XV中。ECKh-422含有突變gltAR163L，從而產生由gltA編碼之檸檬酸合成酶之對NADH不敏感之。其進一步含有來自肺炎克雷伯氏菌之如上文所述整合至染色體中之lpdA基因的NADH不敏感形式。
用肺炎克雷伯氏菌之NADH不敏感lpdA置換天然lpdA之置換法係如實例XIV中所述。所得載體命名為pRE118-V2(參見圖34)。]
羧酸還原酶及PPTase之選殖及表現。為了生成經改造以產生1,4-丁二醇之大腸桿菌菌株，使用熟知分子生物學技術(例如，參見Sambrook，見上文，2001；Ausubel見上文，1999)在大腸桿菌中表現編碼羧酸還原酶及磷酸泛醯巰基乙胺轉移酶之核酸。特定而言，根據PA1/lacO啟動子將car(AAR91681.1)及npt(ABI83656.1)基因選殖至pZS*13載體(Expressys,Ruelzheim,Germany)中。藉由PCR自奴卡菌屬基因組DNA選殖car基因(GNM_720)。其核酸及蛋白質序列分別示於圖59A及59B中。
藉由GeneArt(Regensburg,Germany)合成npt基因(GNM_721)之密碼子最佳化形式。其核酸及蛋白質序列分別示於圖60A及60B中。將 GNM_720及GNM_721選殖至pZS*13中所得載體示於圖61中。
將質粒轉化至ECKh-432中以表現1,4-丁二醇產生所需蛋白質及酶。亦構築含有僅GNM_720及僅GNM_721之質粒之替代形式。
使用羧酸還原酶之1,4-BDO產生之證實。使用大腸桿菌全細胞培養物來證實1,4-丁二醇途徑之功能表現。將經含有GNM_720與GNM_721二者之pZS*13質粒轉化之大腸桿菌ECKh-432單菌落接種至5mL含有合適抗生素之LB培養基中。相似地，將經含有GNM_720或GNM_721之pZS*13質粒轉化之大腸桿菌ECKh-432單菌落接種至含有合適抗生素之LB培養基之額外5mL等分試樣中。藉由用1%最早培養物接種含有合適抗生素之新鮮最低活體內轉變培養基(參見下文)來開始10mL微好氧性培養物。
最低活體內轉變培養基之配方(對於1000mL而言)如下：
藉由在接種後首先用氮將加蓋厭氧瓶沖洗5分鐘、然後用18G針刺穿隔膜來建立微好氧性條件。在生長期間使針保持在瓶中以允許少量空氣進入瓶中。當培養物達到對數生長中期時，用0.2mM IPTG誘導蛋白質表現。將此視為：時間=0hr。分析培養物上清液之BDO、4HB及其他副產物，如上文及WO2008115840中所述(參見表31)。
表31. 不同菌株中之BDO、4-HB及其他產物之產生.
該等結果證實，羧酸還原酶基因GNM_720係ECKh-432中之BDO形成所需，且當其與PPTase GNM_721共表現時，增加其有效性。在表現GNM_720本身或與GNM_721之組合之菌株中，GBL及乙醇之產生量遠小於BDO。
採用羧酸還原酶之達成BDO之其他途徑。預計，羧酸還原酶可作為自TCA循環代謝物：琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸酯達成1,4-丁二醇之許多途徑之組份發揮功能。該等途徑中之若干揭示於圖62中。假定葡萄糖作為碳源，則所有路徑可產生大於或等於1mol/mol之理論BDO產率。可自尤其包括蔗糖、木糖、阿拉伯糖、合成氣體之其他受質獲得相似之高理論產率。預計，羧酸還原酶(亦即，用以催化圖62之步驟F及D)單獨或與PPTase組合之表現對於自琥珀酸酯產生1,4-丁二醇足夠，前提為，存在足夠內源性醇去氫酶活性來催化圖62之步驟C及E。圖62之步驟A至Z之候選酶闡述於部分XXIII中。
實例XXII 採用羧酸還原酶之達成腐胺之途徑
此實例闡述利用羧酸還原酶之實例性腐胺途徑。
腐胺亦稱作1,4-二胺基丁烷或丁二胺，係式NH2(CH2)4NH2之有機化學化合物。其可與己二酸反應反應以生成聚醯胺尼龍-4,6，該聚醯 胺尼龍-4,6由DSM(Heerlen,Netherlands)以商品名StanylTM出售。腐胺係藉由(例如)活的及死亡生物體中胺基酸之天然降解來天然產生。大腸桿菌已經改造以藉由過表現天然鳥胺酸生物合成機器以及鳥胺酸去羧酶來產生腐胺(Qian等人，Biotechnol.Bioeng.104(4)：651-662(2009))。
圖63闡述諸多其他生物合成途徑，其可自琥珀酸酯、琥珀醯基-CoA或α-酮戊二酸酯產生腐胺且採用羧酸還原酶。注意，該等途徑皆不需要形成4-胺基丁酸酯之活化形式(例如4-胺基丁醯基-CoA)，其可由醯基-CoA還原酶還原成4-胺基丁醛，且亦可容易地環化成其內醯胺2-吡咯啶酮(Ohsugi等人，J.Biol.Chem.256：7642-7651(1981))。假定葡萄糖作為碳源，則所有路徑可產生大於或等於1mol/mol之理論腐胺產率。可自尤其包括蔗糖、木糖、阿拉伯糖、合成氣體之其他受質獲得相似之高理論產率。圖63之步驟A至U之候選酶闡述於實例XXIII中。
實例XXIII 用於產生C4化合物之實例性酶
此實例闡述用於產生諸如1,4-丁二醇、4-羥基丁醛及腐胺等C4化合物之實例性酶。
酶類別。繪示於圖58、62及63中之所有轉化屬於示於表32中之一般轉化類別。此實例闡述各類別中之諸多以化學方式表徵之基因。具體而言，列示可應用於在選殖並表現時催化圖58、62及63中之合適轉化之基因。各標記之前三個數位對應於前三個Enzyme Commission編號數位，其表示獨立於受質特異性之轉化之一般類型。
1.1.1.a 氧化還原酶(酮至醇)
醛至醇。闡述於圖58、62及63中之三種轉化涉及醛轉變為醇。該等係4-羥基丁酸去氫酶(步驟C，圖58及62)、1,4-丁二醇去氫酶(步驟E，圖58及62)及5-羥基-2-戊酸(步驟Y，圖62)。編碼催化醛轉變為醇之酶(亦即，醇去氫酶或等效醛還原酶)之實例性基因包括編碼C2-C14中鏈醇去氫酶之alrA(Tani等人Appl.Environ.Microbiol.66：5231-5235(2000))、來自啤酒酵母菌之ADH2(Atsumi等人Nature 451：86-89(2008))、來自大腸桿菌之yqhD(其對長於C(3)之分子具有傾向)(Sulzenbacher等人J.Mol.Biol.342：489-502(2004))及來自丙酮丁醇梭菌之bdh I及bdh II(其將丁醛轉變成丁醇)(Walter等人J.Bacteriol.174：7149-7158(1992))。各實例性基因產物之蛋白質序列可使用以下GenBank登記號找到：
展現4-羥基丁酸去氫酶活性之酶(EC 1.1.1.61)亦屬於此類別。此等酶已在富養產鹼菌(Bravo等人J.Forensic Sci.49：379-387(2004))、克氏羧菌(Wolff等人，Protein Expr.Purif.6：206-212(1995))及擬南芥(Breitkreuz等人J.Biol.Chem.278：41552-41556(2003))中表徵。
顯示，來自熱葡糖苷酶地芽孢桿菌M10EXG之adh1基因(Jeon等人，J.Biotechnol.135：127-133(2008))對4-羥基丁醛與丁醛二者展現高活性(參見上文)。因此，此酶展現1,4-丁二醇去氫酶活性。
另一實例性酶係催化3-羥基異丁酸酯至甲基丙二酸酯半醛之可逆氧化的3-羥基異丁酸去氫酶。此酶參與纈胺酸、白胺酸及異白胺酸降解且已在細菌、真核生物及哺乳動物中進行鑑別。由來自嗜熱棲熱菌HB8之P84067編碼之酶已在結構上進行表徵(Lokanath等人J.Mol.Biol.352：905-17(2005))。使用同位素標記之受質證實人類3-羥基異丁酸去氫酶之可逆性(Manning等人，Biochem.J.231：481-484(1985)。編碼此酶之其他基因包括智人(Hawes等人Methods Enzymol.324：218-228(2000))及穴兔(Chowdhury等人Biosci.Biotechnol Biochem.60：2043-2047(1996)；Hawes等人Methods Enzymol.324：218-228(2000))中之3hidh、繡色假單胞菌中之mmsb及戀臭假單胞菌中之dhat(Aberhart等人J Chem.Soc.[Perkin 1]6：1404-1406(1979)；Chowdhury 等人Biosci.Biotechnol Biochem.67：438-441(2003)；Chowdhury等人Biosci.Biotechnol Biochem.60：2043-2047(1996))。
亦已顯示，若干3-羥基異丁酸去氫酶將丙二酸半醛轉變成3-羥基丙酸(3-HP)。三種展現此活性之基因候選物係來自繡色假單胞菌PAO1(62)之mmsB、來自戀臭假單胞菌KT2440之mmsB(Liao等人，美國公開案2005/0221466)及來自戀臭假單胞菌E23之mmsB(Chowdhury等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.60：2043-2047(1996))。亦已在糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)M3A中鑑別出具有3-羥基丁酸去氫酶活性之酶(Gokam等人，美國專利第7,393,676號；Liao等人，美國公開案第2005/0221466號)。來自其他生物體(包括類球紅桿菌)之其他基因候選物可藉由序列相似性推測。
丙二酸半醛轉變為3-HP亦可藉由兩種其他酶達成：依賴NADH之3-羥基丙酸去氫酶及依賴NADPH之丙二酸酯半醛還原酶。認為依賴NADH之3-羥基丙酸去氫酶參與細菌及植物中自丙酸酯之β-丙胺酸生物合成途徑(Rathinasabapathi,J.Plant Pathol.159：671-674(2002)； Stadtman,J.Am.Chem.Soc.77：5765-5766(1955))。迄今尚未將此酶與任一生物體中之基因相關。依賴NADPH之丙二酸酯半醛還原酶催化自營CO2-固定細菌中之逆反應。儘管已在瑟杜生金屬球菌中檢測到該酶活性，但對基因一致性不瞭解(Alber等人J.Bacteriol.188：8551-8559(2006))。
1.1.1.c 氧化還原酶(2步驟，醯基-CoA至醇)。
圖62之步驟S及W繪示可分別形成4-羥基丁酸酯及1,4-丁二醇之雙功能還原酶。將醯基-CoA轉變成醇之實例性2步氧化還原酶包括彼等轉化諸如以下等受質者：乙醯基-CoA至乙醇(例如，來自大腸桿菌之adhE(Kessler等人FEBS.Lett.281：59-63(1991))及丁醯基-CoA至丁醇(例如，來自丙酮丁醇梭菌之adhE2(Fontaine等人J.Bacteriol.184：821-830(2002))。據顯示，丙酮丁醇梭菌adhE2基因將4-羥基丁醯基-CoA轉變成1,4-丁二醇(參見上文)。除將乙醯基-CoA還原成乙醇外，亦已顯示，由腸膜樣明串珠菌中之adhE編碼之酶將支鏈化合物異丁醛氧化成異丁醯基-CoA(Kazahaya等人J.,Gen.Appl.Microbiol.18：43-55(1972)；Koo等人，Biotechnol.Lett.27：505-510(2005))。
另一實例性酶可將丙二醯基-CoA轉變成3-HP。具有此活性之依賴NADPH之酶已在嗜熱光合綠麴菌中進行表徵，其中其參與3-羥基丙酸酯循環(Hugler等人，J.Bacteriol.184：2404-2410(2002)；Strauss及Fuchs,Eur.J.Biochem.215：633-643(1993))。此酶之質量為300kDa，具有高度受質特異性且顯示與其他已知氧化還原酶之微小序列相似性(Hugler等人，J.Bacteriol.184：2404-2410(2002))。已顯示，其 他生物體中之酶皆不催化此特異性反應；然而，有生物資訊學證據表明，其他生物體可具有相似途徑(Klatt等人，Environ.Microbiol.9：2067-2078(2007))。其他生物體(包括凱斯特玫瑰彎菌、赤桿菌NAP1及海洋γ變形菌HTCC2080)中之酶候選物可藉由序列相似性推測。NAP1及海洋γ變形菌HTCC2080可藉由序列相似性推測。
較長鏈醯基-CoA分子可由諸如編碼形成醇之脂肪醯基-CoA還原酶之荷荷巴(蠟黃楊)FAR等酶還原。其在大腸桿菌中之過表現產生FAR活性及脂肪醇累積(Metz等人Plant Physiol.122：635-644(2000))。
1.2.1.b 氧化還原酶(醯基-CoA至醛)。
圖58、62及63之步驟A涉及由形成醛之琥珀醯基-CoA還原酶將琥珀醯基-CoA轉變成琥珀酸半醛。圖62之步驟Q繪示由形成醛之4-羥基丁醯基-CoA還原酶將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛。若干醯基-CoA去氫酶能夠將醯基-CoA還原成其對應醛。編碼此等酶之實例性基因包括編碼脂肪醯基-CoA還原酶之乙酸鈣不動桿菌acr1(Reiser及Somerville，J.Bacteriol.179：2969-2975(1997))、不動桿菌M-1脂肪醯基-CoA還原酶(Ishige等人，Appl.Environ.Microbiol.68：1192-1195(2002))及由克氏羧菌中之sucD基因編碼之CoA依賴性及NADP依賴性之琥珀酸半醛去氫酶(Sohling及Gottschalk，J.Bacteriol.178：871-80(1996)；Sohling及Gottschalk，J.Bacteriol.178：871-880(1996))。牙齦卟啉單胞菌之SucD係另一形成醛之琥珀醯基-CoA還原酶(Takahashi 等人，J.Bacteriol.182：4704-4710(2000))。假單孢菌中之由bphG編碼之醯化乙醛去氫酶係再一酶，此乃因已顯示其氧化並醯化乙醛、丙醛、丁醛、異丁醛及甲醛(Powlowski等人J.Bacteriol.175：377-385(1993))。除將乙醯基-CoA還原成乙醇外，亦已顯示，由腸膜樣明串珠菌中之adhE編碼之酶將支鏈化合物異丁醛氧化成異丁醯基-CoA(Koo等人，Biotechnol.Lett.27：505-510(2005))。丁醛去氫酶在諸如糖乙酸多丁醇梭菌等產溶劑生物體中催化丁醯基-CoA轉變為丁醛之相似反應(Kosaka等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.71：58-68(2007))。
將醯基-CoA轉變成其對應醛之另一醇類型係丙二醯基-CoA還原酶，其將丙二醯基-CoA轉化成丙二酸半醛。丙二醯基-CoA還原酶係嗜熱嗜酸古細菌中羥由3-羥基丙酸酯循環進行自營碳固定中之關鍵酶(Berg等人，Science 318：1782-1786(2007)；Thauer,Science 318：1732-1733(2007))。該酶利用NADPH作為輔因子且已在金屬球菌及硫化葉菌中進行表徵(Alber等人，J.Bacteriol.188：8551-8559(2006)；Hugler等人，J.Bacteriol.184：2404-2410(2002))。該酶係由瑟杜生金屬球菌中之Msed_0709編碼(Alber等人，J.Bacteriol.188：8551-8559(2006)； Berg等人，Science 318：1782-1786(2007))。選殖編碼來自托克達硫化葉菌之丙二醯基-CoA還原酶之基因並使其在大腸桿菌中異源表現(Alber等人，J.Bacteriol.188：8551-8559(2006))。儘管該等酶之醛去氫酶功能與來自嗜熱光合綠麴菌之雙功能去氫酶相似，但幾乎沒有序列相似性。兩種丙二醯基-CoA還原酶候選物皆與天冬胺酸-半醛去氫酶具有高度序列相似性，該酶催化天冬胺醯基-4-磷酸酯至天冬胺酸半醛之還原及同時去磷酸化。其他基因候選物可藉由與其他生物體(包括硫磺礦硫化葉菌及嗜酸熱硫化葉菌)中之蛋白質之序列同源性發現。CoA-醯化醛去氫酶之再一候選物係來自拜氏梭菌之ald基因(Toth等人，Appl.Environ.Microbiol.65：4973-4980(1999))。已報導，此酶將乙醯基-CoA及丁醯基-CoA還原成其對應醛。此基因與編碼鼠傷寒沙門氏菌及大腸桿菌之乙醛去氫酶之eutE極為相似(Toth等人，Appl.Environ.Microbiol.65：4973-4980(1999))。
1.2.1.c 氧化還原酶(2-酮基酸至醯基-CoA，去羧基)。
圖62中之步驟AA繪示5-羥基-2-酮基戊酸轉變為4-羥基丁醯基-CoA。用於此轉化之候選酶包括1)支鏈2-酮酸去氫酶、2)α-酮戊二酸去氫酶及3)丙酮酸去氫酶多酶複合物(PDHC)。該等酶係催化一系列導致2-酮酸醯化氧化去羧之部分反應之多酶複合物。各2-酮酸去氫酶複合物皆佔據中間代謝中之關鍵位置，且酶活性通常受到嚴格調節 (Fries等人Biochemistry 42：6996-7002(2003))。該等酶共有由以下三種催化組份之多拷貝構成之複雜但常見之結構：α-酮酸去羧酶(E1)、二氫硫辛醯胺醯基轉移酶(E2)及二氫硫辛醯胺去氫酶(E3)。生物體中所有2-酮酸去氫酶複合物皆共有E3組份，而E1及E2組份係由不同基因編碼。酶組份以諸多拷貝存在於複合物中且利用多個輔因子經由受質溝道效應催化定向序列反應。該等去氫酶複合物之總體大小極大，其中分子質量介於4百萬Da與1千萬Da之間(亦即，大於核糖體)。
在大腸桿菌中之厭氧性條件下，2-酮酸去氫酶家族中之酶之活性通常較低或有限。增加NADH(或NADPH)之產生可導致氧化還原失衡，且NADH本身用作酶功能抑制劑。改造努力已增加大腸桿菌丙酮酸去氫酶複合物之厭氧活性(Kim等人Appl.Environ.Microbiol.73：1766-1771(2007)；Kim等人J.Bacteriol.190：3851-3858(2008)；Zhou等人Biotechnol.Lett.30：335-342(2008))。例如，NADH之抑制效應可藉由改造E3組份中之H322Y突變來克服(Kim等人J.Bacteriol.190：3851-3858(2008))。對個別組份之結構研究及其如何在複合物中一起作用有助於深刻理解此家族中之酶之催化機制及架構(Aevarsson等人Nat.Struct.Biol.6：785-792(1999)；Zhou等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：14802-14807(2001))。去氫酶複合物之受質特異性在不同生物體中有所不同，但支鏈酮酸去氫酶通常具有最寬之受質範圍。
α-酮戊二酸去氫酶(AKGD)將α-酮戊二酸酯轉變成琥珀醯基-CoA且係經過TCA循環之代謝通量之主要控制位點(Hansford,R.G.Curr.Top.Bioenerg.10：217-278(1980))。由大腸桿菌中之基因sucA、sucB及lpd編碼之AKGD基因表現在厭氧性條件下且在葡萄糖上生長期間下調(Park等人Mol.Microbiol.15：473-482(1995))。儘管AKGD之受質範圍較窄，但對E2組份之催化核心之結構研究準確找到負責受質特 異性之特定殘基(Knapp等人J.Mol.Biol.280：655-668(1998))。由odhAB(E1及E2)及pdhD(E3，共有結構域)編碼之枯草芽孢桿菌AKGD係在轉錄層面上調節，且依賴於碳源及生物體之生長階段(Resnekov等人Mol.Gen.Genet.234：285-296(1992))。在酵母菌中，編碼E3組份之LPD1基因係在轉錄層面上由葡萄糖調節(Roy及Dawes J.Gen.Microbiol.133：925-933(1987))。由KGD1編碼之E1組份亦係由葡萄糖調節且由HAP2與HAP3之產物活化(Repetto及Tzagoloff Mol.Cell Biol.9：2695-2705(1989))。已在哺乳動物系統中對受副產物NADH及琥珀醯基-CoA抑制之AKGD酶複合物進行充分研究，此乃因已將受損功能與若干神經疾病關聯(Tretter及dam-Vizi Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci.360：2335-2345(2005))。
支鏈2-酮酸去氫酶複合物(BCKAD)(亦稱作2-酮基異戊酸去氫酶)參與支鏈胺基酸降解途徑，將纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之2-酮酸衍生物轉變成其醯基-CoA衍生物及CO2。已在許多生物體中研究該複合物，該等生物體包括枯草芽孢桿菌(Wang等人Eur.J.Biochem.213：1091-1099(1993))、褐鼠(Namba等人J.Biol.Chem.244：4437-4447(1969))及戀臭假單胞菌(Sokatch J.Bacteriol.148：647-652(1981))。在 枯草芽孢桿菌中，該酶係由基因pdhD(E3組份)、bfmBB(E2組份)、bfnBAA及bfmBAB(E1組份)編碼(Wang等人Eur.J.Biochem.213：1091-1099(1993))。在哺乳動物中，該複合物係藉由特定磷酸酶及蛋白質激酶磷酸化來調節。已在大鼠肝細胞中研究該複合物(Chicco等人J.Biol.Chem.269：19427-19434(1994))且其係由基因Bckdha(E1 α)、Bckdhb(E1β)、Dbt(E2)及Dld(E3)編碼。已結晶出戀臭假單胞菌BCKAD複合物之E1及E3組份(Aevarsson等人Nat.Struct.Biol.6：785-792(1999)；Mattevi Science 255：1544-1550(1992))且已對酶複合物進行研究(Sokatch等人J.Bacteriol.148：647-652(1981))。戀臭假單胞菌BCKAD基因之轉錄係由bkdR之基因產物活化(Hester等人Eur.J.Biochem.233：828-836(1995))。在包括褐鼠(Paxton等人Biochem.J.234：295-303(1986))及啤酒酵母菌(Sinclair等人Biochem.Mol.Biol.Int.31：911-922(1993))在內之一些生物體中，已顯示，此複合物具有寬受質範圍，該範圍除包括支鏈胺基酸前體以外，亦包括諸如2-酮基丁酸酯及α-酮戊二酸酯等線性氧代酸。牛BCKAD之活性位點經改造以偏好替代受質乙醯基-CoA(Meng及Chuang，Biochemistry 33：12879-12885(1994))。
亦已深入研究催化丙酮酸酯轉變為乙醯基-CoA之丙酮酸去氫酶複合物。在大腸桿菌酶中，E1組份中之特定殘基負責受質特異性(Bisswanger,H.J Biol Chem.256：815-822(1981)；Bremer,J.Eur.J Biochem.8：535-540(1969)；Gong等人J Biol Chem.275：13645-13653(2000))。如先前所述，酶改造努力已改良厭氧性條件下之大腸桿菌PDH酶活性(Kim等人Appl.Environ.Microbiol.73：1766-1771(2007)；Kim J.Bacteriol.190：3851-3858(2008)；Zhou等人Biotechnol.Lett.30：335-342(2008))。與大腸桿菌PDH不同，枯草芽胞桿菌複合物在厭氧性條件下具有活性且係生長所需(NakanoJ.Bacteriol.179：6749-6755(1997))。在甘油上生長期間表徵之肺炎克雷伯氏菌PDH亦在厭氧性條件下具有活性(Menzel等人J.Biotechnol.56：135-142(1997))。可獲得來自牛腎之酶複合物(Zhou等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：14802-14807(2001))及來自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)之E2催化結構域(Mattevi等人Science 255：1544-1550(1992))之晶體結構。Science 255：1544-1550(1992))。一些哺乳動物PDH酶複合物可對諸如2-酮基丁酸酯等替代受質起反應，但褐鼠PDH及BCKAD之比較動力學指示，BCKAD對作為受質之2-酮基丁酸酯具有更高活性(Paxton等人Biochem.J.234：295-303(1986))。
作為上述大的多酶2-酮酸去氫酶複合物之替代，一些厭氧生物體利用2-酮酸氧化還原酶家族(OFOR)中之酶來催化2-酮酸之醯化氧化去羧。與去氫酶複合物不同，該等酶含有鐵-硫簇，利用不同輔因子，且使用鐵氧化還原蛋白或黃素氧化還原蛋白作為電子受體替代NAD(P)H。儘管此家族中之多數酶特異性對丙酮酸酯作為受質(POR)，但已顯示，一些2-酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶接受寬範圍之2-酮酸作為受質，包括α-酮戊二酸酯及2-酮基丁酸酯(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2002)；Zhang等人J.Biochem.120：587-599(1996))。一種此類酶係來自嗜熱嗜酸古菌托克達硫化葉菌7之OFOR，其含有由基因ST2300編碼之α及β次單元(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2002)；Zhang等人J.Biochem.120：587-599(1996))。已研發基於質粒之表現系統用於在大腸桿菌中有效表現此蛋白質(Fukuda等人Eur.J.Biochem.268：5639-5646(2001))並測定參與受質特異性之殘基(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2002))。最近已亦將兩種來自敏捷氣熱菌菌株K1之OFOR選殖至大腸桿菌中，進行表徵，且發現其與寬範圍之2-酮基酸反應(Nishizawa等人FEBS Lett.579：2319-2322(2005))。可獲得該等OFOR候選物之基因序列，但迄今尚未對其指配 GenBank標識符。有生物資訊學證據表明，在所有古菌、一些厭氧細菌及粒線體真核生物中存在相似酶(Fukuda及Wakagi Biochim.Biophys.Acta 1597：74-80(2005))。此類酶自能量角度亦引人關注，此乃因可使用經還原鐵氧化還原蛋白藉由鐵氧化還原蛋白-NAD還原酶生成NADH(Petitdemange等人Biochim.Biophys.Acta 421：334-337(1976))。此外，由於多數酶經設計以在厭氧條件下作用，因此對於厭氧環境中之活性而言，可能相對於2-酮酸去氫酶複合物家族中之酶需要更少酶改造。
1.2.1.d 氧化還原酶(膦酸鹽還原酶)。
4-羥基丁醯基磷酸酯轉變為4-羥基丁醛可藉由EC類別1.2.1中之氧化還原酶催化。天冬胺酸半醛去氫酶(ASD,EC 1.2.1.11)催化4-天冬胺醯基磷酸酯至天冬胺酸酯-4-半醛之依賴NADPH之還原。ASD參與胺基酸生物合成且最近已作為抗微生物靶進行研究(Hadfield等人，Biochemistry 40：14475-14483(2001)。已對大腸桿菌ASD結構進行解析(Hadfield等人，J.Mol.Biol.289：991-1002(1999))且已顯示，該酶接受替代受質β-3-甲基天冬胺醯基磷酸酯(Shames等人，J.Biol.Chem.259：15331-15339(1984))。流感嗜血桿菌酶已成為改變活性位點之受質結合親和力之酶改造研究的主題(Blanco等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60：1388-1395(2004)；Blanco等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60：1808-1815(2004))。在結核分枝桿菌(Shafiani等人，J.Appl.Microbiol.98：832-838(2005)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Faehnle等人，J.Mol.Biol.353：1055-1068(2005))及傳染性微生物霍亂弧菌及幽門螺旋桿菌(Moore等人，Protein Expr.Purif.25：189-194(2002))中發現其他ASD候選物。相關酶候選物 係在啤酒酵母菌(Pauwels等人，Eur.J.Biochem.270：1014-1024(2003)、枯草芽胞桿菌(O'Reilly及Devine，Microbiology 140(Pt 5)：1023-1025(1994))及其他生物體中發現之乙醯基麩胺醯基磷酸還原酶(EC 1.2.1.38)，該酶將乙醯基麩胺醯基磷酸酯天然還原成乙醯基麩胺酸酯-5-半醛。
此類別中發現之其他實例性酶包括將甘油醛-3-磷酸酯轉變成D-甘油酸酯1,3-雙磷酸酯之甘油醛3-磷酸去氫酶(例如，大腸桿菌gapA(Branlant及Branlant，Eur.J.Biochem.150：61-66(1985))、將N-乙醯基-L-麩胺酸酯-5-半醛轉變成N-乙醯基-L-麩胺醯基-5-磷酸酯之N-乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶(例如，大腸桿菌argC(Parsot等人，Gene 68：275-283(1988))及將L-麩胺酸酯-5-半醛轉變成L-麩胺醯基-5-磷酸酯之麩胺酸-5-半醛去氫酶(例如，大腸桿菌proA(Smith等人，J.Bacteriol.157：545-551(1984))。在大腸桿菌中選殖並表現編碼來自鼠傷寒沙門氏菌(Mahan及Csonka，J.Bacteriol.156：1249-1262(1983))及空腸曲桿菌(Louie及Chan，Mol.Gen.Genet.240：29-35(1993))之麩胺酸-5-半醛去氫酶之基因。
1.2.1.e 酸還原酶.
圖58、62及63中之若干步驟繪示由酸還原酶將未經活化之酸轉變成醛。該等分別包括4-羥基丁酸酯、琥珀酸酯、α-酮戊二酸酯及4-胺基丁酸酯轉變為4-羥基丁醛琥珀酸半醛、2,5-二酮基戊酸酯及4-胺基丁醛。一種顯著之羧酸還原酶可在伊文思奴卡菌中發現，其催化羧酸至其對應醛之依賴鎂、ATP及NADPH之還原(Venkitasubramanian等人，J.Biol.Chem.282：478-485(2007))。此酶係由car基因編碼且使其在大腸桿菌中選殖並進行功能表現(Venkitasubramanian等人，J.Biol.Chem.282：478-485(2007))。npt基因產物之表現經由轉錄後修飾改良酶之活性。npt基因編碼將無活性去輔基酶轉變成活性全酶之特異性磷酸泛醯巰基乙胺轉移酶(PPTase)。此酶之天然受質係香草酸，且該酶展現對芳香族及脂肪族受質之廣泛接受性(Venkitasubramanian等人，Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industires，R.N.Patel編輯，第15章，第425-440頁，CRC Press LLC,Boca Raton,FL.(2006))。
可基於序列同源性鑑別其他car及npt基因。
在灰色鏈黴菌中發現之另一酶候選物係由griC及griD基因編碼。 相信此酶將3-胺基-4-羥基苯甲酸轉變成3-胺基-4-羥基苯甲酸代謝之分路產物3-胺基-4-羥基苯甲醛，此乃因缺失griC或griD導致細胞外3-乙醯基胺基-4-羥基苯甲酸累積(Suzuki等人，J.Antibiot.60(6)：380-387(2007))。griC及griD與SGR_665(序列與伊文思奴卡菌npt相似之酶)共表現可能有益。
具有相似特性之酶α-胺基己二酸酯還原酶(AAR,EC 1.2.1.31)參與一些真菌物種中之離胺酸生物合成途徑。此酶天然將α-胺基己二酸酯還原成α-胺基己二酸酯半醛。羧基首先經由腺苷酸酯之依賴ATP之形成來活化，其隨後由NAD(P)H還原，生成醛及AMP。與CAR一樣，此酶利用鎂且需要由PPTase活化。在啤酒酵母菌(Morris等人，Gene 98：141-145(1991))、白色假絲酵母菌(Guo等人，Mol.Genet.Genomics 269：271-279(2003))及粟酒裂殖酵母菌(Ford等人，Curr.Genet.28：131-137(1995))中發現AAR之酶候選物及其對應PPTase。當在大腸桿菌中表現時，來自粟酒裂殖酵母菌之AAR展現顯著活性(Guo等人，Yeast 21：1279-1288(2004))。來自產黃青黴之AAR接受S-羧基甲基-L-半胱胺酸作為替代受質，但不與己二酸酯、L-麩胺酸酯或二胺基庚二酸酯反應(Hijarrubia等人，J.Biol.Chem.278：8250-8256(2003))。迄今尚未鑑別編碼產黃青黴PPTase之基因。
1.4.1.a 氧化還原酶(胺化)。
麩胺酸去氫酶(步驟J，圖62及63)、4-胺基丁酸去氫酶(步驟M， 圖62及63)、腐胺去氫酶(步驟D，圖63)、5-胺基-2-酮基戊酸去氫酶(步驟P，圖63)及鳥胺酸去氫酶(步驟S，圖63)可由胺化氧化還原酶催化。此EC類別中之酶以NAD+或NADP+作為受體催化氧化α-胺基酸之去胺，且反應通常可逆。作用於胺基酸之實例性氧化還原酶包括由gdhA編碼之麩胺酸去氫酶(去胺)、由ldh編碼之白胺酸去氫酶(去按)及由nadX編碼之天冬胺酸去氫酶(去胺)。來自大腸桿菌之gdhA基因產物(Korber等人，J.Mol.Biol.234：1270-1273(1993)；McPherson及Wootton，Nucleic.Acids Res.11：5257-5266(1983))、來自海棲熱袍菌之gdh(Kort等人，Extremophiles 1：52-60(1997)；Lebbink等人J.Mol.Biol.280：287-296(1998)；Lebbink等人J.Mol.Biol.289：357-369(1999))及來自嗜鹽桿菌之gdhA1(Ingoldsby等人，Gene 349：237-244(2005))催化麩胺酸酯至2-酮基戊二酸酯及氨之可逆互變，同時分別偏好NADP(H)、NAD(H)或二者。仙人掌芽孢桿菌之ldh基因編碼具有寬範圍受質之LeuDH蛋白質，該等受質包括白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及2-胺基丁酸酯(Ansorge及Kula，Biotechnol.Bioeng.68：557-562(2000)；Stoyan等人J.Biotechnol.54：77-80(1997))。來自海棲熱袍菌之編碼天冬胺酸去氫酶之nadX基因參與NAD之生物合成(Yang等人，J.Biol.Chem.278：8804-8808(2003))。
在枯草芽孢桿菌、菸草(Purnell等人，Planta 222：167-180(2005))、水稻(Abiko等人，Plant Cell Physiol.46：1724-1734(2005))、 地中海極嗜酯菌(Diaz等人，Extremophiles 10：105-115(2006))及嗜鹽桿菌(Hayden等人，FEMS Microbiol.Lett.211：37-41(2002))中發現其他麩胺酸去氫酶基因候選物(Khan等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.69：1861-1870(2005))。菸草酶係由gdh1及gdh2編碼之α及β次單元構成(Purnell等人，Planta 222：167-180(2005))。發現，依賴NADH之麩胺酸去氫酶之過表現改良啤酒酵母菌之經改造菌株中之乙醇產生(Roca等人，Appl.Environ.Microbiol.69：4732-4736(2003))。
用於催化醛轉變為其相應一級胺之實例性酶係由lysDH基因編碼之離胺酸6-去氫酶(EC 1.4.1.18)。由lysDH基因編碼之離胺酸6-去氫酶(去胺)催化L-離胺酸之ε-胺基之氧化去胺基以形成2-胺基己二酸酯-6-半醛，該半醛進而以非酶促方式環化以形成△1-六氫吡啶-6-羧酸酯(Misono及Nagasaki，J.Bacteriol.150：398-401(1982))。來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌之lysDH基因編碼依賴NAD之嗜熱性離胺酸6-去氫酶(Heydari等人，Appl.Environ.Microbiol 70：937-942(2004))。經由來自基因組計劃之同源性鑑別來自敏捷氣熱菌K1之lysDH基因。可在根癌土壤桿菌(Hashimoto等人，J.Biochem.106：76-80(1989)；Misono及Nagasaki，J.Bacteriol.150：398-401(1982))及反硝化無色桿菌(Ruldeekulthamrong等人，BMB.Rep.41：790-795(2008))中發現其他酶。
將3-酮基酸轉變成3-胺基酸之酶係3,5-二胺基己酸酯去氫酶(EC 1.4.1.11)，該酶在使離胺酸發酵之生物體中發現。最近在具核梭桿菌中鑑別出編碼此酶之基因kdd(Kreimeyer等人，J.Biol.Chem.282：7191-7197(2007))。該酶已在其他生物體中進行純化並表徵(Baker等人，J.Biol.Chem.247：7724-7734(1972)；Baker及van der Drift，Biochemistry 13：292-299(1974))，但不瞭解與該等酶相關之基因。黃色黏球菌、牙齦卟啉單胞菌W83及其他經定序生物體中之候選物可藉由序列同源性推測。
2.3.1.a 醯基轉移酶(轉移磷酸酯基至CoA).
圖62之步驟P繪示4-羥基丁醯基-CoA至4-羥基丁醯基-Pi之轉化。實例性磷酸酯轉移性醯基轉移酶包括由pta編碼之磷酸轉乙醯基酶及由ptb編碼之磷酸轉丁醯基酶。來自大腸桿菌之pta基因編碼可將乙醯基-CoA轉變成乙醯基-磷酸酯之酶，且反之亦然(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta 191：559-569(1969))。此酶亦可利用丙醯基-CoA代替乙醯基-CoA在此製程中形成丙酸酯(Hesslinger等人，Mol.Microbiol.27：477-492(1998))。相似地，來自丙酮丁醇梭菌之ptb基因編碼可將丁醯基-CoA轉變成丁醯基-磷酸酯之酶(Walter等人，Gene 134：107-111(1993))；Huang等人，J Mol.Microbiol.Biotechno.l 2：33-38(2000)。 其他ptb基因可在丁酸產生菌L2-50(Louis等人，J.Bacteriol.186：2099-2106(2004))及巨大芽孢桿菌(Vazquez等人，Curr.Microbiol.42：345-349(2001))中發現。
2.6.1. 胺基轉移酶.
胺基轉移酶將醛或酮可逆地轉變成胺基。常見胺基供體/受體組合包括麩胺酸酯/α-酮戊二酸酯、丙胺酸/丙酮酸酯及天冬胺酸酯/草醯乙酸酯。已顯示，若干酶將醛轉變成一級胺，且反之亦然，例如4-胺基丁酸酯、腐胺及5-胺基-2-酮基戊酸酯。該等酶尤其非常適於實施以下轉化：圖62及63中之步驟N，圖63中之步驟E及Q。離胺酸-6-胺基轉移酶(EC 2.6.1.36)係一種能夠形成一級胺之實例性酶。已在酵母菌及細菌中證實此酶將離胺酸轉變成α-胺基己二酸酯半醛之功能。已對來自高蛋白假絲酵母菌(Candida utilis)(Hammer及Bode，J.Basic Microbiol.32：21-27(1992))、泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)(Fujii等人，J.Biochem.128：391-397(2000))及棒狀鏈黴菌(Romero等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.18：241-246(1997))之候選物進行表徵。使來自棒狀鏈黴菌之重組離胺酸-6-胺基轉移酶在大腸桿菌中進行功能表現(Tobin等人，J.Bacteriol.173：6223-6229(1991))。泥色黃桿菌酶對作為胺基受體之α-酮戊二酸酯具有特異性(Soda及Misono，Biochemistry 7：4110-4119(1968))。將醛轉變成末端胺之其他酶包括鮑氏不動桿菌中編碼2,4-二胺基丁酸酯：2-酮戊二酸酯4-轉胺酶之dat基因產物(Ikai及Yamamoto，J.Bacteriol.179：5118-5125 (1997))。除其天然受質外，2,4-二胺基丁酸酯(DAT)亦促進離胺酸、4-胺基丁酸酯及鳥胺酸之末端胺之轉胺。
醛轉變為末端胺亦可藉由γ-胺基丁酸轉胺酶(GABA轉胺酶或4-胺基丁酸轉胺酶)催化。此酶使琥珀酸半醛及麩胺酸酯天然互變成4-胺基丁酸酯及α-酮戊二酸酯且已知其具有寬受質範圍(Liu等人，Biochemistry 43：10896-10905 2004)；Schulz等人，Appl.Environ.Microbiol.56：1-6(1990))。大腸桿菌中之兩種GABA轉胺酶係由gabT(Bartsch等人，J.Bacteriol.172：7035-7042(1990))及puuE(Kurihara等人，J.Biol.Chem.280：4602-4608.(2005))編碼。已顯示，家鼷鼠、螢光假單胞菌及野豬中之GABA轉胺酶與一範圍之替代受質(包括6-胺基己酸)反應(Cooper,Methods Enzymol.113：80-82(1985)；Scott及Jakoby，J.Biol.Chem.234：932-936(1959))。
用於使醛及一級胺互變之其他酶候選物係腐胺轉胺酶或其他二胺胺基轉移酶。大腸桿菌腐胺胺基轉移酶係由ygjG基因編碼，且經純化酶亦能夠促進屍胺及精脒轉胺(Samsonova等人，BMC Microbiol.3：2(2003))。另外，此酶對1,7-二胺基庚烷及對除2-酮基戊二酸酯以外之胺基受體(例如，丙酮酸酯、2-酮基丁酸酯)之活性已有報導(Kim, J.Biol.Chem.239：783-786(1964)；Samsonova等人，BMC Microbiol.3：2(2003))。對作為胺基受體之丙酮酸酯之活性高於對α-酮戊二酸酯之活性的腐胺胺基轉移酶係繡色假單胞菌之spuC基因(Lu等人，J.Bacteriol.184：3765-3773(2002))。
促進3-酮基酸轉胺之酶包括GABA胺基轉移酶(如上文所述)、β-丙胺酸/α-酮戊二酸酯胺基轉移酶及3-胺基-2-甲基丙酸酯胺基轉移酶。β-丙胺酸/α-酮戊二酸酯胺基轉移酶(WO08027742)與β-丙胺酸反應，形成丙二酸半醛3-酮基酸。據顯示，克氏酵母菌中之SkPYD4之基因產物優先使用β-丙胺酸作為胺基供體(Andersen及Hansen，Gene 124：105-109(1993))。SkUGA1編碼啤酒酵母菌GABA胺基轉移酶UGA1之同源物(Ramos等人，Eur.J.Biochem.149：401-404(1985))，而SkPYD4編碼參與β-丙胺酸與GABA轉胺二者之酶(Andersen及Hansen，Gene 124：105-109(1993))。3-胺基-2-甲基丙酸酯轉胺酶催化自甲基丙二酸酯半酵至3-胺基-2-甲基丙酸酯之轉化。該酶已在褐鼠及野豬中進行表徵且係由Abat編碼(Kakimoto等人，Biochim.Biophys.Acta 156：374-380(1968)；Tamaki等人，Methods Enzymol.324：376-389(2000))。
若干胺基轉移酶促進胺基酸之胺基轉胺以形成2-酮基酸。天冬胺 酸酯胺基轉移酶係將側氧基自草醯乙酸酯天然轉移至麩胺酸酯從而形成α-酮戊二酸酯及天冬胺酸酯之酶。天冬胺酸酯在結構上與OHED及2-AHD相似。天冬胺酸酯胺基轉移酶活性係由(例如)以下基因之基因產物催化：來自大腸桿菌之aspC之基因產物(Yagi等人，FEBS Lett.100：81-84(1979)；Yagi等人，Methods Enzymol.113：83-89(1985))、來自啤酒酵母菌之AAT2(Yagi等人，J.Biochem.92：35-43(1982))及來自擬南芥之ASP5(de la Torre等人，Plant J.46：414-425(2006)；Kwok及Hanson.J.Exp.Bot.55：595-604(2004)；Wilkie及Warren，Protein Expr.Purif.12：381-389(1998))。已顯示，來自褐鼠之酶促進諸如2-胺基己烷二元酸及2,4-二胺基丁酸等替代受質轉胺(Recasens等人，Biochemistry 19：4583-4589(1980))。作用於其他胺基酸受質之胺基轉移酶亦能夠催化此轉化。纈胺酸胺基轉移酶催化纈胺酸及丙酮酸酯轉變為2-酮異戊酸酯及丙胺酸。大腸桿菌基因avtA編碼一種此類酶(Whalen及Berg，J.Bacteriol.150：739-746(1982))。此基因產物亦催化α-酮丁酸酯之轉胺以生成α-胺基丁酸酯，但尚未鑑別出此反應中之胺供體(Whalen及Berg，J.Bacteriol.158：571-574 1984))。大腸桿菌serC之基因產物催化兩種反應，即磷酸絲胺酸胺基轉移酶及磷酸羥基蘇胺酸胺基轉移酶(Lam及Winkler，J.Bacteriol.172：6518-6528(1990))，且不能檢測到對非磷酸化受質之活性(Drewke等人，FEBS.Lett.390：179-182(1996))。
另一酶候選物係α-胺基己二酸酯胺基轉移酶(EC 2.6.1.39)，該酶參與一些生物體中之離胺酸生物合成及降解。此酶使用α-酮戊二酸酯作為胺基受體使2-胺基己二酸酯及2-酮基己二酸酯互變。在智人(Okuno等人，Enzyme Protein47：136-148(1993))及嗜熱棲熱菌(Miyazaki等人，Microbiology 150：2327-2334(2004))中發現基因候選物。由lysN編碼之嗜熱棲熱菌酶對若干替代受質(包括草醯乙酸酯、2-酮基異己酸酯、2-酮基異戊酸酯及2-酮基-3-甲基戊酸酯)具有活性。
2.7.2.a 磷酸轉移酶(羧基受體).
EC類別2.7.2中之磷酸轉移酶將羧酸轉化成膦酸，同時水解一個ATP。圖62之步驟O涉及藉由此一酶將4-羥基丁酸酯轉變成4-羥基丁醯基磷酸酯。丁酸激酶(EC 2.7.2.7)在丙酮丁醇梭菌產酸期間實施丁醯基-磷酸酯至丁酸酯之可逆轉變(Cary等人，Appl.Environ.Microbiol.56：1576-1583(1990))。此酶係由兩種buk基因產物中之任一者編碼(Huang等人，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2：33-38(2000))。在丁酸梭菌(C.butyricum)及假破傷風梭菌(Twarog及Wolfe，J.Bacteriol.86：112-117(1963))中發現其他丁酸激酶。亦已在大腸桿菌中表現來自海棲熱袍菌之相關酶異丁酸激酶並進行結晶(Diao等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59：1100-1102(2003)；Diao及Hasson，J.Bacteriol.191：2521-2529(2009))。天冬胺酸激酶催化天冬胺酸酯之依賴ATP之磷酸化且參與若干胺基酸之合成。大腸桿菌中由lysC編碼之天冬胺酸激酶III酶具有寬受質範圍，且已闡明參與受質特異性之催化殘基(Keng及Viola，Arch.Biochem.Biophys.335：73-81(1996))。大腸桿菌中之兩種以下其他激酶亦係良好候選物：乙酸激酶 及γ-麩胺醯基激酶。由ackA編碼之大腸桿菌乙酸激酶(Skarstedt及Silverstein，J.Biol.Chem.251：6775-6783(1976))除將乙酸酯磷酸化外亦將丙酸酯磷酸化(Hesslinger等人，Mol.Microbiol.27：477-492(1998))。由proB編碼之大腸桿菌γ-麩胺醯基激酶(Smith等人，J.Bacteriol.157：545-551(1984))將麩胺酸酯之γ碳酸基磷酸化。
乙醯基麩胺酸酯激酶在精胺酸生物合成期間將乙醯基化麩胺酸酯磷酸化。已知此酶不接受替代受質；然而，已藉由定點誘變闡明參與受質結合及磷酸化之大腸桿菌酶之若干殘基(Marco-Marin等人，J.Mol.Biol.334：459-476(2003)；Ramon-Maiques等人，Structure 10：329-342(2002))。該酶係由枯草芽孢桿菌及大腸桿菌中之argB(Parsot等人，Gene 68：275-283(1988))及啤酒酵母菌中之ARG5,6(Pauwels等人，Eur.J.Biochem.270：1014-1024(2003))編碼。啤酒酵母菌之ARG5,6基因編碼聚蛋白質前體，該前體在粒線體基質中成熟而成為乙醯基麩胺酸酯激酶及乙醯基麩胺醯基磷酸還原酶。
2.8.3.a CoA轉移酶.
已顯示，克氏羧菌之cat1、cat2及cat3之基因產物分別展現琥珀 醯基-CoA(步驟G，圖62及63)、4-羥基丁醯基-CoA(步驟T，圖62)及丁醯基-CoA乙醯基轉移酶活性(Seedorf等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：2128-2133(2008)；Sohling及Gottschalk，J Bacteriol 178：871-880(1996))。相似CoA轉移酶活性亦存在於陰道滴蟲(van Grinsven等人，J.Biol.Chem.283：1411-1418(2008))及布魯氏錐蟲(Riviere等人，J.Biol.Chem.279：45337-45346(2004))中。
可用於此類型轉化之酶係醯基-CoA：乙酸-CoA轉移酶，亦稱作乙酸-CoA轉移酶(EC 2.8.3.8)，已顯示，其將CoA部分自多種具支鏈及直鏈醯基-CoA受質轉移至乙酸酯，該等受質包括異丁酸酯(Matthies及Schink，Appl.Environ.Microbiol.58：1435-1439(1992))、戊酸酯(Vanderwinkel等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.33：902-908(1968))及丁酸酯(Vanderwinkel，見上文(1968))。此酶係由大腸桿菌K12中之atoA(α次單元)及atoD(β次單元)編碼(Korolev等人，Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58：2116-2121(2002)；Vanderwinkel，見上文(1968))。相似酶存在於麩胺酸棒桿菌ATCC 13032(Duncan等人，Appl.Environ.Microbiol.68：5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人，Appl.Environ.Microbiol.56：1576-1583(1990)；Wiesenborn等人，Appl.Environ.Microbiol.55：323-329(1989))及糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.71：58-68(2007))中。
來自厭氧細菌發酵胺基酸球菌之戊烯二酸-CoA-轉移酶(EC 2.8.3.12)與二酸戊烯二醯基-CoA及3-丁烯醯基-CoA反應(Mack及Buckel，FEBS Lett.405：209-212(1997))。編碼此酶之基因係gctA及gctB。此酶對其他CoA衍生物具有降低但可檢測之活性，其他CoA衍生物包括戊二醯基-CoA、2-羥基戊二醯基-CoA、己二醯基-CoA及丙烯醯基-CoA(Buckel等人，Eur.J.Biochem.118：315-321(1981))。已在大腸桿菌中選殖並表現該酶(Mac等人，Eur.J.Biochem.226：41-51(1994))。
3.1.2.a CoA水解酶.
3.1.2家族中之酶將醯基-CoA分子水解成其對應酸。然而，若偶合至諸如質子幫浦或直接ATP水解等能量來源，則此等酶可經遺傳修飾以賦予CoA-連接酶或合成酶功能。若干真核乙醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)具有廣泛受質特異性。例如，來自褐鼠腦之酶(Robinson等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.71：959-965(1976))可與丁醯基-CoA、己醯基-CoA及丙二醯基-CoA反應。儘管來自豌豆葉之粒線體之酶之序列尚未報導，但其亦具有廣泛受質特異性，對乙醯基- CoA、丙醯基-CoA、丁醯基-CoA、棕櫚醯基-CoA、油醯基-CoA、琥珀醯基-CoA及巴豆醯基-CoA顯示活性(Zeiher及Randall，Plant.Physiol.94：20-27(1990))。來自啤酒酵母菌之乙醯基-CoA水解酶ACH1代表另一候選物水解酶(Buu等人，J.Biol.Chem.278：17203-17209(2003))。
另一候選物水解酶係對戊二醯基-CoA、己二醯基-CoA、環庚基-CoA、癸二醯基-CoA及十二烷二醯基-CoA展現活性之人類二羧酸硫酯酶acot8(Westin等人，J.Biol.Chem.280：38125-38132(2005))及亦可水解寬範圍之CoA硫酯之最近大腸桿菌同源物tesB(Naggert等人，J.Biol.Chem.266：11044-11050(1991))。相似酶亦已在大鼠肝中進行表徵(Deana,Biochem.Int.26：767-773(1992))。其他潛在大腸桿菌硫酯水解酶包括以下基因之基因產物：tesA(Bonner及Bloch，J.Biol.Chem.247：3123-3133(1972))、ybgC(Kuznetsova等人，FEMS Microbiol.Rev.29：263-279(2005)；Zhuang等人，FEBS Lett.516：161-163(2002))、paaI(Song等人，J.Biol.Chem.281：11028-11038(2006))及ybdB(Leduc等人，J.Bacteriol.189：7112-7126(2007))。
再一候選物水解酶係來自發酵胺基酸球菌之戊烯二酸CoA-轉移酶。藉由定點誘變將此酶轉化成對戊二醯基-CoA乙醯基-CoA及3-丁烯醯基-CoA具有活性之醯基-CoA水解酶(Mack及Buckel,FEBS Lett.405：209-212(1997))。此指示，編碼琥珀醯基-CoA：3-酮酸-CoA轉移酶及乙醯乙醯基-CoA：乙醯基-CoA轉移酶之酶亦可用作用於此反應步驟中之候選物，但可能會需要某些突變來改變其功能。
其他水解酶包括3-羥基異丁醯基-CoA水解酶，已闡述其在纈胺酸降解期間將3-羥基異丁醯基-CoA有效地催化轉變成3-羥基異丁酸酯(Shimomura等人，J.Biol.Chem.269：14248-14253(1994))。編碼此酶之基因包括褐鼠(Shimomura等人，見上文(1994)；Shimomura等人，Methods Enzymol.324：229-240(2000))及智人(Shimomura等人，見上文(1994)之hibch。藉由序列同源性確定之候選基因包括啤酒酵母菌之hibch及仙人掌芽孢桿菌之BC_2292。
4.1.1.a 羧基-裂解酶.
α-酮酸之去羧。α-酮戊二酸去羧酶(步驟B，圖58、62及63)、5-羥基-2-酮基戊酸去羧酶(步驟Z，圖62)及5-胺基-2-酮基戊酸去羧酶(步驟R，圖63)全部參與α-酮酸之去羧。酮酸之去羧係由具有不同受質特異性之多種酶催化，包括丙酮酸酯去羧酶(EC 4.1.1.1)、苯甲醯基甲酸酯去羧酶(EC 4.1.1.7)、α-酮戊二酸去羧酶及支鏈α-酮酸去羧酶。
丙酮酸酯去羧酶(PDC)(亦稱為酮酸去羧酶)係醇發酵中之關鍵酶，催化丙酮酸酯去羧成乙醛。自啤酒酵母菌之酶對包括2-酮丁酸酯、2-酮戊酸酯、3-羥基丙酮酸酯及2-苯基丙酮酸酯在內之脂肪族2-酮酸具有廣泛受質範圍(Davie等人，J.Biol.Chem.267：16601-16606(1992))。已對此酶進行深入研究，針對其經改變活性進行改造，且使其在大腸桿菌中進行功能表現(Killenberg-Jabs等人，Eur.J.Biochem.268：1698-1704(2001)；Li及Jordan，Biochemistry 38：10004-10012(1999)；ter Schure等人，Appl.Environ.Microbiol.64：1303-1307(1998))。由pdc編碼之來自運動發酵單胞菌之PDC亦具有寬受質範圍且已成為改變對不同受質之親和力之定向改造研究之主題(Siegert等人，Protein Eng.Des.Sel.18：345-357(2005))。可獲得此酶之晶體結構(Killenberg-Jabs等人，Eur.J.Biochem.268：1698-1704(2001))。其他經充分表徵之PDC候選物包括來自巴斯德醋酸桿菌(Chandra等人，Arch.Microbiol.176：443-451(2001))及乳酸克氏酵母菌(Krieger等人，Eur.J.Biochem.269：3256-3263(2002))之酶。
與PDC一樣，苯甲醯基甲酸酯去羧酶(EC 4.1.1.7)具有寬受質範圍且已成為酶改造研究之目標。已對來自戀臭假單胞菌之酶進行深入研究，且可獲得此酶之晶體結構(Hasson等人，Biochemistry 37：9918-9930(1998)；Polovnikova等人，Biochemistry 42：1820-1830(2003))。戀臭假單胞菌酶之活性位點中兩個殘基之定點誘變改變對天然及非天然受質之親和力(Km)(Siegert等人，Protein Eng.Des.Sel.18：345-357 (2005))。此酶之性質已藉由定向改造進一步修改(Lingen等人，Protein Eng.15：585-593(2002)；Lingen等人，Chembiochem.4：721-726(2003))。由mdlC編碼之來自繡色假單胞菌之酶亦已以實驗方式進行表徵(Barrowman等人，FEMS Microbiol.Lett.34：57-60(1986))。來自施氏假單胞菌、螢光假單胞菌及其他生物體之其他基因候選物可藉由序列同源性推測或使用在戀臭假單胞菌中產生之生長選擇系統鑑別(Henning等人，Appl.Environ.Microbiol.72：7510-7517(2006))。
能夠將2-酮基酸去羧之第三種酶係α-酮戊二酸去羧酶(KGD)。迄今尚未對此類別酶之受質範圍進行研究。已對來自結核分枝桿菌之KDC(Tian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：10670-10675(2005))進行選殖及功能表現。然而，其並非用於菌株改造之理想候選物，此乃因其較大(約130kD)且富含GC。已在包括大豆根瘤菌及百脈根中慢生根瘤菌在內之若干根瘤菌物種中檢測到KDC酶活性(Green等人，J.Bacteriol.182：2838-2844(2000)。儘管尚未在該等生物體中分離出KDC編碼基因，但可獲得基因組序列，且將各基因組中之若干基因注釋為推定KDC。亦已對來自纖細裸藻之KDC進行表徵，但迄今尚未鑑別出與此活性相關之基因(Shigeoka及Nakano，Arch.Biochem.Biophys.288：22-28(1991))。對自N端起始之前20個胺基酸定序(MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV；SEQ ID NO：45)(Shigeoka及Nakano，Arch.Biochem.Biophys.288：22-28(1991))。該基因可藉由測試含有此N端序列之候選基因之KDC活性來鑑別。
用於催化此反應之第4種候選酶係支鏈α-酮酸去羧酶(BCKA)。已顯示，此類別酶作用於鏈長度在3至6個碳之間變化之多種化合物(Oku及Kaneda，J.Biol.Chem.263：18386-18396(1988)；Smit等人，B.A.,J.E.Hylckama Vlieg,W.J.Engels,L.Meijer,J.T.Wouters及G.Smit，Identification,cloning,and characterization of a Lactococcus lactis branched-chain alpha-keto acid decarboxylaseinvolved in flavor formation.Appl.Environ.Microbiol.71：303-311(2005))。已就多種具支鏈及直鏈受質對乳酸乳球菌中之酶進行表徵，該等受質包括2-酮基丁酸酯、2-酮基己酸酯、2-酮基戊酸酯、3-甲基-2-酮基丁酸酯、4-甲基-2-酮基丁酸酯及異己酸酯(Smit等人，Appl.Environ.Microbiol.71：303-311(2005)。已在結構上對該酶進行表徵(Berg等人，Science 318：1782-1786(2007))。乳酸乳球菌酶與運動發酵單胞菌之丙酮酸酯去羧酶之間的序列比對指示，催化及受質識別殘基幾乎相同(Siegert等人，Protein Eng.Des.Sel.18：345-357(2005))，因此此酶可為用於定向改造之有前景之候選物。在枯草芽孢桿菌中檢測到BCKA對α-酮戊二酸酯之去羧；然而，此活性相對於對其他支鏈受質之活性較低(5%)(Oku及Kaneda，Biosynthesis of branched-chain fatty acids in Bacillus subtilis.A decarboxylase is essential for branched-chain fatty acid synthetase.J.Biol.Chem.263：18386-18396(1988))，且迄今尚未鑑別出編碼此酶之基因。其他BCKA基因候選物可藉由與乳酸乳球菌蛋白質序列之同源性來鑑別。將此酶之許多高評分BLASTp命中(hit)注釋為吲哚丙酮酸酯去羧酶(EC 4.1.1.74)。吲哚丙酮酸酯去羧酶 (IPDA)係在植物及植物細菌中催化吲哚丙酮酸酯至吲哚乙醛之去羧的酶。
源自智人及歐洲牛粒線體支鏈酮酸去氫酶複合物之E1次單元的重組支鏈α-酮酸去羧酶已在大腸桿菌中選殖並進行功能表現(Davie等人，J.Biol.Chem.267：16601-166061992)；Wynn等人，J.Biol.Chem.267：1881-1887(1992)；Wynn等人，J.Biol.Chem.267：12400-12403(1992))。在該等研究中，作者發現，伴護蛋白(chaperonin)GroEL與GroES之共表現將去羧酶之比活性增強500倍(Wynn等人，J.Biol.Chem.267：12400-12403(1992))。該等酶係由兩個α次單元及兩個β次單元構成。
α-酮酸之去羧。若干鳥胺酸去羧酶(步驟U，圖63)亦展現對離胺酸及其他相似化合物之活性。在黏性菸草(Lee及Cho，Biochem.J.360：657-665(2001))、乳酸桿菌30a(Guirard及Snell,J.Biol.Chem.255：5960-5964(1980))及創傷弧菌(Lee等人，J.Biol.Chem.282：27115-27125(2007))中發現此等酶。已結晶出來自乳酸桿菌30a(Momany等人，J.Mol.Biol.252：643-655(1995))及創傷弧菌之酶。創傷弧菌酶有效地催化離胺酸去羧，且已闡明參與受質特異性之殘基(Lee等人，J.Biol.Chem.282：27115-27125(2007))。相似酶已在陰道滴蟲中進行表徵，但不瞭解編碼此酶之基因(Yarlett等人，Biochem.J.293(Pt 2)：487-493(1993))。
亦對麩胺酸去羧酶(步驟L，圖62及63)進行充分表徵。實例性麩胺酸去羧酶可在大腸桿菌(De Biase等人，Protein Expr.Purif.8：430-438(1996))、啤酒酵母菌(Coleman等人，J.Biol.Chem.276：244-250(2001))及智人(Bu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2115-2119(1992)；Bu及Tobin，Genomics 21：222-228(1994))中發現。
離胺酸去羧酶(EC 4.1.1.18)催化離胺酸至屍胺之去羧。此酶之兩種同功酶在大腸桿菌基因組中係由基因cadA及ldcC編碼。CadA與耐酸性有關且受到cadC基因產物之正調節(Lemonnier及Lane，Microbiology 144(Pt 3)：751-760(1998))。CadC接受羥基離胺酸及S-胺基乙基半胱胺酸作為替代受質，且2-胺基庚二酸酯及6-ACA用作此酶之競爭性抑制劑(Sabo等人，Biochemistry 13：662-670(1974))。可利用定向進化或其他酶改造方法來增強此酶將2-胺基庚二酸酯去羧之活性。組成型表現之ldc基因產物之活性小於CadA(Lemonnier及Lane，Microbiology 144(Pt 3)：751-760(1998))。最近在腸炎弧菌中鑑別出與CadA類似之離胺酸去羧酶(Tanaka等人，J.Appl.Microbiol.104：1283-1293(2008))。由ldc編碼之來自反芻月形單胞菌之離胺酸去羧酶與真核鳥胺酸去羧酶具有序列相似性，且接受L-離胺酸與L-鳥胺 酸二者作為受質(Takatsuka等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.63：1843-1846(1999))。對活性位點殘基進行鑑別及改造以改變該酶之受質特異性(Takatsuka等人，J.Bacteriol.182：6732-6741(2000))。
6.2.1.a CoA合成酶.
CoA合成酶或連接酶反應係圖62及63之步驟I及圖62之步驟V所需。琥珀酸酯或4-羥基丁酸酯係所需受質。編碼可能實施該等轉化之酶之實例性基因包括大腸桿菌之sucCD基因，其天然形成琥珀醯基-CoA合成酶複合物。此酶複合物天然催化自琥珀酸酯形成琥珀醯基-CoA，同時消耗一個ATP，該反應活體內係可逆的(Buck等人，Biochem.24：6245-6252(1985))。
其他實例性CoA-連接酶包括尚未表徵序列之大鼠二羧酸-CoA連接酶(Vamecq等人，Biochemical J.230：683-693(1985))、來自產黃青黴之兩種經表徵苯基乙酸-CoA連接酶中之任一者(Lamas-Maceiras等人，Biochem.J.395：147-155(2005)；Wang等人，Biochem Biophy Res Commun 360(2)：453-458(2007))、來自戀臭假單胞菌之苯基乙酸-CoA連接酶(Martinez-Blanco等人，J.Biol.Chem.265：7084-7090(1990))及來自枯草芽孢桿菌之6-羧基己酸-CoA連接酶(Bower等人，J.Bacteriol.178(14)：4122-4130(1996))。其他候選酶係來自家鼷鼠(Hasegawa等人，Biochim.Biophys.Acta 1779：414-419(2008))及智人 (Ohgami等人，Biochem.Pharmacol.65：989-994(2003))之乙醯乙醯基-CoA合成酶，其天然催化乙醯乙酸酯轉變為乙醯乙醯基-CoA之依賴ATP。已在瑟杜生金屬球菌中證實4-羥基丁醯基-CoA合成酶活性(Berg等人，Science 318：1782-1786(2007))。已試驗性地將此功能指配給Msed_1422基因。
形成ADP之乙醯基-CoA合成酶(ACD,EC 6.2.1.13)係將醯基-CoA酯轉變為其相應酸與ATP之同時合成偶合的另一候選酶。已在文獻中闡述具有廣泛受質特異性之若干酶。據顯示，由AF1211編碼之來自閃爍古球菌之ACD I對多種直鏈及支鏈受質起作用，該等受質包括乙醯基-CoA、丙醯基-CoA、丁醯基-CoA、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、異丁酸酯、異戊酸酯、琥珀酸酯、富馬酸酯、苯基乙酸酯、吲哚乙酸酯(Musfeldt等人，J.Bacteriol.184：636-644(2002))。來自死海嗜鹽古細菌之酶(注釋為琥珀醯基-CoA合成酶)接受丙酸酯、丁酸酯及支鏈酸(異戊酸酯及異丁酸酯)作為受質，且顯示在正向及反向上起作用(Brasen等人，Arch.Microbiol.182：277-287(2004))。由來自超嗜熱泉生古菌(crenarchaeon)嗜氣熱棒菌之PAE3250編碼之ACD在所有經表徵ACD內顯示最寬之受質範圍，與乙醯基-CoA、異丁醯基-CoA(較佳受質)及苯基乙醯基-CoA反應(Brasen等人，見上文(2004))。來自閃爍古球菌、死海嗜鹽古細菌及嗜氣熱棒菌之酶全部已在大腸桿菌中進行選 殖，功能表現及表徵(Musfeldt等人，見上文；Brasen等人，見上文(2004))。
實例XXIII 利用羧酸還原酶產生BDO
此實例闡述使用羧酸還原酶產生1,4-丁二醇之微生物之生成。
使用大腸桿菌作為靶生物體來改造闡述於圖58中之用於1,4-丁二醇合成之途徑。大腸桿菌提供用於生成能夠產生1,4-丁二醇之非天然微生物的良好宿主。大腸桿菌適於遺傳操縱且已知能夠在各種含氧條件下有效地產生各種產物，如乙醇、乙酸、甲酸、乳酸及琥珀酸。
將4-羥基丁酸酯途徑基因整合至染色體中：ECKh-432之構築.在命名為ECKh-761之大腸桿菌菌株中表現羧酸還原酶，該菌株係ECKh-432之額外缺失編碼琥珀酸半醛去氫酶之sad及gabD基因的派生物。此菌株含有產生4HB之BDO途徑之組份，該途徑於fimD基因座處整合至大腸桿菌之染色體中，如實例XXI中所述。
羧酸還原酶及PPTase之選殖及表現。為了生成經改造以產生1,4-丁二醇之大腸桿菌菌株，使用熟知分子生物學技術(例如，參見Sambrook，見上文，2001；Ausubel見上文，1999)在大腸桿菌中表現編碼羧酸還原酶及磷酸泛醯巰基乙胺轉移酶之核酸。特定而言，在PA1/lacO啟動子控制下將來自伊文思奴卡菌(命名為720)、恥垢分枝桿菌mc(2)155(命名為890)、鳥分枝桿菌副結核亞種K-10(命名為891)及海棲分枝桿菌M(命名為892)之car基因選殖至pZS*13載體(Expressys,Ruelzheim,Germany)中。在與彼等用於pZS*13中相似之啟動子及核糖 體結合位點控制下將npt(ABI83656.1)基因(即，721)選殖至原始微型F質粒載體PML31之衍生物pKJL33S載體中。
藉由PCR自奴卡菌屬基因組DNA選殖car基因(GNM_720)。其核酸及蛋白質序列分別示於圖59A及59B中。藉由GeneArt(Regensburg,Germany)合成npt基因(GNM_721)之密碼子最佳化形式。其核酸及蛋白質序列分別示於圖60A及60B中。恥垢分枝桿菌mc(2)155(命名為890)、鳥分枝桿菌副結核亞種K-10(命名為891)及海棲分枝桿菌M(命名為892)基因及酶之核酸及蛋白質序列可分別在圖64、65及66中發現。將質粒轉化至ECKh-761中以表現1,4-丁二醇產生所需蛋白質及酶。
使用羧酸還原酶之1,4-BDO產生之證實。使用大腸桿菌全細胞培養物來證實1,4-丁二醇途徑之功能表現。將經分別含有car基因及GNM_721之pZS*13及pKJL33S質粒轉化之大腸桿菌ECKh-761單菌落接種至5mL含有合適抗生素之LB培養基中。相似地，將經含有car之無插入pZS*13質粒及pKJL33S質粒轉化之大腸桿菌ECKh-761單菌落接種至含有合適抗生素之LB培養基之額外5mL等分試樣中。藉由用1.5%最早培養物接種含有合適抗生素之新鮮最低活體內轉變培養基(參見下文)來開始10mL微好氧性培養物。
最低活體內轉變培養基之配方(對於1000mL而言)如下：
藉由在接種後首先用氮將加蓋厭氧瓶沖洗5分鐘、然後用18G針刺穿隔膜來建立微好氧性條件。在生長期間使針保持在瓶中以允許少量空氣進入瓶中。當培養物達到對數生長中期時，用0.2mM IPTG誘導蛋白質表現。將此視為：時間=0hr。分析培養物上清液之BDO、4HB及其他副產物，如上文及WO2008115840中所述(參見表31)。
表33顯示表現不同羧酸還原酶之菌株中不同產物之產生，包括BDO之產生。
該等結果顯示，不同羧酸還原酶可在BDO途徑中發揮功能以產生BDO。
實例XXIV 用以改良經改造微生物特性之代謝修飾
此實例闡述用以改良經改造微生物之特性之其他代謝修飾。此等經改良特性包括(但不限於)增加產物產率、減少副產物產生、改良經改造微生物之生長特性，包括改良用於按比例放大產生之特性及諸如此類。
瓶用培養條件。在補加有10mM NaHCO3、20g/L D-葡萄糖及 100mM用以改良緩衝能力之MOPS、10μg/ml硫胺素及用於質粒維持之合適抗生素之M9最低鹽培養基(6.78g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中實施20毫升用於代謝物產生或生物轉變之瓶培養。使大腸桿菌菌株MG1655 lacIQ+在厭氧性下生長，且藉由用氮將加蓋厭氧瓶沖洗至少5min來獲得厭氧性條件。將微好氧性條件用於所有其他菌株，該等微好氧性條件係藉由在接種後首先用氮將加蓋厭氧瓶沖洗5min，然後用23G針(Becton-Dickenson)刺穿隔膜來建立。在生長期間使針保持在瓶中以允許少量空氣進入。除非文中另有說明，否則當培養物達到對數生長中期時，用0.2mM IPTG誘導蛋白質表現。
用於96孔板之培養條件。使96孔板中之所有培養物在具有MOPS及合適抗生素之1.2ml M9培養基(上文提供組成)中生長。亦添加呈5%葡萄糖形式之碳源。藉由用兩個透氣性黏著密封件覆蓋板來獲得微好氧性條件。對密封件邊緣實施壓膠以使蒸發最小化。使所有培養物在37℃下生長。
細菌菌株及質粒。根據製造商說明書利用PureLink Genomic DNA Mini Kit(Invitrogen)分離來自細菌菌株之基因組DNA。如所述實施重組DNA操縱(Sambrook等人，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,(1989)。使用高忠實性KOD DNA聚合酶(EMD Chemicals；Billerica MA)自合適基因組DNA模板擴增研究中之基因及開放閱讀框。根據標準分子生物學方案利用Taq聚合酶(Promega)實施用於基因分型及定序之分析型PCR實驗。DNA定序由Genewiz(South Plainfield NJ)提供。
用於遺傳操縱之程序。用於BDO途徑之表現載體之研發。載體主鏈係自Dr.Rolf Lutz博士Expressys(expressys.de)獲得。載體及菌株 係基於先前所述之pZ表現系統(Lutz及Bujard，Nucleic Acids Res.25：1203-1210(1997)。)。所得載體係pZE13luc、pZA33luc、pZS*13luc及pZE22luc且含有螢光素酶基因作為填充片段。為了用側接有合適限制酶位點之lacZ-α片段置換螢光素酶填充片段，首先藉由用EcoRI及XbaI消化自各載體去除螢光素酶填充片段。利用以下引子自pUC19藉由PCR擴增lacZ-α片段：lacZα-RI 5’GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3’(SEQ ID NO：1)
lacZα 3'BB 5’-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3’(SEQ ID NO：2)。
此生成5’末端具有EcoRI位點、NheI位點、核糖體結合位點、SalI位點及起始密碼子之片段。在該片段之3’末端含有終止密碼子、XbaI位點、HindIII位點及AvrII位點。用EcoRI及AvrII消化PCR產物且將其連結至用EcoRI及XbaI消化之基礎載體中(XbaI及AvrII具有相容末端且生成非位點)。由於NheI及XbaI限制酶位點生成可連結在一起之相容末端(但在連接後生成不被任一酶消化之位點)，因此選殖至載體中之基因可以「生物積塊」形式在一起(openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology：BioBricks)。簡言之，此方法允許使用2個相同的限制位點將無限數量之基因接合至載體中(只要該等位點不出現在該基因內部即可)，此乃因在每次添加後會破壞該等基因之間之位點。首先，來自該等載體之表現較低，且隨後使用Phusion®定點誘變套組(NEB,Ipswich,MA)對其進行修飾以將間隔子序列AATTAA插入EcoRI與NheI位點之間。此消除RNA中結合RBS及起始密碼子之推定莖環結構。
所有載體皆依次具有指示複製起點、抗生素抗性標記物及啟動 子/調節單元之pZ標號以及字母及數字。複製起點係第二個字母且基於起點表示為E(對於ColE1而言)、A(對於p15A而言)及S(對於pSC101而言)(以及命名為S*之pSC101之更低拷貝數形式)。第一個數字代表抗生素抗性標記物(1為胺苄青黴素，2為康黴素，3為氯黴素)。最後數字界定調節所關注基因之啟動子(1為PLtetO-1，2為PLlacO-1且3為PA1lacO-1)且該等啟動子中之每一者皆藉由其對應誘導物分子而變得活化(pLtetO可藉由四環素誘導；pLlacO-1及pA1lacO-1可藉由IPTG誘導)。然後設計並構築三種基礎載體pZS*13S、pZA33S及pZE13S以用作「誘導型」質粒載體。
除上述「誘導型」啟動子以外，亦自Registry(partsregistry.org)對一組「組成型」啟動子取樣。然後經由Li及Eledge(Nature Methods 2007,4：251-256)闡述之不依賴序列及連接之選殖(SLIC)方法將該等「組成型」啟動子中之每一者引入pZS*13S載體主鏈中以置換pA1lacO-1誘導型啟動子。在該等取樣之「組成型」啟動子(p100、p104、p105、p107、p108、p111、p115及p119)中，實施實驗以確定藉由蛋白質表現量驗證之啟動子強度之順序。對於該等實驗而言，採用「誘導型」及「組成型」質粒載體二者，針對生物積塊及SLIC插入進行修飾，如上文所論述。為了進一步微調一些過度表現蛋白質之蛋白質表現量，因此使用RBS計算器(salis.psu.edu/software/)對啟動子與基因編碼序列之間之核糖體結合位點(RBS)進行修飾。
用於將基因列表插入pZS*13S載體主鏈中之SLIC引子列示於下文中。小寫體標記退火至載體主鏈之序列，而大字體標記退火至基因之編碼區之序列。
1.ppc 525
正向SLIC引子：gaggagaagtcgacATGAACGAACAATATTCCGCATTGCG(SEQ ID NO：100)
反向SLIC引子：ggaagctttctagaTTAGCCGGTATTACGCATACCTGCC(SEQ ID NO：101)
2.sucAB-lpdA
正向SLIC引子：taagctagcaagaggagaagtcgacATGCAGAACAGCGCTTTGAAAG(SEQ ID NO：102)
反向SLIC引子：gcctctaggaagctttctagaTTACTTTTTCTTCGCTTTGGCG(SEQ ID NO：103)。
3.galP 1120
正向SLIC引子：ctagcaagaggagaagtcgacATGCCTGACGCTAAAAAACAGGGGCGGT(SEQ ID NO：104)
反向SLIC引子：ctaggaagctttctagagtcgTTAATCGTGAGCGCCTATTTCGCGCAG(SEQ ID NO：105)。
4.glk 1123
正向SLIC引子：ctagcaagaggagaagtcgacATGACAAAGTATGCATTAGTCGGTGATGTG(SEQ ID NO：106)
反向SLIC引子：ctaggaagctttctagagtcgTTACAGAATGTGACCTAAGGTCTGGCGTAAATG(SEQ ID NO：107)。
5.glf 1786
正向SLIC引子： ctagcaagaggagaagtcgacATGAGTTCTGAAAGTAGTCAGGGTCTAGTC(SEQ ID NO：108)
反向SLIC引子：ctaggaagctttctagagtcgTTACTTCTGGGAGCGCCACATCTC(SEQ ID NO：109)。
對於下文所論述之工作，採用三種針對如上文所論述生物積塊插入進行修改之基礎載體pZS*13S、pZA33S及pZE13S。
以下技術闡述incW質粒pPSX13及pPSX23R之構築。原始incW質粒主鏈(pPSX)係自John M.Pemberton博士(Sarovich及Pemberton，Plasmid 57：306-313(2007))獲得。pPSX質粒經遺傳修飾以將胺苄青黴素標記物(bla基因，命名為pPSX13)插入BamHI限制酶位點中或將康黴素標記物及R6k複製起點(命名為pPSX23R)插入BamHI與SacI限制酶位點之間。亦構築兩種相似incW質粒以包括自pZS*13S-ald-adh擴增之ald-adh基因盒。對於pPSX13-ald-adh抗胺苄青黴素質粒而言，將bla-ald-adh基因盒插入pPSX13之BamHI限制酶位點中。為了構築pPSX23R-ald-adh抗康黴素質粒，在pPSX23R之XhoI與SacI限制酶位點之間用「康黴素標記物-R6k複製起點」盒置換胺苄青黴素標記物(bla基因)。
如下將基因033B、1210及956插入微型F-質粒主鏈pKLJ33S中：設計PCR引子以自合適模板擴增基因033B(033BFOR及033BREV)、1210C(1210CFOR及1210CREV)及956(956FOR及956REV)。該等引子包括如以大寫體表示之各基因之最接近5’(FOR)及3’(REV)末端。各引子亦包括與質粒pZA33S之啟動子區(FOR)及終止子區(REV)直接同源之尾。使用引子pZ-5’及pZ-3’及作為模板之環形pZA33S擴增在任一最末端具有啟動子區及終止子區之pZA33S線性片段。將pZA33S線性片段與033B、1210C及956基因片段中之每一者組合且使用不依賴序 列及連接之選殖將其接合以形成對應質粒pZA33S-033B、pZA33S-1210C及pZA33S-956。
使用引子034Cmfor及034Cmrev自合適pZA33S質粒背景擴增033B、1210C及956基因。設計該等引子以自質粒pZA33S(序列以大寫體表示)擴增氯黴素抗性基因、pA1啟動子、所關注特定基因及終止子元件，而尾序列(以小寫體表示)對應於側接但不包括微型F-質粒pKLJ12之胺苄青黴素抗性基因、阿拉伯糖反應性啟動子及終止子序列之區(Jones及Keasling，Biotechnol.Bioengineer.59：659-665(1998))。
將含有質粒pKLJ12及溫度敏感性Red/ET輔助質粒pREDET(Tet)之大腸桿菌DP10B菌株(GeneBridges GmbH,Heidelberg Germany)接種至含有10μg/ml四環素及100μg/ml最終濃度之胺苄青黴素之LB培養基中且在30℃下在振盪的同時培育3小時直至細胞混濁。將用以誘導Red/ET重組功能表現之阿拉伯糖添加至最終濃度為0.3%，將溫度轉換為37℃且在振盪的同時將細胞再培育1小時。在藉由於冰冷無菌雙蒸餾水中重複離心及再懸浮來達成電勝任後，在1mm光析管中將該等細胞與pZA33S-033B、pZA33S-1210C或pZA33S-956質粒之034Cmfor/034Cmrev PCR擴增物混合且然後使其在1800kV、25μF、 200Ω下進行電穿孔。然後將電穿孔細胞添加至SOC生長培養基，不振盪的情況下在37℃下進行培育，且然後在含有10μg/ml最終濃度之氯黴素之LB固體培養基上鋪開且在37℃下培育18至24小時。然後對所得抗氯黴素單菌落在含有10μg/ml四環素或100μg/ml胺苄青黴素之固體LB培養基上之生長進行評分。藉由PCR及DNA定序驗證顯示具有氯黴素抗性、四環素敏感性及胺苄青黴素敏感性之菌落含有新型微型F-質粒，該等質粒已藉由RED/ET介導之同源重組用pZA33S之氯黴素抗性基因/PA1啟動子/所關注基因/終止子完全交換pKLJ12之胺苄青黴素抗性基因/阿拉伯糖反應性啟動子/終止子，從而產生新型微型F-質粒pKLJ33S-033B、pKLJ33S-1210C、pKLJ33S-956。
使用sacB基因對基因進行染色體置換。用於在大腸桿菌染色體中插入或缺失基因之主要方法係基於來自枯草芽孢桿菌之sacB基因之利用(Gay等人，J.Bacteriol.153：1424-1431(1983))。所用載體係缺失oriT及IS序列之pRE118(ATCC87693)。對所得載體(大小為3.6kb且攜帶康黴素抗性基因)定序且將其稱為pRE118-V2。除非說明，否則片段之所有選殖皆係在pRE118-V2之限制位點KpnI及PstI中進行。所有PCR擴增皆使用來自大腸桿菌MG1655(ATCC47076)之基因組DNA作為DNA模板。染色體中之第一個整合事件係在含有康黴素(25或50mg/L)之LB瓊脂板上進行選擇。藉由PCR使用以下2個引子來驗證正確插入：一個定位於插入區外部且一個在康黴素基因中(5’-aggcagttccataggatggc-3’)(SEQ ID NO：118)。選擇具有正確插入之純系用於解析。在普通液體LB中在期望溫度下將其繼代培養兩次且將連續稀釋物平鋪於LB-無鹽-蔗糖10%板上。篩選在含有蔗糖之板上生長之純系在LB-低鹽瓊脂培養基上之康黴素抗性基因之損失，且藉由涵蓋區之PCR及定序驗證所關注片段之缺失/插入。
使用此方法利用以下引子使appCB缺失：
因此，缺失以下核苷酸：1,036,963->1,039,655。
亦利用上述pRE-sacB-Kan載體使tesB及ybgC缺失。用於達成缺失之引子係：(5’-3’)
因此缺失之核苷酸係：tesB：473,525<-474,385
ybgC：773,975->774,379。
亦利用標準pRE-sacB-Kan載體達成ndh缺失。用於達成缺失之引子係：(5’-3’)
因缺失而缺失之核苷酸係1,165,308->1,166,612。
利用標準pRE-sacB-Kan載體引入yjgB、yqhD、yahK及adhP之缺失。用於達成缺失之引子係：(5’-3’)
因該等缺失中每一者而缺失之核苷酸係：ygjB：4,493,213<-4,494,232，yqhD：3,153,377->3,154,540，yahK：342,108->343,157，adhP：1,550,852<-1,551,862。
使用λ-red介導之組合之基因缺失：藉由Red介導之重組使天然基因cyoABCD自染色體缺失(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079)。
對於cyoABCD缺失而言，使用以下引子分別自pKD3或pKD4(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079)擴增氯黴素或康黴素抗性基因，且使該等引子側接FRT位點且與cyoABCD同源：LK-cyo-F1 CGCCACAACCAGTGACACCC(SEQ ID NO：151)
LK-cyo-R1 GGGGTTTTAGTCGCCCTTTCTGGC(SEQ ID NO：152)
LK-cyo-IO-下游CGGGATCTGGTGGCGTTTAAAGTG(SEQ ID NO：153)
LK-cyo-IO-上游TGACGGCGTTTGTCTTCACCG(SEQ ID NO：154)。
在30℃下使攜帶Red輔助質粒pKD46之大腸桿菌K-12 MG1655在100ml具有胺苄青黴素及1mM L-阿拉伯糖之LB培養基中生長至0.3之OD600，且如別處所述製備電穿孔-勝任細胞(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,(1989))。在冰冷0.1cm光析管 (Bio-Rad公司，Hercules,CA,USA)中將量測為50μl之勝任細胞與400ng PCR片段混合。在1.8kV下以25mF及200Ω將細胞電穿孔，隨後立即添加具有1mM L-阿拉伯糖之1ml SOC培養基(2% Bacto Tryptone(Difco)、0.5%酵母菌提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)。在37℃下培育2h後，將1/10部分擴散至瓊脂板上以在37℃下選擇氯黴素R或康黴素R轉化體。然後使用Plvir且選擇合適抗生素將個別缺失轉導至新宿主菌株中(Silhavy等人，Experiments with gene fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984))。然後用溫度敏感性質粒pCP20轉化抗氯黴素或康黴素菌落，且在30℃下將其平鋪於胺苄青黴素(100μg/ml)板上。pCP20含有酵母菌Flp重組酶基因、抗氯黴素及胺苄青黴素基因及溫度敏感性複製。在42℃下使菌落在無抗生素LB培養基中生長過夜且將其劃線平鋪於預溫熱LB瓊脂板中且在42℃下生長。測試個別純系對胺苄青黴素及氯黴素或康黴素之敏感性以分離已損失pCP20質粒且經由Flp重組酶損失氯黴素或康黴素抗性基因之純系。缺失cyoABCD之陽性純系含有單一FRT「疤痕」且藉由PCR使用側接各別基因之引子來驗證。
因cyoABCD缺失而缺失之核苷酸係：449,887->447,270。
利用上述標準pRed技術將來自中間耶氏桿菌之酯酶整合於染色體中。用於達成插入之引子係：(5’-3’)
於gabD基因座(ORF交換)處插入之序列係： (SEQ ID NO：165)。
sucC及sucD之無標記物缺失。使用兩步驟雙交換同源重組方法達成自染色體缺失天然大腸桿菌sucC(基因2)及sucD(基因3)(圖67)。經由來自pRED-Amp(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)之λ噬菌體Red基因之表現來催化重組。將編碼聚果糖蔗糖酶(基因6)及康黴素抗性(基因7)之基因整合至染色體中，置換sucC(基因2)及sucD(基因3) 之大部分。使用康黴素來選擇成功整合體。在第二個雙交換同源重組步驟中，用缺乏sucC(基因2)及sucD(基因3)之大部分之合適DNA序列置換含有聚果糖蔗糖酶基因(基因6)及康黴素抗性基因(基因7)之經整合序列，且選擇耐蔗糖純系。
經由標準分子生物學技術構築用於上述兩個同源重組步驟之線性雙鏈DNA序列。為了達成用於初始整合步驟中之序列，藉由PCR自大腸桿菌MG1655基因組DNA使用寡核苷酸1及寡核苷酸3擴增自sucB(基因1)內直至sucC(基因2)之第69個鹼基對之1100bp序列(圖68a)。藉由PCR自質粒pRE-118 DNA使用寡核苷酸5及寡核苷酸6擴增編碼聚果糖蔗糖酶(基因6)及康黴素抗性(基因7)之基因(圖68b)。藉由PCR自大腸桿菌MG1655基因組DNA使用寡核苷酸4及寡核苷酸2擴增自sucD(基因3)之第811個bp橫跨mngR(基因4)及部分mngA(基因5)的另一1100bp序列(圖68a)。20bp寡核苷酸3與寡核苷酸5重疊且20bp寡核苷酸6與寡核苷酸4重疊，使得三種重疊PCR產物可使用標準程序組合並擴增(圖68c)。同樣，用於使sucCD缺失之第二重組之線性雙鏈DNA序列係藉由組合並擴增兩種重疊PCR產物達成。藉由PCR自大腸桿菌MG1655基因組DNA使用寡核苷酸1及寡核苷酸8擴增自sucB(基因1)內直至sucC(基因2)之第69個鹼基對之1100bp序列(圖68d)。藉由PCR自大腸桿菌MG1655基因組DNA使用寡核苷酸7及寡核苷酸2擴增自sucD(基因3)之第811個bp橫跨mngR(基因4)及部分mngA(基因5)之另一1100bp序列(圖68d)。寡核苷酸7與寡核苷酸8重疊，使得兩個重疊PCR產物可使用標準程序組合並擴增(圖68e)。因sucCD缺失而缺失之核苷酸係來自：762,306->764,320。
分析程序：採用HPLC、LCMS/MS及GCMS來分析細胞培養物及發酵試樣。兩種技術之間之良好相關性(變異在10%內)提供方法交叉驗證且確保數據精確性。
藉由配備有二極體陣列及折射率(RI)檢測器之HPLC(Agilent 1100)，使用離子排除Carbomix H-NP5管柱(Sepax)以5mM硫酸作為移動相在O.6mL/min流動速率及55℃管柱溫度下量測有機酸、乙酸酯、丙酮酸酯、乳酸酯及琥珀酸酯以及BDO。在210nm下之UV吸收與折射率二者之檢測器中監測有機酸，同時僅使用RI來量測BDO、乙醇及單糖。所有化學品及試劑皆來自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
在與Agilent 1200 HPLC介接之API3200三相四極系統(AB Sciex,Life Technologies,Carlsbad,CA)上利用基於電噴霧電離及MRM之獲取方法實施LCMS/MS分析。以正電離模式監測BDO、4HB、GBL、Glu、Ala及GABA及內標(將13C同位素標記類似物分別用於各分析物，以補償基質效應並確保線性度)。在期望時，使用負電離來定量 酸性分析物，例如，丙酮酸酯、乳酸酯、琥珀酸酯及4HB。在Zorbax Eclipse XDB C18(4.6×30mm，1.8μM粒徑)上實施層析分離，維持管柱在45℃、流動速率0.7mL/min。注射體積係5μL。溶析劑係由具有0.1%甲酸之水及具有0.1%甲酸之甲醇組成，在5%甲醇之等度條件下、之後分級梯度至95%甲醇來溶析所關注分析物，產生2min長時LCMS方法。在含有內標之水中稀釋過濾試樣，稀釋因數端視所關注代謝物之濃度自200至10,000之間變化。在水中進行100倍或更大之稀釋不會導致對於用於大腸桿菌中之1,4-丁二醇產生中之培養基組成及條件所觀察到之離子抑制效應(Yim等人，Nature Chemical Biology 7,445-452,(2011))。BDO及其他分析物之定量動態範圍係0.05-200uM。使用Analyst軟體實施定量。LCMS/MS方式因其允許進行高通量操作之快速周轉時間而係用於監測BDO、4HB、GBL、Glu、Ala及GABA之較佳方法。
以GCMS方式，藉由三甲基矽烷基化將培養營養液試樣中之BDO、4HB、乳酸酯及琥珀酸酯衍生化且藉由GCMS使用自文獻改編且帶有一些修改之程序進行定量分析。研發方法顯示低至低μM量之敏感性、在0.05-15mM範圍內之線性度以及良好重現性。在環境溫度下在speedvac濃縮器中將100μL過濾試樣徹底乾燥約1小時，之後添加二甲基甲醯胺中之20μL 10mM環己醇溶液作為內標。添加100μL具有1%三甲基氯矽烷之N,O-雙(三甲基矽烷基)三氟-乙醯胺(BSTFA)，且在70℃下將該混合物培育30min。將衍生化試樣離心5min並直接注入GCMS(Agilent 6890N/5973N)中。使用Rtx-5SIL MS毛細管管柱(Restek，30m×0.25mm ID×0.25μm膜厚度)。GC以分流注射模式操作，以20：1分流比引入1μL試樣。注射口溫度係250℃。使用氦作為載氣，且流動速率維持在1.0mL/min。將溫度梯度程式最佳化以確保對所關注分析物之良好解析及最低矩陣干擾。首先使烘箱在80℃下 保持1.5min，然後以10℃/min線性變化至140℃並保持3min，之後以100℃/min快速線性變化至300℃並最終保持5min。MS介面轉移線維持在280℃下。總分析時間係17min，包括4min溶劑延遲。在相應細胞培養或發酵培養基中使用分析物溶液構築標準校準曲線以儘可能接近地匹配試樣矩陣。在甲醇中稀釋試樣後，亦使用HP-InnoWax毛細管管柱(30m,0.25mm ID,0.25μm膜厚度)藉由GCMS分析乙醇。使用ChemStation軟體(Agilent)處理GCMS數據。
使用YSI儀器或HPLC-UV-RI量測發酵試樣中之殘餘葡萄糖。藉由YSI或GCMS量測乙醇。
應用本文所述代謝改造策略來增加大腸桿菌中之1,4-丁二醇產生或以其他方式改良經改造微生物之特性。用於該等研究之1,4-丁二醇途徑繪示於圖69中。針對示於圖69中之6個步驟中每一者測試之基因闡述於表34、38、40、42、46及49中。
實例XXV 在編碼α-酮戊二酸去羧酶之基因表現後4-羥基丁酸酯及1,4-丁二醇之產生
此實例闡述在經改造以表現編碼α-酮戊二酸去羧酶之基因之細胞中產生4-羥基丁酸酯(4HB或4hb)及1,4-丁二醇(BDO)。
在大腸桿菌中自pZS*-13S質粒表現若干異源α-酮戊二酸去羧酶基因(表34)以允許自α-酮戊二酸酯至4-羥基丁酸酯及1,4-丁二醇之功能途徑。宿主菌株包括3125、2869及3812。該等宿主菌株係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之 4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。對於此研究而言，牛分枝桿菌sucA及牙齦卟啉單胞菌sucD基因在菌株3125、2869及3812中缺失。另外，菌株3125、2869及3812各自於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。利用自pPSX23R質粒表現之4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛還原酶測試菌株2869及3812。表35、36及37顯示，相對於表示為「pZS*13S」之對照，異源α-酮戊二酸去羧酶基因之表現分別增強菌株3125、2869及3812中之4hb及/或BDO產生。使用先前所述之96孔板方案培養細胞。
實例XXVI 在表現編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶之基因後4HB及BDO之產生
此實例闡述在表現編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶之基因後4HB及BDO之產生。
在大腸桿菌中自pZS*-13S質粒表現若干異源性CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶基因(表38)以允許自琥珀醯基-CoA至4-羥基丁酸酯及1,4-丁二醇之功能途徑。宿主菌株3744係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。對於此研究而言，牛分枝桿菌sucA及牙齦卟啉單胞菌sucD基因在菌株3744中缺失。另外，菌株3744於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。其亦含有表現4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛還原酶之pPSX23R質粒。表39顯示，相對於表示為「pZS*13S」之對照，異源性CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶基因之表現增強菌株3744中之4hb及/或BDO產生。使用先前所述之96孔板方案培養細胞。
實例XXVII 在表現編碼4-羥基丁酸去氫酶之基因後4HB及BDO之產生
此實例闡述在表現編碼4-羥基丁酸去氫酶之基因後4HB及BDO之產生。
在大腸桿菌中自pZS*-13S質粒表現若干異源4-羥基丁酸去氫酶基因(表40)以允許自琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸酯至4-羥基丁酸酯及1,4-丁二醇之功能途徑。宿主菌株3891係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。對於此研究而言，牙齦卟啉單胞菌及克氏羧菌4hbd基因在菌株3891中缺失。另外，菌株3891於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。其亦含有表現4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛還原酶之pPSX23R質粒。表41顯示，相對於表示為「pZS*13S」之對照，異源4-羥基丁酸去氫酶基因之表現增強菌株3891中之4hb及/或BDO產生。使用先前所述之96孔板方案培養細胞。
實例XXVIII 在表現編碼4-羥基丁酸酯轉移酶之基因後4HB及BDO之產生
此實例闡述在表現編碼4-羥基丁酸酯轉移酶之基因後4hb及BDO之產生。
在大腸桿菌中自pZS*-13S或F’質粒表現若干異源4-羥基丁酸酯轉移酶基因(表42)以允許自α-酮戊二酸酯及琥珀醯基-CoA至1,4-丁二醇之功能途徑。宿主菌株包括1269、2731 △cat2及1654。該等宿主菌株係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。利用自pZS*-13S質粒表現之4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛還原酶測試全部菌株1269、2731 △cat2及1654。表43、44及45顯示，異源4-羥基丁酸酯轉移酶基因之表現允許分別在菌株1269、2731 △cat2及1654中產生BDO。使用先前所述之96孔板方案培養細胞。
1210C及033B之核苷酸序列提供於下文，且該等序列經密碼子最佳化以供在大腸桿菌中表現。
33B： (SEQ ID NO：174).
1210C： (SEQ ID NO：175)。
表45. 含有替代4-羥基丁酸酯轉移酶質粒構築體之大腸桿菌宿主 菌株1654之BDO、GBL及4-羥基丁酸酯(4HB)產生.表示為pZS*13S與之後一數字之質粒構築體表現表示為此數字之4-羥基丁酸酯轉移酶基因。pZS*13S-主鏈亦表現功能4-羥基丁醯基-CoA還原酶及4-羥基丁醛去氫酶基因。BDO及4HB濃度以mM表示。
實例XXIX 在表現編碼4-羥基丁醯基-CoA還原酶之基因後4HB及BDO之產生
此實例闡述在表現編碼4-羥基丁醯基-CoA還原酶之基因後4hb及BDO之產生。
在大腸桿菌中自pZS*-13S質粒表現若干異源4-羥基丁醯基-CoA還原酶基因(表46)以允許自琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸酯至1,4-丁二醇之功能途徑。宿主菌株1889係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株1889含有天然醇去氫酶基因adhP、yqhD、yahK及yjgB之缺失。另外，菌株1889於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。菌株1889含有表現功能4-羥基丁醛還原酶基因之F’質粒。菌株4269於hemN基因座處含有在p119啟動子控制下之4-羥基丁醛還原酶基因之染色體整合拷貝。表47及48顯示，相對於表示為「pZS*13S」之對照，異源4-羥基丁醯基-CoA還原酶基因之表現分別增強菌株1889及 4269中之BDO產生。使用先前所述之96孔板方案培養細胞。
實例XXX 在表現編碼4-羥基丁醛還原酶之基因後4HB及BDO之產生
此實例闡述在表現編碼4-羥基丁醛還原酶之基因後4hb及BDO之產生。
在大腸桿菌中自pZS*-13S質粒表現若干異源4-羥基丁醛還原酶基因(表49)以允許自琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸酯至1,4-丁二醇之功能途徑。宿主菌株1889係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株1889含有天然醇去氫酶基因adhP、yqhD、yahK及yjgB之缺失。另外，菌株1889於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。表50顯示，相對於表示為「pZS*13S」之對照，異源4-羥基丁醛還原酶基因之表現增強菌株1889中之BDO產生。使用先前所述之96孔板方案培養細胞。
在下文實例中，闡述在宿主菌株中進行之其他遺傳操縱以改良 葡萄糖上之BDO之產率。缺失及過表現用關鍵基因示於圖70中。
自TCA循環中間體α-酮戊二酸酯(AKG)開始，將通量引導至BDO途徑中存在兩種方式。第一種方式包含α-酮酸去羧酶，其將AKG去羧成琥珀酸半醛且隨後將其還原成4-羥基丁酸酯(4HB)。獲得4HB之替代方式係經由將AKG轉化成琥珀醯基-CoA之AKG去氫酶。然後經由琥珀酸半醛去氫酶將此還原成琥珀酸半醛且然後還原成4HB。然後可經由自乙醯基-CoA轉移CoA之轉移酶將4HB活化成4-羥基丁醯基-CoA(4-HBCoA)。經由醛去氫酶(ALD)將4-HBCoA還原成4-羥基丁醛。使用醇去氫酶(ADH)將該醛最終還原成1,4-丁二醇(BDO)。
實例XXXI 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之過表現
此實例闡述磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)羧化酶之過表現。
ppc係指編碼磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)羧化酶活性之基因。淨反應涉及PEP及碳酸氫酯轉變成草醯乙酸酯及磷酸酯。PEP羧化酶之過表現導致更多磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)轉變成OAA，由此減少自PEP至丙酮酸酯且隨後至乙醯基-CoA之通量。此導致至TCA循環中且因此至該途徑中之通量增加。此外，此過表現亦減少乙醇形成酶可作用之細胞內乙醯基-CoA庫，由此減少乙醇及乙酸酯之形成。對草醯乙酸酯通量增加亦有助於減少丙酮酸酯及丙胺酸分泌。另外，草醯乙酸酯之可用性增加可降低細胞呼吸需要亦及作為CO2之碳損失量。在質粒pZS*-13S上選殖基因ppc，如上文所述。
表51顯示96孔板中自來自菌株3162之4個重複之BDO產生。如上文所述在pZS*上利用pA啟動子過表現基因ppc(525號)且產生RBK變體5K。宿主菌株3162係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單 胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株3162含有天然醇去氫酶基因adhP、yqhD、yahK及yjgB之缺失。另外，菌株3162於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。其亦具有細胞色素氧化酶cyoABCD及appBC之缺失。在pPSX23R質粒表現用於將4-羥基丁醯基-CoA轉變成4-羥基丁醛且隨後轉移成1,4-丁二醇(BDO)之醛去氫酶及醇去氫酶基因。業已闡述用於該等酶步驟之基因候選物。圖71顯示培養物之平均BDO及4HB且比較其與來自對照菌株3162之4個重複。在圖72中對乙醇數量進行相同比較。在ppc過表現之細胞中觀察到較高BDO及4HB。如所預計，見到較低乙醇數量。
實例XXXII α-酮戊二酸去氫酶之過表現
此實例闡述α-酮戊二酸去氫酶之過表現。
此酶複合物係由大腸桿菌中之sucA、sucB及lpdA形成。其將α-酮戊二酸酯轉變成琥珀醯基-CoA，隨後將該琥珀醯基-CoA引導至BDO 途徑中。此途徑之限制，包括α-酮戊二酸去氫酶之能力之任何限制，可使得經由(例如)麩胺酸去氫酶(gdhA)形成麩胺酸酯。此導致碳損失及產率降低。在產生BDO之菌株中表現額外拷貝之sucAB及lpdA有助於大量減少麩胺酸酯。其亦可牽引通量經過TCA循環且有助於減少其他C2(乙醇及乙酸酯)及C3副產物(丙胺酸、丙酮酸酯)。在pA啟動子下在pZS*質粒上選殖sucAB及lpdA，如上文所述。在pPSX23R上表現BDO產生所需之ALD及ADH，如前文所述。
表52顯示菌株3933之4個重複在96孔板中在24小時培養時間後之4HB及BDO產生。宿主菌株3933係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。其含有天然醇去氫酶基因adhP、yqhD、yahK及yjgB之缺失。該菌株於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。其亦具有細胞色素氧化酶cyoABCD及appBC之缺失，且adh於hemN基因座處整合於在啟動子p119控制下之染色體上。
表52. 在質粒上過表現基因sucAB-lpdA之菌株3933之產生4HB之4個重複的BDO、4HB及乙醇數據.底部4列顯示宿主菌株3933之對照培養物之一式兩份數據。所有濃度皆係以mM表示且係在96孔板中24小時培養時間後量測。1438係指天然sucA基因(b0726)，1439係指天然野生型sucB基因(b0727)，pZS*上之生物積塊中之最一個基因係於前文實例XIV所述lpdA之突變形式(b0116)。此基因係大腸桿菌中之丙酮酸去氫酶複合物之次單元且已經修飾以使得丙酮酸去氫酶不受 NADH抑制。突變係如Yim等人，Nature Chemical Biology 7：445-452(2011))中所述進行。
圖73顯示相較於來自對照菌株之4個重複之對應平均值，來自在pZS*上過表現基因sucAB及突變lpdA之產生4HB之宿主菌株之4個重複的平均BDO及4HB數量。ALD及ADH係在質粒pPZSX23R上表現。圖74顯示來自基因sucAB及突變lpdA在pZS*上過表現且相較於彼等來自對照者之菌株之4個重複之平均麩胺酸酯數量的降低。該等結果顯示，sucAB之表現使所產生麩胺酸酯之量顯著降低且不會不利地影響BDO或4HB之產生。
實例XXXIII 非磷酸轉移酶糖吸收系統之過表現
此實例闡述作為非磷酸轉移酶(PTS)糖吸收系統之代表之葡萄糖激酶galP及/或glf之過表現。
宿主菌株中葡萄糖吸收之主要模式係PTS系統。經由此系統轉變成葡萄糖-6-磷酸酯(G6P)之每一葡萄糖分子皆伴有一分子PEP轉變成丙酮酸酯。注意，PEP經由菌株中之PEP羧化酶轉變成草醯乙酸酯。另外，PEP亦轉變成丙酮酸酯(由PTS系統以及丙酮酸激酶)且隨後由菌株中之丙酮酸去氫酶轉變成乙醯基-CoA。BDO途徑需要等莫耳量之草醯乙酸酯及乙醯基-CoA用於形成每一莫耳BDO。與PTS系統相關之固定化學計量破壞此平衡，從而導致乙醯基-CoA相對於草醯乙酸酯之比率較高。此然後導致細胞中產生乙醇及乙酸酯。非PTS模式之糖 吸收之過表現有助於緩解此問題且平衡相較於乙醯基-CoA可用草醯乙酸酯之量，由此增加經過BDO途徑之通量，減少C2副產物乙酸酯及乙醇，且減少C3副產物丙酮酸酯及丙胺酸。
非PTS葡萄糖吸收之主要機制係經由用以輸入糖之諸如galP等通透酶及隨後其經由glk編碼之激酶之依賴ATP之磷酸化。吸收葡萄糖之替代方式係經由葡萄糖促進劑glf。儘管大腸桿菌不具有此促進劑，但將其自運動發酵單胞菌選殖並引入大腸桿菌中(Parker等人Mol Microbiol.15(5)：795-802(1995))。
實例XXXIV γ-丁內酯酯酶之表現
此實例闡述γ-丁內酯酯酶之表現。
γ-丁內酯(GBL)係在糖至1,4-丁二醇(BDO)發酵期間形成之副產物。其係自不穩定途徑中間體4-羥基丁醯基-CoA形成。在較小程度內，其亦可藉由4-羥基丁酸酯之自發內酯化形成。
羥酸及其相應內酯彼此以依賴pH之平衡存在。內酯化係由酸催化且在低pH下有利。在鹼性條件下，平衡驅向開鏈羥基羧酸根陰離子。在通常為7.4之細胞質pH下，有利於GBL內酯水解(圖75)。在具有GBL酯酶活性之酶存在下可加速GBL至4-HB之水解，由此改良產率並消除可使產物之下游分離變得複雜之副產物。
鑑別來自中間耶氏桿菌29909及根癌土壤桿菌菌株C58之酯酶(Carlier等人，Mol.Plant Microbe Interact.17(9)：951-957(2004))且將其選擇作為實例性酯酶基因。耶氏桿菌屬基因(基因座yinte0001_13710)之核苷酸序列示於圖89中(亦參見GenBank ZP_04636075.1；GI：238792441)。來自根癌土壤桿菌之基因之核苷酸序列示於圖90中。該基因亦可命名為ahlK。另外實例性酯酶包括大腸桿菌KTE10之AttM(GenBank ZP_19612688.1,GI：432369596)及非共生 發光桿菌之attM(GenBank YP_003039319.1 GI：253987963)。
表53顯示來自整合有酯酶且與無酯酶對照(菌株2237)比較之菌株(菌株2387)之4個重複之96孔板的BDO、4HB及GBL數據。宿主菌株2237係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株2237含有天然醇去氫酶基因adhP、yqhD、yahK及yjgB之缺失。其於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。亦引入poxB中之另一缺失。
圖76顯示相較於來自對照菌株(2237)之4個重複之相應平均值，來自整合有酯酶之能夠產生4-羥基丁醯基-CoA之宿主菌株(2387)之4個重複的平均BDO及4HB數量。圖77顯示相較於來自對照菌株(2237) 之4個重複之相應平均值，來自整合有酯酶之宿主菌株(2387)之4個重複的平均GBL數量。觀察到整合有酯酶之菌株之GBL較低。該等結果證實具有γ-丁內酯酯酶活性之酶之表現，且不會不利地影響BDO或4HB之產生。
實例XXXV 琥珀醯基-CoA合成酶之缺失
此實例闡述琥珀醯基-CoA合成酶之缺失。
琥珀醯基-CoA合成酶係由大腸桿菌中之sucCD編碼。arcA缺失高度上調該等基因(及整個sdh-suc操縱子)在細胞中之表現。經過TCA循環之重複輪通量導致碳作為CO2損失。sucCD缺失阻斷琥珀醯基-CoA下游之TCA循環，從而將CO2損失減少約70%且使BDO效價及產率相應增加。
在宿主菌株4070中引入sucCD缺失。此菌株係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株4070含有天然醇去氫酶基因adhP、yqhD、yahK及yjgB之缺失。另外，此菌株於attB基因座處含有自p119啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。其亦具有細胞色素氧化酶cyoABCD及appBC之缺失。adh於hemN基因座處整合於在啟動子p119控制下之染色體上。
表54. 相較於無缺失對照(菌株4070)，來自缺失sucCD基因之4-HB產生菌株(菌株4269)之4個重複之96孔板的BDO及4HB數據。對於缺失sucCD之菌株觀察到較高4HB。所有濃度皆係以mM表示且係在24 小時培養時間後量測。
圖78顯示相較於來自對照菌株(4070)之4個重複之相應平均值，來自缺失基因sucCD之宿主菌株(4269)之4個重複的平均BDO及4HB數量。該等結果證實，缺失sucCD使BDO及4HB之產率增加。
實例XXXVI 醯基輔酶A硫酯酶之缺失
此實例闡述醯基輔酶A硫酯酶ybgC及tesB之缺失。
BDO途徑中之一種中間體係4-羥基丁醯基-CoA。此化合物可自發地或以酶促方式獲得環化而形成GBL(γ-丁醯基-內酯)。大腸桿菌具 有一些據報導對C4至C6基團之CoA受質具有廣泛受質特異性的可逆CoA硫酯酶。該等基因候選物之缺失消除約50%經由該途徑形成之GBL。此等活性可類似地在其他生物體中發現。
tesB及ybgC之缺失係在宿主菌株1136中進行。此菌株係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株1136具有ndh(NADH去氫酶II)及琥珀酸半醛去氫酶編碼基因sad及gabD之其他缺失。
圖79顯示相較於來自對照菌株(1136)之3個重複之相應平均值，來自缺失基因ybgC及tesB之宿主菌株(1197)之3個重複的平均BDO及4HB數量。圖80顯示相較於來自對照菌株(1136)之3個重複之相應平均值，來自缺失基因ybgC及tesB之宿主菌株(1197)之3個重複的平均GBL 數量。該等結果證實，一或多個醯基輔酶A硫酯酶之缺失減少γ-丁內酯產生，增加BDO產生且對4HB之產生不具有不利影響。
實例XXXVII 用以阻止或減少回流至途徑中之缺失
此實例闡述用以阻止回流至途徑中之缺失。
在高效價之培養中之1,4-丁二醇(BDO)下，其開始再輸入細胞中。在進入細胞內後，其經由TCA循環代謝。為了阻止此BDO回流至細胞中，使鑑別為反向流之候選物之醇去氫酶缺失。藉由兩種方式鑑別候選物，首先，基於受質特異性列示並優先化所有醇去氫酶。實施微陣列以測定其中之每一者表現程度有多高。基於此，自約35個adh候選物之列表生成5個候選物之短列表。其次，自在MM9培養基中在微好氧性下生長之菌株1427(去除由yqhD編碼之醇去氫酶且不存在下游途徑，細胞累積4HB但不產生BDO)分離具有內源性回流活性(依賴NADP+之BDO轉變成4-羥基丁醛)之蛋白質部分。在追蹤到回流活性時，將試樣純化。所用策略概述於下文。
基於早期實驗，發現內源性ADH活性主要依賴NADPH且在高(>35%)硫酸銨下鹽析。使用微型流化床以15,000psi裂解來自好氧性下生長過夜之2L LB製備物之1427細胞的新鮮試樣。然後經由硫酸銨將試樣分級分離。35%沈澱幾乎不含有ADH活性且不進行進一步處理，而60%沈澱含有具有顯著回流活性之活性ADH且對其繼續進行進一步純化。
陰離子交換純化。將60%硫酸銨沈澱再懸浮於低鹽緩衝液中並進行透析過夜以去除殘餘硫酸銨。將試樣加載至5ml Q-sepharose管柱(強陰離子交換)上且經由緩慢增加之鹽梯度溶析。各部分之陰離子交換溶析、回流活性以及SDS page之概況示於下文圖81中。
示於左側之第一個大峰超出正常範圍且對應於不結合管柱之蛋 白質。該峰具有低回流活性。示於層析圖中間之下一個峰具有顯著回流活性。運行此峰之SDS-PAGE且指示需要進一步純化以分離所關注蛋白質。
分子大小篩選層析。彙集並濃縮來自陰離子交換之峰回流活性以允許施加至S200 sephacryl分子大小篩選管柱。該管柱自試樣成功地去除雜質且結果示於下文(圖82)。
分級管柱之結果指示，所關注蛋白質表現為中範圍MW蛋白質，為約50kDa。然而，尚不清楚蛋白質之性質，但將其縮小至凝膠上約20個條帶。實施進一步層析以嘗試在質譜分析前提純試樣。
疏水性相互作用層析。自分子大小篩選管柱彙集具有最高回流活性之峰並將其加載於phenyl sepharose管柱(疏水性相互作用管柱)上。增加試樣之離子強度以促進與樹脂之結合。結果示於下文(圖83)。
藉由質譜分析示於SDS-PAGE上之試樣以鑑別導致回流之蛋白質。自凝膠，在少量背景蛋白質(約5種)旁邊存在5個顯著條帶。
藉由質譜分析分析經純化試樣，並獲得30種蛋白質之列表。自此列表，所選基因係：
利用抗生蛋白鏈菌素標籤選殖yjgB基因，使其表現並進行純化，以表徵其性質。如藉由SDS-PAGE所分析之純化結果示於圖84中。蛋白質表現充分，並獲得經純化蛋白質之可接受之產率。在NADP+存在下實施以BDO作為受質進行之初始表徵並確認穩健活性(參見圖85)。
基於蛋白質分級分離及微陣列結果，選擇4個基因且使其於彼此頂部缺失以自1872獲得菌株1889。該等基因係yqhD(b3011；GenBank NP_417484.1,GI：16130909)、yjgB(b4269；GenBank NP_418690.4,GI：90111716)、yahK(b0325；GenBank NP_414859.1,GI：16128310)及adhP(b1478；GenBank NP_415995.4,GI：90111280)。
在菌株1872中引入該4種醇去氫酶之缺失。此菌株係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株1872於attB基因座處含有自pA啟動子表現之4-羥基丁醯基-CoA轉移酶之染色體整合拷貝。
圖86顯示菌株1872對菌株1889之平均BDO、4HB及GBL數量。該等結果證實，減少回流之代謝修飾使BDO之產率增加且對4HB之產生不具有不利影響。
實例XXXVIII 用以改良氧化磷酸化之能量效率之缺失
此實例闡述用以改良氧化磷酸化之能量效率之缺失。
大腸桿菌之電子傳遞鏈具有將質子轉位之能力不同之多種NADH去氫酶及細胞色素氧化酶。例如，大腸桿菌中之NADH去氫酶II係不與質子轉位關聯之NADH消耗系統(H+/2e-=0)，而據報導，由nuo編碼之NADH去氫酶I對於每對電子轉位4個質子。Ndh-II之主要作用係氧化NADH及將電子提供給呼吸鏈(Yun等人，J.Appl.Microbiol.99：1404-1412(2005))。NdhII對NADH之親和力相對較低(Hayashi等人，Biochim.Biophys.Acta 977：62-69(1989))。已表明，NdhII可獨立於能量生成起作用以調節NADH庫且可能在細菌生成能量之能力超過要求時較為重要。已顯示，ndh基因以下述方式受fnr基因產物阻抑：在高氧濃度之條件下表現最佳。因此，ndh之缺失將有助於改良細胞之能量效率。相似地，存在已知不轉位任何質子且因此無助於ATP產生之若干其他NADH去氫酶，例如，大腸桿菌中之wrbA、yieF及kefF。該等之同源物可在其他生物體中發現且可經消除以改良每單位耗氧之ATP產生。
宿主菌株879(用於ndh缺失之親本菌株)係基於構築闡述於上文及US20110045575中之菌株ECKh-432。顯著修飾包括adhE、ldhA、pflB、mdh及arcA之缺失。菌株ECKh-432亦含有以下基因之染色體整合拷貝：來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(編碼CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶)、來自牛分枝桿菌之sucA(編碼α-酮戊二酸去羧酶)、來自牙齦卟啉單胞菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)及來自克氏羧菌之4hbd(編碼4-羥基丁酸去氫酶)。菌株879亦具有琥珀酸半醛去氫酶基因sad及gabD之缺失。
表57. 相較於具有完整ndh之宿主菌株(879)之重複，缺失ndh之 菌株之3個重複之BDO、4HB及GBL產生。如方案中所述在20mL瓶中實施實驗。質粒pZS*上存在ALD及ADH以允許將4-HB CoA轉變成4-HB醛且隨後轉變成BDO。所有濃度皆係以mM表示且係在24小時培養時間後量測。
圖87顯示菌株956對菌株879之平均BDO、4HB及GBL數量。該等結果證實，改良氧化磷酸化之能量效率之缺失增加BDO之產率且對4HB產生不具有不利影響。
實例XXXIX 細胞色素氧化酶之缺失
此實例闡述細胞色素氧化酶之缺失。
在電子傳遞鏈之電子輸出側，存在多種具有不同節能效率之細胞色素氧化酶。由cyo操縱子編碼之細胞色素bo複合物主動地泵送膜上之電子並產生4之H+/2e-化學計量。細胞色素bd-I複合物不會主動地泵送質子，但由於膜周質側上醌醇之氧化及隨後自膜之細胞質側吸收質子(用於形成水)，因此淨電子轉移產生2之H+/2e-化學計量。此係由cyd操縱子編碼。直至最近，仍不瞭解由appBC編碼之細胞色素bd-II氧化酶之質子轉位化學計量，但現已確定，此氧化酶可產生電(Borisov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108：17320-17324(2011))。該等基因通常在進入靜止期後或在匱乏碳及磷酸酯之條件下受到誘導(Atlung等人，J.Bacteriol.179：2141-2146(1997))。
細胞色素氧化酶之性質及豐度：cyd操縱子係由fnr及arcA以依賴氧之方式調節且在微好氧性條件下表現最佳(Calhoun等人，J. Bacteriol.175：3020-3025(1993))。當大腸桿菌在高氧張力下生長時，bo-型氧化酶佔優勢。cyo操縱子亦由arcA與fnr二者調節。文獻研究指示，在好氧性生長細胞中，細胞色素o氧化酶以每個細胞約304個分子之量存在且細胞色素d氧化酶以每個細胞204個分子之量存在(Minohara等人，J.Biosci.Bioengineer.93(5)：464-469(2002))。在厭氧性條件下，細胞色素d氧化酶佔優勢且以每個細胞約606個分子存在，此與每細胞之細胞色素o氧化酶僅2個分子不同。細胞色素bd氧化酶對O2之Km遠低於細胞色素bo氧化酶(Minohara等人，見上文，2002)。前者具有10nM之Km，且細胞色素bo氧化酶具有約1μM之Km。
在嘗試測定好氧性生長大腸桿菌中之P/O比率之研究(Noguchi等人，J.Biochem.136：509-515(2004))中，測定在標準進料及限制進料之葡萄糖下，NDH-1形成佔優勢之NADH去氫酶。然而，發現細胞色素bd氧化酶以高於細胞色素bo氧化酶之濃度存在。下表闡釋關於各種NADH去氫酶及細胞色素氧化酶之發現。
表59. 利用不同葡萄糖進料策略在好氧性生長條件下NADH去氫酶及細胞色素氧化酶之濃度(來自Noguchi等人，見上文，2004)。
缺失細胞色素氧化酶之效應：已報導恒化器研究用於理解缺乏電子傳遞鏈之不同組份之菌株在介於0.1/hr與0.7/hr之稀釋速率之間之氧比消耗速率的比率(Calhoun等人，見上文，1993)。侷限於使用bd型氧化酶之菌株相較於彼等僅使用細胞色素bo氧化酶者將氧消耗速率增加到1.45-1.13倍。缺失ndh與cyo二者之菌株相較於僅缺失ndh之菌株之氧消耗速率的比率在介於1.46與1.39之間。Calhoun等人(見上文，1993)之作者推斷，bd型氧化酶之效率低於bo型氧化酶，但仍偶合。
在再一研究中，已報導，含有細胞色素bo型及bd型末端氧化酶二者之大腸桿菌野生型細胞以4.5-4.9之H+/O比率泵送質子，但缺失細胞色素bo氧化酶之突變體顯示3.5-4.1之比率且具有細胞色素bd氧化酶之突變體顯示4.8-5.6之比率(Minohara等人，見上文，2002)。缺乏cyo及cyd操縱子二者之突變體不能在好氧性條件下生長，但彼等過表現細胞色素bo氧化酶者及彼等過表現細胞色素bd氧化酶者與親本W3110菌株一樣生長。該等菌株中每一者之細胞產率與其H+/O比率成比例。有趣的是，缺失cydAB之菌株最初顯示極差細胞產率。然而，在細胞色素bo氧化酶過表現後，細胞產率顯著改良。作者Minohara等人(見上文，2002)已假設，cyd突變菌株中之較低細胞產率可能歸因於cyd突變體中之膜之高H+滲透性。其相信，缺乏高親和力氧還原性 細胞色素bd之突變細胞中細胞色素bo之量可能不足以在低濃度下還原氧分子，且因此細胞膜會受到活性氧物種損害且變得可部分透過。可藉由過表現細胞色素bo氧化酶來緩解此細胞應激(Minohara等人，見上文，2002)。
最近論文(Bekker等人，J.Bacteriol.191：5510-5517(2009))研究了缺失細胞色素bd-II氧化酶之效應。缺乏細胞色素bd-II氧化酶之突變菌株之表型包括在葡萄糖過量條件下生長時之較小泛醌庫。在葡萄糖受限恒化器條件下，此菌株亦具有降低之氧通量。該等結果表明，細胞色素bd-II氧化酶顯著地促成了總體呼吸電子通量。野生型大腸桿菌MG1655細胞之比呼吸速率比缺少appBC之突變菌株高約46%(8.7mmol/gDCW.hr對5.9mmol/gDCW.hr)。在稀釋速率為0.2/hr之葡萄糖受限恒化器中量測該等比呼吸速率。為了改良細胞之能量效率，在菌株 (宿主菌株2424)中敲除appBC，且另外敲除cydAB(菌株2611)或cyoABCD(菌株2471)。下表顯示用於在具有該等菌株中每一者之96孔板中產生C4代謝物之數據。缺失兩種細胞色素氧化酶(由appBC及cyoABCD編碼)及ndh之另一優點係其使得該等細胞相對於較大發酵器中之一範圍之氧轉移速率穩健。由於cydAB具有固定的化學計量用於質子轉位且nuo(NADH去氫酶I)亦如此，因此P/O比率相當恆定且發酵器不同部分中之生物質比亦如此。
圖88分別顯示菌株1889(參見上文)、2424、2611及2471之BDO、4HB及GBL平均數量。該等結果證實，細胞色素氧化酶之缺失導致appBC缺失，從而使BDO及4HB產生減少，但仍產生大量BDO及4HB二者，且預計該等細胞展現可在按比例放大之發酵條件下有利之經改 良能量效率。
本文所揭示之結果證實期望產物(例如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或腐胺，特定而言BDO)之高產率。已證實，此等修飾增加BDO之產物產率。此等有益修飾(包括增加及降低酶表現)使CO2損失降低，減少副產物(例如乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯、丙胺酸、麩胺酸酯及GBL)形成。其他修飾減少自諸如BDO等期望產物至途徑中間體或前體(例如TCA循環中之彼等)之回流。已藉由以下步驟進行其他改良：鑑別更有效地實施期望途徑反應之酶及視情況使該酶經過進化以生成具有經改良特性(例如受質轉變為產物增加、穩定性及諸如此類)之變體。此等酶包括cat2、醛去氫酶及醛去氫酶，如本文所揭示。另外，已測試各種啟動子來鑑別使基因更有效轉錄之啟動子變體。另外，如本文所揭示，各種回流及副產物反應可降低期望途徑中產物形成之效率。在一些情況下，若途徑酶之較高表現導致副產物形成增加，則可藉由降低途徑酶之表現來增加產物產率。例如，已對醛去氫酶觀察到此一結果，其中較低表現減少乙醇產生，而不減少BDO產生。
在本申請案通篇內，已引用了各種出版物。該等出版物之揭示內容的全部內容(包括GenBank及GI編號出版物)皆以引用方式併入本申請案中，以便更全面地闡述本發明所屬之最新技術狀態。儘管已參考上文提供之實例闡述本發明，但應理解，可作出各種修改，此並不背離本發明之精神。
<110> 美商奇諾麥提卡公司
<120> 製造4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇及相關化合物之微生物及方法
<130> 871943-228191
<140>
<141>
<150> 61/655,429
<151> 2012-06-04
<160> 180
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 1
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 2
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 3
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 6
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 7
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 8
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 9
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 10
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 丙酮丁醇梭菌
<400> 11
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 12
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 13
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 14
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 17
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 18
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 19
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 22
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 23
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 24
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 25
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 26
<210> 27
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 27
<210> 28
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 28
<210> 29
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 29
<210> 30
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 30
<210> 31
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 31
<210> 32
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 32
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 33
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 34
<210> 35
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 35
<210> 36
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 36
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 37
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 38
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 39
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 40
<210> 41
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 41
<210> 42
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 42
<210> 43
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 43
<210> 44
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 44
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> 纖細裸藻
<400> 45
<210> 46
<211> 2036
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 46
<210> 47
<211> 388
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 47
<210> 48
<211> 289
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 48
<210> 49
<211> 3696
<212> DNA
<213> 牛分枝桿菌
<400> 49
<210> 50
<211> 1231
<212> PRT
<213> 牛分枝桿菌
<400> 50
<210> 51
<211> 1356
<212> DNA
<213> 牙齦卟啉單胞菌
<400> 51
<210> 52
<211> 451
<212> PRT
<213> 牙齦卟啉單胞菌
<400> 52
<210> 53
<211> 1116
<212> DNA
<213> 牙齦卟啉單胞菌
<400> 53
<210> 54
<211> 371
<212> PRT
<213> 牙齦卟啉單胞菌
<400> 54
<210> 55
<211> 1296
<212> DNA
<213> 牙齦卟啉單胞菌
<400> 55
<210> 56
<211> 431
<212> PRT
<213> 牙齦卟啉單胞菌
<400> 56
<210> 57
<211> 906
<212> DNA
<213> 丙酮丁醇梭菌
<400> 57
<210> 58
<211> 301
<212> PRT
<213> 丙酮丁醇梭菌
<400> 58
<210> 59
<211> 1068
<212> DNA
<213> 丙酮丁醇梭菌
<400> 59
<210> 60
<211> 355
<212> PRT
<213> 丙酮丁醇梭菌
<400> 60
<210> 61
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 61
<210> 62
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 62
<210> 63
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 63
<210> 64
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 64
<210> 65
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 65
<210> 66
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 66
<210> 67
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 67
<210> 68
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 68
<210> 69
<211> 1407
<212> DNA
<213> 拜氏梭菌
<400> 69
<210> 70
<211> 468
<212> PRT
<213> 拜氏梭菌
<400> 70
<210> 71
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 71
<210> 72
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 72
<210> 73
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 73
<210> 74
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 74
<210> 75
<211> 1023
<212> DNA
<213> 熱葡糖苷酶地芽胞桿菌
<400> 75
<210> 76
<211> 340
<212> PRT
<213> 熱葡糖苷酶地芽胞桿菌
<400> 76
<210> 77
<211> 4090
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 77
<210> 78
<211> 475
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 78
<210> 79
<211> 475
<212> PRT
<213> 肺炎克雷伯氏菌
<400> 79
<210> 80
<211> 347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 80
<210> 81
<211> 4678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 81
<210> 82
<211> 1114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (323)..(958)
<400> 82
<210> 83
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 83
<210> 84
<211> 2521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 84
<210> 85
<211> 3010
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 85
<210> 86
<211> 4180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 86
<210> 87
<211> 4960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 87
<210> 88
<211> 5083
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 88
<210> 89
<211> 5097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 89
<210> 90
<211> 3525
<212> DNA
<213> 伊文思奴卡菌
<400> 90
<210> 91
<211> 1174
<212> PRT
<213> 伊文思奴卡菌
<400> 91
<210> 92
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 92
<210> 93
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 93
<210> 94
<211> 3522
<212> DNA
<213> 恥垢分枝桿菌
<400> 94
<210> 95
<211> 1173
<212> PRT
<213> 恥垢分枝桿菌
<400> 95
<210> 96
<211> 3522
<212> DNA
<213> 鳥分枝桿菌
<400> 96
<210> 97
<211> 1173
<212> PRT
<213> 鳥分枝桿菌
<400> 97
<210> 98
<211> 3525
<212> DNA
<213> 海棲分枝桿菌
<400> 98
<210> 99
<211> 1174
<212> PRT
<213> 海棲分枝桿菌
<400> 99
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 100
<210> 101
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 101
<210> 102
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 102
<210> 103
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 103
<210> 104
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 104
<210> 105
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 105
<210> 106
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 106
<210> 107
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 107
<210> 108
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 108
<210> 109
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 109
<210> 110
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 110
<210> 111
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 111
<210> 112
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 112
<210> 113
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 113
<210> 114
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 114
<210> 115
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 115
<210> 116
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 116
<210> 117
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 117
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 118
<210> 119
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 119
<210> 120
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 120
<210> 121
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 121
<210> 122
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 122
<210> 123
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 123
<210> 124
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 124
<210> 125
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 125
<210> 126
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 126
<210> 127
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 127
<210> 128
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 128
<210> 129
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 129
<210> 130
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 130
<210> 131
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 131
<210> 132
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 132
<210> 133
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 133
<210> 134
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 134
<210> 135
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 135
<210> 136
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 136
<210> 137
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 137
<210> 138
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 138
<210> 139
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 139
<210> 140
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 140
<210> 141
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 141
<210> 142
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 142
<210> 143
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 143
<210> 144
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 144
<210> 145
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 145
<210> 146
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 146
<210> 147
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 147
<210> 148
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 148
<210> 149
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 149
<210> 150
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 150
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 151
<210> 152
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 152
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 153
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 154
<210> 155
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 155
<210> 156
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 156
<210> 157
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 157
<210> 158
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 158
<210> 159
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 159
<210> 160
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 160
<210> 161
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 161
<210> 162
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 162
<210> 163
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 163
<210> 164
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成引子
<400> 164
<210> 165
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 165
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 166
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 167
<210> 168
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 168
<210> 169
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 169
<210> 170
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 170
<210> 171
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 171
<210> 172
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 172
<210> 173
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸
<400> 173
<210> 174
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 174
<210> 175
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 175
<210> 176
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多核苷酸
<400> 176
<210> 177
<211> 792
<212> DNA
<213> 中間耶氏桿菌
<400> 177
<210> 178
<211> 771
<212> DNA
<213> 根癌土壤桿菌
<400> 178
<210> 179
<211> 263
<212> PRT
<213> 中間耶氏桿菌
<400> 179
<210> 180
<211> 256
<212> PRT
<213> 根癌土壤桿菌
<400> 180

Claims (28)

  1. 一種非天然微生物，該微生物具有4-羥基丁酸酯途徑且能夠產生4-羥基丁酸酯，其中該微生物包含遺傳修飾，該遺傳修飾選自：(A)增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表現之遺傳修飾；(B)增加α-酮戊二酸去氫酶表現之遺傳修飾；(C)增加非磷酸轉移酶(PTS)葡萄糖吸收系統表現之遺傳修飾；(D)增加γ-丁內酯酯酶表現之遺傳修飾；(E)降低琥珀醯基-CoA合成酶表現之遺傳修飾；(F)降低醯基輔酶A硫酯酶表現之遺傳修飾；(G)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾；(H)降低非產能NADH去氫酶表現之遺傳修飾；(I)降低細胞色素氧化酶表現之遺傳修飾；及(J)(A)至(I)項之遺傳修飾中之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種或全部的組合。
  2. 如請求項1之微生物，其中(D)或(F)項之該微生物進一步包含4-羥基丁醯基-CoA途徑。
  3. 如請求項1之微生物，其中該微生物進一步包含1,4-丁二醇途徑。
  4. 如請求項1至3中任一項之微生物，其進一步包含選自以下之代謝修飾：(i)增加丙酮酸去氫酶表現之遺傳修飾；(ii)降低好氧性呼吸控制調節系統表現之遺傳修飾；(iii)增加NADH不敏感之檸檬酸合成酶表現之遺傳修飾；(iv)降低蘋果酸去氫酶表現之遺傳修飾； (v)降低乳酸去氫酶表現之遺傳修飾；(vi)降低醇去氫酶表現之遺傳修飾；(vii)降低丙酮酸甲酸裂解酶表現之遺傳修飾；及(viii)(i)至(vii)項之遺傳修飾中之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種或全部的組合。
  5. 如請求項1至4中任一項之微生物，其中該微生物包含選自表62、表63或圖91之代謝修飾。
  6. 如請求項1至5中任一項之微生物，其中：(K)(A)、(B)或(C)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙胺酸或其組合之產生減少；(L)(B)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，麩胺酸酯之產生減少；(M)(C)項之微生物具有包括增加通透酶、葡萄糖激或葡萄糖促進劑或其組合之表現之遺傳修飾；(N)(D)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，γ-丁內酯之產生減少；(O)(E)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，4-羥基丁酸酯之產生增加；(P)(F)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，γ-丁內酯之產生減少；(Q)(F)項之微生物具有之遺傳修飾包括降低至少兩種醯基輔酶A硫酯酶之表現的至少兩種遺傳修飾；(R)(G)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，自該4-羥基丁酸酯途徑之下游產物之回流減少； (S)(H)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，NADH庫之消耗受到抑制或該微生物中之能量效率增加或其組合；(T)(I)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，能量效率增加；或(U)(I)項之微生物相對於不存在該遺傳修飾之親本微生物，對一段氧濃度範圍之耐受性增加。
  7. 一種產生4-羥基丁酸酯之方法，其包括由如請求項1、2或4至6中任一項之非天然微生物在條件下培養足以產生4-羥基丁酸酯之時間。
  8. 一種產生1,4-丁二醇之方法，其包括由如請求項3至6中任一項之非天然微生物在條件下培養足以產生1,4-丁二醇之時間。
  9. 如請求項7或8中任一項之方法，其中該非天然微生物係在實質上厭氧性之培養基中。
  10. 如請求項7至9中任一項之方法，其中利用蒸餾法純化該4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇。
  11. 一種產生經分離或純化之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇之方法，其包括由如請求項3至6中任一項之非天然微生物在條件下培養足以產生4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇之時間，及分離或純化該4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇。
  12. 如請求項11之方法，其中該分離或純化法包括蒸餾法。
  13. 一種包含生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇之培養基，其中該生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇具有反映大氣二氧化碳吸收來源之碳-12、碳-13及碳-14同位素比率且係由如請求項1至6中任一項之微生物產生。
  14. 如請求項13之培養基，其中該培養基係從具有4-羥基丁酸酯、1- 4-羥基丁醯基-CoA或1,4-丁二醇途徑之微生物中分離。
  15. 一種生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇，其具有反映大氣二氧化碳吸收來源之碳-12、碳-13及碳-14同位素比率且係由如請求項1至6中任一項之微生物產生。
  16. 如請求項15之生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇，其中該生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%之Fm值。
  17. 一種生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇，其係如請求項7至12中任一項之方法產生。
  18. 一種組合物，其包含如請求項15至17中任一項之生物衍生之該4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇及除了該生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇以外之化合物。
  19. 如請求項18之組合物，其中除了該生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇以外之化合物係具有4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇途徑之非天然微生物之細胞部分。
  20. 一種組合物，其包含如請求項15至17中任一項之生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇或其溶胞物或培養物上清液。
  21. 一種生物性產物，其包含如請求項15至17中任一項之生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇，其中該生物性產物係塑膠、彈性纖維、聚胺基甲酸酯、聚酯、聚羥基烷酸酯、聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)或其共聚物、聚(四亞甲基醚)二醇(PTMEG)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚胺基甲酸酯-聚脲共聚物或尼龍(nylon)。
  22. 如請求項21之生物性產物，其包含至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇。
  23. 如請求項21或22之生物性產物，其中該生物性產物之至少一部 分包含生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇作為重複單元。
  24. 一種模製產物，其係由如請求項21至23中任一項之生物性產物進行模製獲得。
  25. 一種產生如請求項21至23中任一項之生物性產物之方法，其包括使該生物衍生之4-羥基丁酸酯或1,4-丁二醇與其本身或與另一化合物在產生該生物性產物之反應中發生化學反應。
  26. 一種減少細胞或細胞培養物中γ-丁內酯產生之方法，其包括在該細胞中表現編碼γ-丁內酯酯酶之核酸。
  27. 如請求項26之方法，其中該γ-丁內酯酯酶係耶氏桿菌屬(Yersinia)之γ-丁內酯酯酶或與耶氏桿菌屬之γ-丁內酯酯酶具有至少90%一致性之多肽。
  28. 如請求項26或27中任一項之方法，其包括在該細胞中表現編碼胺基酸序列SEQ ID NO：179之核酸或編碼與SEQ ID NO：179具有至少90%一致性之多肽之核酸。
TW102119681A 2012-06-04 2013-06-03 製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法 TW201410865A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261655429P 2012-06-04 2012-06-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201410865A true TW201410865A (zh) 2014-03-16

Family

ID=49712814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102119681A TW201410865A (zh) 2012-06-04 2013-06-03 製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法

Country Status (8)

Country Link
US (4) US11932845B2 (zh)
EP (2) EP3831951A3 (zh)
CN (2) CN111705028A (zh)
AR (1) AR093753A1 (zh)
BR (1) BR112014030202A2 (zh)
SI (1) SI2855687T1 (zh)
TW (1) TW201410865A (zh)
WO (1) WO2013184602A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113122563A (zh) * 2021-04-22 2021-07-16 洛阳华荣生物技术有限公司 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3831951A3 (en) * 2012-06-04 2021-09-15 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
EP2909325A4 (en) * 2012-10-22 2016-05-25 Genomatica Inc MICROORGANISMS AND METHODS FOR ENHANCING THE AVAILABILITY OF REDUCING EQUIVALENTS IN THE PRESENCE OF METHANOL, AND THE PRODUCTION OF SUCCINATE CORRESPONDING
EP2924122B1 (en) * 2012-11-26 2017-08-23 Showa Denko K.K. 1,4-butanediol manufacturing method and microorganism
US20140371417A1 (en) 2013-04-26 2014-12-18 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
ES2800606T3 (es) 2013-12-27 2021-01-04 Genomatica Inc Métodos y organismos con mayores eficiencias del flujo de carbono
US20150259311A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of producing lactone from hydroxycarboxylic acid or dicarboxylic acid in aqueous solution
US10227616B2 (en) 2014-04-16 2019-03-12 Novamont S.P.A. Process for the production of 1,4-butanediol
WO2015167043A1 (ko) * 2014-04-30 2015-11-05 삼성전자 주식회사 증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올 생산방법
EP2944697A1 (en) 2014-05-13 2015-11-18 Evonik Degussa GmbH Method of producing nylon
CN104164398A (zh) * 2014-06-30 2014-11-26 天津大学 大肠杆菌呼吸链单基因失活株及应用
US20170298363A1 (en) * 2014-09-18 2017-10-19 Genomatica, Inc Non-natural microbial organisms with improved energetic efficiency
CN107404882A (zh) 2015-02-27 2017-11-28 白狗实验室有限公司 用于生产丙酮、异丙醇、丁酸、其他生物产品及其混合物的混合营养发酵方法
CN105985987B (zh) * 2015-03-02 2020-01-31 苏州安捷生物科技有限公司 一种生物法制备脂肪醇的方法
CA2989087A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Evonik Degussa Gmbh A method of producing alcohols
CA2897454C (en) 2015-07-03 2023-03-14 Governing Council Of The University Of Toronto Microorganisms and methods for biosynthesis of adipic acid
WO2017102952A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Evonik Degussa Gmbh A genetically modified acetogenic cell
MY187786A (en) 2016-07-27 2021-10-22 Evonik Operations Gmbh N-acetyl homoserine
CN108624516B (zh) * 2017-03-20 2022-08-26 华东理工大学 一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备idms标准品的方法
BR112019020461A2 (pt) 2017-03-31 2020-06-09 Genomatica Inc variantes de aldeído desidrogenase e métodos de uso
CN111819284B (zh) * 2018-03-02 2024-03-08 三菱化学株式会社 3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法
CN108410831B (zh) * 2018-03-22 2021-07-27 浙江工业大学 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN108517324B (zh) * 2018-04-17 2021-07-13 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因
CN113179645A (zh) 2018-09-26 2021-07-27 基因组股份公司 醛脱氢酶变体及其使用方法
FR3086670A1 (fr) * 2018-09-28 2020-04-03 IFP Energies Nouvelles Procede de production d’alcools avec clostridium sur support solide
FR3088324B1 (fr) * 2018-11-08 2020-10-09 Inst Des Sciences Et Industries Du Vivant Et De Lenvironnement Agroparistech Procede biocatalytique de production de 2h-hbo a partir de lgo utilisant une cyclohexanone monooxygenase
CN109943550B (zh) * 2019-03-26 2021-01-26 自然资源部第二海洋研究所 一种海洋细菌来源酯酶Erp3及其编码基因与应用
IL300042A (en) * 2020-07-24 2023-03-01 Univ Duke Methods and compositions for the production of acetyl-COA derivatives
CN111924980A (zh) * 2020-08-05 2020-11-13 盐城工学院 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌去除富营养废水中六价铬的应用
CN112746067B (zh) * 2021-01-26 2023-10-31 洛阳华荣生物技术有限公司 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体
CN113278658B (zh) * 2021-05-21 2022-09-30 山东阜丰发酵有限公司 提高l-苹果酸发酵效率的生物工艺
CN114807206B (zh) * 2022-03-28 2023-03-21 珠海麦得发生物科技股份有限公司 合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用
CN114814065B (zh) * 2022-04-12 2023-12-01 上海交通大学 幽门螺旋杆菌的唾液中voc标志物及其在制备诊断试剂中的应用
CN114836343B (zh) * 2022-04-19 2024-03-15 河北科技大学 一株能高产γ-氨基丁酸且拮抗有害菌的植物乳杆菌P10及其应用
CN116083329A (zh) * 2022-09-26 2023-05-09 北京绿色康成生物技术有限公司 发酵生产γ-丁内酯或1,4-丁二醇的方法

Family Cites Families (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1230276A (zh) 1968-12-09 1971-04-28
JPS4831084B1 (zh) 1970-09-04 1973-09-26
GB1344557A (en) 1972-06-23 1974-01-23 Mitsubishi Petrochemical Co Process for preparing 1,4-butanediol
DE2455617C3 (de) 1974-11-23 1982-03-18 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen Verfahren zur Herstellung von Butandiol und/oder Tetrahydrofuran über die Zwischenstufe des &gamma;-Butyrolactons
DE2501499A1 (de) 1975-01-16 1976-07-22 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von butandiol-(1.4)
JPS575693A (en) 1980-06-13 1982-01-12 Ajinomoto Co Inc Production of l-arginine through fermentation process
US4301077A (en) 1980-12-22 1981-11-17 Standard Oil Company Process for the manufacture of 1-4-butanediol and tetrahydrofuran
IT1190783B (it) 1981-04-29 1988-02-24 Davy Mckee Oil & Chem Processo per l'idrogenolisi di esteri di acidi carbossilici
US4652685A (en) 1985-11-15 1987-03-24 General Electric Company Hydrogenation of lactones to glycols
JPS62285779A (ja) 1986-06-04 1987-12-11 Chiyoda Chem Eng & Constr Co Ltd １，４−ブタンジオ−ル産生バチルス属細菌及びそれを用いる１，４−ブタンジオ−ルの製造方法
US5250430A (en) 1987-06-29 1993-10-05 Massachusetts Institute Of Technology Polyhydroxyalkanoate polymerase
US5245023A (en) 1987-06-29 1993-09-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
US4876331A (en) 1987-08-18 1989-10-24 Mitsubishi Kasei Corporation Copolyester and process for producing the same
DE68923805T2 (de) 1988-04-27 1995-12-07 Daicel Chem Verfahren zur herstellung von optisch aktivem 1,3-butanediol.
US4925608A (en) 1988-09-27 1990-05-15 Norton Company Joining of SiC parts by polishing and hipping
ATE85813T1 (de) 1988-12-12 1993-03-15 Unilever Nv Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 1,3-propandiol aus glycerin.
US5371002A (en) 1989-06-07 1994-12-06 James Madison University Method of production of poly-beta-hydroxyalkanoate copolymers
ATE172497T1 (de) 1989-07-10 1998-11-15 Massachusetts Inst Technology Verfahren zur herstellung von polyester- biopolymeren
GB9011777D0 (en) 1990-05-25 1990-07-18 Ici Plc Hv/hb copolymer production
US5674978A (en) 1990-09-21 1997-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides derived from glutamic acid decarboxylase
US5475086A (en) 1990-09-21 1995-12-12 The Regents Of The University Of California Cloned glutamic acid decarboxylase peptides
US5998366A (en) 1990-09-21 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Method for ameliorating glutamic acid decarboxylase associated autoimmune disorders
US6682906B1 (en) 1990-09-21 2004-01-27 The Regents Of The University Of California Cloned glutamic acid decarboxylase
GB9108756D0 (en) 1991-04-24 1991-06-12 Ici Plc Production of polyalkanoate in plants
US5286842A (en) 1991-07-01 1994-02-15 Mitsubishi Kasei Corporation Process for producing a biodegradable polymer
GB9115245D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Ici Plc Production of polyalkanoate
SK6494A3 (en) 1991-07-19 1994-10-05 Univ Michigan State Transgenic plants material producing polyhydroxyalkanoates
US5610041A (en) 1991-07-19 1997-03-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants
BR9203053A (pt) 1991-08-07 1993-03-30 Ajinomoto Kk Processo para produzir acido l-glutamico pro fermentacao
JP2777757B2 (ja) 1991-09-17 1998-07-23 鐘淵化学工業株式会社 共重合体およびその製造方法
DE4220759A1 (de) 1992-06-24 1994-01-05 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen für Oligosaccharid-Transporter, Plasmide, Bakterien und Pflanzen enthaltend einen Transporter sowie Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen zur Identifikation des Transporteers
GB9223332D0 (en) 1992-11-06 1992-12-23 Ici Plc Production of polyhydroxyalkanoate in plants
EP0625006A4 (en) 1992-11-20 1996-04-24 Agracetus Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic.
JP3263710B2 (ja) 1992-12-11 2002-03-11 高砂香料工業株式会社 生分解性光学活性ポリマー及びその製造方法
JP3241505B2 (ja) 1993-08-11 2001-12-25 高砂香料工業株式会社 生分解性光学活性コポリマー及びその製造方法
PL185681B1 (pl) 1993-10-28 2003-07-31 Ajinomoto Kk Sposób wytwarzania L-aminokwasu przy użyciu mikroorganizmu
GB9414506D0 (en) 1994-07-18 1994-09-07 Zeneca Ltd Improved production of polyhydroxyalkanoate
DE4433134A1 (de) 1994-09-16 1996-03-21 Buck Chem Tech Werke Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinanter Bakterienstämme zur Durchführung des Verfahrens
US5563239A (en) 1994-11-09 1996-10-08 Eastman Chemical Company Composition and process for the production of poly(3-hydroxyalkanoates)
US5478952A (en) 1995-03-03 1995-12-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Ru,Re/carbon catalyst for hydrogenation in aqueous solution
US5747311A (en) 1995-08-22 1998-05-05 Microgen Corporation Process for chemical modification of reactants by microbes
US5869301A (en) 1995-11-02 1999-02-09 Lockhead Martin Energy Research Corporation Method for the production of dicarboxylic acids
US5770435A (en) 1995-11-02 1998-06-23 University Of Chicago Mutant E. coli strain with increased succinic acid production
DE19543635A1 (de) 1995-11-23 1997-05-28 Hp Chemie Pelzer Res & Dev Verbundwerkstoffe aus Polyhydroxyfettsäuren und Fasermaterialien
US5849894A (en) 1995-11-29 1998-12-15 Monsanto Company Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase
KR19990087330A (ko) 1996-02-27 1999-12-27 로저 윌킨슨 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 39e의 2차 알콜 탈수소 효소를코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현과 효소의 생화학적 특성화
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US5959179A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Method for transforming soybeans
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
US6730503B1 (en) 1996-09-19 2004-05-04 Roche Vitamins Inc. Alcohol/aldehyde dehydrogenase
JPH10166664A (ja) 1996-12-12 1998-06-23 Casio Electron Mfg Co Ltd カラー印刷装置
EP0977865A1 (en) 1997-02-13 2000-02-09 James Madison University Methods of making polyhydroxyalkanoates comprising 4-hydroxybutyrate monomer units
US6759219B2 (en) 1997-03-03 2004-07-06 Metabolix, Inc. Methods for the biosynthesis of polyesters
US6156852A (en) 1997-04-21 2000-12-05 Monsanto Company Hydroxy-terminated polyhydroxyalkanoates
DE69837917T2 (de) 1997-04-21 2008-02-21 Metabolix, Inc., Cambridge Endstellige hydroxyl aufweisende polyhydroxyalkanoate
KR19990013007A (ko) 1997-07-31 1999-02-25 박원훈 형질전환된 대장균 ｓｓ373(ｋｃｔｃ 8818ｐ)과 이를 이용한숙신산의 생산방법
WO1999014313A2 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Metabolix, Inc. Biological systems for manufacture of polyhydroxylalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids
EP1710302B1 (en) 1997-09-19 2007-11-21 Metabolix, Inc. Biological systems for manufacture of polyhydroxyalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids
US6228579B1 (en) 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
US6280986B1 (en) 1997-12-01 2001-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Stabilization of pet operon plasmids and ethanol production in bacterial strains lacking lactate dehydrogenase and pyruvate formate lyase activities
US6159738A (en) 1998-04-28 2000-12-12 University Of Chicago Method for construction of bacterial strains with increased succinic acid production
ATE385521T1 (de) 1998-08-04 2008-02-15 Metabolix Inc Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen
CA2339421C (en) 1998-08-18 2011-10-11 Metabolix, Inc. Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers
DE19856136C2 (de) 1998-12-04 2002-10-24 Pasteur Institut Verfahren und Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in Suspension
US6835820B2 (en) 1999-01-07 2004-12-28 The University Of Massachusetts Polyhydroxyalkanoate biosynthesis associated proteins and coding region in bacillus megaterium
EP1147229A2 (en) 1999-02-02 2001-10-24 Bernhard O. Palsson Methods for identifying drug targets based on genomic sequence data
US6686310B1 (en) 1999-02-09 2004-02-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company High surface area sol-gel route prepared hydrogenation catalysts
US6448473B1 (en) 1999-03-05 2002-09-10 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
AU3798900A (en) 1999-04-09 2000-11-14 University Of Guelph Novel proteins related to gaba metabolism
KR100329019B1 (ko) 1999-04-13 2002-03-18 윤덕용 유기산의 고효율 생산방법
EP1204755B1 (en) 1999-08-18 2006-08-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol
US6361983B1 (en) 1999-09-30 2002-03-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the isolation of 1,3-propanediol from fermentation broth
DE19956686A1 (de) 1999-11-25 2001-05-31 Degussa Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen
US6897055B2 (en) 1999-11-25 2005-05-24 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the genes sucC and sucD
ATE329048T1 (de) 2000-07-21 2006-06-15 Metabolix Inc Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen
US6495152B2 (en) 2000-08-18 2002-12-17 Tepha, Inc. Sulfur containing polyhydroxyalkanoate compositions and method of production
US6916637B2 (en) 2000-09-30 2005-07-12 Degussa Ag Fermentation process for the preparation of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae
CA2429039A1 (en) 2000-11-20 2002-05-30 Cargill, Incorporated 3-hydroxypropionic acid and other organic compounds
WO2002053746A1 (en) 2000-12-28 2002-07-11 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Process for producing prenyl alcohol
US7711490B2 (en) 2001-01-10 2010-05-04 The Penn State Research Foundation Method and system for modeling cellular metabolism
US7127379B2 (en) 2001-01-31 2006-10-24 The Regents Of The University Of California Method for the evolutionary design of biochemical reaction networks
US20030059792A1 (en) 2001-03-01 2003-03-27 Palsson Bernhard O. Models and methods for determining systemic properties of regulated reaction networks
US7052883B2 (en) 2001-04-03 2006-05-30 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene
WO2003008604A2 (en) 2001-07-18 2003-01-30 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aceb gene
US20090158452A1 (en) 2001-12-04 2009-06-18 Johnson Richard G Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CN1217001C (zh) 2002-01-04 2005-08-31 清华大学 一种生产d－(－)－3－羟基丁酸的方法
EP1575881B1 (en) 2002-01-18 2009-05-27 Novozymes A/S Alanine 2,3- aminomutase
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US20030224363A1 (en) 2002-03-19 2003-12-04 Park Sung M. Compositions and methods for modeling bacillus subtilis metabolism
WO2003082214A2 (en) 2002-03-29 2003-10-09 Genomatica, Inc. Human metabolic models and methods
US20050287655A1 (en) 2002-05-10 2005-12-29 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing mevalonic acid
US7856317B2 (en) 2002-06-14 2010-12-21 Genomatica, Inc. Systems and methods for constructing genomic-based phenotypic models
AU2003256480B2 (en) 2002-07-10 2008-03-06 The Penn State Research Foundation Method for determining gene knockout strategies
WO2004007688A2 (en) 2002-07-15 2004-01-22 Kosan Biosciences, Inc. Metabolic pathways for starter units in polyketide biosynthesis
EP1537222B1 (en) 2002-08-09 2011-03-09 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives
US7132267B2 (en) 2002-08-09 2006-11-07 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives and vicinal cyano, hydroxy substituted carboxylic acid esters
ATE505559T1 (de) 2002-09-12 2011-04-15 Metabolix Inc Produktion von polyhydroxyalkanoat mittels coenzym-a-abhängiger aldehyd-dehydrogenase-wege
CN100558886C (zh) 2002-09-27 2009-11-11 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 醛脱氢酶基因
EP1552472A4 (en) 2002-10-15 2008-02-20 Univ California METHODS AND SYSTEMS FOR IDENTIFYING FUNCTIONAL REACTION PATHWAYS
US20040152159A1 (en) 2002-11-06 2004-08-05 Causey Thomas B. Materials and methods for the efficient production of acetate and other products
US7056714B2 (en) 2003-03-11 2006-06-06 University Of Iowa Research Foundation, Inc. Carboxylic acid reductase polypeptide, nucleotide sequence encoding same and methods of use
US7927859B2 (en) 2003-08-22 2011-04-19 Rice University High molar succinate yield bacteria by increasing the intracellular NADH availability
CA2535710A1 (en) 2003-09-18 2005-03-24 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Alcohol dehydrogenases with increased solvent and temperature stability
RU2376369C2 (ru) 2003-11-27 2009-12-20 Корея Эдванст Инститьют Оф Сайенс Энд Текнолоджи МУТАНТ БАКТЕРИИ РУБЦА РОДА Mannheimia (ВАРИАНТЫ) - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ
FR2863168A1 (fr) 2003-12-04 2005-06-10 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'inducteurs de la voie de degradation de la gamma-butyrolactone pour inactiver le signal n-acy homoserine lactone.
FR2864967B1 (fr) 2004-01-12 2006-05-19 Metabolic Explorer Sa Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol
DE102004031177A1 (de) 2004-06-29 2006-01-19 Henkel Kgaa Neue Geruchsstoffe bildende Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren
KR100656590B1 (ko) 2004-07-30 2006-12-11 한국과학기술원 박테리아 변이균주 및 이를 이용한 숙신산 및 아미노산의제조방법
US7601858B2 (en) 2004-08-17 2009-10-13 Gs Cleantech Corporation Method of processing ethanol byproducts and related subsystems
US7223567B2 (en) 2004-08-27 2007-05-29 Rice University Mutant E. coli strain with increased succinic acid production
GB0419424D0 (en) 2004-09-02 2004-10-06 Viragen Scotland Ltd Transgene optimisation
JP4712716B2 (ja) 2004-09-09 2011-06-29 財団法人地球環境産業技術研究機構 プロモーター機能を有するｄｎａ断片
WO2006069174A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Rice University Simultaneous anaerobic production of isoamyl acetate and succinic acid
KR100727054B1 (ko) 2005-08-19 2007-06-12 한국과학기술원 푸마레이트 하이드라타제 ｃ를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
KR100679638B1 (ko) 2005-08-19 2007-02-06 한국과학기술원 포메이트 디하이드로게나제 ｄ 또는 ｅ를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
KR100676160B1 (ko) 2005-08-19 2007-02-01 한국과학기술원 말릭효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
CN101300356A (zh) 2005-09-09 2008-11-05 基因组股份公司 用于琥珀酸盐之生长关联性生产的方法和生物
US9297028B2 (en) 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US20080274526A1 (en) 2007-05-02 2008-11-06 Bramucci Michael G Method for the production of isobutanol
KR20070096348A (ko) 2006-03-23 2007-10-02 주식회사 엘지화학 1,4―ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ〔１，４―ＢＤＯ〕생성능을가지는 변이체 및 이를 이용한 １，４―ＢＤＯ의 제조방법
WO2008018930A2 (en) 2006-05-01 2008-02-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production in non-recombinant hosts
US8962298B2 (en) 2006-05-02 2015-02-24 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cell comprising a diol dehydratase
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
EP2064321B1 (en) 2006-08-30 2016-03-09 Cargill, Incorporated Beta-alanine/alpha-ketoglutarate aminotransferase for 3-hydroxypropionic acid production
US8017364B2 (en) 2006-12-12 2011-09-13 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Solvent tolerant microorganisms
CA2678946C (en) 2007-03-16 2019-02-12 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
CA2688938C (en) 2007-03-20 2018-01-16 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for efficient succinate and malate production
US20090111154A1 (en) 2007-04-04 2009-04-30 The Regents Of The University Of California Butanol production by recombinant microorganisms
WO2008131286A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing isopropanol
ES2426070T3 (es) 2007-04-18 2013-10-21 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Producción fermentativa de isobutanol utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas muy activas
US8426174B2 (en) 2007-05-02 2013-04-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 2-butanol
US8426173B2 (en) 2007-05-02 2013-04-23 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 1-butanol
WO2008144626A1 (en) 2007-05-18 2008-11-27 Microbia Precision Engineering, Inc. Malic acid production in recombinant yeast
US20110039327A1 (en) 2007-05-18 2011-02-17 Aaron Adriaan Winkler Organic acid production by fungal cells
US20090023182A1 (en) 2007-07-18 2009-01-22 Schilling Christophe H Complementary metabolizing organisms and methods of making same
US7947483B2 (en) 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
KR101042242B1 (ko) 2007-09-07 2011-06-17 한국과학기술원 1,4-부탄디올 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한1,4-부탄디올의 제조방법
WO2009049274A2 (en) 2007-10-12 2009-04-16 The Regents Of The University Of California Microorganism engineered to produce isopropanol
SG186647A1 (en) 2007-12-13 2013-01-30 Glycos Biotechnologies Inc Microbial conversion of oils and fatty acids to high-value chemicals
WO2009094485A1 (en) 2008-01-22 2009-07-30 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
US20090246842A1 (en) 2008-02-15 2009-10-01 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing propanol
WO2009103026A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing isopropanol
CN102015995B (zh) 2008-03-03 2014-10-22 焦耳无限科技公司 产生碳基目的产物的二氧化碳固定工程微生物
US8216820B2 (en) 2008-04-25 2012-07-10 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Transformant of coryneform bacteria capable of producing isopropanol
JP2011519561A (ja) 2008-05-01 2011-07-14 ジェノマティカ， インコーポレイテッド メタクリル酸の産生のための微生物
EP2313491A4 (en) * 2008-07-08 2011-12-07 Opx Biotechnologies Inc METHODS, COMPOSITIONS AND SYSTEMS FOR BIOSYNTHETIC BIOPRODUCTION OF 1,4-BUTANEDIOL
US20100021978A1 (en) * 2008-07-23 2010-01-28 Genomatica, Inc. Methods and organisms for production of 3-hydroxypropionic acid
WO2010030711A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
US8354563B2 (en) 2008-10-16 2013-01-15 Maverick Biofuels, Inc. Methods and apparatus for synthesis of alcohols from syngas
WO2010071697A1 (en) 2008-12-16 2010-06-24 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products
JP5774493B2 (ja) 2008-12-31 2015-09-09 メタボリック エクスプローラー ジオールの生産方法
US20110014669A1 (en) 2009-01-23 2011-01-20 Microbia, Inc. Production of 1,4 Butanediol in a Microorganism
EP3392340B1 (en) * 2009-06-04 2022-01-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
VN29235A1 (zh) 2009-06-04 2012-03-26
WO2011031897A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the co-production of isopropanol with primary alcohols, diols and acids
WO2011047101A1 (en) 2009-10-13 2011-04-21 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
US8530210B2 (en) * 2009-11-25 2013-09-10 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
KR20120120493A (ko) 2009-12-10 2012-11-01 게노마티카 인코포레이티드 합성 가스 또는 기타 가스상 탄소원 및 메탄올을 1,3-부탄디올로 변환하는 방법 및 변환용 유기체
CN102781926B (zh) 2010-02-11 2016-11-09 梅塔玻利克斯公司 γ-丁内酯的生产方法
US8048661B2 (en) * 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
WO2011137192A1 (en) 2010-04-27 2011-11-03 The Regents Of The University Of California Production of 1,4-butanediol by recombinant microorganisms
WO2012001003A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Metabolic Explorer Method for the preparation of hydroxy acids
RU2626531C2 (ru) * 2010-10-28 2017-07-28 Адиссео Франс С.А.С. Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты
EP2511377A1 (en) 2011-04-14 2012-10-17 B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG Means and methods for producing crotonic acid
AU2012272856A1 (en) 2011-06-22 2013-05-02 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
KR20130094115A (ko) 2012-02-15 2013-08-23 삼성전자주식회사 1,4-부탄디올의 생산을 위한 변형 미생물
EP3831951A3 (en) 2012-06-04 2021-09-15 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
US9657316B2 (en) 2012-08-27 2017-05-23 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing 1,4-butanediol related thereto
US20140275465A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genomatica, Inc. Process and systems for obtaining 1,4-butanediol from fermentation broths
AU2014239256B2 (en) 2013-03-15 2018-11-08 Genomatica, Inc. Process and systems for obtaining 1,4-butanediol from fermentation broths
US20140371417A1 (en) 2013-04-26 2014-12-18 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113122563A (zh) * 2021-04-22 2021-07-16 洛阳华荣生物技术有限公司 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法
CN113122563B (zh) * 2021-04-22 2023-12-08 洛阳华荣生物技术有限公司 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20170362565A1 (en) 2017-12-21
US20230065295A1 (en) 2023-03-02
EP3831951A2 (en) 2021-06-09
WO2013184602A2 (en) 2013-12-12
EP2855687B1 (en) 2020-04-22
BR112014030202A2 (pt) 2017-09-12
EP3831951A3 (en) 2021-09-15
AR093753A1 (es) 2015-06-24
CN111705028A (zh) 2020-09-25
EP2855687A4 (en) 2016-09-14
US11085015B2 (en) 2021-08-10
WO2013184602A3 (en) 2014-01-30
CN104685058B (zh) 2020-07-07
US9677045B2 (en) 2017-06-13
CN104685058A (zh) 2015-06-03
US11932845B2 (en) 2024-03-19
EP2855687A2 (en) 2015-04-08
US20150148513A1 (en) 2015-05-28
SI2855687T1 (sl) 2020-09-30
US20140030779A1 (en) 2014-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230065295A1 (en) Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
US10662451B2 (en) Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
US11572564B2 (en) Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
US20190264240A1 (en) Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
TWI494434B (zh) 製備１，４－丁二醇之微生物
EP2438178B1 (en) Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
EP2989113B1 (en) Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
AU2013203176A1 (en) Microorganisms for the production of 1,4-butanediol,4-hydroxybutanal, 4-hydroxy-butyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto