TWI494434B - 製備１，４－丁二醇之微生物 - Google Patents

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Description

製備1,4-丁二醇之微生物
本發明大體上係關於生物體之電腦模擬(in silico )設計，且更特定言之，係關於具有1,4-丁二醇生物合成能力之生物體。
本申請案主張2008年9月10日申請之美國臨時申請案第61/191,710號及2008年9月17日申請之美國臨時申請案第61/192,511號之優先權，各申請案之全部內容均以引用的方式併入本文中。
化合物4-羥基丁酸(4-hydroxybutanoic acid；4-hydroxybutanoate；4-hydroxybutyrate；4-HB)為有工業潛力作為各種日用品及專業化學品之建構嵌段的4-碳羧酸。詳言之，4-HB有潛力作為1,4-丁二醇族化學品之新入口點，該族化學品包括溶劑、樹脂、聚合物前驅體及專業化學品。1,4-丁二醇(BDO)為具有每年約30億磅之全球市場的聚合物中間物及工業溶劑。BDO目前係由石油化學前驅體，主要由乙炔、順丁烯二酸酐及環氧丙烷製造。
舉例而言，在雷普合成反應(Reppe synthesis reaction)中使乙炔與兩分子甲醛反應(Kroschwitz及Grant,Encyclopedia of Chem. Tech .,John Wiley and Sons,Inc.,New York(1999))，接著催化氫化以形成1,4-丁二醇。據估計美國生產之乙炔的90%被消耗用於丁二醇製造。或者，其可由衍生自丁烷之順丁烯二酸酐的酯化及催化氫化形成。在下游階段，丁二醇可進一步轉化；例如藉由氧化轉化成γ-丁內酯，γ-丁內酯可進一步轉化成吡咯啶酮及N-甲基-吡咯啶酮，或藉由氫解轉化成四氫呋喃。此等化合物具有多種用途，如用作聚合物中間物、溶劑及添加劑，且具有每年合計接近20億磅之市場。
需要開發一種藉由替代方法製造此等化學品之方法，該替代方法不僅用可再生原料替代石油基原料，而且使用較少的能量密集型及資本密集型製程。能源部(Department of Energy)已提出1,4-二酸且尤其琥珀酸作為製造丁二醇族產品的藉由生物學方法製備之關鍵中間物(DOE Report,「Top Value-Added Chemicals from Biomass」,2004)。然而，琥珀酸分離及純化成本高且催化還原為丁二醇需要高溫及高壓。
因此，需要有效製備商業量之1,4-丁二醇及其化學前驅體之替代方法。本發明滿足此需要且亦提供相關優點。
本發明提供一種含有1,4-丁二醇(BDO)路徑之非天然存在之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸。本發明另外提供使用此等微生物製備BDO之方法。
本發明係針對具有4-羥基丁酸(4-HB)、γ-丁內酯及1,4-丁二醇(BDO)之生物合成製備能力之細胞及生物體的設計及製備。本發明尤其係關於能夠藉由引入一或多種編碼BDO路徑酶之核酸來製備BDO之微生物的設計。
在一實施例中，本發明利用大腸桿菌(Escherichia coli )代謝之電腦模擬化學計量模型，該等模型鑑別4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)之生物合成製備之代謝設計。本文所述之結果指示代謝路徑可經設計及重組工程改造以達成4-HB及下游產物(諸如1,4-丁二醇)在大腸桿菌及其他細胞或生物體中的生物合成。例如用於電腦模擬設計之4-HB之生物合成製備可藉由建構具有所設計代謝基因型之菌株來證實。此等代謝工程改造之細胞或生物體亦可進行適應進化以進一步增強4-HB生物合成，包括在接近理論最大生長之條件下。
在某些實施例中，所設計菌株之4-HB生物合成特徵使其具遺傳穩定性且尤其適用於連續生物過程。獨立菌株設計策略經鑑別將不同非天然或異源反應能力併入大腸桿菌或其他宿主生物體中，從而導致4-HB及1,4-丁二醇由CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶產生代謝路徑。已鑑別出電腦模擬代謝設計，其產生4-HB由每一此等代謝路徑在大腸桿菌與酵母物種中的生物合成。1,4-丁二醇中間物γ-丁內酯可在pH<7.5之條件下，尤其在酸性條件下，諸如pH值低於5.5，例如pH<7、pH<6.5、pH<6且尤其在pH<5.5或更低pH值下在培養物中藉由自發環化而產生。
經由平台之計算組件鑑別之菌株可藉由遺傳工程改造任何預測代謝變化而進行實際製備，該等變化導致4-HB、1,4-丁二醇或其他中間物及/或下游產物之生物合成製備。在另一實施例中，展示此等化合物之生物合成製備的菌株可進一步進行適應進化以進一步增強產物生物合成。適應進化後產物生物合成產量水準亦可藉由系統之計算組件預測。
在其他特定實施例中，建構微生物以表現編碼由琥珀酸至4-HB及4-HB-CoA之酶促步驟的4-HB生物合成路徑。與缺乏4-HB生物合成路徑之宿主微生物相比，琥珀酸輔酶A轉移酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、NAD依賴性4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁酸輔酶A轉移酶在宿主微生物中之共同表現導致4-HB的大量產生。在另一特定實施例中，藉由引入編碼α-酮戊二酸去羧酶及NAD依賴性4-羥基丁酸去氫酶之核酸產生利用α-酮戊二酸作為受質之4-HB製備型微生物。
在另一特定實施例中，建構在4-HB存在下培養時生物合成BDO的含有1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之微生物。BDO生物合成路徑由編碼多官能醛/醇去氫酶之核酸或編碼醛去氫酶及醇去氫酶之核酸組成。為支持4-HB受質上之生長，此等BDO製備型微生物亦表現4-羥基丁酸CoA轉移酶或4-丁酸激酶以及磷酸轉羥基丁醯酶。在另一特定實施例中，經由編碼官能4-HB生物合成路徑及官能BDO生物合成路徑之核酸之外源表現產生合成BDO之微生物。4-HB生物合成路徑由琥珀酸輔酶A轉移酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、NAD依賴性4-羥基丁酸去氫酶及4-羥基丁酸輔酶A轉移酶組成。BDO路徑由多官能醛/醇去氫酶組成。本文進一步描述製備BDO之其他路徑(參見圖8-圖13)。
如本文所用之術語「非天然存在」當關於本發明之微生物使用時意欲意謂微生物具有至少一種通常未見於所提及物種之天然存在菌株(包括所提及物種之野生型菌株)中的基因變化。基因變化包括例如引入編碼代謝多肽之可表現核酸的修飾、其他核酸添加、核酸缺失及/或微生物遺傳物質之其他功能破壞。對於所提及物種之異源、同源或異源與同源多肽而言，此等修飾包括例如其編碼區域及功能片段。其他修飾包括例如修飾改變基因或操縱子之表現的非編碼調節區域。例示性代謝多肽包括BDO族化合物之生物合成路徑內之酶或蛋白質。
代謝修飾係指自其天然存在狀態改變之生物化學反應。因此，非天然存在微生物可具有對編碼代謝多肽之核酸或其功能片段的遺傳修飾。本文揭示例示性代謝修飾。
如本文所用之術語「經分離」當關於微生物使用時意欲意謂與自然界中存在之所提及微生物相比實質上不含至少一種組份的生物體。該術語包括與自然環境中所存在之微生物相比移除一些或所有組份的微生物。該術語亦包括與非天然存在之環境中所存在的微生物相比移除一些或所有組份的微生物。因此，與自然界中所存在或非天然存在之環境中所生長、儲存或生存之微生物相比，經分離微生物與其他物質部分或完全分離。經分離微生物之特定實例包括部分純之微生物、實質上純之微生物及在非天然存在之培養基中培養之微生物。
如本文所用之術語「微生物」意欲意謂以微觀細胞形式存在且包括於古菌域、細菌域或真核域中之任何生物體。因此，該術語意欲涵蓋原核或真核細胞或具有微觀尺寸之生物體，且包括所有種類之細菌、古菌及真細菌以及真核微生物，諸如酵母及真菌。該術語亦包括可經培養用於生物化學品製備之任何種類之細胞培養物。
如本文所用之術語「4-羥基丁酸」意欲意謂具有化學式C4 H8 O3 且分子質量為104.11g/mol(其鈉鹽為126.09g/mol)之丁酸之4-羥基衍生物。化合物4-羥基丁酸在此項技術中亦稱為4-HB、4-羥基丁酸鹽、γ-羥基丁酸或GHB。如本文所用之術語意欲包括化合物之各種鹽形式中之任一者且包括例如4-羥基丁酸鹽(4-hydroxybutanoate；4-hydroxybutyrate)。4-HB之鹽形式之特定實例包括4-羥基丁酸鈉及4-羥基丁酸鉀。因此，術語4-羥基丁酸、4-HB、4-羥基丁酸鹽、γ-羥基丁酸及GHB以及其他此項技術中所認可之名稱在本文中同義使用。
如本文所用之術語「單體」當關於4-HB使用時意欲意謂呈非聚合形式或未衍生形式之4-HB。聚合4-HB之特定實例包括聚4-羥基丁酸及例如4-HB與3-HB之共聚物。4-HB之衍生形式之特定實例為4-HB-CoA。此項技術中亦已知4-HB之其他聚合4-HB形式及其他衍生形式。
如本文所用之術語「γ-丁內酯」意欲意謂具有化學式C4 H6 O2 且分子質量為86.089g/mol之內酯。化合物γ-丁內酯在此項技術中亦稱為GBL、丁內酯、1,4-內酯、4-丁內酯、4-羥基丁酸內酯及γ-羥基丁酸內酯。如本文所用之術語意欲包括化合物之各種鹽形式中之任一者。
如本文所用之術語「1,4-丁二醇」意欲意謂帶有兩個羥基之烷烴丁烷之醇衍生物，其具有化學式C4 H10 O2 且分子質量為90.12g/mol。化合物1,4-丁二醇在此項技術中亦稱為BDO且為本文稱為BDO族化合物之化合物家族的化學中間物或前驅體。
如本文所用之術語「四氫呋喃」意欲意謂對應於芳族化合物呋喃之完全氫化類似物之雜環有機化合物，其具有化學式C4 H8 O且分子質量為72.11g/mol。化合物四氫呋喃在此項技術中亦稱為THF、四氫呋喃、1,4-環氧丁烷、環氧丁烷、環四亞甲基氧化物(cyclotetramethylene oxide)、氧雜環戊烷、二環氧乙烷、四氫呋喃(oxolane)、呋喃烷(furanidine)、氫呋喃、氧化四甲基醚。如本文所用之術語意欲包括化合物之各種鹽形式中之任一者。
如本文所用之術語「CoA」或「輔酶A」意欲意謂有機輔因子或輔基(酶之非蛋白質部分)，許多酶(去輔基酶)之活性需要該有機輔因子或輔基存在以形成活性酶系統。輔酶A在某些縮合酶中起作用，在乙醯基或其他醯基轉移中及在脂肪酸合成及氧化中、丙酮酸氧化及其他乙醯化中起作用。
如本文所用之術語「實質上缺氧」當關於培養或生長條件使用時意欲意謂在液體培養基中氧氣之量小於飽和溶氧量之約10%。該術語亦意欲包括液體或固體培養基之密封室維持在小於約1%氧氣之氛圍中。
本發明之非天然存在微生物可含有穩定基因變化，其係指可培養5代以上而無變化損失之微生物。一般而言，穩定基因變化包括持續10代以上之修飾，尤其穩定修飾應持續約25代以上，且更特定言之，穩定遺傳修飾應為50代以上(包括無限期)。
熟習此項技術者應瞭解，包括本文所例示之代謝修飾的基因變化係關於合適宿主或源生物體(諸如大腸桿菌、酵母或本文所揭示之其他生物體)及其相應代謝反應或所要遺傳物質(諸如編碼用於其相應代謝反應之酶的基因)之合適源生物體進行描述。然而，鑒於多種生物體之全基因組測序及基因組領域中之高技術程度，熟習此項技術者將能夠容易地對基本上所有其他生物體應用本文所提供之教示及指導。舉例而言，本文所例示之大腸桿菌代謝變化可容易地藉由併入來自除所提及物種以外之物種的相同或類似編碼核酸而應用於其他物種。此等基因變化包括例如一般而言物種同源物且詳言之直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置換之基因變化。
直系同源物為藉由垂直遺傳相關聯且在不同生物體中負責實質上相同或一致功能之基因。舉例而言，就環氧化物水解之生物功能而言，可將小鼠環氧化物水解酶與人類環氧化物水解酶視為直系同源物。例如當基因共用指示其同源之足夠量的序列相似性時，基因係藉由垂直遺傳相關聯，或基因由於共同祖先而藉由進化相關聯。若基因共用三維結構，但不一定具有足夠指示其自共同祖先進化之量的序列相似性以致一級序列相似性不可識別之程度，則亦可將基因視為直系同源物。直系同源之基因可編碼具有約25%至100%胺基酸序列一致性之序列相似性的蛋白質。若基因之三維結構亦展示相似性，則亦可認為已藉由垂直遺傳產生編碼共用小於25%之胺基酸相似性的蛋白質之基因。認為已藉由自共同祖先垂直遺傳產生包括組織纖維蛋白溶酶原活化劑及彈性蛋白酶之絲胺酸蛋白酶家族成員。
直系同源物包括經由例如進化已在結構或總活性上趨異之基因或其經編碼基因產物。舉例而言，若一個物種編碼展示兩種功能之基因產物且若已將此等功能分離至第二物種之不同基因中，則將該三種基因及其相應產物視為直系同源物。對於生物化學產物之生長偶合製備而言，熟習此項技術者應瞭解，選擇具有待引入或破壞之代謝活性的直系同源基因以建構非天然存在之微生物。展示可分離活性之直系同源物之實例為已將不同活性分離至在兩個或兩個以上物種之間或單一物種內之不同基因產物中。特定實例為將彈性蛋白酶蛋白水解及纖維蛋白溶酶原蛋白水解(兩種類型之絲胺酸蛋白酶活性)分離至不同分子中作為纖維蛋白溶酶原活化劑及彈性蛋白酶。第二實例為分離支原體5'-3'外切核酸酶及果蠅(Drosophila )DNA聚合酶III活性。可將來自第一物種之DNA聚合酶視為來自第二物種之外切核酸酶或聚合酶之任一者或兩者的直系同源物，反之亦然。
相反，旁系同源物為藉由例如複製、繼之以進化趨異相關聯之同源物，且具有類似或共同、但不一致之功能。旁系同源物可源自或衍生自例如相同物種或不同物種。舉例而言，可將微粒體環氧化物水解酶(環氧化物水解酶I)及可溶性環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)視為旁系同源物，此係因為其表示兩種由共同祖先共同進化之不同酶，該等酶在相同物種中催化不同反應且具有不同功能。旁系同源物為來自同一物種且彼此具有顯著序列相似性從而表明其同源或經由自共同祖先共同進化而相關聯之蛋白質。旁系同源蛋白質家族群包括HipA同源物、螢光素酶基因、肽酶及其他。
非直系同源基因置換為可用來自一個物種之非直系同源基因取代不同物種中之所提及基因功能。取代包括例如能夠在原物種中執行與不同物種中之所提及功能相比實質上相同或類似之功能。儘管一般而言，非直系同源基因置換應可鑑別為結構上與編碼所提及功能之已知基因相關，然而結構關聯性較小但功能類似之基因及其相應基因產物仍應屬於如本文所用之術語的含義。功能相似性需要例如在非直系同源基因產物之活性位點或結合區域中與編碼尋求取代之功能之基因相比的至少一些結構相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或不相關基因。
因此，在鑑別及建構具有4-HB、GBL及/或BDO生物合成能力之本發明之非天然存在微生物中，熟習此項技術者應瞭解，在將本文所提供之教示及指導應用於特定物種之情況下，代謝修飾之鑑別可包括直系同源物之鑑別及包含或失活。就旁系同源物及/或非直系同源基因置換係存在於編碼催化類似或實質上類似代謝反應之酶的所提及微生物中而言，熟習此項技術者亦可利用此等進化相關基因。
直系同源物、旁系同源物及非直系同源基因置換可藉由熟習此項技術者熟知之方法測定。舉例而言，檢測兩種多肽之核酸或胺基酸序列將揭示比較序列之間的序列一致性及相似性。基於此等相似性，熟習此項技術者可確定相似性是否足夠高以指示蛋白質係經由自共同祖先進化而相關聯。諸如Align、BLAST、Clustal W及其他演算法之熟習此項技術者熟知之演算法比較且測定原始序列相似性或一致性，以及測定可賦予權重或分值之序列中缺口之存在或顯著性。此等演算法亦在此項技術中已知且同樣適用於測定核苷酸序列相似性或一致性。基於計算統計學相似性之熟知方法或發現隨機多肽之類似匹配的概率及所測定匹配之顯著性來計算測定關聯性之充分相似性參數。必要時，熟習此項技術者亦可藉由視覺最佳化兩個或兩個以上序列之電腦比較。相關基因產物或蛋白質可預期具有高相似性，例如25%至100%序列一致性。若檢查足夠容量之資料庫，則不相關蛋白質可能具有基本上與預期偶然出現相同之一致性(約5%)。5%與24%之間的序列可能或可能不表示足夠同源性以斷定比較序列相關。鑒於資料集容量，可進行測定此等匹配之顯著性的其他統計學分析以測定此等序列之相關性。
使用BLAST演算法測定兩個或兩個以上序列之關聯性的例示性參數可例如如下所述。簡言之，可使用BLASTP 2.0.8版(1999年1月5日)及以下參數執行胺基酸序列比對：矩陣：0 BLOSUM62；缺口開啟：11；缺口延伸：1；x_下降值：50；期望值：10.0；字長：3；過濾：開啟。可使用BLASTN 2.0.6版(1998年9月16日)及以下參數執行核酸序列比對：匹配：1；錯配：-2；缺口開啟：5；缺口延伸：2；x_下降值：50；期望值：10.0；字長：11；過濾：關閉。熟習此項技術者已知可對以上參數進行何種修改以例如增加或降低比較之嚴格性且測定兩個或兩個以上序列之關聯性。
本發明提供一種非天然存在之微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之微生物，該微生物包括至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去羧酶之外源核酸，其中該外源核酸以足以製備單體4-羥基丁酸(4-HB)之量表現。4-羥基丁酸去氫酶(4-hydroxybutanoate dehydrogenase)亦稱為4-羥基丁酸去氫酶(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)或4-HB去氫酶。琥珀醯基-CoA合成酶亦稱為琥珀醯基-CoA合酶或琥珀醯基-CoA連接酶。
本發明亦提供一種非天然存在之微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之微生物，該微生物具有至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或α-酮戊二酸去羧酶之外源核酸，其中該外源核酸以足以製備單體4-羥基丁酸(4-HB)之量表現。
本發明之非天然存在微生物生物催化劑包括利用代謝反應之組合以生物合成方式製備本發明化合物的微生物。生物合成化合物可細胞內製備及/或分泌至培養基中。藉由非天然存在之微生物製備之例示性化合物包括例如4-羥基丁酸、1,4-丁二醇及γ-丁內酯。
在一實施例中，將非天然存在之微生物工程改造以製備4-HB。此化合物為1,4-丁二醇族化合物之一個有用入口點。由琥珀酸、由琥珀酸經由琥珀醯基-CoA或由α-酮戊二酸形成4-HB之生物化學反應展示於圖1之步驟1-8中。
應瞭解可使用BDO路徑之適當酶之任何組合，只要達成由起始組份至BDO產物之轉化即可。因此，應瞭解可利用本文所揭示之任何代謝路徑且熟習此項技術者充分瞭解如何選擇適當酶以達成如本文所揭示之所要路徑。
在另一實施例中，本發明提供一種非天然存在之微生物，其包含具有1,4-丁二醇(BDO)路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺化)、4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶或4-羥基丁醯基-CoA去氫酶(參見實例VII表17)。BDO路徑可能進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
熟習此項技術者應瞭解可利用如本文所揭示路徑之各種組合。舉例而言，在非天然存在之微生物中，核酸可編碼4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶或4-胺基丁酸-CoA連接酶；4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺化)或4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶；及4-羥基丁醯基-CoA去氫酶。以下特定描述其他例示性組合且該等組合可進一步見於圖8-圖13中。舉例而言，BDO路徑可進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。
本發明另外提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(醇形成)、4-胺基丁醯基-CoA還原酶、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(參見實例VII及表18)，且可進一步包含1,4-丁二醇去氫酶。舉例而言，外源核酸可編碼4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶或4-胺基丁酸-CoA連接酶；4-胺基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)；及4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶。此外，該等核酸可編碼4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶或4-胺基丁酸-CoA連接酶；4-胺基丁醯基-CoA還原酶；4-胺基丁-1-醇去氫酶；及4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶。
本發明進一步提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含4-胺基丁酸激酶、4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)、4-胺基丁-1-醇轉胺酶、[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺化)、[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸轉胺酶、4-羥基丁醯基-磷酸去氫酶或4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見實例VII及表19)。舉例而言，外源核酸可編碼4-胺基丁酸激酶；4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)；4-胺基丁-1-醇去氫酶；及4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶。或者，外源核酸可編碼4-胺基丁酸激酶；[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺化)或[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸轉胺酶；4-羥基丁醯基-磷酸去氫酶；及4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)。
本發明亦提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二側氧基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)、2,5-二側氧基戊酸還原酶、α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二醯基-CoA水解酶、α-酮戊二醯基-CoA連接酶、α-酮戊二醯基-CoA還原酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶、α-酮戊二醯基-CoA還原酶(醇形成)、5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶或5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)(參見實例VIII及表20)。BDO路徑可能進一步包含4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)、4-羥基丁醯基-CoA還原酶或1,4-丁二醇去氫酶。舉例而言，外源核酸可編碼α-酮戊二酸5-激酶；2,5-二側氧基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)；2,5-二側氧基戊酸還原酶；及5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶。或者，外源核酸可編碼α-酮戊二酸5-激酶；2,5-二側氧基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)；2,5-側氧基戊酸還原酶；及5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)。或者，外源核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二醯基-CoA水解酶或α-酮戊二醯基-CoA連接酶；α-酮戊二醯基-CoA還原酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶；及5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶。在另一實施例中，外源核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二醯基-CoA水解酶或α-酮戊二醯基-CoA連接酶；α-酮戊二醯基-CoA還原酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶及5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)。或者，外源核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二醯基-CoA水解酶或α-酮戊二醯基-CoA連接酶；α-酮戊二醯基-CoA還原酶(醇形成)；及5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶。在另一實施例中，外源核酸可編碼α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二醯基-CoA水解酶或α-酮戊二醯基-CoA連接酶；α-酮戊二醯基-CoA還原酶(醇形成)；及5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)。
本發明另外提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶、麩胺醯基-CoA連接酶、麩胺酸5-激酶、麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)、麩胺醯基-CoA還原酶、麩胺酸-5-半醛還原酶、麩胺醯基-CoA還原酶(醇形成)、2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺化)、2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)(參見實例IX及表21)。舉例而言，外源核酸可編碼麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶或麩胺醯基-CoA連接酶；麩胺醯基-CoA還原酶；麩胺酸-5-半醛還原酶；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺化)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶或5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)。或者，外源核酸可編碼麩胺酸5-激酶；麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)；麩胺酸-5-半醛還原酶；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺化)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶或5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)。在另一實施例中，外源核酸可編碼麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶或麩胺醯基-CoA連接酶；麩胺醯基-CoA還原酶(醇形成)；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺化)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶或5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)。在另一實施例中，外源核酸可編碼麩胺酸5-激酶；麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)；2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺化)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶；及5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶或5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)。
本發明另外提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、3-羥基丁醯基-CoA脫水酶、乙烯基乙醯基-COA Δ-異構酶，或4-羥基丁醯基-CoA脫水酶(參見實例X及表22)。舉例而言，外源核酸可編碼3-羥基丁醯基-CoA去氫酶；3-羥基丁醯基-CoA脫水酶；乙烯基乙醯基-CoA Δ-異構酶；及4-羥基丁醯基-CoA脫水酶。
在另一實施例中，本發明提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含高絲胺酸去胺酶、高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶、高絲胺酸-CoA連接酶、高絲胺酸-CoA去胺酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶、4-羥基丁-2-烯酸還原酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶(參見實例XI及表23)。舉例而言，外源核酸可編碼高絲胺酸去胺酶；4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶；4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶。或者，外源核酸可編碼高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶或高絲胺酸-CoA連接酶；高絲胺酸-CoA去胺酶；及4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶。在另一實施例中，外源核酸可編碼高絲胺酸去胺酶；4-羥基丁-2-烯酸還原酶；及4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶或4-羥基丁醯基-CoA連接酶。或者，外源核酸可編碼高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶或高絲胺酸-CoA連接酶；高絲胺酸-CoA去胺酶；及4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶。
本發明進一步提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含琥珀醯基-CoA還原酶(醇形成)、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(本文亦稱為醯基磷酸還原酶)(參見表15)。此BDO路徑可進一步包含琥珀醯基-CoA還原酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)或1,4-丁二醇去氫酶。
在另一實施例中，本發明提供一種非天然存在之微生物，其包含具有BDO路徑之微生物，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含麩胺酸去氫酶、4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺化)、4-胺基丁酸轉胺酶、麩胺酸去羧酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(醯基磷酸還原酶)(參見表16)。此BDO路徑可進一步包含α-酮戊二酸去羧酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)或1,4-丁二醇去氫酶。
在另一實施例中，本發明提供一種具有4-HB或BDO路徑之非天然存在微生物，其中該非天然存在微生物包含至少一種編碼如圖1所例示以4-HB或BDO路徑使受質轉化成產物之酶或蛋白質的外源核酸，該受質至產物之轉化例如琥珀醯基-CoA至琥珀酸半醛、琥珀酸半醛至4-羥基丁酸、4-羥基丁酸至4-羥基丁醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA至4-羥基丁醛、4-羥基丁醛至1,4-丁二醇。在另一實施例中，如圖8A之一實施例中所例示，4-HB或BDO路徑中之受質至產物可為例如琥珀醯基-CoA至琥珀酸半醛、琥珀酸半醛至4-羥基丁酸、4-羥基丁酸至4-羥基丁醯基-磷酸、4-羥基丁醯基-磷酸至4-羥基丁醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA至4-羥基丁醛、4-羥基丁醛至1,4-丁二醇。因此，本發明提供一種非天然存在之微生物，其含有至少一種編碼酶或蛋白質之外源核酸，其中該酶或蛋白質使4-HB或BDO路徑(諸如圖8-圖13中所示之路徑)之受質及產物轉化，且熟習此項技術者可容易地根據本文所揭示之4-HB或BDO路徑確定此等受質及產物。
上述路徑僅為例示性的。熟習此項技術者可容易地視需要自本文所揭示之路徑選擇適當路徑以獲得合適的4-HB或BDO路徑或其他代謝路徑。
本文一般關於代謝反應、其反應物或產物，或特定關於一或多種編碼與所提及代謝反應、反應物或產物有關或催化所提及代謝反應、反應物或產物之酶的核酸或基因來描述本發明。除非本文另外明確說明，否則熟習此項技術者應瞭解，提及反應亦包括提及該反應之反應物及產物。類似地，除非本文另外明確說明，否則提及反應物或產物亦為提及反應且提及任何此等代謝組份亦為提及編碼催化所提及反應、反應物或產物之酶的基因。同樣地，鑒於代謝生物化學、酶學及基因組學之熟知領域，本文提及基因或編碼核酸亦包括提及相應編碼酶及其催化之反應以及該反應之反應物及產物。
經由生物合成模式使用本發明之微生物製備4-HB尤其有用，因為其可製備單體4-HB。本發明之非天然存在之微生物及其4-HB及BDO族化合物的生物合成亦尤其有用，因為4-HB產物可(1)得以分泌；(2)可能缺乏任何衍生作用，諸如輔酶A；(3)避免生物合成期間之熱力學改變；(4)允許直接生物合成BDO，及(5)允許4-HB在酸性pH值培養基中自發化學轉化成γ-丁內酯(GBL)。此後一特徵亦尤其適用於例如BDO族化合物(諸如1,4-丁二醇及/或四氫呋喃(THF))之有效化學合成或生物合成。
微生物一般缺乏合成4-HB之能力。認為任何本文所揭示在1,4-丁二醇族化合物範圍內之化合物或熟習此項技術者已知在1,4-丁二醇族化合物範圍內之化合物均在1,4-丁二醇族化合物之範圍內。此外，尚未知具有所有必要代謝酶促能力之生物體由本文所述之酶及本文所例示之生物化學路徑製備4-HB。相反地，其中可能例外為以下進一步描述之一些厭氧微生物，該等具有酶促能力之微生物使用4-HB作為受質以製備例如琥珀酸。相反，本發明之非天然存在之微生物可產生產物4-HB或BDO。如上所述，4-HB以其單體形式之生物合成不僅尤其適用於BDO族化合物之化學合成，其亦允許BDO族化合物之進一步生物合成且完全避免化學合成程序。
可製備4-HB或BDO之本發明之非天然存在微生物係藉由確保宿主微生物包括完全生物化學合成至少一種本發明之4-HB或BDO生物合成路徑之功能能力來製備。確保至少一種必要4-HB或BDO生物合成路徑將4-HB生物合成能力賦予宿主微生物。
本文例示5種4-HB生物合成路徑且圖1中為說明之目的展示該等路徑。其他4-HB及BDO路徑描述於圖8-圖13中。一種4-HB生物合成路徑包括自琥珀酸生物合成4-HB(琥珀酸路徑)。參與此4-HB路徑之酶包括CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶。在此路徑中，CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶催化圖1中所示箭頭之逆反應。另一4-HB生物合成路徑包括經由琥珀醯基-CoA自琥珀酸生物合成(琥珀醯基-CoA路徑)。參與此4-HB路徑之酶包括琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶。三種其他4-HB生物合成路徑包括自α-酮戊二酸生物合成4-HB(α-酮戊二酸路徑)。因此，第三種4-HB生物合成路徑為經由麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶及4-羥基丁酸去氫酶生物合成琥珀酸半醛。第四種4-HB生物合成路徑亦包括自α-酮戊二酸生物合成4-HB，但利用α-酮戊二酸去羧酶催化琥珀酸半醛合成。4-羥基丁酸去氫酶催化琥珀酸半醛至4-HB之轉化。第五種4-HB生物合成路徑包括經由琥珀醯基-CoA自α-酮戊二酸生物合成且利用α-酮戊二酸去氫酶製備琥珀醯基-CoA，該路徑集中於以上所述之琥珀醯基-CoA路徑。此等4-HB生物合成路徑、其受質、反應物及產物中之每一者均進一步描述於以下實例中。如本文所述，4-HB可藉由包括製備BDO之適當酶進一步經生物合成轉化成BDO(參見實例)。因此，應瞭解4-HB路徑可與將4-HB轉化為BDO之酶一起使用以產生BDO路徑。
本發明之非天然存在之微生物可藉由引入編碼一或多種參與一或多種4-HB或BDO生物合成路徑之酶的可表現核酸來製備。視生物合成所選之宿主微生物而定，可表現用於一些或所有特定4-HB或BDO生物合成路徑之核酸。舉例而言，若所選宿主缺乏所要生物合成路徑(例如琥珀酸至4-HB路徑)中之一或多種酶，則將缺失酶(例如此實例中之CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶與4-羥基丁酸去氫酶)之可表現核酸引入宿主中以進行後續外源表現。或者，若所選宿主展現一些路徑酶之內源表現，但缺乏其他酶之表現，則缺失酶需要編碼核酸以實現4-HB或BDO生物合成。舉例而言，若所選宿主展現內源CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶，但缺乏4-羥基丁酸去氫酶，則此酶需要編碼核酸以實現4-HB生物合成。因此，本發明之非天然存在之微生物可藉由引入外源酶或蛋白質活性以獲得所要生物合成路徑來製備，或所要生物合成路徑可藉由引入與一或多種內源酶或蛋白質一起製備所要產物(諸如4-HB或BDO)之一或多種外源酶或蛋白質活性而獲得。
以類似方式，若選擇經由琥珀酸至琥珀醯基-CoA路徑(琥珀醯基-CoA路徑)進行4-HB生物合成，則缺乏酶(琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及/或4-羥基丁酸去氫酶)之宿主的編碼核酸外源表現於接受者宿主中。經由α-酮戊二酸至琥珀酸半醛路徑(α-酮戊二酸路徑)選擇4-HB生物合成可利用針對缺乏一或多種酶(麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶及/或4-羥基丁酸去氫酶或α-酮戊二酸去羧酶及4-羥基丁酸去氫酶)之宿主的外源表現。熟習此項技術者可容易地確定如本文所揭示用於製備4-HB或BDO之路徑酶。
視所選宿主微生物之4-HB或BDO生物合成路徑組份而定，本發明之非天然存在之微生物應包括至少一種外源表現之編碼4-HB或BDO路徑之核酸及一或多種4-HB或BDO生物合成路徑之至多所有編碼核酸。舉例而言，4-HB或BDO生物合成可經由相應編碼核酸之外源表現而建立於缺乏路徑酶或蛋白質之宿主中。在缺乏4-HB或BDO路徑之所有酶或蛋白質之宿主中，可包括路徑中所有酶或蛋白質之外源表現，但應瞭解即使宿主含有至少一種路徑酶或蛋白質，仍可表現路徑之所有酶或蛋白質。舉例而言，可包括製備BDO之路徑中所有酶或蛋白質之外源表現。舉例而言，可在缺乏4-羥基丁酸去氫酶之宿主中經由編碼4-羥基丁酸去氫酶之核酸的外源表現由所有5種路徑建立4-HB生物合成。相反，可在缺乏所有8種酶之宿主中經由所有8種CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶、α-酮戊二酸去羧酶、α-酮戊二醛去氫酶及4-羥基丁酸去氫酶之外源表現由所有5種路徑建立4-HB生物合成。
鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者應瞭解以可表現形式引入之編碼核酸的數目應至少與所選宿主微生物之4-HB或BDO路徑缺乏相當。因此，本發明之非天然存在之微生物可具有1、2、3、4、5、6、7、8或至多所有編碼本文所揭示構成一或多種4-HB或BDO生物合成路徑之酶的核酸。在某些實施例中，非天然存在之微生物亦可包括有助於或最佳化4-HB或BDO生物合成或賦予宿主微生物其他有用功能之其他遺傳修飾。一種此類其他功能性可包括例如增強一或多種4-HB路徑前驅體之合成，該等前驅體為諸如琥珀酸、琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸、4-胺基丁酸、麩胺酸、乙醯乙醯基-CoA及/或高絲胺酸。
一般而言，選擇宿主微生物以便使其製備4-HB或BDO路徑之前驅體，該前驅體呈天然製備之分子形式或提供所要前驅體之重新製備或使由宿主微生物天然製備之前驅體產量增加的工程改造產物形式。舉例而言，在諸如大腸桿菌之宿主生物體中天然地製備琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸、4-胺基丁酸、麩胺酸、乙醯乙醯基-CoA及高絲胺酸。如本文所揭示，宿主生物體可經工程改造以增加前驅體之產量。此外，已經工程改造以製備所要前驅體之微生物可用作宿主生物體且經進一步工程改造以表現4-HB或BDO路徑之酶或蛋白質。
在某些實施例中，本發明之非天然存在之微生物由含有合成4-HB或BDO之酶促能力的宿主產生。在此特定實施例中，其可用於增加4-HB或BDO路徑產物之合成或積聚以例如驅動4-HB或BDO路徑反應向4-HB或BDO製備進行。合成或積聚增加可藉由例如編碼一或多種本文所揭示之4-HB或BDO路徑酶之核酸的過度表現來實現。一或多種4-HB或BDO路徑酶之過度表現可例如經由一或多種內源基因之外源表現或經由一或多種異源基因之外源表現發生。因此，可容易地經由1、2、3、4、5、6種等至多所有編碼4-HB或BDO生物合成路徑酶之核酸的過度表現產生天然存在之生物體作為本發明之非天然存在之4-HB或BDO製備型微生物。此外，非天然存在之生物體可藉由導致4-HB或BDO生物合成路徑中酶活性增加之內源基因的突變誘發產生。
在尤其有用之實施例中，利用編碼核酸之外源表現。外源表現賦予宿主及應用以定製表現及/或調節元件之能力以達成由使用者控制之所要表現量。然而，在其他實施例中，當基因與誘導性啟動子或其他調節元件連接時，亦可諸如藉由移除負性調節效應物或誘導基因啟動子而利用內源表現。因此，具有天然存在之誘導性啟動子之內源基因可藉由提供適當誘導劑來上調，或內源基因之調節區域可經工程改造以併有誘導性調節元件，藉此使內源基因表現在所要時間上調。類似地，可包括誘導性啟動子作為引入非天然存在之微生物中之外源基因的調節元件(參見實例)。
如本文所用之「外源」意欲意謂將所提及分子或所提及活性引入宿主微生物中。該分子可例如藉由向宿主遺傳物質中引入編碼核酸，諸如藉由整合至宿主染色體中或作為非染色體遺傳物質(諸如質體)來引入。因此，如本文關於編碼核酸之表現所用之術語係指向微生物中引入呈可表現形式之編碼核酸。當關於生物合成活性使用時，該術語係指引入宿主參考生物體中之活性。來源可為例如在引入至宿主微生物中之後表現所提及活性之同源或異源編碼核酸。因此，術語「內源」係指存在於宿主中之所提及分子或活性。類似地，該術語當關於編碼核酸表現使用時係指微生物內所含之編碼核酸之表現。術語「異源」係指源自除所提及物種外之來源的分子或活性，而「同源」係指源自宿主微生物之分子或活性。因此，本發明之編碼核酸之外源表現可利用異源或同源編碼核酸中之任一者或兩者。
4-HB或BDO路徑酶之編碼核酸之來源可包括例如經編碼基因產物能夠催化所提及反應之任何物種。此等物種包括原核生物體與真核生物體，包括(但不限於)細菌(包括古菌及真細菌)及真核生物(包括酵母、植物、昆蟲、動物及哺乳動物(包括人類))。此等來源之例示性物種包括例如以下所列舉之彼等生物體以及本文所揭示或可用作相應基因之源生物體的其他例示性物種，包括(但不限於)：大腸桿菌、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri )、克氏梭菌(Clostridium kluyveri )、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum )、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii )、糖全丁基丙酮酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum )、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens )、艱難梭菌(Clostridium difficile )、肉毒梭菌(Clostridium botulinum )、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum )、假破傷風梭菌(Clostridium tetanomorphum )、破傷風梭菌(Clostridium tetani )、丙酸梭菌(Clostridium propionicum )、胺基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum )、近端梭菌(Clostridium subterminale )、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii )、真養雷氏菌(Ralstonia eutropha )、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis )、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis )、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana )、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus )、假單胞菌屬(Pseudomonas species )(包括綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida )、斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri )、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens ))、智人(Homo sapiens )、家兔(Oryctolagus cuniculus )、球形紅細菌(Rhodobacter spaeroides )、布氏熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brockii )、勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula )、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides )、橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus )、卡氏玫瑰菌(Roseiflexus castenholzii )、赤桿菌(Erythrobacter )、荷荷芭(Simmondsia chinensis )、不動桿菌(Acinetobacter )種(包括乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus )及貝利不動桿菌(Acinetobacter baylyi ))、牙齦卟啉單胞菌、托氏硫化葉菌(Sulfolobus tokodaii )、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus )、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius )、枯草桿菌(Bacillus subtilis )、仙人掌桿菌(Bacillus cereus )、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )、短芽孢桿菌(Bacillus brevis )、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus )、褐家鼠(Rattus norvegicus )、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia )、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca )、細小裸藻(Euglena gracilis )、齒垢密螺旋體(Treponema denticola )、熱乙酸穆爾氏菌(Moorella thermoacetica )、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima )、極端嗜鹽菌(Halobacterium salinarum )、嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus )、嗜熱泉生古細菌(Aeropyrum pernix )、野豬(Sus scrofa )、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans )、麩胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum )、醱酵胺基酸球菌(Acidaminococcus fermentans )、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis )、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes )、念珠菌(Candida )、土麯黴(Aspergillus terreus )、戊糖片球菌(Pedicoccus pentosaceus )、運動醱酵單孢菌(Zymomonas mobilus )、巴斯醋桿菌(Acetobacter pasteurians )、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis )、巴克氏真桿菌(Eubacterium barkeri )、多毛擬桿菌(Bacteroides capillosus )、克利厭氧桿菌(Anaerotruncus colihominis )、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilusm )、空腸彎麴菌(Campylobacter jejuni )、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens )、無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus )、黃色黏球菌(Myxococcus xanthus )、核梭桿菌(Fusobacterium nuleatum )、產黃青黴(Penicillium chrysogenum )、海洋γ變形菌(marine gamma proteobacterium)、丁酸製備型細菌及本文所揭示之其他物種(參見實例)。舉例而言，本文關於大腸桿菌及酵母宿主例示具有4-HB或BDO生物合成製備之微生物。然而，目前可用之全基因組序列有550個以上物種(其中一半以上此等物種可通過公共資料庫(諸如NCBI)獲得)，包括395個微生物基因組及多個酵母、真菌、植物及哺乳動物基因組，編碼相關聯或關係遠之物種(包括例如已知基因之同源物、直系同源物、旁系同源物及非直系同源基因置換，及生物體之間的基因變化互換)中的一或多種基因之必要4-HB或BDO生物合成活性之基因的鑑別為常規的且在此項技術中熟知。因此，能夠實現本文關於諸如大腸桿菌或酵母之特定生物體所述的本發明之4-HB或BDO及其他化合物之生物合成的代謝變化可容易地應用於其他微生物，該等其他微生物同樣包括原核生物體及真核生物體。鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者應已知可將一種生物體中所例示之代謝變化同樣應用於其他生物體。
在一些情況下，諸如當不相關物種中存在替代4-HB或BDO生物合成路徑時，可藉由例如由催化置換所提及反應之類似、但非一致代謝反應的不相關物種之一或多種旁系同源物的外源表現，將4-HB或BDO生物合成賦予宿主物種。因為在不同生物體之間存在代謝網路中之某些差異，所以熟習此項技術者應瞭解不同生物體之間的實際基因使用可能不同。然而，鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者亦應瞭解本發明之教示及方法可使用本文所例示之彼等生物體之同源代謝變化應用於所有微生物以在目標物種中建構將合成4-HB(諸如單體4-HB)或BDO之微生物。
宿主微生物可選自例如細菌、酵母、真菌或任何可應用於醱酵過程之多種其他微生物，且在該等宿主微生物中產生非天然存在之微生物。例示性細菌包括選自以下之物種：大腸桿菌、產酸克雷伯氏菌、產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens )、琥珀酸放線菌(Actinobacillus succinogenes )、曼海姆產琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens )、艾特利根瘤菌(Rhizobium etli )、枯草桿菌、麩胺酸棒桿菌、氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans )、運動醱酵單孢菌(Zymomonas mobilis )、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor )、丙酮丁醇梭菌、螢光假單胞菌及惡臭假單胞菌。例示性酵母或真菌包括選自以下之物種：釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、乳酸克魯維酵母、馬克西安克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus )、土麯黴、黑曲黴菌(Aspergillus niger )及畢赤酵母(Pichiapastoris )。大腸桿菌為尤其有用之宿主生物體，此係因為其為適用於遺傳工程改造之經良好表徵之微生物。其他尤其有用之宿主生物體包括酵母，諸如釀酒酵母。
可例如藉由此項技術中熟知之重組及偵測方法執行建構及測試非天然存在之4-HB或BDO製備型宿主之表現量的方法。此等方法可見描述於例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版, Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中。4-HB及GBL可藉由例如HPLC使用Spherisorb 5 ODS1管柱及70% 10mM磷酸鹽緩衝液(pH=7)及30%甲醇之移動相來分離，且使用UV偵測器在215nm下偵測(Hennessy等人,2004,J. Forensic Sci. 46(6):1-9)。BDO係藉由氣相層析或藉由HPLC及折射率偵測器使用Aminex HPX-87H管柱及0.5mM硫酸之移動相來偵測(Gonzalez-Pajuelo等人,Met. Eng . 7:329-336(2005))。
可使用此項技術中熟知之技術將4-HB或BDO製備路徑中涉及之外源核酸序列穩定或短暫地引入宿主細胞中，該等技術包括(但不限於)結合、電穿孔、化學轉化、轉導、轉染及超音波轉化。對於大腸桿菌或其他原核細胞中之外源表現而言，必要時，真核核酸之基因或cDNA中之一些核酸序列可編碼諸如N端線粒體之靶向信號或可在轉化於原核宿主細胞中之前移除的其他靶向信號。舉例而言，移除線粒體前導序列導致在大腸桿菌中表現增加(Hoffmeister等人，J. Biol Chern . 280:4329-4338(2005))。對於在酵母或其他真核細胞中之外源表現而言，基因可在不添加前導序列之細胞溶質中表現，或可藉由添加適用於宿主細胞之諸如線粒體靶向之合適靶向序列或分泌信號，靶向線粒體或其他細胞器，或靶向以進行分泌。因此，應瞭解，可將移除或包括靶向序列之對核酸序列的適當修飾併入外源核酸序列中以賦予所需性質。此外，基因可由此項技術中熟知之技術進行密碼子最佳化以達成蛋白質之最佳化表現。
可建構一或多種表現載體以具有如本文所例示之與在宿主生物體中起作用之表現控制序列可操作連接的一或多種4-HB生物合成路徑及/或一或多種BDO生物合成編碼核酸。適用於本發明之微生物宿主生物體中使用之表現載體包括例如質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體及人工合成染色體，其包括可實現穩定整合至宿主染色體中之操作的載體及選擇序列或標記。另外，表現載體可包括一或多種可選擇標記基因及適當的表現控制序列。亦可包括例如提供對抗生素或毒素之抗性、補體營養缺陷或供應培養基中不存在之關鍵養分的可選擇標記基因。表現控制序列可包括此項技術中熟知之組成性及誘導性啟動子、轉錄強化子、轉錄終止子及其類似物。當兩個或兩個以上外源編碼核酸共同表現時，可將兩種核酸插入例如單一表現載體或分開的表現載體中。對於單一載體表現，可將編碼核酸與一種共同的表現控制序列操作性連接或與諸如一種誘導性啟動子及一種組成性啟動子之不同表現控制序列操作性連接。可使用此項技術中熟知之方法證實代謝或合成路徑中涉及之外源核酸序列的轉化。此等方法包括例如核酸分析，諸如北方墨點法(Northern blots)或mRNA之聚合酶鏈反應(PCR)擴增，或用於基因產物表現之免疫墨點法(immunoblotting)，或測試所引入核酸序列或其相應基因產物之表現的其他合適分析方法。熟習此項技術者應瞭解，外源核酸以足以製備所要產物之量表現，且進一步瞭解可使用此項技術中熟知且如本文所揭示之方法最佳化表現量以獲得足夠表現。
使用如本文所例示之此項技術中熟知之方法建構本發明之非天然存在之微生物以按足以製備4-HB(諸如單體4-HB)或BDO之量外源表現至少一種編碼4-HB或BDO路徑酶之核酸。應瞭解，本發明之微生物係在足以製備4-HB或BDO之條件下培養。在各路徑中4-HB酶之例示性表現量進一步描述於以下實例中。遵循本文所提供之教示及指導，本發明之非天然存在之微生物可達成4-HB(諸如單體4-HB)或BDO之生物合成，從而使細胞內濃度介於約0.1mM至200mM或200mM以上，例如0.1mM至25mM或25mM以上。一般而言，4-HB(諸如單體4-HB)或BDO之細胞內濃度介於約3mM至150mM或150mM以上，尤其約5mM至125mM或125mM以上，且更特定言之介於約8mM至100mM，例如約3mM至20mM，尤其介於約5mM至15mM且更特定言之介於約8mM至12mM，該濃度包括約10mM、20mM、50mM、80mM或80mM以上。亦可由本發明之非天然存在之微生物達成此等例示性範圍中之每一者之間及以上之細胞內濃度。
在某些實施例中，培養條件包括缺氧或實質上缺氧生長或維持條件。例示性缺氧條件先前已進行描述且在此項技術中熟知。醱酵過程之例示性缺氧條件描述於本文中且描述於例如2007年8月10日申請之美國專利申請案第11/891,602號中。任何此等條件均可與非天然存在之微生物以及此項技術中熟知之其他缺氧條件一起使用。在此等缺氧條件下，4-HB或BDO產生劑可合成5mM至10mM或10mM以上之細胞內濃度以及本文所例示之所有其他濃度的4-HB或BDO。應瞭解，儘管以上描述係指細胞內濃度，但4-HB或BDO製備型微生物可細胞內製備4-HB或BDO及/或分泌產物至培養基中。
培養條件可包括例如液體培養程序以及醱酵及其他大規模培養程序。如本文所述，可在缺氧或實質上缺氧之培養條件下獲得本發明之生物合成產物之尤其有用產率。
如本文所述，達成4-HB或BDO生物合成之一種例示性生長條件包括缺氧培養或醱酵條件。在某些實施例中，本發明之非天然存在之微生物可在缺氧或實質上缺氧條件下維持、培養或醱酵。簡言之，缺氧條件係指缺少氧氣之環境。實質上缺氧之條件包括例如培養、分批醱酵或連續醱酵，以致培養基中之溶氧濃度保持在0與飽和之10%之間。實質上缺氧條件亦包括密封室內之液體培養基中或固體瓊脂上之生長或休眠細胞維持在小於1%氧氣之氛圍中。可藉由例如用N2 /CO2 混合物或其他合適非氧氣體噴射培養物來維持氧氣百分比。
本發明亦提供一種非天然存在之微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之微生物，該等路徑包括至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸去羧酶、CoA非依賴性醛去氫酶、CoA依賴性醛去氫酶或醇去氫酶之外源核酸，其中該外源核酸以足以製備1,4-丁二醇(BDO)之量表現。4-羥基丁酸：CoA轉移酶亦稱為4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶。本文亦揭示其他4-HB或BDO路徑酶(參見實例及圖8-圖13)。
本發明進一步提供非天然存在之微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之微生物，該等路徑包括至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA-合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、4-丁酸激酶、磷酸轉丁醯酶、α-酮戊二酸去羧酶、醛去氫酶、醇去氫酶或醛/醇去氫酶之外源核酸，其中該外源核酸以足以製備1,4-丁二醇(BDO)之量表現。
亦可產生生物合成BDO之非天然存在之微生物。如同本發明之4-HB製備型微生物一樣，BDO製備型微生物亦可細胞內製備或將BDO分泌至培養基中。遵循先前針對建構合成4-HB之微生物提供之教示及指導，其他BDO路徑可併入4-HB製備型微生物中以產生亦合成BDO及其他BDO族化合物之生物體。已知BDO及其下游產物之化學合成。能夠進行BDO生物合成之本發明之非天然存在微生物如圖1所示使用4-HB作為入口點避免此等化學合成。如以下所進一步描述，亦可使用4-HB產生劑將4-HB化學轉化成GBL且接著轉化成例如BDO或THF。或者，4-HB產生劑可進一步修飾以包括將4-HB及/或GBL轉化成BDO之生物合成能力。
引入至4-HB產生劑中之其他BDO路徑包括例如圖1中以步驟9-步驟13所例示之缺乏本底之宿主的外源表現或一或多種酶之過度表現。一種此路徑包括例如進行如圖1中之步驟9、12及13所示之反應所需的酶活性，其中醛及醇去氫酶可為獨立的酶或具有醛與醇去氫酶活性之多功能酶。另一此路徑包括例如進行如圖1中之步驟10、11、12及13所示之反應所需之酶活性，其中醛及醇去氫酶亦可為獨立的酶或具有醛與醇去氫酶活性之多功能酶。因此，引入至4-HB產生劑中之其他BDO路徑包括例如在缺乏本底之宿主中之外源表現或4-羥基丁酸：CoA轉移酶、丁酸激酶、磷酸轉丁醯酶、CoA非依賴性醛去氫酶、CoA依賴性醛去氫酶或醇去氫酶中之一或多者的過度表現。在不存在能夠修飾4-HB之內源醯基-CoA合成酶之情況下，非天然存在之BDO製備型微生物可進一步包括4-HB選擇性外源醯基-CoA合成酶，或作為4-HB至4-HB-CoA之淨反應轉化之多種酶的組合。如以下實例中所進一步例示，丁酸激酶及磷酸轉丁醯酶展現BDO路徑活性且在4-HB受質下催化圖1中所示之轉化。因此，本文亦可將此等酶分別稱為4-羥基丁酸激酶及磷酸轉羥基丁醯酶。
可用於此等4-HB至BDO之活體內轉化之例示性醇及醛去氫酶列於以下表1中。
表1.用於4-HB至BDO轉化之醇及醛去氫酶。
本文揭示其他例示性酶及路徑(參見實例)。此外，應瞭解，可利用酶進行所用受質並非天然受質之反應。儘管非天然受質之活性可能低於天然受質，但應瞭解，如本文所揭示，此等酶可以天然存在之酶或使用定向進化或適應進化來修飾之酶形式利用(亦參見實例)。
經由任何本文所揭示路徑進行BDO製備在一定程度上係基於用於前驅體至BDO轉化之適當酶的鑑別。已鑑別許多用於若干反應步驟之特定酶。對於尚未鑑別反應前驅體之特異性酶的轉化，已鑑別最適於催化反應步驟之酶候選物。如下所討論，已展示酶對大量受質起作用。此外，蛋白質工程領域之發展亦使其可改變酶以對受質(即使並非天然受質)起有效作用。以下所述為來自適用於BDO路徑以及已用於進化酶以對非天然受質起作用之方法之不同種類之寬泛特異性酶的若干實例。
BDO路徑中之關鍵種類之酶為使酮或醛與醇相互轉化之氧化還原酶(1.1.1)。此種類中之眾多例示性酶可對多種受質起作用。展示自土壤細菌短桿菌屬(Brevibacterium sp)KU 1309純化之醇去氫酶(1.1.1.1)(Hirano等人，J. Biosc. Bioeng. 100:318-322(2005))對過多脂族以及芳族醇在高活性下起作用。表2展示酶之活性及其對不同醇之Km 。酶可逆且亦對若干種醛具有極高活性(表3)。
表2. 來自短桿菌屬KU之醇去氫酶氧化各種醇之相對活性。
表3. 來自短桿菌屬KU 1309之醇去氫酶還原各種羰基化合物之相對活性。
來自真養雷氏菌之乳酸去氫酶(1.1.1.27)為已證實對若干種2-含氧酸(諸如2-側氧基丁酸、2-側氧基戊酸及2-側氧基戊二酸(類似於2-側氧基己二酸之C5化合物))具有高活性之另一種酶(Steinbuchel及Schlegel,Eur. J. Biochem . 130:329-334(1983))。表4中之第2欄顯示來自真養雷氏菌(先前為富養產鹼菌(A. eutrophus ))之ldhA 對不同受質之活性(Steinbuchel及Schlegel,同上,1983)。
表4. 真養雷氏菌ldhA 對不同受質之活體外活性(Steinbuchel及Schlegel,同上,1983)且與其對丙酮酸之活性的比較。
已展示可使2-含氧酸轉化成其醯基-CoA對應物(1.2.1)之氧化還原酶亦接受多種受質。舉例而言，亦稱為2-側氧基異戊酸去氫酶(1.2.1.25)之分支鏈2-酮酸去氫酶複合物(BCKAD)參與分支鏈胺基酸降解路徑，從而使纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之2-酮酸衍生物轉化為其醯基-CoA衍生物及CO2 。在一些包括褐家鼠(Paxton等人,Biochem. J. 234:295-303(1986))及釀酒酵母(Sinclair等人,Biochem. Mol Biol. Int . 32:911-922(1993))之生物體中，已展示此複合物具有廣泛受質範圍，該受質範圍除分支鏈胺基酸前驅體外亦包括直鏈含氧酸，諸如2-側氧基丁酸及α-酮戊二酸。
已報導另一類酶(亦即胺基轉移酶(2.6.1))之成員對多種受質起作用。已鑑別出來自強烈熾熱球菌(Pyrococcus fursious )之天冬胺酸胺基轉移酶(aspAT )，其在大腸桿菌中表現且進行重組蛋白表徵表明該酶對天冬胺酸及α-酮戊二酸具有最高活性，且對丙胺酸、麩胺酸及芳族胺基酸具有較低但顯著之活性(Ward等人,Archaea 133-141(2002))。在另一情況下，已報導自墨西哥利什曼原蟲(Leishmania mexicana )鑑別且於大腸桿菌中表現之胺基轉移酶(Vernal等人,FEMS Microbiol. Lett. 229:217-222(2003))分別對酪胺酸(對酪胺酸之活性視為100%)、苯丙胺酸(90%)、色胺酸(85%)、天冬胺酸(30%)、白胺酸(25%)及甲硫胺酸(25%)具有寬泛受質特異性(Vernal等人,Mol. Biochem. Parasitol 96:83-92(1998))。已報導來自克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi )之酪胺酸胺基轉移酶之類似寬泛特異性，但此等酶兩者具有僅6%之序列同源性。後一種酶可接受白胺酸、甲硫胺酸以及酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及丙胺酸作為有效胺基供體(Nowicki等人,Biochim. Biophys. Acta 1546:268-281(2001))。
已表明CoA轉移酶(2.8.3)具有對一種以上受質起作用之能力。特定言之，CoA轉移酶係自丙酮丁醇梭菌純化且據報導其對乙酸、丙酸及丁酸具有最高活性。其亦對戊酸、異丁酸及巴豆酸具有顯著活性(Wiesenborn等人,Appl. Environ. Microbiol. 55:323-329(1989))。在另一項研究中，已展示亦稱為乙酸-CoA轉移酶(EC 2.8.3.8)之大腸桿菌酶醯基-CoA：乙酸-CoA轉移酶將CoA部分自多種分支鏈及直鏈醯基-CoA受質轉移至乙酸，該等受質包括異丁酸(Matthies及Schink,App. Environm. Microbiol . 58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem. Biophys. Res Commun . 33:902-908(1968b))及丁酸(Vanderwinkel等人,Biochem. Biophys. Res Commun .33:902-908(1968a))。
其他酶類另外支持酶之寬泛受質特異性。亦已證實一些異構酶(5.3.3)對多種受質起作用。舉例而言，來自斯氏假單胞菌之L-鼠李糖異構酶催化各種醛醣與酮醣之間的異構化(Yoshida等人,J. Mol. Biol . 365:1505-1516(2007))。此等異構化包括L-鼠李糖與L-鼠李樹膠糖、L-甘露糖及L-果糖、L-木糖與L-木酮糖、D-核糖與D-核酮糖及D-阿洛糖與D-阿洛酮糖之間的異構化。
在另一類酶中，發現磷酸轉移酶(2.7.1)(將L-高絲胺酸轉化成L-高絲胺酸磷酸酯之來自大腸桿菌之高絲胺酸激酶(2.7.1.39))磷酸化眾多高絲胺酸類似物。在此等受質中，R位置之羧基官能基已經酯或羥甲基置換(Huo及Viola,Biochemistry 35:16180-16185(1996))。表5顯示此激酶之寬泛受質特異性。
表5. 高絲胺酸激酶之受質特異性。
適用於BDO路徑之另一類酶為酸-硫醇連接酶(6.2.1)。如同其他種類中之酶一樣，已確定此種類中之某些酶具有寬泛受質特異性。舉例而言，已證實來自惡臭假單胞菌之醯基CoA連接酶對包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸及辛酸之若干種脂族受質起作用且對諸如苯基乙酸及苯氧基乙酸之芳族化合物起作用(Fernandez-Valverde等人，Appl. Environ. Microbiol. 59:1149-1154(1993))。相關酶，來自三葉草根瘤菌(Rhizobium trifolii )之丙二醯基CoA合成酶(6.3.4.9)可將若干種二酸(亦即丙二酸乙酯、丙二酸丙酯、丙二酸烯丙酯、丙二酸異丙酯、丙二酸二甲酯、丙二酸環丙酯、丙二酸環丙基亞甲酯、丙二酸環丁酯及丙二酸苯甲酯)轉化成其相應單硫酯(Poh1等人,J.Am. Chem. Soc. 123:5822-5823(2001))。類似地，亦發現去羧酶(4.1.1)具有寬泛受質範圍。丙酮酸去羧酶(PDC)(亦稱為酮酸去羧酶)為酒精醱酵中之關鍵酶，其催化丙酮酸去羧化成乙醛。對於包括2-酮丁酸、2-酮戊酸及2-苯基丙酮酸之脂族2-酮酸，自釀酒酵母分離之酶具有寬泛受質範圍(Li及Jordan,Biochemistry 38:10004-10012(1999))。類似地，苯甲醯甲酸去羧酶具有寬泛受質範圍且為酶工程研究之目標。來自惡臭假單胞菌之酶已經廣泛研究且可獲得此酶之晶體結構(Polovnikova等人,Biochemistry 42:1820-1830(2003)；Hasson等人,Biochemistry 37:9918-9930(1998))。已展示分支鏈α-酮酸去羧酶(BCKA)對鏈長為3至6個碳之多種化合物起作用(Oku及Kaneda,J .Biol .Chem . 263:18386-18396(1998)；Smit等人,Appl .Environ .Microbiol . 71:303-311(2005))。已關於多種分支鏈及直鏈受質表徵乳酸乳球菌中之酶，該等受質包括2-側氧基丁酸、2-側氧基己酸、2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基丁酸、4-甲基-2-側氧基丁酸及異己酸(Smit等人,Appl .Environ .Microbiol . 71:303-311(2005))。
有趣的是，亦已報導已知具有一種優勢活性之酶催化極不同之功能。舉例而言，已知來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus )及枯草桿菌之輔因子依賴性磷酸甘油酸變位酶(5.4.2.1)亦充當磷酸酶(Rigden等人,Protein Sci . 10:1835-1846(2001))。已知來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之酶對若干種受質具有活性，該等受質包括3-磷酸甘油酸、α-萘基磷酸、對硝基苯基磷酸、AMP、果糖-6-磷酸、核糖-5-磷酸及CMP。
與酶天然具有寬泛受質特異性之此等實例相比，眾多酶已使用定向進化進行修飾以拓寬其對其非天然受質之特異性。或者，亦已使用定向進化改變酶之受質偏好。因此，對既定酶進行工程改造以對天然受質(例如提高效率)或非天然受質(例如增加效率)起有效作用為可行。舉例而言，已報導來自綠膿桿菌之脂肪酶之對映選擇性顯著提高(Reetz等人,Agnew. Chem. Int. Ed Engl . 36:2830-2832(1997))。此酶以有利於(S )-酸僅2%對映異構過量(ee)水解2-甲基癸酸對硝基苯酯。然而，在4個連續回合之易誤性突變誘發及篩檢之後，製備以81%對映異構過量催化必要反應之變異體(Reetz等人,Agnew. Chem. Int. Ed Engl . 36:2830-2832(1997))。
已使用定向進化方法來修飾酶以對一系列非天然受質起作用。藉由隨機化活性位點附近之胺基酸殘基來拓寬綠膿桿菌中脂肪酶之受質特異性。此舉使得此酶接受α取代羧酸酯(Reetz等人,Agnew. Chem. Int. Ed Engl . 44:4192-4196(2005))。在酶之另一種成功修飾中，利用DNA改組以產生接受β-分支鏈受質之大腸桿菌胺基轉移酶，該β-分支鏈受質為野生型酶所不良接受(Yano等人,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A . 95:5511-5515(1998))。特定言之，在4個回合之改組結束時，天冬胺酸胺基轉移酶對纈胺酸及2-側氧基纈胺酸之活性增加最多5個數量級，同時對天然受資天冬胺酸之活性降低最多30倍。近來，使用一種演算法以設計可用以催化非天然且非生物受質(4-羥基-4-(6-甲氧基-2-萘基)-2-丁酮)中之碳-碳鍵裂解之逆向醛縮酶(retro-aldolase)(Jiang等人,Science 319:1387-1391(2008))。此等演算法使用4種不同催化基元之不同組合以設計新穎酶，且20種用於實驗表徵之所選設計使反應速率相較於未催化反應提高4倍(Jiang等人,Science 319:1387-1391(2008))。因此，此等工程改造方法不僅能擴大酶可作用之受質的陣列，且其可允許設計及建構極有效之酶。舉例而言，已報導DNA改組方法(關於暫時模板或RACHITT之隨機嵌合發生)產生對複合受質具有高脫硫速率以及使非天然受質轉化快達20倍之工程改造單加氧酶(Coco等人,Nat. Biotechnol. 19:354-359(2001))。類似地，使惰性突變體丙糖磷酸異構酶之比活性由1.3倍提高至19倍(Hermes等人,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87:696-700 1990))。藉由使用蛋白質全長上之隨機突變誘發來實現此比活性增強，且改良可溯自6個胺基酸殘基之突變。
亦已在若干種研究中證實改變酶對所要受質之受質特異性之蛋白質工程方法的有效性。來自嗜熱棲熱菌之異丙基蘋果酸去氫酶係藉由改變接近活性位點之殘基進行修飾，以便使其目前可對作為受質之蘋果酸及D-乳酸起作用(Fujita等人,Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:2695-2700(2001))。在此研究中以及在其他研究中，指出可修飾一個或一些殘基以改變受質特異性。舉例而言，在推定受質結合區域中改變單一胺基酸之二氫黃酮醇4-還原酶可優先還原二氫堪非黃酮醇(Johnson等人,Plant. J. 25:325-333(2001))。藉由改變活性位點中之一個殘基而使來自大腸桿菌之極強特異性異檸檬酸去氫酶之受質特異性由異檸檬酸變為異丙基蘋果酸(Doyle等人,Biochemistry 40:4234-4241(2001))。類似地，藉由改變N末端附近之一些殘基而使NAD+ 依賴性1,5-羥基前列腺素去氫酶之輔因子特異性改變為NADP+ (Cho等人,Arch. Biochem. Biophys. 419:139-146(2003))。使用序列分析及分子模型化分析以鑑別用於修飾之關鍵殘基，藉由定點突變誘發進一步研究該等關鍵殘基。
跨越不同種類之酶中存在眾多改變酶之功能以使其相較於酶之天然受質更偏好一種非天然受質的實例。岩藻糖苷酶係藉由DNA改組及篩檢在大腸桿菌中由半乳糖苷酶進化(Zhang等人,Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 94:4504-4509(1997))。類似地，使用同源性模型化及定點突變誘發使來自大腸桿菌之天冬胺酸胺基轉移酶轉化成酪胺酸胺基轉移酶(Onuffer及Kirsch,Protein Sci .,4:1750-1757(1995))。據報導來自惡臭假單胞菌之苯甲醯甲酸去羧酶之活性位點中之兩個殘基的定點突變誘發改變對天然及非天然受質之親和力(Km)(Siegert等人,Protein Eng Des Sel 18:345-357(2005))。使來自釀酒酵母之細胞色素c過氧化酶(CCP)進行定向分子進化以產生針對經典過氧化酶受質愈創木酚具有增加之活性的突變體，因此改變來自蛋白質細胞色素c之CCP對小有機分子之受質特異性。在3個回合之DNA改組及篩檢之後，分離出相對於天然受資而言針對愈創木酚具有增加300倍之活性且對此受質有增加高達1000倍特異性的突變體(Iffland等人,Biochemistry 39:10790-10798(2000))。
在一些情況下，已獲得與母酶中之任一者相比具有不同受質偏好之酶。舉例而言，聯苯-二加氧酶介導之多氯化聯苯之降解係藉由改組來自兩種細菌(類產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligens )及洋蒽伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia ))之基因來改良(Kumamaru等人,Nat. Biotechnol 16:663-666(1998))。所得嵌合聯苯加氧酶展示與兩種親本酶相比不同之受質偏好，且增強對最初為酶之不良受質的相關聯苯化合物及單芳環烴(諸如甲苯及苯)之降解活性。
除改變酶特異性之外，亦有可能增強對於酶天然具有低活性之受質的活性。一項研究表明可藉由隨機突變誘發顯著改良具有寬泛受質特異性(尤其對離胺酸、精胺酸、丙胺酸、絲胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、白胺酸及組胺酸)但對色胺酸具有低活性之來自惡臭假單胞菌之胺基酸消旋酶(Kino等人,Appl. Microbiol. Biotechnol . 73:1299-1305(2007))。類似地，牛BCKAD之活性位點經工程改造以偏好替代受質乙醯基-CoA(Meng及Chuang,Biochemistry 33:12879-12885(1994))。此等方法之有趣態樣為即使已應用隨機方法以產生具有有效活性之此等突變酶，仍可鑑別賦予活性改良之精確突變或結構變化。舉例而言，在上述研究中，有助於改良對色胺酸之活性的突變溯自兩個不同位置。
亦使用定向進化以表現難以表現之蛋白質。舉例而言，藉由使辣根過氧化酶經受隨機突變誘發及基因重組，鑑別出活性比野生型高14倍以上之突變體(Lin等人,Biotechno l. Prog. 15:467-471(1999))。
定向進化之另一實例展示為達成多種所要功能可對酶進行的大量修飾。使來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之乳酸去氫酶進行定點突變誘發，且在咸信確定對不同醇酸具有特異性的位點進行三種胺基酸取代(Clarke等人,Biochem. Biophys. Res. Commun. 148:15-23(1987))。在此等突變之後，酶對草醯乙酸之特異性比對丙酮酸之特異性高500倍，此與野生型酶相反，該野生型酶對丙酮酸之催化特異性為其對草醯乙酸之催化特異性的1000倍。使用定點突變誘發將此酶進一步工程改造以對分支鏈經取代丙酮酸具有活性(Wilks 等人，Biochemistry 29:8587-8591(1990))。特定言之，酶對α-酮異己酸之Kcat 具有55倍提高。在同一酶中進行三種結構修飾以將其對乳酸之受質特異性變為對蘋果酸之受質特異性。酶對蘋果酸具有高活性及特異性(Wilks等人,Science 242:1541-1544(1988))。隨後將來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之同一酶工程改造以對具有帶正電側鏈之α-酮酸(諸如含有銨基之α-酮酸)具有高催化活性(Hogan等人，Biochemistry 34:4225-4230(1995))。在酶之位置102具有引入之酸性胺基酸的突變體偏好此等側鏈銨基的結合。所獲得之結果表明突變體展示對於ω-胺基-α-酮酸受質之kcat /Km 值提高達25倍。有趣的是，亦對此酶進行結構修飾以替代乳酸去氫酶充當苯基乳酸去氫酶(Wilks等人，Biochemistry 31:7802-7806,1992)。向酶之基因中引入使得基因之區域切除之限制性位點。此區域編碼多肽(殘基98-110)之移動表面環，其通常密封活性位點使其遠離大量溶劑且為受質特異性之主要決定因素。插入可變長度及序列環以便產生具有改變之受質特異性之醇酸去氫酶。藉由一種較長環結構，對於丙酮酸之活性降低至一百萬分之一，但對於苯基丙酮酸之活性基本不變。達成390,000倍之特異性(kcat /Km )變化。苯基乳酸去氫酶需要此酶對苯基丙酮酸之選擇性與此酶對丙酮酸之選擇性為1700:1。上述研究指示可使用各種酶工程方法以獲得用於如本文所揭示之BDO路徑的酶。
如本文所揭示，可利用許多主要代謝中間物至1,4-丁二醇之生物合成路徑，該等代謝中間物包括乙醯基-CoA、琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸、麩胺酸、4-胺基丁酸及高絲胺酸。乙醯基-CoA、琥珀醯基-CoA及α-酮戊二酸為三羧酸(TCA)循環之常見中間物，三羧酸循環是以其整體形式存在於利用氧氣進行細胞呼吸之幾乎所有活細胞中且以截短形式存在於許多厭氧生物體中之一系列反應。麩胺酸為經由麩胺酸去氫酶或許多轉胺反應中之任一者自α-酮戊二酸衍生之胺基酸(參見圖8B)。4-胺基丁酸可由麩胺酸之去羧化形成(參見圖8B)或由乙醯乙醯基-CoA經由圖9C中所揭示之路徑形成。乙醯乙醯基-CoA衍生自兩個乙醯基-CoA分子經由酶(乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶或同樣乙醯乙醯基-輔酶A硫解酶)之縮合。高絲胺酸為蘇胺酸及甲硫胺酸代謝之中間物，其係經由天冬胺酸自草醯乙酸形成。草醯乙酸至高絲胺酸之轉化需要一種NADH、兩種NADPH及一種ATP。
亦可利用除以上所例示路徑以外之路徑以在非天然存在之微生物中產生BDO之生物合成。在一實施例中，可使用L-高絲胺酸至BDO路徑達成生物合成(參見圖13)。此路徑之莫耳產量為每莫耳葡萄糖0.90莫耳，其似乎受還原等效物之可用性限制。第二路徑由乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)合成BDO且能夠達到每莫耳葡萄糖1.091莫耳之最大理論產量(參見圖9)。任一路徑之建構可藉由將兩種外源酶引入至諸如大腸桿菌之宿主生物體中來實現，且兩種路徑可經由琥珀醯基-CoA另外補充BDO製備。以下進一步描述路徑酶、熱力學、理論產量及總體可行性。
亦可將高絲胺酸路徑工程改造以產生BDO製備型微生物。高絲胺酸為蘇胺酸及甲硫胺酸代謝之中間物，其係經由天冬胺酸自草醯乙酸形成。草醯乙酸至高絲胺酸之轉化需要一種NADH、兩種NADPH及一種ATP。高絲胺酸一旦形成即饋入蘇胺酸與甲硫胺酸之生物合成路徑。在大多數生物體中，回饋高含量之蘇胺酸或甲硫胺酸以抑制高絲胺酸生物合成路徑(Caspi等人,Nucleic Acids Res. 34:D511-D516(1990))。
高絲胺酸至4-羥基丁酸(4-HB)之轉化可如本文所述以兩個酶促步驟實現(參見圖13)。此路徑之第一步驟為藉由推定之解氨酶使高絲胺酸去胺化。在步驟2中，在消耗一種NADH之情況下藉由推定之還原酶將產物烯烴4-羥基丁-2-烯酸還原為4-HB。接著可使4-HB轉化成BDO。
本文揭示可用於催化以上轉化之酶。舉例而言，路徑之步驟1中之解氨酶極類似於天冬胺酸解氨酶(天冬胺酸酶)之化學性質。天冬胺酸酶為微生物中之一種普遍存在之酶，且已廣泛表徵(Viola,R. E.,Mol. Biol . 74:295-341(2008))。已破解大腸桿菌天冬胺酸酶之晶體結構(Shi等人,Biochemistry 36:9136-9144(1997))，因此可在酶之活性位點直接工程改造突變，其將改變酶之受質特異性以包括高絲胺酸。步驟2中之氧化還原酶具有類似於大腸桿菌TCA循環中若干種經充分表徵之酶(包括反丁烯二酸還原酶)的化學性質。因為此反應之熱力學極有利，所以具有寬泛受質特異性之內源性還原酶可能會能夠還原4-羥基丁-2-烯酸。在缺氧條件下此路徑之產量為每莫耳葡萄糖0.9莫耳BDO。
發現琥珀醯基-CoA路徑具有較高產量，此係由於其在能量上更有效。一種草醯乙酸分子經由高絲胺酸路徑轉化成BDO將需要消耗2種ATP等效物。因為假定PEP羧激酶可逆時，葡萄糖至兩個草醯乙酸分子之轉化可產生最多3個ATP分子，所以葡萄糖經由高絲胺酸至BDO之總轉化具有負能量產量。正如所料，若假定能量可經由呼吸產生，則高絲胺酸路徑之最大產量增至每莫耳葡萄糖1.05莫耳，該產量為琥珀醯基-CoA路徑產量之96%。琥珀醯基-CoA路徑可經由丙酮酸去氫酶及TCA循環之氧化分支引導一些碳通量以在無能量消耗之情況下產生還原等效物與琥珀醯基-CoA。因此，不會遭遇與高絲胺酸路徑相同之能量困難，此係因為並非所有通量均經由草醯乙酸至琥珀醯基-CoA至BDO引導。總之，高絲胺酸路徑表明BDO之高產途徑。
亦可工程改造乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)路徑以產生BDO製備型微生物。乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)可藉由脂肪酸代謝中涉及之酶(包括乙醯基-CoA乙醯基轉移酶及乙醯乙醯基-CoA轉移酶)由乙醯基-CoA形成。經由乙醯乙酸之生物合成途徑亦尤其適用於可代謝諸如一氧化碳、二氧化碳或甲醇之單碳化合物以形成乙醯基-CoA之微生物。
乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)至4-胺基丁酸之三步途徑(參見圖9C)可用以經由乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)合成BDO。可如圖8B所示將4-胺基丁酸轉化成琥珀酸半醛。根據三個還原步驟可將琥珀酸半醛(其為自琥珀醯基-CoA移除之一個還原步驟或自α-酮戊二酸移除之一個去羧化步驟)轉化成BDO(圖1)。簡言之，此路徑步驟1涉及藉由例如由atoA 及atoD 基因編碼之大腸桿菌乙醯乙醯基-CoA轉移酶使乙醯乙醯基-CoA轉化成乙醯乙酸(Hanai等人,Appl. Environ. Microbiol. 73:7814-7818(2007))。乙醯乙醯基-CoA生物路徑之步驟2藉由ω-胺基轉移酶使乙醯乙酸轉化成3-胺基丁酸。來自反硝化產鹼菌(Alcaligens denitrificans )之ω-胺基酸：丙酮酸胺基轉移酶(ω-APT)在大腸桿菌中過度表現且活體外展示對3-胺基丁酸具有高活性(Yun等人,Appl. Environ. Microbiol. 70:2529-2534(2004))。
在步驟3中，推定之胺基變位酶使胺基由碳主鏈之3位移至4位。尚未表徵對3-胺基丁酸執行此功能之胺基變位酶，但來自斯氏梭菌之酶具有極類似機制。酶D-離胺酸-5,6-胺基變位酶牽涉於離胺酸生物合成中。
乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)至BDO之合成途徑經過4-胺基丁酸(大腸桿菌中通常由麩胺酸之去羧化形成之代謝物)。4-胺基丁酸一旦形成，即可藉由4-胺基丁酸轉胺酶(2.6.1.19)(一種已經生物化學表徵之酶)轉化成琥珀酸半醛。
選擇此路徑中之候選酶之一個考慮因素為步驟2及3所涉及之酶的立體選擇性。反硝化產鹼菌中之ω-ABT對3-胺基丁酸之L-立體異構體具特異性，而D-離胺酸-5,6-胺基變位酶可能需要D-立體異構體。若具有互補立體選擇性之酶未最初發現或未經工程改造，則可將可使L-3-胺基丁酸轉化成D-3-胺基丁酸之具有消旋酶活性之第三種酶添加至路徑中。儘管胺基酸消旋酶普遍存在，但仍未知此等酶是否可對ω-胺基酸起作用。
在缺氧條件下此路徑之最大理論莫耳產量為每莫耳葡萄糖1.091莫耳。為產生乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)至BDO之通量，假定乙醯基-CoA：乙醯乙醯基-CoA轉移酶可逆。大腸桿菌中此酶之功能為藉由首先將其轉化成硫酯而代謝短鏈脂肪酸。
儘管尚未在大腸桿菌中經實驗證實乙醯基-CoA：乙醯乙醯基-CoA轉移酶在乙酸消耗方向中之作用，但關於其他生物體中類似酶之研究支持此反應可逆之假定。腸微生物羅斯氏菌屬(Roseburia sp.)及普拉氏梭桿菌(F. prasnitzii )中之酶丁醯基-CoA：乙酸：CoA轉移酶在利用乙酸之方向中起作用以製備丁酸(Duncan等人,Appl. Environ. Microbiol 68:5186-5190(2002))。另一極類似酶，布氏錐蟲(Trypanosoma brucei )中之乙醯基：琥珀酸CoA-轉移酶亦在利用乙酸之方向中起作用。此反應具有接近平衡之Δrxn G，因此高濃度乙酸可能驅動目標方向之反應。在最大理論BDO產率為每莫耳葡萄糖1.09莫耳下，模擬預測在無醱酵副產物之情況下大腸桿菌可產生以每莫耳葡萄糖計1.098莫耳ATP。此ATP產量應足夠用於細胞生長、維持及製備。乙醯乙醯基-CoA(乙醯乙酸)生物路徑為乙醯基-CoA至BDO之高產途徑。
因此，除先前例示用於在所選宿主中建立4-HB生物合成之各種修飾中之任一者之外，BDO製備型微生物可包括4-HB路徑代謝修飾之先前組合及排列中之任一者以及CoA非依賴性醛去氫酶、CoA依賴性醛去氫酶或醇去氫酶或本文所揭示之其他酶表現之任何組合以產生GBL及/或BDO之生物合成路徑。因此，本發明之BDO產生劑可具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9種或最多所有對應於本文所揭示之任何4-HB路徑酶及/或任何BDO路徑酶之酶的外源表現。
使用此項技術中熟知之方法進行遺傳修飾微生物之設計及建構以達成足以製備BDO之表現量。詳言之，本發明之非天然存在之微生物可達成BDO之生物合成，使得細胞內濃度如以上所討論介於約0.1mM至200mM或200mM以上，諸如約0.1mM至25mM或25mM以上。舉例而言，BDO之細胞內濃度介於約3mM至20mM，尤其介於約5mM至15mM，且更特定言之介於約8mM至12mM，包括約10mM或10mM以上。亦可由本發明之非天然存在之微生物達成此等例示性範圍中之每一者之間及以上之細胞內濃度。如同4-HB產生劑一樣，BDO產生劑亦可在缺氧條件下維持、培養或醱酵。
本發明進一步提供一種4-HB製備方法。該方法包括在實質上缺氧條件下歷時足以製備單體4-羥基丁酸(4-HB)之時段培養具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之非天然存在之微生物，該微生物包含至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去羧酶之外源核酸。舉例而言，該方法可另外包括4-HB至GBL及至BDO或THF之化學轉化。
本發明另外提供一種4-HB製備方法。該方法包括在實質上缺氧條件下歷時足以製備單體4-羥基丁酸(4-HB)之時段培養具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之非天然存在之微生物，該微生物包括至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶或α-酮戊二酸去羧酶之外源核酸。4-HB產物可分泌至培養基中。
本發明進一步提供一種製備BDO之方法。該方法包括培養非天然存在之微生物生物催化劑歷時足以製備1,4-丁二醇(BDO)之時段，該微生物生物催化劑包含具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之微生物，該等路徑包括至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉羥基丁醯酶、α-酮戊二酸去羧酶、醛去氫酶、醇去氫酶或醛/醇去氫酶之外源核酸。BDO產物可分泌至培養基中。
本發明另外提供藉由培養具有本發明之BDO路徑的非天然存在之微生物來製備BDO之方法。BDO路徑可包含至少一種在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺化)、4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶或4-羥基丁醯基-CoA去氫酶(參見實例VII及表17)。
或者，BDO路徑可包含至少一種在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含4-胺基丁酸CoA轉移酶、4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁酸-CoA連接酶、4-胺基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)、4-胺基丁醯基-CoA還原酶、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(參見實例VII及表18)。
此外，本發明提供一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養具有BDO路徑之非天然存在之微生物，該路徑包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含4-胺基丁酸激酶、4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)、4-胺基丁-1-醇去氫酶、4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)、4-胺基丁-1-醇轉胺酶、[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺化)、[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸轉胺酶、4-羥基丁醯基-磷酸去氫酶或4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(參見實例VII及表19)。
本發明進一步提供一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養具有BDO路徑之非天然存在之微生物，該路徑包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二側氧基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)、2,5-二側氧基戊酸還原酶、α-酮戊二酸CoA轉移酶、α-酮戊二醯基-CoA水解酶、α-酮戊二醯基-CoA連接酶、α-酮戊二醯基-CoA還原酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶、α-酮戊二醯基-CoA還原酶(醇形成)、5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶或5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)(參見實例VIII及表20)。
本發明另外提供一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養具有BDO路徑之非天然存在之微生物，該路徑包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含麩胺酸CoA轉移酶、麩胺醯基-CoA水解酶、麩胺醯基-CoA連接酶、麩胺酸5-激酶、麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)、麩胺醯基-CoA還原酶、麩胺酸-5-半醛還原酶、麩胺醯基-CoA還原酶(醇形成)、2-胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺化)、2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶、5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)(參見實例IX及表21)。
本發明另外包括一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養具有BDO路徑之非天然存在之微生物，該路徑包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、3-羥基丁醯基-CoA脫水酶、乙烯基乙醯基-CoA Δ-異構酶或4-羥基丁醯基-CoA脫水酶(參見實例X及表22)。
本發明亦提供一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養具有BDO路徑之非天然存在之微生物，該路徑包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含高絲胺酸去胺酶、高絲胺酸CoA轉移酶、高絲胺酸-CoA水解酶、高絲胺酸-CoA連接酶、高絲胺酸-CoA去胺酶，4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶、4-羥基丁-2-烯酸還原酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶(參見實例XI及表23)。
本發明另外提供一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養具有BDO路徑之非天然存在之微生物，該路徑包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含琥珀醯基-CoA還原酶(醇形成)、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(醯基磷酸還原酶)。此BDO路徑可進一步包含琥珀醯基-CoA還原酶、4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基-CoA轉移酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉-4-羥基丁醯酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶、4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)或1,4-丁二醇去氫酶。
本發明亦提供一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養具有BDO路徑之非天然存在之微生物，該路徑包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，該BDO路徑包含麩胺酸去氫酶、4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺化)、4-胺基丁酸轉胺酶、麩胺酸去羧酶、4-羥基丁醯基-CoA水解酶、4-羥基丁醯基-CoA連接酶、4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(醯基磷酸還原酶)。
應瞭解，在本發明之方法中，可將一或多種外源核酸中之任一者引入微生物中以製備本發明之非天然存在之微生物。可引入核酸以便賦予微生物以例如4-HB、BDO、THF或GBL生物合成路徑。或者，可引入編碼核酸以製備具有催化一些所要反應之生物合成能力的中間微生物以賦予4-HB、BDO、THF或GBL生物合成能力。舉例而言，具有4-HB生物合成路徑之非天然存在之微生物可包含至少兩種編碼所要酶之外源核酸，該等酶為諸如以下組合：4-羥基丁酸去氫酶與α-酮戊二酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶與CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶；4-羥基丁酸去氫酶與CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶與琥珀醯基-CoA合成酶；琥珀醯基-CoA合成酶與麩胺酸去羧酶，及其類似組合。因此，應瞭解，本發明之非天然存在之微生物可包括兩種或兩種以上生物合成路徑酶之任何組合。類似地，應瞭解，本發明之非天然存在之微生物必要時可包括三種或三種以上生物合成路徑酶之任何組合，例如4-羥基丁酸去氫酶、α-酮戊二酸去羧酶及CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶與琥珀醯基-CoA合成酶；4-羥基丁酸去氫酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶等，只要所要生物合成路徑之酶的組合使得可製備相應所要產物即可。
類似地，例如，就經引入以賦予BDO製備之任何一或多種外源核酸而言，具有BDO生物合成路徑之非天然存在之微生物可包含至少兩種編碼所要酶之外源核酸，該等酶為諸如以下酶之組合：4-羥基丁酸去氫酶與α-酮戊二酸去羧酶；4-羥基丁酸去氫酶與4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶；4-羥基丁酸去氫酶與丁酸激酶；4-羥基丁酸去氫酶與磷酸轉丁醯酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶與醛去氫酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶與醇去氫酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶與醛/醇去氫酶、4-胺基丁酸-CoA轉移酶與4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶；4-胺基丁酸激酶與4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)；及其類似組合。因此，應瞭解，本發明之非天然存在之微生物可包括兩種或兩種以上生物合成路徑酶之任何組合。類似地，應瞭解，本發明之非天然存在之微生物可包括三種或三種以上生物合成路徑酶之任何組合，該等酶為例如4-羥基丁酸去氫酶、α-酮戊二酸去羧酶及4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶；4-羥基丁酸去氫酶、丁酸激酶及磷酸轉丁醯酶；4-羥基丁酸去氫酶、4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶及醛去氫酶；4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶、醛去氫酶及醇去氫酶；丁酸激酶、磷酸轉丁醯酶及醛/醇去氫酶；4-胺基丁醯基-CoA水解酶、4-胺基丁醯基-CoA還原酶及4-胺基丁-1-醇轉胺酶；3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、3-羥基丁醯基-CoA脫水酶及4-羥基丁醯基-CoA脫水酶；及其類似組合。類似地，本發明之非天然存在之微生物必要時可包括4種、5種或5種以上如本文所揭示之生物合成路徑酶之任何組合，只要所要生物合成路徑酶之組合使得可製備相應所要產物即可。
可培養任何本文所述之非天然存在之微生物以製備及/或分泌本發明之生物合成產物。舉例而言，可培養4-HB產生劑以生物合成製備4-HB。4-HB可如下所述分離或處理以產生GBL、THF及/或BDO。類似地，可培養BDO產生劑以生物合成製備BDO。如本文所揭示，可對BDO分離或進行進一步處理以化學合成BDO族化合物。
生長培養基可包括例如可向非天然存在之微生物供應碳源之任何碳水化合物來源。此等來源包括例如糖類，諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖，果糖、蔗糖及澱粉。其他碳水化合物來源包括例如可再生原料及生物質。可在本發明之方法中用作原料之例示型生物質包括纖維素生物質、半纖維素生物質及木質素原料或原料之一部分。此等生物質原料含有例如適用作諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖及澱粉之碳源之碳水化合物受質。鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，除以上所例示之可再生原料及生物質外之可再生原料及生物質亦可用於培養用於製備4-HB或BDO及本發明之其他化合物的本發明之微生物。
因此，鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，可製備當在諸如碳水化合物之碳源上生長時分泌本發明之生物合成化合物的非天然存在之微生物。此等化合物包括例如4-HB、BDO及4-HB路徑、BDO路徑及/或組合4-HB及BDO路徑中之任何中間代謝物。所有所需為工程改造一或多種圖1所示之酶活性以達成包括例如一些或所有4-HB及/或BDO生物合成路徑之包涵物的所要化合物或中間物之生物合成。因此，本發明提供一種當在碳水化合物上生長時分泌4-HB，當在碳水化合物上生長時分泌BDO及/或當在碳水化合物上生長時分泌圖1所示任何中間代謝物的非天然存在之微生物。本發明之BDO製備型微生物可由例如琥珀酸、琥珀醯基-CoA、α-酮戊二酸、琥珀酸半醛、4-HB、4-羥基丁醯基磷酸、4-羥基丁醯基-CoA(4-HB-CoA)及/或4-羥基丁醛起始合成。
在某些實施例中，培養條件包括缺氧或實質上缺氧生長或維持條件。例示性缺氧條件先前已進行描述且在此項技術中熟知。以下實例中描述用於醱酵過程之例示性缺氧條件。任何此等條件可與非天然存在之微生物以及此項技術中熟知之其他缺氧條件一起使用。在此等缺氧條件下，4-HB及BDO產生劑可分別合成細胞內濃度為5mM至10mM或10mM以上以及先前所例示之所有其他濃度的單體4-HB及BDO。
本發明之4-HB及BDO製備型非天然存在之微生物亦可產生許多下游化合物。就本發明之4-HB製備型微生物而言，單體4-HB及GBL平衡存在於培養基中。4-HB至GBL之轉化可藉由例如在酸性pH值培養基中培養微生物來有效實現。小於或等於7.5之pH值，尤其等於或低於5.5之pH值使4-HB自發地轉化為GBL。
可使用此項技術中熟知之多種方法使所得GBL與4-HB及培養物中之其他組份分離。此等分離方法包括例如實例中所例示之萃取程序以及包括連續液-液萃取、滲透蒸發、膜過濾、膜分離、逆滲透、電透析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離子交換層析、尺寸排阻層析、吸附層析及超濾之方法。此項技術中熟知所有以上方法。經分離GBL可藉由例如蒸餾進一步純化。
可由本發明之4-HB製備型非天然存在之微生物製備的另一下游化合物包括例如BDO。此化合物可藉由例如GBL之化學氫化合成。此項技術中熟知化學氫化反應。一例示性程序包括使用以化學計量或催化方式使用之異相或均相氫化催化劑以及氫氣或基於氫化物之還原劑化學還原4-HB及/或GBL或源自培養物之此兩種組份之混合物來製備1,4-丁二醇。
此項技術中熟知之其他程序同樣適用於以上化學反應且包括例如WO第82/03854號(Bradley等人)，其描述γ-丁內酯經氧化銅及氧化鋅催化劑之氣相氫解。英國專利第1,230,276號，其描述使用氧化銅-氧化鉻催化劑之γ-丁內酯之氫化。在液相中進行氫化。亦例示具有高的總反應器壓力之分批反應。反應器中之反應物及產物分壓遠高於各別露點。英國專利第1,314,126號，其描述γ-丁內酯經鎳-鈷-釷氧化物催化劑之液相氫化。例示具有高的總壓及遠高於各別組份露點之組份分壓之分批反應。英國專利第1,344,557號，其描述γ-丁內酯經氧化銅-氧化鉻催化劑之液相氫化。指示氣相或含有蒸氣之混合相適用於一些情況。例示使用高的總反應器壓力之連續流動管式反應器。英國專利第1,512,751號，其描述γ-丁內酯經氧化銅-氧化鉻催化劑液相氫化為1,4-丁二醇。例示具有高的總反應器壓力及(若可測定)遠高於各別露點之反應物及產物分壓的分批反應。美國專利第4,301,077號，其描述γ-丁內酯經Ru-Ni-Co-Zn催化劑氫化為1,4-丁二醇。該反應可以液相或氣相或以混合液-氣相進行。例示在高總反應器壓力及相對低反應器生產率下之連續流動液相反應。美國專利第4,048,196號，其描述γ-丁內酯經氧化銅-氧化鋅催化劑藉由液相氫化製備1,4-丁二醇。進一步例示在高的總反應器壓力及高的反應物及產物分壓下操作之連續流動管式反應器。以及美國專利第4,652,685號，其描述內酯氫化為二醇。
可由本發明之4-HB製備型微生物製備之另一下游化合物包括例如THF。此化合物可藉由例如GBL之化學氫化合成。此項技術中熟知適用於使GBL轉化為THF之一例示性程序包括例如使用以化學計量或催化方式使用之異相或均相氫化催化劑以及氫氣或基於氫化物之還原劑化學還原4-HB及/或GBL或源自培養物之此兩種組份之混合物來製備四氫呋喃。此項技術中熟知之其他程序同樣適用於以上化學反應且包括例如美國專利第6,686,310號，其描述高表面積溶膠-凝膠途徑製備之氫化催化劑。亦描述順丁烯二酸還原為四氫呋喃(THF)及1,4-丁二醇(BDO)及γ-丁內酯還原為四氫呋喃及1,4-丁二醇之方法。
培養條件可包括例如液體培養程序以及醱酵及其他大規模培養程序。如以下實例所進一步描述，可在缺氧或實質上缺氧之培養條件下獲得本發明之生物合成產物之尤其有用產量。
可使用熟知方法執行測試4-HB或BDO製備之合適純化及/或檢定。待測試之各工程改造菌株均可生長諸如一式三份培養物之合適複製。舉例而言，可監測工程改造製備宿主中之產物及副產物形成。可藉由諸如HPLC(高效液相層析)、GC-MS(氣相層析-質譜)及LC-MS(液相層析-質譜)之方法或其他合適分析方法使用此項技術中熟知之常規程序分析最終產物及中間物及其他有機化合物。亦可用培養上清液測試醱酵培養液中之產物釋放。可藉由HPLC使用例如葡萄糖及醇之折射率偵測器及有機酸之UV偵測器(Lin等人，Biotechnol. Bioeng. 90:775-779(2005))或此項技術中熟知之其他合適檢定及偵測方法定量副產物及殘餘葡萄糖。亦可使用此項技術中熟知之方法檢定來自外源DNA序列之個別酶或蛋白質活性。
可使用此項技術中熟知之多種方法使4-HB或BDO產物與培養物中之其他組份分離。此等分離方法包括例如萃取程序以及包括連續液-液萃取、滲透蒸發、膜過濾、膜分離、逆滲透、電透析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離子交換層析、尺寸排阻層析、吸附層析及超濾之方法。此項技術中熟知所有以上方法。
本發明進一步提供一種製造4-HB之方法。該方法包括在實質上缺氧條件下歷時足以製備單體4-羥基丁酸(4-HB)之時段使具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之非天然存在之微生物醱酵，該微生物包含至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶或麩胺酸去羧酶之外源核酸，該方法包含分批進料醱酵(fed-batch fermentation)及分批分離；分批進料醱酵及連續分離，或連續醱酵及連續分離。
上述培養及化學氫化亦可按比例擴大且連續生長以製造4-HB、GBL、BDO及/或THF。例示性生長程序包括例如分批進料醱酵及分批分離；分批進料醱酵及連續分離，或連續醱酵及連續分離。此項技術中熟知所有此等方法。利用4-HB產生劑藉由利用以上氫化程序同時連同諸如醱酵之連續培養方法使得4-HB生物合成及化學轉化成GBL、BDO及/或THF同時進行。其他氫化程序在此項技術中亦熟知且同樣可應用於本發明之方法。
醱酵程序尤其適用於生物合成製備商業量之4-HB及/或BDO。一般而言，且如同非連續性培養程序一樣，4-HB或BDO之連續及/或近乎連續製備應包括在足以維持及/或接近維持指數生長期生長之養分及培養基中培養本發明之非天然存在之4-HB或BDO製備型生物體。此等條件下之連續培養可包括例如1日、2日、3日、4日、5日、6日或7日或7日以上。另外，連續培養可包括1週、2週、3週、4週或5週或5週以上及最多若干個月。或者，本發明之生物體若適用於特定應用則可培養數小時。應瞭解，連續及/或近乎連續培養條件亦可包括此等例示性時期之間的所有時間間隔。應進一步瞭解，本發明之微生物之培養時間為足以製備足夠達到所要目的之量的產物的時段。
此項技術中熟知醱酵程序。簡言之，用於生物合成製備4-HB、BDO或本發明之其他4-HB衍生產物之醱酵可用於例如分批進料醱酵及分批分離；分批進料醱酵及連續分離，或連續醱酵及連續分離中。以下實例中進一步例示此項技術中熟知之分批及連續醱酵程序之實例。
除分別使用本發明之4-HB或BDO產生劑連續製備大量單體4-HB及BDO之以上醱酵程序外，4-HB產生劑亦可例如同時經受如先前關於將單體4-HB化學轉化為例如GBL、BDO及/或THF所述之化學合成程序。BDO產生劑可類似地例如同時經受如先前關於將BDO化學轉化為例如THF、GBL、吡咯啶酮及/或其他BDO族化合物所述之化學合成程序。此外，4-HB及BDO產生劑之產物可與醱酵培養物分離且依序經受如本文所揭示之化學轉化。
簡言之，可如Frost等人,Biotechnology Progress 18:201-211(2002)所述執行GBL在醱酵培養液中之氫化。醱酵期間氫化之另一程序包括例如美國專利第5,478,952號中所述之方法。以下實例中進一步例示此方法。
因此，本發明另外提供一種製造γ-丁內酯(GBL)、四氫呋喃(THF)或1,4-丁二醇(BDO)之方法。該方法包括在實質上缺氧之條件下歷時足以製備1,4-丁二醇(BDO)、GBL或THF之時段使具有4-羥基丁酸(4-HB)及/或1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之非天然存在之微生物醱酵，該等路徑包含至少一種編碼4-羥基丁酸去氫酶、CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶、琥珀醯基-CoA合成酶、CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶、4-羥基丁酸：CoA-轉移酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、α-酮戊二酸去羧酶、麩胺酸去羧酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉丁醯酶、CoA非依賴性1,4-丁二醇半醛去氫酶、CoA依賴性1,4-丁二醇半醛去氫酶、CoA非依賴性1,4-丁二醇醇去氫酶或CoA依賴性1,4-丁二醇醇去氫酶之外源核酸，該醱酵包含分批進料醱酵及分批分離；分批進料醱酵及連續分離，或連續醱酵及連續分離。
除生物合成如本文所述之4-HB、BDO及本發明之其他產物外，亦可利用本發明之非天然存在之微生物及方法彼此之各種組合及與此項技術中熟知之其他微生物及方法之各種組合以藉由其他途徑達成產物生物合成。舉例而言，一種不使用4-HB產生劑及化學步驟或不直接使用BDO產生劑來製備BDO之替代方法為經由添加能夠將4-HB或本文所例示之4-HB產物轉化為BDO之另一微生物。
一種此程序包括例如如上文及下文所述使本發明之4-HB製備型微生物醱酵以製備4-HB。接著可將4-HB用作將4-HB轉化為例如BDO、GBL及/或THF之第二微生物之受質。可將4-HB直接添加至第二生物體之另一培養物中，或可藉由例如細胞分離使4-HB產生劑之原始培養物不含此等微生物，且接著可在無中間純化步驟下利用後續添加第二生物體至醱酵培養液中來製備最終產物。一種具有藉由生物化學方式將4-HB用作受質以轉化為BDO之能力的例示性第二生物體為例如丙酮丁醇梭菌(例如參見Jewell等人,Current Microbiology, 13:215-19(1986))。
在其他實施例中，本發明之非天然存在之微生物及方法可以多種子路徑組裝以達成如所述之例如4-HB及/或BDO之生物合成。在此等實施例中，可將本發明之所要產物之生物合成路徑分成不同微生物且可將該等不同微生物共培養以製備最終產物。在此生物合成流程中，一種微生物之產物為第二微生物之受質，直至合成最終產物。舉例而言，可如先前所述藉由建構含有使一種路徑中間物轉化成另一路徑中間物或產物(舉例而言，諸如內源性琥珀酸之受資經由4-HB至最終產物BDO)之生物合成路徑之微生物來實現BDO之生物合成。或者，亦可在同一血管中使用兩種生物體經由共培養或共醱酵由微生物來生物合成製備BDO。第一微生物為具有由琥珀酸製備4-HB之基因之4-HB產生劑，且第二微生物為具有將4-HB轉化成BDO之基因之BDO產生劑。
鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，本發明之非天然存在之微生物及方法連同其他微生物、具有子路徑之其他非天然存在之微生物之共培養物及此項技術中熟知之其他化學及/或生物化學程序之組合存在多種組合及排列以製備本發明之4-HB、BDO、GBL及THF產物。
為產生較佳產生劑，可利用代謝模型化以最佳化生長條件。模型化亦可用於設計另外最佳利用路徑之基因剔除(例如參見美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466及美國專利第7,127,379號)。模型化分析允許可靠預測使代謝向更有效製備BDO改變對細胞生長之影響。
一種鑑別及設計有利於生物合成所要產物之代謝變化之計算方法為OptKnock計算構架(Burgard等人,Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003))。OptKnock為代謝模型化及模擬程式，該程式表明產生過度製備目標產物之遺傳穩定微生物的基因破壞或缺失策略。特定言之，該構架研究微生物之完全代謝及/或生物化學網路，以表明促使所要生物化學品變為細胞生長之必然副產物之遺傳操作。藉由經由置於關鍵位置之基因破壞或缺失或其他功能基因破壞(例如整個基因之缺失、轉錄或轉譯所需之調節序列之缺失、產生截短基因產物之一部分基因之缺失)或藉由使經編碼基因產物失活之各種突變策略中之任一者使生物化學製備與細胞生長偶合，由於強制生長偶合之生物化學製備，在生物反應器中長時期之後經工程改造之菌株上所施加之生長選擇壓力產生效能改良。最後，當建構基因缺失時，可忽略所設計菌株回復其野生型狀態之可能性，此係因為OptKnock所選之基因將自基因組完全移除。因此，此計算方法可用以鑑別導致所要產物生物合成之替代路徑，或與非天然存在之微生物一起使用以進一步最佳化所要產物之生物合成。
簡言之，OptKnock為本文用以指模型化細胞代謝之計算方法及系統之術語。OptKnock程式係關於將特定約束併入至通量平衡分析(FBA)模型中之模型及方法之構架。此等約束包括例如定性動力學資訊、定性調節資訊及/或DNA微陣列實驗資料。OptKnock亦藉由例如固定經由通量平衡模型得到之通量邊界且隨後探測在基因添加或破壞/缺失存在下代謝網路之效能極限來計算各種代謝問題之解答。OptKnock計算構架使得構築能有效查詢代謝網路之效能極限之模型組成，且提供解決所得混合整數線性程式設計問題之方法。本文稱為OptKnock之代謝模型化及模擬方法描述於例如2002年1月10日申請之美國公開案第2002/0168654號、2002年1月10日申請之國際專利第PCT/US02/00660號及2007年8月10日申請之美國專利申請案第11/891,602號中。
鑑別及設計有利於產物之生物合成製備之代謝變化的另一種計算方法為稱為SimPheny之代謝模型化及模擬系統。此計算方法及系統描述於例如2002年6月14日申請之美國公開案2003/0233218及2003年6月13日申請之國際專利申請案第PCT/US03/18838號中。SimPheny為可用於電腦模擬製備網路模型且經由生物系統之化學反應模擬質量、能量或電荷通量以界定系統中含有化學反應之任何及所有可能官能基之解空間的計算系統，藉此確定生物系統所允許之活性的範圍。此方法稱為基於約束之模型化，此係因為解空間係由諸如所包括反應之已知化學計量之約束以及與最大流通反應有關之反應熱力學及能力約束限定。可詢問由此等約束限定之空間以確定生物系統或其生物化學組份之表型能力及行為。
此等計算方法與生物學事實一致，此係因為生物系統具靈活性且可以許多不同方式達到相同結果。生物系統係經由已受所有生命系統必須面對之基本約束所限制的進化機制來設計。因此，基於約束之模型化策略涵蓋此等一般事實。此外，經由固定約束對網路模型連續施加其他限制之能力導致解空間之大小減小，藉此增強可用以預測生理效能或表型之精確度。
鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者將能夠應用代謝模型化及模擬之各種計算構架以在宿主微生物中設計及實施所要化合物之生物合成。此代謝模型化及模擬方法包括例如以上如SimPheny及OptKnock所例示之計算系統。為說明本發明，本文關於模型化及模擬之OptKnock計算構架描述一些方法。熟習此項技術者將已知如何使用OptKnock使代謝變化之鑑別、設計及實施應用於此項技術中熟知之任何此等其他代謝模型化及模擬計算構架及方法。
上述方法將提供一組代謝反應以供破壞。在生物體生長階段中，消除組內之各反應或代謝修飾可導致所要產物成為必然產物。因為已知該等反應，所以二階OptKnOck問題之解答亦將提供相關基因或編碼一或多種催化反應組內之各反應之酶的基因。一組反應及其編碼參與各反應之酶的相應基因之鑑別一般為自動過程，其係經由使反應與具有酶與編碼基因之間的關係之反應資料庫關聯來實現。
一旦經鑑別，則被破壞以達成所要產物之製備之該組反應係藉由功能性破壞至少一種編碼該組內之各代謝反應之基因而在目標細胞或生物體中實施。一種達成反應組之功能性破壞之尤其有用方法為使各編碼基因缺失。然而，在一些情況下，藉由其他遺傳畸變破壞反應可為有益的，該等遺傳畸變包括例如突變、諸如啟動子或調節因子之順式結合位點之調節區域缺失或在許多位置中之任一處截短編碼序列。例如當需要產物偶合之快速評定時或當遺傳回復變異不太可能存在時，產生小於基因組之總缺失之此等後來畸變可能有用。
為鑑別導致其他組反應破壞之上述二階OptKnock問題之其他製備性解答或可導致生物合成(包括所要產物之生長偶合之生物合成)之代謝修飾，可實施稱為整數切割之最佳化方法。此方法藉由經在各迭代時併入稱為整數切割之其他約束而迭代解決以上所例示之OptKnock問題來進行。整數切割約束有效阻止解答程序選擇在任何先前迭代中鑑別為使產物生物合成與生長強制偶合之精確相同組反應。舉例而言，若先前鑑別之生長偶合之代謝修飾明確說明反應1、2及3用於破壞，則以下約束防止相同反應在後續解答中被同時考慮。整數切割法在此項技術中熟知且可見描述於例如Burgard等人,Biotechnol. Prog . 17:791-797(2001)中。如同本文關於方法用途以及用於代謝模型化及模擬之OptKnock計算構架所描述之所有方法一樣，降低迭代計算分析中冗餘之整數切割法亦可與此項技術中熟知之其他計算構架(包括例如SimPheny)一起應用。
本文所例示之方法允許建構以生物合成方式製備所要產物之細胞及生物體，包括使目標生物化學產物之製備與經工程改造以具有經鑑別基因變化之細胞或生物體之生長必然偶合。因此，本文所述之計算方法允許鑑別及實施藉由選自OptKnock或SimPheny之電腦模擬方法鑑別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括例如添加一或多種生物合成路徑酶及/或功能性破壞一或多種代謝反應(包括例如藉由基因缺失破壞)。
如以上所討論，OptKnock方法係在突變體微生物網路經受長期生長選擇時可向其計算方式預測之最大生長表型進化之前提下開發。換言之，該方法影響生物體在選擇壓力下自優化之能力。OptKnock構架允許詳盡列舉促使生物化學製備與基於網路化學計量之細胞生長之間的偶合之基因缺失組合。最佳基因/反應基因剔除之鑑別需要二階優化問題之解答，該解答選擇活性反應組以便使所得網路之最佳生長解答過度製備目標生物化學品(Burgard等人,Biotechnol. Bioeng . 84:647-657(2003))。
如先前所例示及例如美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466及美國專利第7,127,379號中所述，可利用大腸桿菌代謝之電腦模擬化學計量模型以鑑別代謝路徑之必需基因。如本文所揭示，OptKnock數學構架可應用於導致所要產物之生長偶合製備之單點基因缺失。此外，二階OptKnock問題之解答僅提供一組缺失。為列舉所有有意義之解答，亦即導致生長偶合製備形成之所有組基因剔除，可實施稱為整數切割之最佳化技術。如以上所討論，此舉需要在各迭代時併入稱為整數切割之其他約束來迭代解決OptKnock問題。
上文所例示且以下實例中進一步說明之方法能夠建構以生物合成方式製備之細胞及生物體，其包括使目標生物化學產物之製備與經工程改造以具有經鑑別基因變化之細胞或生物體之生長必然偶合。就此而言，已鑑別導致4-HB及1,4-丁二醇之生物合成之代謝變化。與未經修飾之微生物相比，由經鑑別代謝變化建構之微生物菌株製備高含量之4-HB或BDO。此等菌株可在不經受負選擇壓力之情況下，例如以連續醱酵方法有利地用於商業製備4-HB、BDO、THF及GBL。
因此，本文所述之計算方法能夠鑑別及實施藉由選自OptKnock或SimPheny之電腦模擬方法鑑別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括例如添加一或多種生物合成路徑酶及/或功能性破壞一或多種代謝反應(包括例如藉由基因缺失破壞)。
應瞭解，本文所提供之本發明之定義內亦包括實質上不影響本發明之各種實施例之活性的修飾。因此，以下實例意欲說明而不限制本發明。
可培養任何本文所述之非天然存在之微生物以製備及/或分泌本發明之生物合成產物。舉例而言，可培養生物合成製備BDO之BDO產生劑。
對於BDO製備，在有碳來源及其他必需養分之培養基中培養重組菌株。極需要在醱酵槽中維持缺氧條件以降低全過程之成本。此等條件可例如藉由首先噴射含氮氣之培養基且接著用隔膜與鉗口蓋密封燒瓶來獲得。對於缺氧下未觀測到生長之菌株，可藉由將隔膜穿孔使其具有有限通氣之小孔來施用微氧條件。例示性缺氧條件先前已進行描述且在此項技術中熟知。例示性有氧及缺氧條件描述於例如2007年8月10日申請之美國專利申請案第11/891,602號中。如本文所揭示，以分批、分批進料或連續方式進行醱酵。
必要時，培養基之pH值可按照將培養基維持於需要pH值所需藉由添加鹼(諸如NaOH或其他鹼)或酸維持於所要pH值，尤其中性pH值，諸如約7之pH值。可藉由使用分光光度計(600nm)量測光學密度來測定生長速率，且藉由監測碳源隨時間之消耗來測定葡萄糖攝取速率。
除諸如以上所例示之可再生原料之外，本發明之BDO製備型微生物亦可經修飾以於作為其碳源之合成氣上生長。在此特定實施例中，一或多種蛋白質或酶表現於BDO製備型生物體中以提供利用合成氣或其他氣態碳源之代謝路徑。
亦稱為合成氣或發生氣(producer gas)之合成氣體為煤及諸如生物質材料(包括農作物及殘餘物)之含碳材料氣化之主要產物。合成氣為主要由H2 及CO構成之混合物且可由氣化包括(但不限於)煤、煤油、天然氣、生物質及有機廢物之任何有機原料獲得。氣化一般在高的燃料：氧氣比下進行。儘管主要為H2 及CO，但合成氣亦可包括較少量之CO2 及其他氣體。因此，合成氣體提供一種具成本效益之氣態碳(諸如CO及另外CO2 )來源。
Wood-Ljungdahl路徑催化CO及H2 轉化為乙醯基-CoA及諸如乙酸之其他產物。能夠利用CO及合成氣之生物體一般亦具有經由相同基本組酶及由Wood-Ljungdahl路徑涵蓋之轉化利用CO2 及CO2 /H2 混合物之能力。許久以前已認識到CO2 藉由微生物而H2 依賴性轉化為乙酸，其揭示CO亦可藉由相同生物體使用且涉及相同路徑。已展示許多產乙酸菌在CO2 存在下生長且製備諸如乙酸之化合物，只要存在氫氣以供應必要還原等效物即可(例如參見Drake,Acetogenesis ，第3-60頁,Chapman and Hall,New York,(1994))。此可由以下方程式概述：2CO2 +4H2 +n ADP+n Pi→CH3 COOH+2H2 O+n ATP。
因此，具有Wood-Ljungdahl路徑之非天然存在之微生物亦可利用CO2 及H2 混合物來製備乙醯基-CoA及其他所要產物。
Wood-Ljungdahl路徑在此項技術中熟知且由12個反應組成，該等反應可分成兩個分支：(1)甲基分支及(2)羰基分支。甲基分支使合成氣轉化為甲基-四氫葉酸(甲基-THF)，而羰基分支使甲基-THF轉化為乙醯基-CoA。甲基分支中之反應係依序由以下酶或蛋白質催化：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、甲酸去氫酶、甲醯四氫葉酸合成酶、甲醯基四氫葉酸環化脫水酶、亞甲基四氫葉酸去氫酶及亞甲基四氫葉酸還原酶。羰基分支中之反應係依序由以下酶或蛋白質催化：甲基四氫葉酸：類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白組裝蛋白(例如AcsF)、鐵氧化還原蛋白、乙醯基-CoA合酶、一氧化碳去氫酶及鎳蛋白組裝蛋白(例如CooC)。遵循本文關於引入足夠量之編碼核酸以產生BDO路徑所提供的教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，亦可關於至少引入宿主生物體中不存在之編碼Wood-Ljungdahl酶或蛋白質之核酸執行相同工程設計。因此，向本發明之微生物中引入一或多種編碼核酸以使得經修飾生物體含有完整Wood-Ljungdahl路徑將賦予合成氣利用能力。
因此，鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，當在諸如碳水化合物之碳源上生長時可製備分泌本發明之生物合成化合物的非天然存在之微生物。此等化合物包括例如BDO及BDO路徑中之任何中間代謝物。所有所需為工程改造一或多種所需酶或蛋白質活性以達成包括例如一些或所有BDO生物合成路徑之包涵物的所要化合物或中間物之生物合成。因此，本發明提供一種當在碳水化合物或其他碳源上生長時製備及/或分泌BDO且當在碳水化合物或其他碳源上生長時製備及/或分泌BDO路徑中所示之任何中間代謝物的非天然存在之微生物。如本文所揭示，本發明之BDO製備型微生物可自BDO路徑中之中間物起始合成。
為產生較佳產生劑，可利用代謝模型化以最佳化生長條件。模型化亦可用於設計另外最佳利用路徑之基因剔除(例如參見美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466及美國專利第7,127,379號)。模型化分析允許可靠預測使代謝向更有效製備BDO改變對細胞生長之影響。
一種鑑別及設計有利於生物合成所要產物之代謝變化之計算方法為OptKnock計算構架(Burgard等人,Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003))。OptKnock為代謝模型化及模擬程式，該程式表明產生過度製備目標產物之遺傳穩定微生物之基因缺失策略。特定言之，該構架研究微生物之完全代謝及/或生物化學網路，以表明促使所要生物化學品變為細胞生長之必然副產物之遺傳操作。藉由經由置於關鍵位置之基因缺失或其他功能基因破壞使生物化學製備與細胞生長偶合，由於強制生長偶合之生物化學製備，在生物反應器中長時期之後經工程改造之菌株上所施加之生長選擇壓力產生效能改良。最後，當建構基因缺失時，可忽略所設計菌株回復其野生型狀態之可能性，此係因為OptKnock所選之基因將自基因組完全移除。因此，此計算方法可用以鑑別導致所要產物生物合成之替代路徑，或與非天然存在之微生物一起使用以進一步最佳化所要產物之生物合成。
簡言之，OptKnock為本文用以指模型化細胞代謝之計算方法及系統之術語。OptKnock程式係關於將特定約束併入至通量平衡分析(FBA)模型中之模型及方法之構架。此等約束包括例如定性動力學資訊、定性調節資訊及/或DNA微陣列實驗資料。OptKnock亦藉由例如固定經由通量平衡模型得到之通量邊界且隨後探測在基因添加或缺失存在下代謝網路之效能極限來計算各種代謝問題之解答。OptKnock計算構架允許構築能有效查詢代謝網路之效能極限之模型組成，且提供解決所得混合整數線性程式設計問題之方法。本文稱為OptKnock之代謝模型化及模擬方法描述於例如2002年1月10日申請之美國公開案第2002/0168654號、2002年1月10日申請之國際專利第PCT/US02/00660號及2007年8月10日申請之美國專利申請案第11/891,602號中。
鑑別及設計有利於產物之生物合成製備之代謝變化的另一種計算方法為稱為SimPheny之代謝模型化及模擬系統。此計算方法及系統描述於例如2002年6月14日申請之美國公開案2003/0233218及2003年6月13日申請之國際專利申請案第PCT/US03/18838號中。SimPheny為可用於電腦模擬製備網路模型且經由生物系統之化學反應模擬質量、能量或電荷通量以界定系統中含有化學反應之任何及所有可能官能基之解空間的計算系統，藉此確定生物系統所允許之活性的範圍。此方法稱為基於約束之模型化，此係因為解空間係由諸如所包括反應之已知化學計量之約束以及與最大流通反應有關之反應熱力學及能力約束限定。可詢問由此等約束限定之空間以確定生物系統或其生物化學組份之表型能力及行為。
此等計算方法與生物學事實一致，此係因為生物系統具靈活性且可以許多不同方式達到相同結果。生物系統係經由已受所有生命系統必須面對之基本約束所限制的進化機制來設計。因此，基於約束之模型化策略涵蓋此等一般事實。此外，經由固定約束對網路模型連續施加其他限制之能力導致解空間之大小減小，藉此增強可用以預測生理效能或表型之精確度。
鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者將能夠應用代謝模型化及模擬之各種計算構架以在宿主微生物中設計及實施所要化合物之生物合成。此等代謝模型化及模擬方法包括例如以上如SimPheny及OptKnock所例示之計算系統。為說明本發明，本文關於模型化及模擬之OptKnock計算構架描述一些方法。熟習此項技術者將已知如何使用OptKnock使代謝變化之鑑別、設計及實施應用於此項技術中熟知之任何此等其他代謝模型化及模擬計算構架及方法。
上述方法將提供一組代謝反應以供破壞。在生物體生長階段中，消除組內之各反應或代謝修飾可導致所要產物成為必然產物。因為已知該等反應，所以二階OptKnock問題之解答亦將提供相關基因或編碼一或多種催化反應組內之各反應之酶的基因。一組反應及其編碼參與各反應之酶的相應基因之鑑別一般為自動過程，其係經由使反應與具有酶與編碼基因之間的關係之反應資料庫關聯來實現。
一旦經鑑別，則被破壞以達成所要產物之製備之該組反應係藉由功能性破壞至少一種編碼該組內之各代謝反應之基因而在目標細胞或生物體中實施。一種達成反應組之功能性破壞之尤其有用方法為使各編碼基因缺失。然而，在一些情況下，藉由其他遺傳畸變破壞反應可為有益的，該等遺傳畸變包括例如突變、諸如啟動子或調節因子之順式結合位點之調節區域缺失或在許多位置中之任一處截短編碼序列。例如當需要產物偶合之快速評定時或當遺傳回復變異不太可能存在時，產生小於基因組之總缺失之此等後來畸變可能有用。
為鑑別導致其他組反應破壞之上述二階OptKnock問題之其他製備性解答或可導致生物合成(包括所要產物之生長偶合之生物合成)之代謝修飾，可實施稱為整數切割之最佳化方法。此方法藉由經在各迭代時併入稱為整數切割之其他約束而迭代解決以上所例示之OptKnock問題來進行。整數切割約束有效阻止解答程序選擇在任何先前迭代中鑑別為使產物生物合成與生長強制偶合之精確相同組反應。舉例而言，若先前鑑別之生長偶合之代謝修飾明確說明反應1、2及3用於破壞，則以下約束防止相同反應在後續解答中被同時考慮。整數切割法在此項技術中熟知且可見描述於例如Burgard等人,Biotechnol. Prog . 17:791-797(2001)中。如同本文關於方法用途以及用於代謝模型化及模擬之OptKnock計算構架所描述之所有方法一樣，降低迭代計算分析中冗餘之整數切割法亦可與此項技術中熟知之其他計算構架(包括例如SimPheny)一起應用。
本文所例示之方法允許建構以生物合成方式製備所要產物之細胞及生物體，包括使目標生物化學產物之製備與經工程改造以具有經鑑別基因變化之細胞或生物體之生長必然偶合。因此，本文所述之計算方法允許鑑別及實施藉由選自OptKnock或SimPheny之電腦模擬方法鑑別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括例如添加一或多種生物合成路徑酶及/或功能性破壞一或多種代謝反應(包括例如藉由基因缺失破壞)。
如以上所討論，OptKnock方法係在突變體微生物網路經受長期生長選擇時可向其計算方式預測之最大生長表型進化之前提下開發。換言之，該方法影響生物體在選擇壓力下自優化之能力。OptKnock構架允許詳盡列舉促使生物化學製備與基於網路化學計量之細胞生長之間的偶合之基因缺失組合。最佳基因/反應基因剔除之鑑別需要二階優化問題之解答，該解答選擇活性反應組以便使所得網路之最佳生長解答過度製備目標生物化學品(Burgard等人,Biotechnol. Bioeng . 84:647-657(2003))。
如先前所例示及例如美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466及美國專利第7,127,379號中所述，可利用大腸桿菌代謝之電腦模擬化學計量模型以鑑別代謝路徑之必需基因。如本文所揭示，OptKnock數學構架可應用於導致所要產物之生長偶合製備之單點基因缺失。此外，二階OptKnock問題之解答僅提供一組缺失。為列舉所有有意義之解答，亦即導致生長偶合製備形成之所有組基因剔除，可實施稱為整數切割之最優化技術。如以上所討論，此舉需要在各迭代時併入稱為整數切割之其他約束來迭代解決OptKnock問題。
應瞭解，本文所提供之本發明之定義內亦提供實質上不影響本發明之各種實施例之活性的修飾。因此，以下實例意欲說明而不限制本發明。
實例I
4-羥基丁酸之生物合成
此實例描述4-HB製備之例示性生物化學路徑。
微生物中關於4-HB合成之先前報導集中於此化合物作為製備生物可降解塑性聚羥基烷酸(PHA)中之中間物(美國專利第6,117,658號)。使用優於聚3-羥基丁酸聚合物(PHB)之4-HB/3-HB共聚物可導致塑性(脆性較差)(Saito及Doi,Intl. J. Biol. Macromol 16:99-104(1994))。由於以下若干種原因，故本文所述單體4-HB之製備為根本上不同之方法：(1)產物係經分泌，其與細胞內製備且保留於細胞中之PHA相反；(2)對於製備羥基丁酸聚合物之生物體，未製備游離4-HB，而藉由聚羥基烷酸合酶使用輔酶A衍生物；(3)在聚合物之情況下，形成粒狀產物改變熱力學；及(4)細胞外pH值並非製備聚合物之關鍵所在，然而其將影響4-HB是否以游離酸或共軛鹼狀態存在，以及4-HB與GBL之間的平衡。
可以兩個酶促還原步驟由琥珀酸(TCA循環之主要代謝物)製備4-HB，其中琥珀酸半醛為中間物(圖1)。第一種此等酶(琥珀酸半醛去氫酶)產自包括大腸桿菌之許多生物體，其中已發現NADH依賴性酶與NADPH依賴性酶(Donnelly及Cooper,Eur. J. Biochem . 113:555-561(1981)；Donnelly及Cooper,J. Bacteriol . 145:1425-1427(1981)；Marek及Henson,J. Bacteriol . 170:991-994(1988))。亦存在支持琥珀酸半醛去氫酶在釀酒酵母中之活性的證明(Ramos等人,Eur. J. Biochem . 149:401-404(1985))，且已藉由序列同源性鑑別推定基因。然而，如圖1所示，大多數報導指示此酶沿琥珀酸合成方向作用(Donnelly及Cooper,同上；Lutke-Eversloh及Steinbuchel,FEMS Microbiol. Lett . 181:63-71(1999))，參與4-HB及γ-胺基丁酸之降解路徑。琥珀酸半醛亦經由兩種酶麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸去羧酶之作用，經TCA循環中間物α-酮戊二酸，由諸如大腸桿菌之某些微生物天然製備。絕對厭氧菌克氏梭菌用以降解琥珀酸之替代路徑將琥珀酸活化為琥珀醯基-CoA，接著使用已知用於此方向之替代琥珀酸半醛去氫酶使琥珀醯基-COA轉化成琥珀酸半醛(Sohling及Gottschalk,Eur. J. Biochem. 212:121-127(1993))。然而，此途徑具有將琥珀酸轉化成琥珀醯基-CoA所需之ATP能量成本。
該路徑之第二種酶4-羥基丁酸去氫酶並非產自大腸桿菌或酵母，而是見於諸如克氏梭菌及真養雷氏菌之各種細菌中(Lutke-Eversloh及Steinbuchel,同上；Sohling及Gottschalk,J. Bacteriol. 178:871-880(1996)；Valentin等人,Eur. J. Biochem. 227:43-60(1995)；Wolff及Kenealy,Protein Expr. Purif. 6:206-212(1995))。已知此等酶具NADH依賴性，但亦存在NADPH依賴性形式。大腸桿菌中顯示導致聚(4-羥基丁酸)積聚之自α-酮戊二酸至4-HB之其他路徑(Song等人,Wei Sheng Wu Xue.Bao. 45:382-386(2005))。重組菌株需要過度表現三種異源基因：PHA合酶(真養雷氏菌)、4-羥基丁酸去氫酶(真養雷氏菌)及4-羥基丁酸：CoA轉移酶(克氏梭菌)，以及兩種天然大腸桿菌基因：麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸去羧酶。或者，圖1中之步驟4及步驟5可藉由α-酮戊二酸去羧酶，諸如細小裸藻中所鑑別之α-酮戊二酸去羧酶進行(Shigeoka等人,Biochem. J. 282(Pt2):319-323(1992)；Shigeoka及Nakano,Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28(1991)；Shigeoka及Nakano,Biochem J. 292(Pt 2):463-467(1993))。然而，先前並未應用此酶以影響任何生物體中4-HB或相關聚合物之製備。
在兩種微生物(大腸桿菌及釀酒酵母)中使用各生物體之電腦模擬代謝模型研究微生物之4-羥基丁酸製備能力。如圖1所示，4-HB之潛在路徑經由琥珀酸、琥珀醯基-CoA或α-酮戊二酸中間物進行。
由琥珀酸製備4-HB之路徑之第一步驟涉及琥珀酸經由NADH依賴性琥珀酸半醛去氫酶或NADPH依賴性琥珀酸半醛去氫酶轉化成琥珀酸半醛。在大腸桿菌中，gabD 為NADP依賴性琥珀酸半醛去氫酶且為4-胺基丁酸攝取及降解中所涉及之基因簇之一部分(Niegemann等人,Arch .Microbiol . 160:454-460(1993)；Schneider等人,J .Bacteriol . 184:6976-6986(2002))。咸信Sad 編碼酶之NAD依賴性琥珀酸半醛去氫酶活性(Marek及Henson，同上)。釀酒酵母僅含有推定分配至UGA2之NADPH依賴性琥珀酸半醛去氫酶，其侷限於細胞溶質(Huh等人,Nature 425:686-691(2003))。在大腸桿菌與釀酒酵母中假定琥珀酸至4-HB之路徑的最大產量計算僅需要假定非天然4-HB去氫酶已添加至其代謝網路。
琥珀醯基-CoA至4-羥基丁酸之路徑在美國專利第6,117,658號中描述為製造包含4-羥基丁酸單體單元之聚羥基烷酸方法之一部分。克氏梭菌為已知具有CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶活性之生物體之一實例(Sohling及Gottschalk,同上；Sohling及Gottschalk,同上)。在此研究中，假定來自克氏梭菌或另一生物體之此酶以及非天然或異源4-HB去氫酶表現於大腸桿菌或釀酒酵母中以完成琥珀醯基-CoA至4-HB之路徑。大腸桿菌中顯示導致聚(4-羥基丁酸)積聚達細胞乾重之30%的α-酮戊二酸至4-HB之路徑(Song等人，同上)。因為大腸桿菌及釀酒酵母天然或內源地具有麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶與麩胺酸去羧酶(Coleman等人,J. Biol. Chem. 276:244-250(2001))，所以AKG至4-HB之路徑可在兩種生物體中藉由僅假定存在非天然4-HB去氫酶來完成。
實例II
由琥珀酸及α-酮戊二酸生物合成1,4-丁二醇
此實例說明由微生物建構及生物合成製備4-HB及BDO。本文揭示4-HB及BDO之路徑。
存在若干種可利用於上述路徑中之替代酶。使琥珀酸轉化為琥珀醯基-CoA(圖1中之步驟1)之天然或內源性酶可經諸如由cat1 基因克氏梭菌編碼之CoA轉移酶置換(Sohling及Gottschalk,Eur. J Biochem. 212:121-127(1993))，其以類似於步驟9之方式起作用。然而，藉由此酶製備乙酸可能並非最佳，此係因為其可經分泌而不再轉化為乙醯基-CoA。就此而言，在步驟9中消除乙酸形成亦可有益。作為此CoA轉移酶之一種替代物，可使用首先藉由ATP使4-HB磷酸化且接著轉化為CoA衍生物之機制，其類似於大腸桿菌中乙酸轉化為乙醯基-CoA之乙酸激酶/磷酸轉乙醯酶路徑。此途徑之淨成本為一種ATP，其與由乙酸再生乙醯基-CoA所需相同。已知酶(磷酸轉丁醯酶(ptb)及丁酸激酶(bk))對用於丙酮丁醇梭菌中丁酸製備之非羥基化分子進行此等步驟(Cary等人，Appl Environ Microbiol 56:1576-1583(1990)；Valentine,R. C.及R. S. Wolfe,J Biol Chem. 235:1948-1952(I960))。此等酶可逆，從而允許合成在4-HB方向進行。
除琥珀酸之外或替代琥珀酸，亦可經由α-酮戊二酸製備BDO。如先前所述且以下進一步例示，一種實現產物生物合成之路徑為使用內源性酶經由α-酮戊二酸製備琥珀酸半醛(圖1，步驟4-5)。替代方法為使用α-酮戊二酸去羧酶，其可以一個步驟執行此轉化(圖1，步驟8；Tian等人，Proc Natl Acad Sci U S.A 102:10670-10675(2005))。
對於建構BDO製備型微生物之不同菌株，組裝一系列適用基因以進行證實。簡言之，針對圖1中所示之完全BDO製備路徑之各步驟，使用可獲得之文獻資源、NCBI基因資料庫及同源性搜索鑑別4-HB及/或BDO生物合成路徑內之一或多種基因。此研究中選殖且評估之基因以及多肽序列之適當參考文獻及URL引文呈現於以下表6中。如以下所進一步討論，合成一些基因以使密碼子最佳化，而其他則經由PCR自天然或野生型生物體之基因組DNA選殖。對於一些基因，使用兩種方法，且在此情況下，當用於實驗中時，天然基因係藉由基因識別碼之字尾「n」指示。注意：僅DNA序列不同；蛋白質一致。
表6. 宿主BDO製備型微生物中表現之基因。
BDO路徑之表現載體建構。 載體主鏈及一些菌株係獲自Expressys之Dr. Rolf Lutz(www.expressys.de/)。載體及菌株係基於Dr. Rolf Lutz及Prof. Hermann Bujard開發之pZ表現系統(Lutz,R.及H. Bujard,Nucleic Acids Res 25:1203-1210(1997))。所獲得之載體為pZE13luc、pZA33luc、pZS*13luc及pZE22luc且含有螢光素酶基因作為填充片段。為用由適當限制酶位點側接之lacZ-α片段置換螢光素酶填充片段，首先藉由用EcoRI及XbaI消化自各載體移除螢光素酶填充片段。lacZ-α片段由以下引子由pUC19進行PCR擴增：
lacZα-RI
5’GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3’
lacZα 3'BB
5’-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3’.
此舉產生具有EcoRI位點、NheI位點、核糖體結合位點、SalI位點及起始密碼子之5'末端之片段。片段之3'末端含有終止密碼子、XbaI、HindIII及AvrII位點。將PCR產物用EcoRI及AvrII消化且接合至用EcoRI及XbaI消化之基礎載體(XbaI及AvrII具有相容末端且產生非位點)。因為NheI及XbaI限制酶位點產生可接合於一起之相容末端(但產生未經任一酶消化之NheI/XbaI非位點)，所以選殖至載體中之基因可「生物圍砌」於一起(http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks )。簡言之，此方法能夠使用相同之兩個限制位點(只要該等位點不出現於基因內部即可)使無限數目之基因連接至載體中，此係因為基因之間的位點在各添加之後已破壞。
所有載體均具有pZ名稱，繼之以字母及數字指示複製起點、抗生素抗性標記及啟動子/調節單元。複製起點為第二個字母，且對於基於ColE1之起點由E表示，對於基於p15A之起點由A表示且對於基於pSC101之起點由S表示。第一個數字表示抗生素抗性標記(安比西林(Ampicillin)為1、康黴素(Kanamycin)為2、氯黴素(Chloramphenicol)為3、觀黴素(Spectinomycin)為4且四環素(Tetracycline)為5)。最後之數字定義調節目標基因之啟動子(PLtetO-1 為1、PLlacO-1 為2、PAllacO-1 為3且Plac/ara-1 為4)。之後立即追隨MCS及目標基因。對於本文所討論之研究，吾人利用兩種基礎載體pZA33及pZE13，其已針對如以上所討論之生物磚塊插入物修飾。一旦已將目標基因選殖至其中，即使用4個表6中指定之數字基因密碼指示所得質體；例如，pZA33-XXXX-YYYY-...
宿主菌株建構。 本文所述之所有研究中之母株均為大腸桿菌K-12菌株MG1655。按照服務契約由第三方使用redET方法建構adhE、gabD及aldA中之無標記缺失型菌株(Datsenko,K. A.及B. L. Wanner,Proc Natl Acad Sci U.S.A 97:6640-6645(2000))。後續菌株經由噬菌體P1介導之轉導建構(Miller,J. Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratories,New York(1973))。菌株C600Z1(laciq 、PN25-tetR、SpR 、lacY1、leuB6、mcrB+、supE44、thi-1、thr-1、tonA21)係獲自Expressys且用作P1轉導之lacIq 等位基因之來源。噬菌體P1vir在C600Z1大腸桿菌株上生長，其具有與lacIq 連接之觀黴素抗性基因。C600Z1上生長之P1溶胞物用以感染對觀黴素抗性具有選擇之MG1655。接著藉由測定轉導子抑制與PAllacO-1 啟動子連接之基因表現之能力針對所連接之lacIq 篩檢抗觀黴素菌落。所得菌株由MG1655 lacIq 表示。使用類似程序以將lacIQ 引入至缺失型菌株中。
由琥珀酸製備4-HB。 對於由琥珀酸建構4-HB產生劑而言，如下所述，將琥珀酸至4-HB及4-HB-CoA之基因編碼步驟(圖1中之1、6、7及9)於pZA33及pZE13載體上組裝。評估基因之各種組合以及作為對照之帶有不完全路徑之構築體(表7及表8)。接著將質體轉化至含有lacIQ 之宿主菌株中，其允許藉由添加異丙基β-D-1-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)誘導性表現。測試野生型與編碼天然琥珀酸半醛去氫酶之基因缺失型宿主(圖1中之步驟2)。
首先使用菌株MG1655 lacIQ 作為含有路徑基因之質體構築體之宿主在活體外檢定中測試異源酶之活性。使細胞在含有對於各構築體適當之抗生素之LB培養基(Difco)中有氧生長且當光學密度(OD600)達到約0.5時藉由添加1mM IPTG誘發。6小時之後收集細胞，且如以下所討論進行酶檢定。
活體外酶檢定。 為獲得活性檢定之粗萃取物，藉由在4,500rpm下離心(Beckman-Coulter，Allegera X-15R)10分鐘收集細胞。使小球再懸浮於具有Benzonase及溶菌酶之0.3mL BugBuster(Novagen)試劑中，且在輕微震盪下在室溫下進行溶解歷時15分鐘。藉由在4℃下在14,000rpm下離心(Eppendorf離心機5402)30分鐘獲得無細胞溶胞物。使用Bradford等人(Anal. Biochem . 72:248-254(1976))之方法及如下所述進行之特異性酶檢定測定樣品中之細胞蛋白質。活性以每毫克蛋白質之單位數報導，其中活性單位定義為在室溫下在1分鐘內轉化1μmol受質所需之酶的量。一般而言，所報導之值為至少3次重複檢定之平均值。
遵循先前描述之程序(Sohling及Gottschalk,J. Bacteriol . 178:871-880(1996))，藉由監測由琥珀醯基-CoA及乙酸形成乙醯基-CoA來測定琥珀醯基-CoA轉移酶(Cat1)活性。藉由在ATP存在下遵循由琥珀酸及CoA形成琥珀醯基-CoA來測定琥珀醯基-CoA合成酶(SucCD)活性。實驗遵循Cha及Parks,J. Biol. Chem . 239:1961-1967(1964)所述之程序。藉由遵循在340nm下在琥珀酸半醛及CoA存在下使NAD轉化成NADH來測定CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶(SucD)活性(Sohling及GottSchalk,Eur. J. Biochem . 212:121-127(1993))。藉由監測在340nm下在琥珀酸半醛存在下NADH至NAD之氧化來測定4-HB去氫酶(4-HBd)酶活性。實驗遵循公開之程序(Gerhardt等人,Arch. Microbiol . 174:189-199(2000))。使用Scherf及Buckel,Appl. Environ. Microbiol . 57:2699-2702(1991)之改良程序測定4-HB CoA轉移酶(Cat2)活性。使用HPLC測定由乙醯基-CoA及4-HB或丁酸形成4-HB-CoA或形成丁醯基-CoA。
使用由若干個文獻來源(Durre等人,FEMS Microbiol. Rev . 17:251-262(1995)；Palosaari及Rogers,J. Bacteriol .170:2971-2976(1988)；及Welch等人,Arch. Biochem. Biophys . 273:309-318(1989))改編之程序在還原方向檢定醇(ADH)及醛(ALD)去氫酶。NADH氧化之後，在室溫下每4秒讀取340nm下之吸光度，歷時總計240秒。在100mM MOPS(用KOH調節至pH 7.5)、0.4mM NADH及1μl至50μl細胞萃取物中執行還原檢定。藉由添加以下試劑起始反應：對於ADH為100μl 100mM乙醛或丁醛，或對於ALD為100μl 1mM乙醯基-CoA或丁醯基-CoA。使分光光度計快速空白且接著起始動力學讀取。可使用每分鐘340nm下吸光度降低之所得斜率以及340nm下NAD(P)H之莫耳消光係數(6000)及萃取物之蛋白質濃度來測定比活性。
如Cary等人,J. Bacteriol. 170:4613-4618(1988)中所述在丁醯基-CoA至丁醯基-磷酸方向量測PTB之酶活性。其提供用於轉化之無機磷酸，且接著由試劑5,5'-二硫基雙-(2-硝基苯甲酸)或DTNB使游離CoA增加。DTNB與諸如游離CoA之硫醇基快速反應以釋放黃色2-硝基-5-巰基苯甲酸(TNB)，其在412nm下吸收，莫耳消光係數為14,140M cm-1 。檢定緩衝液含有150mM磷酸鉀(pH 7.4)、0.1mM DTNB及0.2mM丁醯基-CoA，且藉由添加2μL至50μL細胞萃取物起始反應。在消耗ATP之丁酸至丁醯基-磷酸形成方向量測BK之酶活性。該程序類似於先前Rose等人,J. Biol. Chem . 211:737-756(1954)所述之乙酸激酶之檢定。然而，已發現Sigma提供之另一種乙酸激酶檢定方案更有用且靈敏。此檢定連接藉由乙酸激酶使ATP轉化為ADP與所連接之藉由丙酮酸激酶使ADP及磷烯醇丙酮酸(PEP)轉化為ATP及丙酮酸，繼之以藉由乳酸去氫酶使丙酮酸及NADH轉化為乳酸及NAD+。用丁酸取代乙酸為能夠使檢定遵循BK酶活性之唯一主要修飾。檢定混合物含有80mM三乙醇胺緩衝液(pH 7.6)、200mM丁酸鈉、10mM MgCl2 、0.1mM NADH、6.6mM ATP、1.8mM磷酸烯醇丙酮酸。根據製造商之說明添加丙酮酸激酶、乳酸去氫酶及肌激酶。藉由添加2μL至50μL細胞萃取物起始反應，且基於340nm下之吸光度降低(指示NADH氧化)監測反應。
藉由HPLC分析CoA衍生物。 開發基於HPLC之檢定以監測涉及輔酶A(CoA)轉移之酶促反應。所開發之方法能夠藉由定量測定存在於活體外反應混合物中之CoA、乙醯基CoA(AcCoA)、丁醯基CoA(BuCoA)及4-羥基丁酸CoA(4-HBCoA)來表徵酶活性。達成降至低μM之靈敏性以及所有目標CoA衍生物之極佳溶解。
如下執行化學品及樣品製備。簡言之，COA、AcCoA、BuCoA及所有其他化學品係獲自Sigma-Aldrich。溶劑甲醇及乙腈為HPLC級。標準校正曲線在0.01-1mg/mL濃度範圍內顯示極佳線性。酶促反應混合物含有100mM Tris HCl緩衝液(pH 7)，在不同時間點獲取等分試樣，且用甲酸(最終濃度0.04%)中止反應且藉由HPLC直接分析。
使用裝備有二元泵、脫氣裝置、恆溫自動取樣器及柱室之Agilent 1100 HPLC系統執行HPLC分析，且使用二極管陣列偵測器(DAD)進行分析。使用逆相管柱Kromasil 100 5 μm C18,4.6×150mm(Peeke Scientific)。將25mM磷酸鉀(pH 7)及甲醇或乙腈以1mL/min之流動速率用作水性溶劑及有機溶劑。開發兩種方法：用於分析良好拆分之CoA、AcCoA及BuCoA之具有較快梯度之短方法，及用於區分接近時間溶離之AcCoA與4-HBCoA的較長方法。短方法利用乙腈梯度(0分鐘-5%、6分鐘-30%、6.5分鐘-5%、10分鐘-5%)，且CoA、AcCoA及BuCoA分別產生2.7分鐘、4.1分鐘及5.5分鐘之滯留時間。在長方法中，使用具有以下線性梯度之甲醇：0分鐘-5%、20分鐘-35%、20.5分鐘-5%、25分鐘-5%。CoA、AcCoA、4-HBCoA及BuCoA之滯留時間分別為5.8分鐘、8.4分鐘、9.2分鐘及16.0分鐘。注入體積為5μL，管柱溫度30℃，且在260nm下監測UV吸光度。
結果表明四個路徑步驟中之每一者之活性(表7)，但活性明顯取決於基因源、載體中基因之位置及其用其他基因進行表現之情形。舉例而言，基因0035編碼琥珀酸半醛去氫酶，該酶與由0008編碼之酶相比活性更強，且0036及0010n為比0009活性更強之4-HB去氫酶基因。當相同操縱子上存在優於其之另一基因時，亦似乎存在較佳4-HB去氫酶活性。
表7. 在4-HB-CoA路徑中來自含有質體表現基因之MG1655 lacIQ 的細胞萃取物中之活體外酶活性。活性以每毫克蛋白質之單位數報導，其中活性單位定義為在室溫下在1分鐘內轉化1μmol受質所需之酶的量。
(a)在pZE13(一種具有colE1起點及安比西林抗性之高複本質體)上由Plac表現之基因。基因識別碼如表6中所提供。
(b)在pZA33(一種具有pACYC起點及氯黴素抗性之中等複本質體)上由Plac表現之基因。
(c)以每毫升萃取物之蛋白質毫克數給出之細胞蛋白質。
接著針對活體內由主要代謝中間物製備4-HB之能力評估含有4-HB路徑中之基因的重組菌株。細胞在LB培養基中缺氧生長至OD600為約0.4，接著用1mM IPTG誘發。一小時後，添加琥珀酸鈉至10mM，且再過24小時及48小時之後取樣進行分析。如下所述藉由GC-MS分析培養液中之4-HB。結果指示在24小時之後，與對照菌株中基本為零相比，重組菌株可製備2mM以上之4-HB(表8)。
表8. 在具有表現各種組合之4-HB路徑基因之質體的大腸桿菌株中由琥珀酸製備4-HB。
(a)經校正4-HB濃度，μM/OD600單位
使用CoA轉移酶(cat1)由琥珀酸製備琥珀醯基-CoA之替代方法將使用編碼琥珀醯基-CoA合成酶之天然大腸桿菌sucCD基因。將此基因簇以及4-HB之剩餘步驟的候選基因選殖至pZE13上以產生pZE13-0038-0035-0036。
由葡萄糖製備4-HB。 儘管以上實驗表明由主要代謝中間物(琥珀酸)至4-HB之功能路徑，但工業方法將需要由諸如葡萄糖或蔗糖之低成本碳水化合物原料製備化學品。因此，下一組實驗旨在確定在葡萄糖上生長期間由細胞製備之內源琥珀酸是否可推動4-HB路徑。細胞在補充有20g/L葡萄糖、100mM改良緩衝能力之3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)、10μg/mL硫胺及適當抗生素之M9基本培養基(6.78g/L Na2 HPO4 、3.0g/L KH2 PO4 、0.5g/L NaCl、1.0g/LNH4 Cl、1mM MgSO4 、0.1mMCaCl2 )中缺氧生長。當OD600達到約0.2時添加0.25mM IPTG，且在誘發之後每24小時獲取樣品以供4-HB分析。在所有情況下，4-HB在24小時之後達到平衡，在最佳菌株中具有約1mM之最大值(圖3a)，而琥珀酸濃度繼續上升(圖3b)。此指示路徑之琥珀酸供應可能不受限制，且困難之處在於酶本身之活性或NADH可用性。0035及0036明顯分別為CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶及4-HB去氫酶之最佳基因候選物。消除一或兩種編碼已知(gabD)或推定(aldA)天然琥珀酸半醛去氫酶之基因對效能具有較小作用。最終，應注意：與對照組相比，在4-HB製備型菌株中細胞生長至更低OD(圖3c)。
由葡萄糖製備4-HB之替代路徑係經由α-酮戊二酸。吾人研究使用來自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶(Tian等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:10670-10675(2005))直接由α-酮戊二酸製備琥珀酸半醛(圖1中之步驟8)。為表明此基因(0032)活體內有用，將其在與pZA33上之4-HB去氫酶(基因0036)相同之宿主中在pZE13上表現。在用1mM IPTG誘發之後24小時內，此菌株能夠製備1.0mM以上之4-HB(圖4)。因為此菌株並不表現CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶，所以消除經由琥珀醯基-CoA製備琥珀酸半醛之可能性。負責製備琥珀酸半醛之天然基因亦可在此路徑中起作用(圖1中之步驟4及步驟5)；然而，當pZE13-0032質體不計入宿主中時，所製備之4-HB的量可忽略。
由4-HB製備BDO。 由4-HB製備BDO需要兩個由去氫酶催化之還原步驟。醇及醛去氫酶(分別為ADH及ALD)為NAD+/H及/或NADP+/H依賴性酶，該等酶一起可將分子上之羧酸基團還原為醇基，或反過來可進行醇至羧酸之氧化。此生物轉化已在野生型丙酮丁醇梭菌中得以證實(Jewell等人,Current Microbiology ,13:215-19(1986))，但既未鑑別負責酶亦未鑑別負責基因。此外，未知是否首先需要4-HB-CoA之活化(圖1中之步驟9)，或醛去氫酶(步驟12)是否可直接對4-HB起作用。吾人基於對4-HB及路徑中間物之非羥基化類似物之已知活性或藉由與此等經表徵基因之相似性開發一系列來自丙酮丁醇梭菌及相關生物體之候選酶(表6)。因為一些候選物為多功能去氫酶，所以其可潛在地催化酸(或CoA-衍生物)至醛以及醛至醇之NAD(P)H依賴性還原。在開始在大腸桿菌中對此等基因起作用之前，首先使用丙酮丁醇梭菌ATCC 824驗證以上提及之結果。使細胞在30℃下，在10% CO2 、10% H2 及80% N2 之缺氧氛圍中，在補充有10mM 4-HB之Schaedler培養液(Accumedia,Lansing,MI)中生長。獲取週期性培養樣品，離心，且如下所述藉由GC-MS分析培養液之BDO。在1日、2日及7日培育之後，分別偵測到0.1mM、0.9mM及1.5mM之BDO濃度。在未添加4-HB下生長之培養物中未偵測到BDO。為表明所製備BDO源自葡萄糖，在補充有4g/L均一標記之13 C-葡萄糖之M9基本培養基中使最佳BDO製備型菌株MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036生長。在0.67之OD下由1mM IPTG誘發細胞，且24小時後取樣。藉由質譜分析對培養物上清液進行分析。
接下來，當在大腸桿菌宿主MG1655 lacIQ 中表現時，測試4-HB至BDO轉化路徑之基因候選物之活性。在37℃下在0.25mM IPTG存在下使含有pZA33上表現之各基因候選物之重組菌株生長4小時以完全誘發酶表現。誘發之後4小時，收集細胞且如上所述檢定ADH及ALD活性。因為4-HB-CoA及4-羥基丁醛不可購得，所以使用非羥基化受質執行檢定(表9)。丙酮丁醇梭菌adhE2 (0002)及大腸桿菌adhE (0011)之4-碳與2-碳受質之間的活性比類似於文獻(Atsumi等人,Biochim .Biophys .Acta . 1207:1-11(1994))中先前報導之彼等受質之活性比。
表9. 醛及醇去氫酶在來自含有pZA33表現基因候選物之MG1655 lacIQ 的細胞萃取物中之活體外酶活性。活性以每毫克細胞蛋白質μmol min-1 表示。N.D.：未測定。
對於BDO製備實驗，來自牙齦卟啉單胞菌W83之cat2(基因0034)包括於pZA33上使4-HB轉化為4-HB-CoA，而候選去氫酶基因表現於pZE13上。宿主菌株為MG1655 lacIQ 。由於受質之相似性，故亦測試CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶(sucD)以及醇及醛去氫酶候選物在此步驟中起作用之能力。細胞在補充有10mM 4-HB之LB培養基中生長至OD為約0.5，用1mM IPTG誘發且在24小時之後對培養液取樣且如下所述分析BDO。使用來自丙酮丁醇梭菌之adhE2、來自克氏梭菌之sucD或來自牙齦卟啉單胞菌之sucD發生最佳BDO製備(圖5)。有趣的是，在有氧條件下所製備之BDO的絕對量較高；然而，此主要係由於在缺氧培養物中達成較低細胞密度。當校正至細胞OD時，在缺氧條件中每單位生物質之BDO製備較高(表10)。
表10. 表現來自丙酮丁醇梭菌之adhE2 、來自克氏梭菌之sucD 或來自牙齦卟啉單胞菌之sucD(來自圖3中之實驗2、9及10之數據)以及陰性對照(實驗1)的細胞培養物之絕對及校正BDO濃度。
如以上所討論，使用不產生副產物乙酸之將4-HB轉化為4-HB-CoA之途徑可能有利。為實現此目的，吾人測試使用來自丙酮丁醇梭菌之磷酸轉丁醯酶(ptb)及丁酸激酶(bk)經由圖1中之步驟10及步驟11進行此轉化。選殖來自丙酮丁醇梭菌之天然ptb/bk操縱子(基因0020及0021)且表現於pZA33中。獲取來自含有所得構築體之細胞的萃取物且如本文所述檢定兩種酶活性。BK之比活性為約65U/mg，而PTB之比活性為約5U/mg。將一個單位(U)之活性定義為在室溫下在1分鐘內轉化1μM受質。最終，測試構築體對4-HB至BDO轉化之參與程度。宿主菌株係由所述pZA33-0020-0021構築體及pZE 13-0002轉化，且與在使用以上圖5中所用之有氧程序之BDO製備中使用cat2進行比較。與當使用cat2時之2mM相比，BK/PTB菌株製備1mM BDO(表11)。有趣的是，結果取決於宿主菌株是否含有天然adhE基因缺失。
表11. 在pZE13中表現來自丙酮丁醇梭菌之adhE2以及在pZA33上表現來自牙齦卟啉單胞菌之cat2(0034)或來自丙酮丁醇梭菌之PTB/BK基因的細胞培養物之絕對及校正BDO濃度。宿主菌株為MG1655 1acIQ 或MG1655 ΔadhE 1acIQ 。
由葡萄糖製備BDO 。路徑證實之最後步驟為在大腸桿菌中表現路徑之4-HB與BDO區段且證實在葡萄糖基本培養基中製備BDO。建構新穎質體以使所有必需基因均安裝於兩種質體上。一般而言，cat1、adhE及sucD基因係由pZE13表現，且cat2及4-HBd係由pZA33表現。在MG1655 1acIQ 本底中測試基因來源及基因次序之各種組合。使細胞在補充有20g/L葡萄糖、100mM改良緩衝能力之3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)、10μg/mL硫胺及適當抗生素之M9基本培養基(6.78g/L Na2 HPO4 、3.0g/L KH2 PO4 、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4 Cl、1mM MgSO4 、0.1mM CaCl2 )中缺氧生長。在接種之後約15小時添加0.25mM IPTG，且在誘發之後24小時及48小時獲取培養上清液樣品以進行BDO、4-HB及琥珀酸分析。BDO製備似乎顯示基因次序依賴性(表12)。最高BDO製備(0.5mM以上)由首先表現之cat2、繼之以pZA33上之4-HBd，及cat1繼之以pZE13上之牙齦卟啉單胞菌sucD獲得。在pZE13上之最後位置添加丙酮丁醇梭菌adhE2產生微小改良。亦製備較高濃度之4-HB及琥珀酸。
表12. 在補充有20g/L葡萄糖之基本培養基中生長的表現BDO路徑基因組合之重組大腸桿菌株中製備BDO、4-HB及琥珀酸。濃度以mM給出。
藉由GCMS分析BDO、4-HB及琥珀酸。 醱酵及細胞培養樣品中之BDO、4-HB及琥珀酸係藉由矽烷化衍生且使用由文獻報導改編之方法藉由GCMS定量分析(Simonov等人,J. Anal Chem. 59:965-971(2004))。所開發之方法顯示降至1μM之良好靈敏性、達至少25mM之線性以及極佳選擇性及重現性。
如下進行樣品製備：將100μL經過濾(0.2μm或0.45μm針筒過濾器)樣品(例如醱酵培養液、細胞培養物或標準溶液)在環境溫度下在快速真空濃縮器(Speed Vac Concentrator，Savant SVC-100H)中乾燥約1小時，接著添加20μL 10mM環己醇之二甲基甲醯胺溶液作為內標。將混合物渦旋且於水浴(Branson 3510)中音波處理15分鐘以確保均質性。添加100μL矽烷化衍生試劑，具有1%三甲基氯矽烷之N,O-雙(三甲基矽烷基)三氟-乙醯亞胺(BSTFA)，且將混合物在70℃下培育30分鐘。將衍生樣品離心5分鐘，且將澄清溶液直接注入至GCMS中。除BDO購自J.T.Baker之外，所有化學品及試劑均來自Sigma-Aldrich。
用Agilent氣相層析儀6890N進行GCMS，其與以電子碰撞電離(EI)模式操作之質量選擇性偵測器(MSD)5973N連接用於分析。使用30m×0.25mm內徑×0.25μm薄膜厚度之DB-5MS毛細管柱(J＆W Scientific，Agilent Technologies)。以分流注入方式以20:1分流比引入1μL樣品來操作GC。注射口溫度為250℃。將氦氣用作載氣，且使流動速率維持在1.0mL/min、將溫度梯度程式最佳化以確保目標分析物溶解良好且基質干擾最小。最初使烘箱維持在80℃歷時1分鐘，接著以2℃/min上升至120℃，隨後以100℃/min快速上升至320℃且最後在320℃維持6分鐘。使MS介面輸送管維持於280℃。使用『低質量』MS調整裝置及30-400m/z質量-範圍掃描獲得數據。總分析時間為29分鐘，其包括3分鐘溶劑延遲。對於BSTFA衍生之環己醇、BDO、4-HB及琥珀酸，滯留時間分別對應於5.2分鐘、10.5分鐘、14.0分鐘及18.2分鐘。對於定量分析，選擇以下比質量片段(摘錄之離子層析譜)：內標環己醇之m/z為157，BDO之m/z為116，且4-HB與琥珀酸之m/z為147。在相應細胞培養物或醱酵培養基中，使用分析物溶液建構標準校正曲線以儘可能接近地匹配樣品矩陣。使用環境資料分析ChemStation軟體(Environmental Data Analysis ChemStation software，Agilent Technologies)處理GCMS數據。
結果指示大多數所製備之4-HB及BDO經13 C標記(圖6，右側)。展示未標記葡萄糖中所生長之平行培養物之質譜以進行比較(圖6，左側)。注意到所見之峰為含有不同數目來自代謝物之碳原子之衍生分子的片段。衍生試劑亦提供一些天然存在地標記分布之碳及矽原子，因此結果並未嚴格定量。
使用替代路徑由4-HB製備BDO。 亦針對BDO製備測試各種替代路徑。此包括使用天然大腸桿菌SucCD酶以使琥珀酸轉化為琥珀醯基-CoA(表13，第2列-第3列)，在α-酮戊二酸路徑中使用α-酮戊二酸去羧酶(表13，第4列)，及使用PTB/BK作為替代方法以產生4HB之CoA-衍生物(表13，第1列)。建構含有表現表13中所示之基因之質體的菌株，其涵蓋此等變異體。結果展示在所有情況下，均出現4-HB及BDO之製備(表13)。
表13.　 在補充有20g/L葡萄糖之基本培養基中缺氧生長且在用0.1mM IPTG誘發之後24小時收集之不同BDO路徑變異體之重組大腸桿菌株基因中製備BDO、4-HB及琥珀酸。濃度以mM給出。
實例III
4-羥基丁酸、γ-丁內酯及1,4-丁二醇之生物合成
此實例描述使用醱酵及其他生物過程生物合成製備4-羥基丁酸、γ-丁內酯及1,4-丁二醇。
以下描述將4-HB醱酵步驟整合至製備經純化GBL、1,4-丁二醇(BDO)及四氫呋喃(THF)之完整過程中之方法。因為4-HB及GBL處於平衡，所以醱酵培養液將含有兩種化合物。在低pH值下，此平衡轉向有利於GBL。因此，醱酵可在pH 7.5或更低pH值、一般pH 5.5或更低pH值下操作。在移除生物質之後，產物流進入分離步驟，在該步驟中移除GBL且使富含4-HB之剩餘物流再循環。最終，蒸餾GBL以移除任何雜質。以三種方式中之一者操作該過程：1)分批進料醱酵及分批分離；2)分批進料醱酵及連續分離；3)連續醱酵及連續分離。此等模式中之前兩種模式示意性展示於圖7中。以下所述之整合醱酵程序亦用於本發明之BDO製備型細胞以生物合成BDO及後續BDO族產物。
製備4-HB/GBL之醱酵方案(分批)：使用5L含有5g/L磷 酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米漿且原始葡萄糖濃度為20g/L之培養液，使製備生物體於用N2 /CO2 混合物噴射之10L生物反應器中生長。當細胞生長且利用葡萄糖時，再將另外的70%葡萄糖以近似平衡葡萄糖消耗之速率饋入生物反應器中。生物反應器之溫度維持於30℃。生長持續約24小時，直至4-HB濃度達到20g/L與200g/L之間，其中細胞密度在5g/L與10g/L之間。pH值未加以控制且操作結束時通常會降至pH 3-6。在培養期結束後，使醱酵槽內含物穿過細胞分離單元(例如離心機)以移除細胞及細胞碎片，且將醱酵培養液轉移至產物分離單元中。藉由此項技術中用於分離有機產物與稀釋水溶液之標準分離程序，諸如使用與水不可混溶之有機溶劑(例如甲苯)之液-液萃取，進行4-HB及/或GBL分離，得到4-HB/GBL之有機溶液。接著使所得溶液經受標準蒸鎦法以移除及再循環有機溶劑，且得到以經純化液體形式分離之GBL(沸點204℃-205℃)。
製備4-HB/GBL之醱酵方案(完全連續)： 首先除原始葡萄糖濃度為30-50g/L之外使用以上所述之裝置及培養基組合物以分批模式使製備生物體生長。當葡萄糖耗盡時，以介於0.5L/h與1L/h之間的速率連續供應具有相同組成之進料培養基，且以相同速率抽取液體。生物反應器中之4-HB濃度保持恆定於30-40g/L，且細胞密度保持恆定在3g/L與5g/L之間。溫度維持於30℃，且視需要使用濃NaOH及HCl使pH值維持於4.5。連續操作生物反應器一個月，每日取樣以確保4-HB濃度之一致性。以連續模式在供應新鮮進料培養基時不斷移除醱酵槽內含物。接著在移除或未移除細胞及細胞碎片之情況下，使含有細胞、培養基及產物4-HB及/或GBL之出口流經受連續產物分離程序，且藉由此項技術中用於分離有機產物與稀釋水溶液之標準連續分離方法，諸如使用與水不可混溶之有機溶劑(例如甲苯)之連續液-液萃取進行分離，得到4-HB/GBL之有機溶液。隨後使所得溶液經受標準連續蒸餾法以移除及再循環有機溶劑，且得到以經純化液體形式分離之GBL(沸點204℃-205℃)。
GBL還原方案： 一旦GBL如上所述經分離及純化，則接著將使其經受諸如此項技術(所引用參考文獻)中熟知之還原方案以製備1,4-丁二醇或四氫呋喃(THF)或其混合物。熟知在氫氣壓力下異相或均相氫化催化劑與GBL組合提供產物1,4-丁二醇或四氫呋喃(THF)或其混合物。重要的是，應注意，如上所述自醱酵培養液分離之4-HB/GBL產物混合物可在GBL分離及純化之前直接經受此等相同還原方案以得到產物1,4-丁二醇或四氫呋喃或其混合物。接著分離所得產物1,4-丁二醇及THF且藉由在此項技術中熟知之程序純化。
直接製備BDO或THF之醱酵及氫化方案(分批)： 使用5L含有5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30 g/L玉米漿且原始葡萄糖濃度為20g/L之培養液，使細胞於用N2 /CO2 混合物噴射之10L生物反應器中生長。當細胞生長且利用葡萄糖時，再將另外的70%葡萄糖以近似平衡葡萄糖消耗之速率饋入生物反應器中。生物反應器之溫度維持於30℃。生長持續約24小時，直至4-HB濃度達到20g/L與200g/L之間，其中細胞密度在5g/L與10g/L之間。pH值未加以控制且操作結束時通常會降至pH 3-6。在培養期結束後，使醱酵槽內含物穿過細胞分離單元(例如離心機)以移除細胞及細胞碎片，且將醱酵培養液轉移至還原單元(例如氫化容器)中，其中將混合物4-HB/GBL直接還原為1,4-丁二醇或THF或其混合物。在還原程序結束後，將反應器內含物轉移至產物分離單元中。藉由此項技術中用於分離有機產物與稀釋水溶液之標準分離程序，諸如使用與水不可混溶之有機溶劑(例如甲苯)之液-液萃取，進行1,4-丁二醇及/或THF分離，得到1,4-丁二醇及/或THF之有機溶液。接著使所得溶液經受標準蒸鎦法以移除及再循環有機溶劑，且得到以經純化液體形式分離之1,4-丁二醇及/或THF。
直接製備BDO或THF之醱酵及氫化方案(完全連續)： 首先除原始葡萄糖濃度為30-50g/L之外使用以上所述之裝置及培養基組合物以分批模式使細胞生長。當葡萄糖耗盡時，以介於0.5L/h與1L/h之間的速率連續供應具有相同組成之進料培養基，且以相同速率抽取液體。生物反應器中之4-HB濃度保持恆定於30-40g/L，且細胞密度保持恆定在3g/L與5g/L之間。溫度維持於30℃，且視需要使用濃NaOH及HCl使pH值維持於4.5。連續操作生物反應器一個月，每日取樣以確保4-HB濃度之一致性。以連續模式在供應新鮮進料培養基時不斷移除醱酵槽內含物。接著使含有細胞、培養基及產物4-HB及/或GBL之出口流穿過細胞分離單元(例如離心機)以移除細胞及細胞碎片，且將醱酵培養液轉移至連續還原單元(例如氫化容器)中，其中將混合物4-HB/GBL直接還原為1,4-丁二醇或THF或其混合物。在還原程序結束後，將反應器內含物轉移至連續產物分離單元中。藉由此項技術中用於分離有機產物與稀釋水溶液之標準連續分離程序，諸如使用與水不可混溶之有機溶劑(例如甲苯)之液-液萃取，進行1,4-丁二醇及/或THF分離，得到1,4-丁二醇及/或THF之有機溶液。接著使所得溶液經受標準連續蒸餾法以移除及再循環有機溶劑，且得到以經純化液體形式分離之1,4-丁二醇及/或THF。
直接製備BDO之醱酵方案(分批)： 使用5L含有5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米漿且原始葡萄糖濃度為20g/L之培養液，使製備生物體於用N2 /CO2 混合物噴射之10L生物反應器中生長。當細胞生長且利用葡萄糖時，再將另外的70%葡萄糖以近似平衡葡萄糖消耗之速率饋入生物反應器中。生物反應器之溫度維持於30℃。生長持續約24小時，直至BDO濃度達到20g/L與200g/L之間，其中細胞密度一般在5g/L與10g/L之間。在培養期結束後，使醱酵槽內含物穿過細胞分離單元(例如離心機)以移除細胞及細胞碎片，且將醱酵培養液轉移至產物分離單元中。藉由此項技術中用於分離有機產物與稀釋水溶液之標準分離程序，諸如使用與水不可混溶之有機溶劑(例如甲苯)之液-液萃取，進行BDO分離，得到BDO之有機溶液。接著使所得溶液經受標準蒸鎦法以移除及再循環有機溶劑，且得到以經純化液體形式分離之BDO(沸點228℃-229℃)。
直接製備BDO之醱酵方案(完全連續)： 首先除原始葡萄糖濃度為30-50g/L之外使用以上所述之裝置及培養基組合物以分批模式使製備生物體生長。當葡萄糖耗盡時，以介於0.5L/h與1L/h之間的速率連續供應具有相同組成之進料培養基，且以相同速率抽取液體。生物反應器中之BDO濃度保持恆定為30-40g/L，且細胞密度保持恆定在3g/L與5g/L之間。溫度維持於30℃，且視需要使用濃NaOH及HCl使pH值維持於4.5。連續操作生物反應器一個月，每日取樣以確保BDO濃度之一致性。以連續模式在供應新鮮進料培養基時不斷移除醱酵槽內含物。接著在移除或未移除細胞及細胞碎片之情況下，使含有細胞、培養基及產物BDO之出口流經受連續產物分離程序，且藉由此項技術中用於分離有機產物與稀釋水溶液之標準連續分離方法，諸如使用與水不可混溶之有機溶劑(例如甲苯)之連續液-液萃取進行分離，得到BDO之有機溶液。隨後使所得溶液經受標準連續蒸餾法以移除及再循環有機溶劑，且得到以經純化液體形式(熔點20℃)分離之BDO(沸點228℃-229℃)。
實例IV
例示性BDO路徑
此實例描述1,4-丁二醇(BDO)合成路徑之例示性酶及相應基因。
圖8-圖13中展示例示性BDO合成路徑。圖8-圖13中所述之路徑為由常見主要代謝中間物至1,4-丁二醇。圖8-圖13中所述之所有轉化均屬於表14中所示之18個一般類別之轉化。以下描述各類別中之多種生物化學表徵之候選基因。特定列舉當在宿主生物體中選殖及表現時可適用於催化圖9-圖13中之適當轉化的基因。表15-表23提供圖9-圖13中之各關鍵步驟之前三種例示性基因(參見下文)。本文描述為圖8中所述之路徑而提供之例示性基因。
表14. 將常見主要代謝中間物轉化成1,4-丁二醇所需之酶類型。各標記之前三個數字對應於前三個酶委員會(Enzyme Commission)編號數字，其表示與受質特異性無關之一般轉化類型。
1.1.1.a-氧化還原酶(醛至醇或酮至羥基)
醛至醇 。編碼催化醛至醇轉化之酶(亦即醇去氫酶或等效醛還原酶)的例示性基因包括編碼C2-C14之中鏈醇去氫酶之alrA (Tani等人,Appl. Environ. Microbiol . 66:5231-5235(2000))；來自釀酒酵母之ADH2(Atsumi等人,Nature 451:86-89(2008))；偏好比C(3)長之分子的來自大腸桿菌之yqhD (Sulzenbacher等人,Journal of Molecular Biology 342:489-502(2004))；及來自使丁醛轉化成丁醇之丙酮丁醇梭菌之bdh I及bdh II(Walter等人,Journal of Bacteriology 174:7149-7158(1992))。此等例示性基因產物中之每一者之蛋白質序列(若可獲得)可使用以下GenBank寄存編號查到：
展示4-羥基丁酸去氫酶活性之酶(EC 1.1.1.61)亦屬於此類別。此等酶已在真養雷氏菌(Bravo等人,J.Forensic Sci . 49:379-387(2004))、克氏梭菌(Wolff等人,Protein Expr. Purif . 6:206-212(1995))及阿拉伯芥(Breitkreuz等人,J. Biol. Chem . 278:41552-41556(2003))中表徵。
另一例示性酶為3-羥基異丁酸去氫酶，其催化3-羥基異丁酸至甲基丙二酸半醛之可逆氧化。此酶參與纈胺酸、白胺酸及異白胺酸降解且已在細菌、真核生物及哺乳動物中鑑別。由來自嗜熱棲熱菌HB8之P84067 編碼之酶已在結構上表徵(Lokanath等人,J Mol Biol 352:905-17(2005))。使用同位素標記受質證實人類3-羥基異丁酸去氫酶之可逆性(Manning等人,Biochem J 231:481-484(1985))。編碼此酶之其他基因包括智人(Hawes等人,Methods Enzymol. 324:218-228(2000))及家兔(Chowdhury等人，Biosci.Biotechnol Biochem. 60:2043-2047(1996)；Hawes等人,Methods Enzymol. 324:218-228(2000))中之3hidh 、綠膿桿菌中之mmsb 及惡臭假單胞菌中之dhat (Aberhart等人,J Chem.Soc. [Perkin 1 ]6:1404-1406(1979)；Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol Biochem. 67:438-441(2003)；Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol Biochem. 60:2043-2047(1996))。
亦已展示若干種使丙二酸半醛轉化為3-羥基丙酸(3-HP)之3-羥基異丁酸去氫酶。三種展現此活性之基因候選物為來自綠膿桿菌PAO1(62)之mmsB 、來自惡臭假單胞菌KT2440之mmsB (Liao等人，美國公開案2005/0221466)及來自惡臭假單胞菌E23之mmsB (Chowdhury等人，Biosci.Biotechnol.Biochem . 60:2043-2047(1996))。亦已鑑別在糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis )M3A中具有3-羥基丁酸去氫酶活性之酶(Gokam等人，美國專利第7,393,676號；Liao等人，美國公開案第2005/0221466號)。可藉由序列相似性推斷來自包括球形紅細菌之其他生物體之其他基因候選物。
亦可藉由兩種其他酶實現丙二酸半醛至3-HP之轉化：NADH依賴性3-羥基丙酸去氫酶及NADPH依賴性丙二酸半醛還原酶。認為NADH依賴性3-羥基丙酸去氫酶參與在細菌及植物中由丙酸生物合成β-丙胺酸之路徑(Rathinasabapathi,B.Journal of Plant Pathology 159:671-674(2002)；Stadtman,E. R.J.Am.Chem.Soc. 77:5765-5766(1955))。迄今為止此酶與任何生物體中之基因均不相關。NADPH依賴性丙二酸半醛還原酶在自養CO2 固定細菌中催化逆反應。儘管已在勤奮金屬球菌中偵測到酶活性，但仍未知基因之身分(Alber等人,J.Bacteriol . 188:8551-8559(2006))。
酮至羥基 。存在若干種使酮轉化成羥基官能基之例示性醇去氫酶。兩種來自大腸桿菌之此等酶係由蘋果酸去氫酶(mdh )及乳酸去氫酶(ldhA )編碼。此外，已展示來自真養雷氏菌之乳酸去氫酶顯示對諸如乳酸、2-側氧基丁酸、2-側氧基戊酸及2-酮戊二酸之各種鏈長之受質的高活性(Steinbuchel,A.及H. G. Schlegel,Eur. J. Biochem. 130:329-334(1983))。α-酮己二酸至α-羥基己二酸之轉化可由2-酮己二酸還原酶(一種經報導見於大鼠及人類胎盤中之酶)催化(Suda等人,Arch.Biochem.Biophys. 176:610-620(1976)；Suda等人,Biochem.Biophys.Res.Commun. 77:586-591(1977))。此步驟之另一候選物為已經選殖及表徵之來自人類心臟之線粒體3-羥基丁酸去氫酶(bdh )(Marks等人,J. Biol. Chem. 267:15459-15463(1992))。此酶為對3-羥基酸起作用之去氫酶。另一例示性醇去氫酶如拜氏梭菌(Ismaiel等人,J.Bacteriol. 175:5097-5105(1993))及布氏熱厭氧桿菌(Lamed等人,Biochem. J. 195:183-190(1981)；Peretz及Burstein,Biochemistry 28:6549-6555(1989))中所示使丙酮轉化為異丙醇。
使乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA之例示性3-羥基醯基去氫酶包括來自丙酮丁醇梭菌之hbd (Boynton等人,Journal of Bacteriology 178:3015-3024(1996))、來自拜氏梭菌之hbd (Colby等人,Appl Environ. Microbiol 58:3297-3302(1992))及來自勤奮金屬球菌之多種類似酶(Berg等人,Archaea. Science. 318:1782-1786(2007))。
1.1.1.c-氧化還原酶(2步驟，醯基-CoA至醇)
使醯基-CoA轉化為醇之例示性2步氧化還原酶包括使諸如乙醯基-CoA之受質轉化成乙醇之酶(例如來自大腸桿菌之adhE (Kessler等人,FEBS.Lett . 281:59-63(1991)))及使丁醯基-CoA轉化成丁醇之酶(例如，來自丙酮丁醇梭菌之adhE2 (Fontaine等人,J.Bacteriol . 184:821-830(2002)))。除了將乙醯基-CoA還原為乙醇之外，已展示由腸膜明串珠菌中之adhE 編碼之酶將分支鏈化合物異丁醛氧化為異丁醯基-CoA(Kazahaya等人,J.Gen.Appl.Microbiol 18:43-55(1972)；Koo等人,Biotechnol Lett. 27:505-510(2005))。
另一例示性酶可使丙二醯基-CoA轉化為3-HP。具有此活性之NADPH依賴性酶已於橙色綠屈撓菌中表徵，該酶於其中參與3-羥基丙酸循環(Hugler等人,J.Bacteriol. 184:2404-2410(2002)；Strauss及Fuchs,Eur.J.Biochem . 215:633-643(1993))。質量為300kDa之此酶具極高受質特異性且展示與其他已知氧化還原酶之序列相似性極小(Hugler等人,J. Bacteriol. 184:2404-2410(2002))。已展示在其他生物體中無酶催化此特定反應；然而，存在其他生物體可能具有類似路徑之生物資訊證據(Klatt等人,Environ. Microbiol. 9:2067-2078(2007))。包括卡氏玫瑰菌、赤桿菌屬NAP1 及海洋γ變形菌HTCC2080之其他生物體中之酶候選物可藉由序列相似性推斷。
長鏈醯基-CoA分子可由諸如編碼醇形成脂肪醯基-CoA還原酶之荷荷芭(jojoba；Simmondsia chinensis )FAR 之酶還原。其在大腸桿菌中過度表現，產生FAR活性及脂肪醇積聚(Metz等人,Plant Physiology 122:635-644(2000))。
1.2.1.b-氧化還原酶(醯基-CoA至醛)
若干種醯基-CoA去氫酶能夠使醯基-CoA還原為其相應醛。編碼此等酶之例示性基因包括編碼脂肪醯基-CoA還原酶之乙酸鈣不動桿菌acr1 (Reiser及Somerville,J. Bacteriology 179:2969-2975(1997))、不動桿菌屬M-1 脂肪醯基-CoA還原酶(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol. 68:1192-1195(2002))，及由克氏梭菌中之sucD 基因編碼之CoA依賴性及NADP依賴性琥珀酸半醛去氫酶(Sohling及Gottschalk,J Bacteriol 178:871-80(1996)；Sohling及Gottschalk,J Bacteriol. 178:871-880(1996))。牙齦卟啉單胞菌之SucD 為另一琥珀酸半醛去氫酶(Takahashi等人,J. Bacteriol. 182:4704-4710(2000))。由bphG 編碼之假單胞菌屬中之酶醯化乙醛去氫酶為如已顯示氧化及醯化乙醛、丙醛、丁醛、異丁醛及甲醛之另一酶(Powlowski等人,J Bacteriol. 175:377-385(1993))。
使醯基-CoA轉化為其相應醛之另一酶類型為丙二醯基-CoA還原酶，其使丙二醯基-CoA轉化成丙二酸半醛。丙二醯基-CoA還原酶為在嗜酸熱古菌中經由3-羥基丙酸循環之自養碳固定中的關鍵酶(Berg等人,Science 318:1782-1786(2007)；Thauer,R. K.,Science 318:1732-1733(2007))。酶利用NADPH作為輔因子且已在生金球形菌屬(Metallosphaera spp )及硫化葉菌屬(Sulfolobus spp )中表徵(Alber等人,J. Bacteriol. 188:8551-8559(2006)；Hugler等人,J.Bacteriol 184:2404-2410(2002))。酶係由勤奮金屬球菌中之Msed_0709 編碼(Alber等人,J.Bacteriol. 188:8551-8559(2006)；Berg等人,Science 318:1782-1786(2007))。在大腸桿菌中選殖來自托氏硫化葉菌之編碼丙二醯基-CoA還原酶之基因且異源表現(Alber等人,J.Bacteriol. 188:8551-8559(2006))。儘管此等酶之醛去氫酶功能性類似於來自橙色綠屈撓菌之雙功能去氫酶，但仍具有較小序列相似性。兩種丙二醯基-CoA還原酶候選物皆具有與天冬胺酸-半醛去氫酶(一種催化天冬胺醯基-4-磷酸至天冬胺酸半醛之還原及同時去磷酸化之酶)之高序列相似性。可由與包括硫磺礦硫化葉菌及嗜酸熱硫化葉菌之其他生物體中之蛋白質的序列同源性找出其他基因候選物。
1.2.1.c-氧化還原酶(2-含氧酸至醯基-CoA，去羧化)
此族中之酶包括：1)分支鏈2-酮酸去氫酶、2)α-酮戊二酸去氫酶及3)丙酮酸去氫酶多酶複合物(PDHC)。此等酶為催化一系列導致2-酮酸醯化氧化去羧化之部分反應的多酶複合物。各2-酮酸去氫酶複合物在中間代謝中均佔據關鍵位置，且通常緊密調節酶活性(Fries等人,Biochemistry 42:6996-7002(2003))。酶共用由以下三種催化組份之多個複本構成之複合但常見的結構：α-酮酸去羧酶(E1)、二氫硫辛醯胺醯基轉移酶(E2)及二氫硫辛醯胺去氫酶(E3)。生物體中之所有2-酮酸去氫酶複合物共用E3組份，而E1及E2組份係由不同基因編碼。酶組份以眾多複本存在於複合物中且利用多個輔因子以經由受質引導催化反應之定向序列。此等去氫酶複合物之總尺寸極大，分子質量在4×106 Da與10×106 Da之間(亦即，大於核糖體)。
在缺氧條件下在大腸桿菌中2-酮酸去氫酶族中之酶的活性通常低或受限。NADH(或NADPH)產量增加可導致氧化還原不平衡，且NADH本身充當酶功能之抑制劑。工程改造努力使大腸桿菌丙酮酸去氫酶複合物之缺氧活性增加(Kim等人,Appl. Environ.Microbiol . 73:1766-1771(2007)；Kim等人,J.Bacteriol . 190:3851-3858(2008)；Zhou等人,Biotechnol.Lett . 30:335-342(2008))。舉例而言，NADH之抑制影響可藉由在E3組份中工程改造H322Y突變而克服(Kim等人,J.Bacteriol . 190:3851-3858(2008))。個別組份之結構研究及其在複合物中如何合作使得洞悉催化機理及此家族中之酶的架構(Aevarsson等人,Nat.Struct.Biol . 6:785-792(1999)；Zhou等人,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A .98:14802-14807(2001))。在不同生物體中去氫酶複合物之受質特異性不同，但一般分支鏈酮酸去氫酶具有最寬泛受質範圍。
α-酮戊二酸去氫酶(AKGD)使α-酮戊二酸轉化為琥珀醯基-CoA且為經由TCA循環控制代謝通量之初始位點(Hansford,R. G.Curr.Top.Bioenerg . 10:217-278(1980))。由大腸桿菌中之基因sucA 、sucB 及lpd 編碼，在缺氧條件下且在葡萄糖上生長期間下調AKGD基因表現(Park等人,Mol. Microbiol . 15:473-482(1995))。儘管AKGD之受質範圍狹窄，但E2組份催化核心之結構研究精確地識別負責受質特異性之特定殘基(Knapp等人,J.Mol.Biol . 280:655-668(1998))。由odhAB (E1及E2)及pdhD (E3，共有域)編碼之枯草桿菌AKGD在轉錄水準調節且取決於生物體之碳源及生長階段(Resnekov等人,Mol.Gen.Genet. 234:285-296(1992))。在酵母中，在轉錄水準藉由葡萄糖調節編碼E3組份之LPD1 基因(Roy及Dawes,J.Gen.Microbiol . 133:925-933(1987))。由KGD1 編碼之E1組份亦係藉由葡萄糖調節且藉由HAP2及HAP3之產物活化(Repetto及 Tzagoloff,Mol. Cell Biol. 9:2695-2705(1989))。由產物NADH及琥珀醯基-CoA抑制之AKGD酶複合物已在哺乳動物系統中充分研究，因為其受損功能與若干種神經疾病有關(Tretter及dam-Vizi,Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci. 360：2335-2345(2005))。
亦稱為2-側氧基異戊酸去氫酶之分支鏈2-酮酸去氫酶複合物(BCKAD)參與分支鏈胺基酸降解路徑，從而使纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之2-酮酸衍生物轉化為其醯基-CoA衍生物及CO2 。該複合物已在包括枯草桿菌(Wang等人,Eur.J.Biochem . 213:1091-1099(1993))、褐家鼠(Namba等人,J.Biol.Chem . 244:4437-4447(1969))及惡臭假單胞菌(Sokatch,J.Bacteriol . 148:647-652(1981))之許多生物體中進行研究。在枯草桿菌中，酶係由基因pdhD (E3組份)、bfmBB (E2組份)、bfmBAA 及bfmBAB (E1組份)編碼(Wang等人,Eur.J.Biochem . 213:1091-1099(1993))。在哺乳動物中，複合物係由特異性磷酸酶及蛋白質激酶藉由磷酸化調節。複合物已在大鼠肝細胞中進行研究(Chicco等人,J.Biol.Chem . 269:19427-19434(1994))且係由基因Bckdha (E1 α)、Bckdhb (E1 β)、Dbt (E2)及Dld (E3)編碼。已使惡臭假單胞菌BCKAD複合物之E1及E3組份結晶(Aevarsson等人,Nat.Struct.Biol . 6:785-792(1999)；Mattevi,Science 255:1544-1550(1992))且已研究酶複合物(Sokatch等人,J.Bacteriol . 148:647-652(1981))。惡臭假單胞菌BCKAD基因之轉錄係由bkdR 之基因產物活化(Hester等人,Eur.J.Biochem ,233:828-836(1995))。在包括褐家鼠(Paxton等人,Biochem.J . 234:295-303(1986))及釀酒酵母(Sinclair等人,Biochem.Mol.Biol.Int . 31:911-922(1993))之一些生物體中，此複合物已展示具有寬泛受質範圍，除分支鏈胺基酸前驅體之外，其包括諸如2-側氧基丁酸及α-酮戊二酸之直鏈含氧酸。牛BCKAD之活性位點經工程改造偏好替代受質乙醯基-CoA(Meng及Chuang,Biochemistry 33:12879-12885(1994))。
亦廣泛研究催化丙酮酸至乙醯基-CoA轉化之丙酮酸去氫酶複合物。在大腸桿菌酶中，E1組份中之特定殘基負責受質特異性(Bisswanger,H.J Biol Chem. 256:815-822(1981)；Bremer,J.Eur.J Biochem. 8:535-540(1969)；Gong等人,J Biol Chem. 275:13645-13653(2000))。如先前所提及，酶工程改造努力已改良缺氧條件下之大腸桿菌PDH酶活性(Kim等人,Appl.Environ.Microbiol. 73:1766-1771(2007)；Kim,J.Bacteriol. 190:3851-3858(2008)；Zhou等人,Biotechnol.Lett. 30:335-342(2008))。與大腸桿菌PDH相反，枯草桿菌複合物在缺氧條件下具活性且為生長所需要(Nakano,J.Bacteriol. 179:6749-6755(1997))。在甘油上生長期間所表徵之肺炎克雷伯氏菌PDH在缺氧條件下亦具活性(Menzel等人,J.Biotechnol. 56:135-142(1997))。可獲得來自牛腎臟之酶複合物的晶體結構(Zhou等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 98:14802-14807(2001))及來自維涅蘭德固氮菌(Azotobacter vinelandii )之E2催化結構域(Mattevi等人,Science 255:1544-1550(1992))。一些哺乳動物PDH酶複合物可對諸如2-側氧基丁酸之替代受質起反應，但褐家鼠PDH及BCKAD之比較動力學指示BCKAD對作為受質之2-側氧基丁酸具有較高活性(Paxton等人,Biochem.J. 234:295-303(1986))。
作為以上所述之大的多酶2-酮酸去氫酶複合物之替代物，一些厭氧生物體利用2-酮酸氧化還原酶族(OFOR)中之酶催化2-酮酸之醯化氧化去羧化。不同於去氫酶複合物，此等酶含有鐵-硫簇，利用不同輔因子，且使用鐵氧化還原蛋白或黃素氧化還原蛋白作為電子受體替代NAD(P)H。儘管此族中之大多數酶對作為受質之丙酮酸(POR)具特異性，但一些2-酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶已顯示接受寬泛範圍之2-酮酸(包括α-酮戊二酸及2-側氧基丁酸)作為受質(Fukuda及Wakagi,Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002)；Zhang等人,J.Biochem. 120:587-599(1996))。一種此酶為來自嗜酸熱古菌托氏硫化葉菌7之OFOR，其含有由基因ST2300 編碼之α及β次單元(Fukuda及Wakagi,Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002)；Zhang等人,J. Biochem. 120:587-599(1996))。已開發基於質體之表現系統以在大腸桿菌中有效表現此蛋白質(Fukuda等人,Eur. J. Biochem. 268:5639-5646(2001))且確定受質特異性所涉及之殘基(Fukuda及Wakagi,Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002))。兩種來自嗜熱泉生古細菌株K1 之OFOR近來亦被選殖至大腸桿菌中，經表徵且發現其與寬泛範圍之2-含氧酸反應(Nishizawa等人,FEBS Lett. 579:2319-2322(2005))。此等OFOR候選物之基因序列可獲得，但迄今為止其仍不具有經分配之GenBank識別碼。存在類似酶存在於所有古菌、一些厭氧細菌及線粒體真核中之生物資訊證據(Fukuda及Wakagi,Biochim.Biophys.Acta 1597:74-80(2005))。根據能量觀點，此類酶亦引起關注，因為所還原之鐵氧化還原蛋白可用於藉由鐵氧化還原蛋白-NAD還原酶產生NADH(Petitdemange等人,Biochim.Biophys.Acta 421:334-337(1976))。此外，因為大多數酶經設計在缺氧條件下起作用，所以關於在缺氧環境中之活性，相對於2-酮酸去氫酶複合物家族中之酶而言，可能需要較少酶工程改造。
1.2.1.d-氧化還原酶(磷酸化/去磷酸化)
此種類中之例示性酶包括：使甘油醛-3-磷酸轉化為D-甘油酸1,3-雙磷酸之甘油醛3-磷酸去氫酶(例如，大腸桿菌gapA (Branlant及Branlant,Eur. J. Biochem . 150:61-66(1985)))；使L-天冬胺酸-4-半醛轉化為L-4-天冬胺醯基-磷酸之天冬胺酸-半醛去氫酶(例如，大腸桿菌asd (Biellmann等人,Eur.J.Biochem . 104:53-58(1980)))；使N-乙醯基-L-麩胺酸-5-半醛轉化為N-乙醯基-L-麩胺醯基-5-磷酸之N-乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶(例如，大腸桿菌argC (Parsot等人,Gene 68:275-283(1988)))；及使L-麩胺酸-5-半醛轉化為L-麩胺醯基-5-磷酸之麩胺酸-5-半醛去氫酶(例如，大腸桿菌proA (Smith等人,J Bacteriol . 157:545-551(1984)))。
1.3.1.a-對CH-CH供體起作用之氧化還原酶
例示性烯醯基-CoA還原酶為來自丙酮丁醇梭菌之bcd 的基因產物(Atsumi等人,Metab Eng (2007)；Boynton等人,Journal of Bacteriology 178:3015-3024(1996))，其天然催化巴豆醯基-CoA至丁醯基-CoA之還原。此酶之活性可藉由表現bcd 連同表現編碼電子轉移黃素蛋白之丙酮丁醇梭菌etfAB 基因來增強。烯醯基-CoA還原酶步驟之另一候選物為來自細小裸藻之線粒體烯醯基-CoA還原酶(Hoffmeister等人,Journal of Biological Chemistry 280:4329-4338(2005))。在大腸桿菌中選殖源自此序列移除該序列之線粒體靶向前導序列後之構築體，從而產生活性酶(Hoffmeister等人，同上,(2005))。這種方法為熟習表現真核基因之技術者所熟知，尤其熟習可在原核生物體中靶向特定細胞內區間之基因產物之前導序列者。此基因之近同源物，來自原核生物齒垢密螺旋體之TDE0597，表示已在大腸桿菌中選殖且表現之第三種烯醯基-CoA還原酶(Tucci及Martin,FEBS Letters 581:1561-1566(2007))。
已知例示性2-烯酸還原酶(EC 1.3.1.31)催化多種α,β-不飽和羧酸及醛之NADH依賴性還原(Rohdich等人,J. Biol. Chem. 276:5779-5787(2001))。2-烯酸還原酶係由若干種梭狀芽孢桿菌物種中之enr 編碼(Giesel及Simon,Arch Microbiol. 135(1)：第51-57頁(2001)，包括酪丁酸梭菌及熱乙酸梭菌(目前稱為熱乙酸穆爾氏菌)(Rohdich等人，同上,(2001))。在近來公開之克氏梭菌基因組序列中，已報導烯酸還原酶之9個編碼序列，其中一者已經表徵(Seedorf等人,Proc Natl Acad Sci U. S. A. 105(6):2128-33(2008))。來自酪丁酸梭菌與熱乙酸梭菌之enr 基因已經選殖且測序，且其彼此顯示59%一致性。亦發現前一基因與在克氏梭菌中表徵之基因具有約75%相似性(Giesel及Simon,Arch Microbiol 135(1):51-57(1983))。已基於此等序列結果報導enr 極類似於大腸桿菌中之二烯醯基CoA還原酶(fadH )(163 Rohdich等人，同上(2001))。熱乙酸梭菌enr 基因亦在大腸桿菌中以酶促活性形式表現(163 Rohdich等人，同上(2001))。
1.4.1.a-對胺基酸起作用之氧化還原酶
大多數對胺基酸起作用之氧化還原酶催化利用NAD+或NADP+作為受體之α-胺基酸的氧化去胺化。對胺基酸起作用之例示性氧化還原酶包括由gdhA 編碼之麩胺酸去氫酶(去胺化)、由ldh 編碼之白胺酸去氫酶(去胺化)及由nadX 編碼之天冬胺酸去氫酶(去胺化)。來自大腸桿菌之gdhA 基因產物(Korber等人,J. Mol. Biol. 234:1270-1273(1993)；McPherson及Wootton,Nucleic.Acids Res. 11:5257-5266(1983))、來自海棲熱袍菌之gdh (Kort等人,Extremophiles 1:52-60(1997)；Lebbink等人,J. Mol. Biol. 280:287-296(1998)；Lebbink等人,J. Mol. Biol. 289:357-369(1999))及來自極端嗜鹽菌之gdhA 1 (Ingoldsby等人,Gene 349:237-244(2005))催化麩胺酸至2-酮戊二酸及氨之可逆相互轉化，同時分別有利於NADP(H)、NAD(H)或兩者。仙人掌桿菌之ldh 基因編碼具有包括白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及2-胺基丁酸之寬泛受質範圍之LeuDH蛋白質(Ansorge及Kula,Biotechnol Bioeng. 68:557-562(2000)；Stoyan等人,J. Biotechnol 54:77-80(1997))。編碼天冬胺酸去氫酶之來自海棲熱袍菌之nadX 基因牽涉於NAD之生物合成中(Yang等人,J. Biol. Chem. 278:8804-8808(2003))。
由lysDH 基因編碼之離胺酸6-去氫酶(去胺化)催化L-離胺酸之s-胺基的氧化去胺化以形成2-胺基己二酸-6-半醛，其接著非酶促環化以形成Δ1-哌啶-6-羧酸(Misono及Nagasaki,J. Bacteriol. 150:398-401(1982))。來自嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌之lysDH 基因編碼耐熱NAD依賴性離胺酸6-去氫酶(Heydari等人,Appl Environ. Microbiol 70:937-942(2004))。此外，經由基因組計劃之同源性鑑別來自嗜熱泉生古細菌K1 之lysDH 基因。
2.3.1.a-醯基轉移酶(轉移磷酸基)
例示性磷酸轉移醯基轉移酶包括由pta 編碼之磷酸轉乙醯酶及由ptb 編碼之磷酸轉丁醯酶。來自大腸桿菌之pta 基因編碼可使乙醯基-CoA轉化為乙醯基-磷酸之酶，反之亦然(Suzuki,T.,Biochim. Biophys. Acta 191:559-569(1969))。此酶亦可在過程中利用丙醯基-CoA替代乙醯基-CoA形成丙酸(Hesslinger等人,Mol.Microbiol 27:477-492(1998))。類似地，來自丙酮丁醇梭菌之ptb 基因編碼可使丁醯基-CoA轉化為丁醯基-磷酸之酶(Walter等人,Gene 134(1)：第107-11頁(1993))；Huang等人,J Mol Microbiol Biotechnol 2(1)：第33-38頁(2000))。其他ptb 基因可見於丁酸製備型細菌L2-50(Louis等人,J. Bacteriol . 186:2099-2106(2004))及巨大芽孢桿菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol 42:345-349(2001))中。
2.6.1.a-胺基轉移酶
天冬胺酸胺基轉移酶將天冬胺酸之胺基轉移至α-酮戊二酸，形成麩胺酸及草醯乙酸。此轉化係由例如來自大腸桿菌之aspC (Yagi等人,FEBS Lett . 100:81-84(1979)；Yagi等人,Methods Enzymol . 113:83-89(1985))、來自釀酒酵母之AAT2(Yagi等人,J Biochem . 92:35-43(1982))及來自阿拉伯芥之ASP5 (48,108,225 48。de la等人,Plant J 46:414-425(2006)；Kwok及Hanson,J Exp.Bot . 55:595-604(2004)；Wilkie及Warren,Protein Expr.Purif . 12:381-389(1998))的基因產物催化。纈胺酸胺基轉移酶催化纈胺酸及丙酮酸至2-酮異戊酸及丙胺酸之轉化。大腸桿菌基因avtA 編碼一種此酶(Whalen及Berg,J.Bacteriol 150:739-746(1982))。此基因產物亦催化α-酮丁酸胺化以產生α-胺基丁酸，但尚未鑑別此反應中之胺供體(Whalen及Berg,J. Bacteriol. 158:571-574(1984))。大腸桿菌serC 之基因產物催化兩種反應，磷酸絲胺酸胺基轉移酶及磷酸羥基蘇胺酸胺基轉移酶(Lam及Winkler,J.Bacteriol. 172:6518-6528(1990))，且不能偵測到對非磷酸化受質之活性(Drewke等人,FEES.Lett. 390:179-182(1996))。
Cargill已開發由β-丙胺酸經由丙二醯基-半醛製備3-HP之β-丙胺酸/α-酮戊二酸胺基轉移酶(PCT/US2007/076252(Jessen等人))。亦展示克魯維酵母中之SkPYD4之基因產物優先使用β-丙胺酸作為胺基供體(Andersen等人,FEBS.J. 274:1804-1817(2007))。SkUGA1編碼釀酒酵母GABA胺基轉移酶之同源物UGA1(Ramos等人,Eur.J.Biochem. 149:401-404(1985))，而SkPYD4編碼β-丙胺酸與GABA胺基轉移中所涉及之酶(Andersen等人,FEBS.J. 274:1804-1817(2007))。3-胺基-2-甲基丙酸轉胺酶催化由甲基丙二酸半醛至3-胺基-2-甲基丙酸之轉化。該酶已於褐家鼠及野豬中表徵且由Abat 編碼(Kakimoto等人,Biochim.Biophys.Acta 156:374-380(1968)；Tamaki等人,Methods Enzymol. 324:376-389(2000))。與3-胺基-2-甲基丙酸轉胺酶具有高序列同源性之其他生物體中之酶候選物包括秀麗隱桿線蟲中之Gta-1 及枯草桿菌中之gabT 。另外，已展示大腸桿菌中由基因gabT 編碼之一種天然GABA胺基轉移酶具有寬泛受質特異性(Liu等人,Biochemistry 43:10896-10905(2004)；Schulz等人,Appl Environ Microbiol 56:1-6(1990))。puuE 之基因產物催化大腸桿菌中之其他4-胺基丁酸轉胺酶(Kurihara等人,J.Biol.Chem. 280:4602-4608(2005))。
已報導未與抑制劑結合及與抑制劑結合之大腸桿菌4-胺基丁酸轉胺酶之X射線晶體結構(Liu等人,Biochemistry 43:10896-10905(2004))。已研究且表明受質結合及受質特異性。藉由定點突變誘發及X射線結晶學研究活性位點殘基之作用(Liu等人,Biochemistry 44:2982-2992(2005))。基於結構資訊，嘗試工程改造具有新穎酶活性之大腸桿菌4-胺基丁酸轉胺酶。此等研究提供發展BDO路徑之轉胺酶活性之基礎。
2.7.2.a-磷酸轉移酶，羧基受體
例示性激酶包括由ackA 編碼之大腸桿菌乙酸激酶(Skarstedt及Silverstein,J.Biol.Chem . 251:6775-6783(1976))、由buk1 及buk2 編碼之丙酮丁醇梭菌丁酸激酶(Walter等人,Gene 134(1):107-111(1993)；Huang等人,J Mol Microbiol Biotechnol 2(1):33-38(2000))，及由proB 編碼之大腸桿菌γ-麩胺醯基激酶(Smith等人,J.Bacteriol . 157:545-551(1984))。此等酶分別磷酸化乙酸、丁酸及麩胺酸。來自大腸桿菌之ackA 基因產物亦磷酸化丙酸(Hesslinger等人,Mol.Microbiol 27:477-492(1998))。
2.8.3.a-輔酶A轉移酶
在CoA-轉移酶族中，已展示亦稱為乙酸-CoA轉移酶(EC 2.8.3.8)之大腸桿菌酶醯基-CoA：乙酸-CoA轉移酶使CoA部分由多種分支鏈及直鏈醯基-CoA受質轉移至乙酸，該等受質包括異丁酸(Matthies及Schink,Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem. Biophys. Res Commun. 33:902-908(1968))及丁酸(Vanderwinkel,同上(1968))。此酶係由大腸桿菌屬K12中之atoA (α次單元)及atoD (β次單元)(Korolev等人,Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr . 58:2116-2121(2002)；Vanderwinkel,同上(1968))及麩胺酸棒桿菌ATCC 13032中之actA 及cg0592 (Duncan等人,Appl Environ Microbiol 68:5186-5190(2002))編碼。由序列同源性找出之其他基因包括大腸桿菌UT189 中之atoD 及atoA 。
類似轉化係由已顯示分別展現琥珀醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA及丁醯基-COA乙醯基轉移酶活性的克氏梭菌之cat1 、cat2 及cat3 之基因產物催化(Seedorf等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105(6):2128-2133(2008)；Sohling及Gottschalk,J Bacteriol 178(3):871-880(1996))。
來自厭氧菌醱酵胺基酸球菌之戊烯二酸-CoA-轉移酶(EC 2.8.3.12)與二酸戊烯二醯基-CoA及3-丁烯基-CoA反應(Mack及Buckel,FEBS Lett. 405:209-212(1997))。編碼此酶之基因為gctA 及gctB 。此酶具有降低但可偵測之對其他CoA衍生物(包括戊二醯基-CoA、2-羥基戊二醯基-CoA、己二醯基-CoA及丙烯醯基-CoA)之活性(Buckel等人,Eur.J.Biochem. 118:315-321(1981))。已在大腸桿菌中選殖且表現該酶(Mac等人,Eur.J.Biochem. 226:41-51(1994))。
3.1.2.a-硫醇酯水解酶(CoA特異性)
在CoA水解酶家族中，酶3-羥異丁醯基-CoA水解酶對3-HIBCoA具特異性且已描述其在纈胺酸降解期間有效催化所要轉化(Shimomura等人,J Biol Chem 269:14248-14253(1994))。編碼此酶之基因包括褐家鼠(Shimomura等人，同上(1994)；Shimomura等人,Methods Enzymol . 324:229-240(2000))及智人(Shimomura等人，同上,2000)之hibch。由序列同源性找出之候選基因包括釀酒酵母之hibch及仙人掌桿菌之BC_2292 。
己二醯基-CoA至己二酸之轉化可藉由醯基-CoA水解酶進行或等效地由硫酯酶進行。主要大腸桿菌基因候選物為tesB (Naggert等人,J Biol Chem . 266(17):11044-11050(1991))，其展示與人類acot8 之高相似性，人類acot8 為對己二醯基-CoA具有活性之二羧酸乙醯基轉移酶(Westin等人,JBiol Chem 280(46):38125-38132(2005))。亦已在大鼠肝臟中表徵此活性(Deana,Biochem Int . 26(4)：第767-773頁(1992))。
其他潛在大腸桿菌硫醇酯水解酶包括tesA (Bonner及Bloch,J Biol Chem . 247(10):3123-3133(1972))、ybgC (Kuznetsova等人,FEMS Microbiol Rev . 29(2):263-279(2005)；Zhuang等人,FEBS Lett . 516(1-3):161-163(2002))、paaI (Song等人,J Biol Chem . 281(16):11028-11038(2006))及ybdB (Leduc等人,J Bacteriol . 189(19):7112-7126(2007))之基因產物。
若干種真核乙醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)具有寬泛受質特異性。來自褐家鼠腦之酶(Robinson等人,Biochem .Biophys .Res .Commun . 71:959-965(1976))可與丁醯基-CoA、己醯基-CoA及丙二醯基-CoA反應。
4.1.1.a-去羧酶
例示性去羧酶為參與檸檬酸分解代謝及分支鏈胺基酸生物合成從而使2-乙醯乳酸轉化為乙醯甲基甲醇之乙醯乳酸去羧酶。在乳酸乳球菌中，酶係由六個由基因aldB 編碼之次單元構成且係由纈胺酸、白胺酸及異白胺酸活化(Goupil 等人,Appl. Environ. Microbiol . 62:2636-2640(1996)；Goupil-Feuillerat等人,J. Bacteriol . 182:5399-5408(2000))。此酶已在大腸桿菌中過度表現且經表徵(Phalip等人,FEBS Lett . 351:95-99(1994))。在其他生物體中，酶為由嗜熱鏈球菌中之aldC (Monnet等人,Lett. Appl. Microbiol . 36:399-405(2003))、巨大芽孢桿菌中之aldB (Diderichsen等人,J. Bacteriol . 172:4315-4321(1990)；Najmudin等人,Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr . 59:1073-1075(2003))及來自產氣腸桿菌之budA (Diderichsen等人,J. Bacteriol . 172:4315-4321(1990))編碼之二聚體。來自巨大芽孢桿菌之酶在枯草桿菌中選殖且過度表現且藉由結晶學表徵(Najmudin等人,Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr . 59:1073-1075(2003))。另外，來自乳明串珠菌(Leuconostoc lactis )之酶已經純化且表徵，但尚未分離出基因(O'Sullivan等人,FEMS Microbiol. Lett . 194:245-249(2001))。
在念珠菌之菌株中以及在絲狀真菌土麯黴中，烏頭酸去羧酶催化衣康酸生物合成中之最後步驟(Bonnarme等人,J Bacteriol . 177:3573-3578(1995)；Willke及Vorlop,Appl Microbiol Biotechnol 56:289-295(2001))。儘管衣康酸為生物技術所關注之化合物，但迄今為止尚未報導烏頭酸去羧酶基因或蛋白質序列。
4-草醯巴豆酸去羧酶已自眾多生物體分離且加以表徵。編碼此酶之基因包括假單胞菌屬(菌株600)中之dmpH 及dmpE (Shingler等人,J Bacteriol . 174:711-724(1992))、來自惡臭假單胞菌之xylII 及xylIII (Kato及Asano,Arch.Microbiol 168:457-463(1997)；Lian及Whitman,J.Am.Chem.Soc . 116:10403-10411(1994)；Stanley等人,Biochemistry 39:3514(2000))，及來自真養雷氏菌JMP134 之Reut_B5691 及Reut_B5692 (Hughes等人,J Bacteriol. 158:79-83(1984))。已在大腸桿菌中選殖且表現編碼來自假單胞菌屬(菌株600)之酶的基因(Shingler等人,J Bacteriol . 174:711-724(1992))。
已表徵另一類催化肉桂酸(苯丙烯酸)及經取代肉桂酸衍生物至相應苯乙烯衍生物之轉化的去羧酶。此等酶在多種生物體中常見，且已在大腸桿菌中選殖且表現之編碼此等酶之特異性基因為:來自釀酒酵母之pad 1 (Clausen等人,Gene 142:107-112(1994))、來自植物乳桿菌之pdc (Barthelmebs等人,Appl Environ Microbiol 67:1063-1069(2001)；Qi等人,Metab Eng 9:268-276(2007)；Rodriguez等人，J.Agric.Food Chem. 56:3068-3072(2008))、來自產酸克雷伯氏菌之pofK(pad) (Hashidoko等人,Biosci.Biotech.Biochem. 58:217-218(1994)；Uchiyama等人,Biosci.Biotechnol.Biochem. 72:116-123(2008))、戊糖片球菌(Barthelmebs等人,Appl Environ Microbiol 67:1063-1069(2001))，及來自枯草桿菌及短小芽胞桿菌之padC (Lingen等人,Protein Eng 15:585-593(2002))。亦已純化且表徵來自螢光假單胞菌之阿魏酸去羧酶(Huang等人，J.Bacteriol. 176:5912-5918(1994))。重要的是，已展示此類酶穩定且不需要外源或內部結合之輔因子，因此使得此等酶理想地適用於生物轉化(Sariaslani,Annu. Rev. Microbiol. 61:51-69(2007))。
其他去羧酶可由α-酮戊二酸形成琥珀酸半醛。此等酶包括來自細小裸藻之α-酮戊二酸去羧酶(Shigeoka等人.Biochem.J. 282(第2部分):319-323(1992)；Shigeoka及Nakano,Arch.Biochem.Biophys. 288:22-28(1991)；Shigeoka及Nakano,Biochem.J. 292(第2部分):463-467(1993))，其相應基因序列有待確定；及來自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶(Tian等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A . 102:10670-10675(2005))。此外，麩胺酸去羧酶可使麩胺酸轉化為4-胺基丁酸，諸如大腸桿菌gadA 及gadB 基因之產物(De Biase等人,Protein.Expr.Purif . 8:430-438(1993))。
酮酸去羧酶
丙酮酸去羧酶(PDC，EC 4.1.1.1)(亦稱為酮酸去羧酶)為酒精醱酵中之關鍵酶，其催化丙酮酸去羧化成乙醛。對於包括2-酮丁酸、2-酮戊酸、3-羥基丙酮酸及2-苯基丙酮酸之脂族2-酮酸，此酶具有寬泛受質範圍(Berg等人,Science 318:1782-1786(2007))。來自運動醱酵單孢菌之由pdc 編碼之PDC已成為改變對不同受質之親和力的定向工程改造研究之標的(Siegert等人,Protein Eng Des Sel 18:345-357(2005))。來自釀酒酵母之PDC亦已經廣泛研究，進行工程改造以改變活性，且在大腸桿菌中功能表現(Killenberg-Jabs等人,Eur.J.Biochem . 268:1698-1704(2001)；Li及Jordan,Biochemistry 38:10004-10012(1999)；ter Schure等人,Appl.Environ.Microbiol . 64:1303-1307(1998))。可獲得此酶之晶體結構(Killenberg-Jabs,Eur.J.Biochem . 268:1698-1704(2001))。其他充分表徵之PDC候選物包括來自巴斯醋桿菌之酶(Chandra等人,Arch.Microbiol . 176:443-451(2001))及來自乳酸克魯維酵母之酶(Krieger等人,Eur.J.Biochem. 269:3256-3263(2002))。
如同PDC一樣，苯甲醯基甲酸去羧酶(EC 4.1.1.7)具有寬泛受質範圍且為酶工程研究之目標。已廣泛研究來自惡臭假單胞菌之酶且可獲得此酶之晶體結構(Hasson等人,Biochemistry 37:9918-9930(1998)；Polovnikova等人,Biochemistry 42:1820-1830(2003))。惡臭假單胞菌酶之活性位點中之兩個殘基之定點突變誘發改變對天然及非天然存在之受質的親和力(Km)(Siegert,Protein Eng Des Sel 18:345-357(2005))。此酶之特性已藉由定向工程改造進一步修飾(Lingen等人,Protein Eng 15:585-593(2002))；Lingen,Chembiochem 4:721-726(2003))。亦已通過實驗表徵來自綠膿桿菌之由mdlC 編碼之酶(Barrowman等人,FEMS Microbiology Letters 34:57-60(1986))。來自斯氏假單胞菌、螢光假單胞菌及其他生物體之其他基因候選物可藉由序列同源性推斷或使用在惡臭假單胞菌中開發之生長選擇系統鑑別(Henning等人,Appl.Environ.Microbiol. 72:7510-7517(2006))。
4.2.1.a-脫水酶
巴克氏真桿菌之2-(羥甲基)戊二酸脫水酶為例示性脫水酶。此酶已在煙酸分解代謝之情形下進行研究且由hmd 編碼(Alhapel等人,Proc Natl Acad Sci USA 103:12341-12346(2006))。具有高序列同源性之類似酶見於多毛擬桿菌、克利厭氧桿菌及嗜熱鹽鹼厭氧菌中。
第二例示性脫水酶為反丁烯二酸水合酶，其為催化蘋果酸至反丁烯二酸之脫水的酶。可獲得此酶之大量結構資訊且研究者已成功工程改造該酶以改變活性、抑制及定位(Weaver,T.,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr . 61:1395-1401(2005))。其他反丁烯二酸水合酶包括藉由來自大腸桿菌(Estevez等人,Protein Sci . 11:1552-1557(2002)；Hong及Lee,Biotechnol.Bioprocess Eng . 9:252-255(2004)；Rose及Weaver,Proc Natl Acad Sci U.S.A 101:3393-3397(2004))、空腸彎麴菌(Smith等人,Int.J Biochem.Cell Biol 31:961-975(1999))及嗜熱棲熱菌(Mizobata等人，Arch.Biochem.Biophys . 355:49-55(1998))之fumC 及來自褐家鼠之fumH (Kobayashi等人,J Biochem . 89:1923-1931(1981))編碼之酶。具有高序列同源性之類似酶包括來自阿拉伯芥之fuml 及來自麩胺酸棒桿菌之fumC 。
α-甲基蘋果酸脫水酶(亦稱為2-甲基蘋果酸脫水酶)使2-甲基蘋果酸轉化為中康酸。在麩胺酸降解VI路徑之情形下在假破傷風梭菌、摩氏摩根菌(Morganella morganii )、無丙二酸檸檬酸桿菌中偵測2-甲基蘋果酸脫水酶活性(Kato及Asano,Arch. Microbiol 168:457-463(1997))；然而迄今為止編碼此酶之基因尚未定序。
來自丙酮丁醇梭菌之crt之基因產物催化3-羥基丁醯基-CoA脫水為巴豆醯基-CoA(Atsumi等人,Metab Eng.； 29(2007)；Boynton等人,Journal of Bacteriology 178:3015-3024(1996))。咸信在苯基乙酸分解代謝期間，惡臭假單胞菌之烯醯基-CoA水合酶phaA 及phaB 進行雙鍵之羥基化(Olivera等人,Proc Natl Acad Sci USA 95(11):6419-6424(1998))。來自螢光假單胞菌之paaA 及paaB 催化類似轉化(14 Olivera等人，同上，1998)。最後，已展示許多大腸桿菌基因顯示烯醯基-CoA水合酶功能性，包括maoC (Park及Lee,J Bacteriol 185(18):5391-5397(2003))、paaF (Park及Lee,Biotechnol Bioeng. 86(6):681-686(2004a)；Park及Lee,Appl Biochem Biotechnol. 113-116:335-346(2004b)；Ismail等人,Eur J Biochem 270(14)：第3047-3054頁(2003))，及paaG (Park及Lee,同上,2004；Park及Lee,同上,2004b；Ismail等人，同上,2003)。
大腸桿菌基因fadA 及fadB 編碼展現酮醯基-CoA硫解酶、3-羥基醯基-CoA去氫酶及烯醯基-CoA水合酶活性之多酶複合物(Yang等人,Biochemistry 30(27)：第6788-6795頁(1991)；Yang等人,J Biol Chem 265(18)：第10424-10429頁(1990)；Yang等人,J Biol Chem 266(24)：第16255頁(1991)；Nakahigashi及Inokuchi,Nucleic Acids Res 18(16)：第4937頁(1990))。fadI 及fadJ 基因編碼類似功能且僅在缺氧條件下天然地表現(Campbell等人,Mol Microbiol 47(3):第793-805頁(2003))。先前已描述在大腸桿菌中製備聚[(R)-3-羥基丁酸酯]之方法，其涉及活化fadB (藉由破壞負調節因子，fadR )及共同表現非天然酮硫解酶(來自真養雷氏菌之phaA )(Sato等人,J Biosci Bioeng 103(1):38-44(2007))。此研究明顯表明編碼3-羥基醯基-CoA去氫酶及烯醯基-CoA水合酶活性之β-氧化酶、尤其fadB 之基因產物，可充當由乙醯基-CoA前驅體製備長鏈分子之路徑的一部分。
4.3.1.a-解氨酶
催化天冬胺酸去胺化為反丁烯二酸之天冬胺酸酶(EC 4.3.1.1)為微生物中普遍存在之酶且已廣泛表徵(Viola,R. E.,Adv.Enzymol.Relat Areas Mol.Biol 74:295-341(2000))。已解決由aspA 編碼之大腸桿菌天冬胺酸酶之晶體結構(Shi等人,Biochemistry 36:9136-9144(1997))。亦已展示大腸桿菌酶與替代受質天冬胺酸苯基甲酯、天冬醯胺、苯甲基-天冬胺酸及蘋果酸反應(Ma等人,Ann N.Y.Acad Sci 672:60-65(1992))。在另一項研究中，對此酶使用定向進化以改變受質特異性(Asano等人,Biomol.Eng 22:95-101(2005))。亦已在流感嗜血桿菌(Sjostrom等人,Biochim.Biophys.Acta 1324:182-190(1997))、螢光假單胞菌(Takagi等人,J.Biochem . 96:545-552(1984))、秀麗隱桿線蟲(Sjostrom等人,Biochim.Biophys.Acta 1324:182-190(1997))及黏質沙雷氏菌(Takagi及Kisumi,J Bacteriol .161:1-6(1985))中表徵具有天冬胺酸酶功能性之酶。
3-甲基天冬胺酸酶(EC 4.3.1.2)(亦稱為β-甲基天冬胺酸酶或3-甲基天冬胺酸解氨酶)催化蘇-3-甲基天冬胺酸去胺化為中康酸。來自假破傷風梭菌之3-甲基天冬胺酸酶已經選殖，在大腸桿菌中功能性表現，且結晶(Asuncion等人,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr. 57:731-733(2001)；Asuncion等人,J Biol Chem. 277:8306-8311(2002)；Botting等人,Biochemistry 27:2953-2955(1988)；Goda等人,Biochemistry 31:10747-10756(1992))。在無丙二酸檸檬酸桿菌中，此酶係由BAA28709 編碼(Kato及Asano,Arch.Microbiol 168:457-463(1997))。3-甲基天冬胺酸酶亦已自大腸桿菌YG1002 結晶(Asano及Kato,FEMS Microbiol Lett . 118:255-258(1994))，但蛋白質序列尚未列於諸如GenBank之公開資料庫中。序列同源性可用於鑑別其他候選基因，包括破傷風梭菌中之CTC_02563 及大腸桿菌O157:H7中之ECs0761 。
形成烯醯基-CoA產物之解氨酶候選物包括β-丙胺醯基-CoA解氨酶(EC 4.3.1.6)，其去胺化β-丙胺醯基-CoA；及3-胺基丁醯基-CoA解氨酶(EC 4.3.1.14)。已在丙酸梭菌中鑑別且表徵兩種β-丙胺醯基-CoA解氨酶(Herrmann等人,FEES J . 272:813-821(2005))。迄今為止尚未研究其他β-丙胺醯基-CoA解氨酶，但可藉由序列相似性鑑別基因候選物。一種此候選物為黃色黏球菌中之MXAN_4385。
5.3.3.a-異構酶
來自胺基丁酸梭菌與克氏梭菌之4-羥基丁醯基-CoA脫水酶催化4-羥基丁醯基-CoA至巴豆醯基-CoA之可逆轉化且具有固有乙烯基乙醯基-CoA Δ-異構酶活性(Scherf及Buckel,Eur. J Biochem. 215:421-429(1993)；Scherf等人,Arch.Microbiol 161:239-245(1994))。兩種天然酶已經純化且表徵，其包括N端胺基酸序列(Scherf及Buckel,同上,1993；Scherf等人，同上,1994)。來自胺基丁酸梭菌及克氏梭菌之abfD 基因與此等N端胺基酸序列完全匹配，因此編碼4-羥基丁醯基-CoA脫水酶/乙烯基乙醯基-CoA Δ-異構酶。此外，經由基因組計劃之同源性鑑別來自牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277之abfD 基因。
5.4.3.a-胺基變位酶
離胺酸2,3-胺基變位酶(EC 5.4.3.2)為使離胺酸轉化為(3S)-3,6-二胺基己酸從而使胺基由2位移至3位之例示性胺基變位酶。該酶見於使離胺酸醱酵成乙酸及丁酸之細菌中，該等細菌包括核梭桿菌(kamA )(Barker等人,J. Bacteriol. 152:201-207(1982))及近端梭菌(kamA )(Chirpich等人,J.Biol.Chem. 245:1778-1789(1970))。來自近端梭菌之酶已結晶(Lepore等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102:13819-13824(2005))。編碼此功能之酶亦係由秀麗隱桿線蟲中之yodO 編碼(Chen等人,Biochem. J. 348 Pt 3:539-549(2000))。該酶利用吡哆醛5'-磷酸作為輔因子，需要由S-腺苷甲硫胺酸活化，且具立體選擇性，從而僅與L-離胺酸反應。尚未展示該酶與替代受質反應。
第二胺基變位酶，β-離胺酸5,6-胺基變位酶(EC 5.4.3.3)催化離胺酸醱酵成乙酸及丁酸之下一步驟，其使(3S)-3,6-二胺基己酸轉化為(3S,5S)-3,5-二胺基己酸，使末端胺基由6位移至5位。此酶亦催化離胺酸轉化為2,5-二胺基己酸且亦稱為離胺酸-5,6-胺基變位酶(EC 5.4.3.4)。該酶已在斯氏梭菌(kamD ，kamE )中結晶(Berkovitch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101:15870-15875(2004))。來自牙齦卟啉單胞菌之酶亦已經表徵(Tang等人,Biochemistry 41:8767-8776(2002))。
鳥胺酸4,5-胺基變位酶(EC 5.4.3.5)使D-鳥胺酸轉化為2,4-二胺基戊酸，亦使末端胺移至相鄰碳處。來自斯氏梭菌之酶係由兩種基因(oraE 及oraS )編碼，且已在大腸桿菌中選殖、測序及表現(Chen等人,J.Biol.Chem. 276:44744-44750(2001))。迄今為止此酶尚未在其他生物體中表徵。
酪胺酸2,3-胺基變位酶(EC 5.4.3.6)參與酪胺酸生物合成，藉由將胺由2位移至3位使酪胺酸可逆轉化為3-胺基-3-(4-羥基苯基)丙酸。在球孢鏈黴菌(Streptomyces globisporus )中，亦已展示該酶與酪胺酸衍生物反應(Christenson等人,Biochemistry 42:12708-12718(2003))。未獲得序列資訊。
在白胺酸降解及生物合成期間，白胺酸2,3-胺基變位酶(EC 5.4.3.7)使L-白胺酸轉化為β-白胺酸。關於白胺酸2,3-胺基變位酶之檢定偵測在許多生物體中之活性(Poston,J. M.Methods Enzymol. 166:130-135(1988))，但迄今為止尚未鑑別編碼該酶之基因。
Cargill已開發出使L-丙胺酸轉化為β-丙胺酸之新穎2,3-胺基變位酶，因此產生以4個生物化學步驟由丙酮酸至3-HP之路徑(Liao等人,美國公開案第2005-0221466號)。
6.2.1.a-酸-硫醇連接酶
例示性酸-硫醇連接酶為大腸桿菌之sucCD 之基因產物，其在一ATP之伴隨消耗下催化由琥珀酸形成琥珀醯基-CoA(一種活體內可逆反應)(Buck等人,Biochemistry 24(22):第6245-6252頁(1985))。其他例示性CoA-連接酶包括：仍未表徵序列之大鼠二羧酸-CoA連接酶(Vamecq等人,Biochem J . 230(3)：第683-693頁(1985))；兩種來自產黃青黴之經表徵苯基乙酸-CoA連接酶中之任一者(Lamas-Maceiras等人,Biochem J 395(1):147-155(2006)；Wang等人,Biochem Biophys Res Commun, 360(2):453-458(2007))；來自惡臭假單胞菌之苯基乙酸-CoA連接酶(Martinez-Bianco等人,J Biol Chem . 265(12):7084-7090(1990))；及來自枯草桿菌之6-羧基己酸-CoA連接酶(Bower等人,J Bacteriol 178(14):4122-4130(1996))。
實例V
由琥珀醯基-CoA起始之例示性BDO路徑
此實例描述由琥珀醯基-CoA起始之例示性BDO路徑。
本文描述且先前已描述由琥珀醯基-COA起始之BDO路徑(參見，2008年3月14日申請之美國申請案第12/049,256號及2008年3月14日申請之PCT申請案第US 08/57168號，各文獻皆以引用方式併入本文中)。圖8A展示其他路徑。此等例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表15中。
簡言之，可藉由琥珀醯基-CoA還原酶(或琥珀酸半醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使琥珀醯基-CoA轉化為琥珀酸半醛。如先前所述，可藉由4-羥基丁酸去氫酶(EC 1.1.1.a)使琥珀酸半醛轉化為4-羥基丁酸。或者，可藉由琥珀醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使琥珀醯基-CoA轉化為4-羥基丁酸。如先前所述，可藉由4-羥基丁醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)使4-羥基丁酸轉化為4-羥基丁醯基-CoA，或藉由4-羥基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)。或者，如先前所述，可藉由4-羥基丁酸激酶(EC 2.7.2.a)使4-羥基丁酸轉化為4-羥基丁醯基-磷酸。如先前所述，可藉由磷酸轉-4-羥基丁醯酶(EC 2.3.1.a)使4-羥基丁醯基-磷酸轉化為4-羥基丁醯基-CoA。或者，可藉由4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)(醯基磷酸還原酶)使4-羥基丁醯基-磷酸轉化為4-羥基丁醛。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為1,4-丁二醇。如先前所述，可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
表15. 由琥珀醯基-CoA起始之BDO路徑。
實例VI
由α-酮戊二酸起始之其他例示性BDO路徑
此實例描述由α-酮戊二酸起始之例示性BDO路徑。
本文描述且先前已描述由琥珀醯基-CoA起始之BDO路徑(參見，2008年3月14日申請之美國申請案第12/049,256號及2008年3月14日申請之PCT申請案第US08/57168號，各文獻皆以引用方式併入本文中)。圖8B展示其他路徑。此等例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表16中。
簡言之，如先前所述，可藉由α-酮戊二酸去羧酶(EC 4.1.1.a)使α-酮戊二酸轉化為琥珀酸半醛。或者，可藉由麩胺酸去氫酶(EC 1.4.1.a)使α-酮戊二酸轉化為麩胺酸。可藉由4-胺基丁酸氧化還原酶(去胺化)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁酸轉胺酶(EC 2.6.1.a)使4-胺基丁酸轉化為琥珀酸半醛。可藉由麩胺酸去羧酶(EC 4.1.1.a)使麩胺酸轉化為4-胺基丁酸。如先前所述，可藉由4-羥基丁酸去氫酶(EC 1.1.1.a)使琥珀酸半醛轉化為4-羥基丁酸。如先前所述，可藉由4-羥基丁醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)使4-羥基丁酸轉化為4-羥基丁醯基-CoA，或藉由4-羥基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)。可藉由4-羥基丁酸激酶(EC 2.7.2.a)使4-羥基丁酸轉化為4-羥基丁醯基-磷酸。如先前所述，可藉由磷酸轉-4-羥基丁醯酶(EC 2.3.1.a)使4-羥基丁醯基-磷酸轉化為4-羥基丁醯基-CoA。或者，可藉由4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)(醯基磷酸還原酶)使4-羥基丁醯基-磷酸轉化為4-羥基丁醛。如先前所述，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為1,4-丁二醇。如先前所述，可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
表16. 由α-酮戊二酸起始之BDO路徑。
實例VII
由4-胺基丁酸起始之BDO路徑
此實例描述由4-胺基丁酸起始之例示性BDO路徑。
圖9A描述使4-胺基丁酸轉化為BDO之例示性BDO路徑。此例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表17中。
簡言之，可藉由4-胺基丁酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-胺基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-胺基丁酸-CoA連接酶(或4-胺基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)使4-胺基丁酸轉化為4-胺基丁醯基-CoA。可藉由4-胺基丁醯基-CoA氧化還原酶(去胺化)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁醯基-CoA轉胺酶(EC 2.6.1.a)使4-胺基丁醯基-CoA轉化為4-側氧基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-側氧基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為1,4-丁二醇。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
圖9A展示使4-胺基丁酸轉化為BDO之另一例示性BDO路徑之酶。此例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表18中。
簡言之，可藉由4-胺基丁酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-胺基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-胺基丁酸-CoA連接酶(或4-胺基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)使4-胺基丁酸轉化為4-胺基丁醯基-CoA。可藉由4-胺基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使4-胺基丁醯基-CoA轉化為4-胺基丁-1-醇。或者，可藉由4-胺基丁醯基-CoA還原酶(或4-胺基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使4-胺基丁醯基-CoA轉化為4-胺基丁醛，且藉由4-胺基丁-1-醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-胺基丁醛轉化為4-胺基丁-1-醇。可藉由4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(EC 2.6.1.a)使4-胺基丁-1-醇轉化為4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
表18. 由4-胺基丁酸起始之BDO路徑。
圖9B描述使4-胺基丁酸轉化為BDO之例示性BDO路徑。此例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表19中。
簡言之，可藉由4-胺基丁酸激酶(EC 2.7.2.a)使4-胺基丁酸轉化為[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸。可藉由4-胺基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)使[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸轉化為4-胺基丁醛。可藉由4-胺基丁-1-醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-胺基丁醛轉化為4-胺基丁-1-醇。可藉由4-胺基丁-1-醇氧化還原酶(去胺化)(EC 1.4.1.a)或4-胺基丁-1-醇轉胺酶(EC 2.6.1.a)使4-胺基丁-1-醇轉化為4-羥基丁醛。或者，可藉由[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸氧化還原酶(去胺化)(EC 1.4.1.a)或[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸轉胺酶(EC 2.6.1.a)使[(4-胺基丁醇基)氧基]膦酸轉化為[(4-側氧基丁醇基)氧基]膦酸。可藉由4-羥基丁醯基磷酸去氫酶(EC 1.1.1.a)使[(4-側氧基丁醇基)氧基]膦酸轉化為4-羥基丁醯基-磷酸。可藉由4-羥基丁醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)使4-羥基丁醯基-磷酸轉化為4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
表19. 由4-胺基丁酸起始之BDO路徑。
圖9C展示經由乙醯乙酸之例示性路徑。
實例VIII
由α-酮戊二酸起始之例示性BDO路徑
此實例描述由α-酮戊二酸起始之例示性BDO路徑。
圖10描述使α-酮戊二酸轉化為BDO之例示性BDO路徑。此例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表20中。
簡言之，可藉由α-酮戊二酸5-激酶(EC 2.7.2.a)使α-酮戊二酸轉化為α-酮戊二醯基-磷酸。可藉由2,5-二側氧基戊酸半醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)使α-酮戊二醯基-磷酸轉化為2,5-二側氧基戊酸。可藉由2,5-二側氧基戊酸還原酶(EC 1.1.1.a)使2,5-二側氧基戊酸轉化為5-羥基-2-側氧基戊酸。或者，可藉由α-酮戊二酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、α-酮戊二醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或α-酮戊二醯基-CoA連接酶(或α-酮戊二醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)使α-酮戊二酸轉化為α-酮戊二醯基-CoA。可藉由α-酮戊二醯基-CoA還原酶(或2,5-二側氧基戊酸去氫酶)(EC 1.2.1.b)使α-酮戊二醯基-CoA轉化為2,5-二側氧基戊酸。可藉由5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶使2,5-二側氧基戊酸轉化為5-羥基-2-側氧基戊酸。或者，可藉由α-酮戊二醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使α-酮戊二醯基-CoA轉化為5-羥基-2-側氧基戊酸。可藉由5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶(EC 4.1.1.a)使5-羥基-2-側氧基戊酸轉化為4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。可藉由5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)(EC 1.2.1.c)使5-羥基-2-側氧基戊酸轉化為4-羥基丁醯基-CoA。
表20. 由α-酮戊二酸起始之BDO路徑。
實例IX 由麩胺酸起始之例示性BDO路徑
此實例描述由麩胺酸起始之例示性BDO路徑。
圖11描述使麩胺酸轉化為BDO之例示性BDO路徑。此例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表21中。
簡言之，可藉由麩胺酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、麩胺醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或麩胺醯基-CoA連接酶(或麩胺醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)使麩胺酸轉化為麩胺醯基-CoA。或者，可藉由麩胺酸5-激酶(EC 2.7.2.a)使麩胺酸轉化為麩胺酸-5-磷酸。可藉由麩胺酸-5-半醛去氫酶(磷酸化)(EC 1.2.1.d)使麩胺酸-5-磷酸轉化為麩胺酸-5-半醛。可藉由麩胺醯基-CoA還原酶(或麩胺酸-5-半醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使麩胺醯基-CoA轉化為麩胺酸-5-半醛。可藉由麩胺酸-5-半醛還原酶(EC 1.1.1.a)使麩胺酸-5-半醛轉化為2-胺基-5-羥基戊酸。或者，可藉由麩胺醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使麩胺醯基-CoA轉化為2-胺基-5-羥基戊酸。可藉由2胺基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去胺化)(EC 1.4.1.a)或2-胺基-5-羥基戊酸轉胺酶(EC 2.6.1.a)使2-胺基-5-羥基戊酸轉化為5-羥基-2-側氧基戊酸。可藉由5-羥基-2-側氧基戊酸去羧酶(EC 4.1.1.a)使5-羥基-2-側氧基戊酸轉化為4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。或者，可藉由5-羥基-2-側氧基戊酸去氫酶(去羧化)(EC 1.2.1.c)使5-羥基-2-側氧基戊酸轉化為4-羥基丁醯基-CoA。
表21. 由麩胺酸起始之例示性BDO路徑。
實例X 由乙醯乙醯基-CoA起始之例示性BDO
此實例描述由乙醯乙醯基-CoA起始之例示性BDO路徑。
圖12描述使乙醯乙醯基-CoA轉化為BDO之例示性BDO路徑。此例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表22中。
簡言之，可藉由3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.1.1.a)使乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA。可藉由3-羥基丁醯基-CoA脫水酶(EC 4.2.1.a)使3-羥基丁醯基-CoA轉化為巴豆醯基-CoA。可藉由乙烯基乙醯基-CoA Δ-異構酶(EC 5.3.3.3)使巴豆醯基-CoA轉化為乙烯基乙醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA脫水酶(EC 4.2.1.a)使乙烯基乙醯基-CoA轉化為4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為1,4-丁二醇。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
表22. 由乙醯乙醯基-CoA起始之BDO路徑。
實例XI 由高絲胺酸起始之例示性BDO路徑
此實例描述由高絲胺酸起始之例示性BDO路徑。
圖13描述使高絲胺酸轉化為BDO之例示性BDO路徑。此例示性BDO路徑之酶以及編碼此等酶之例示性基因列於表23中。
簡言之，可藉由高絲胺酸去胺酶(EC 4.3.1.a)使高絲胺酸轉化為4-羥基丁-2-烯酸。或者，可藉由高絲胺酸CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、高絲胺酸-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或高絲胺酸-CoA連接酶(或高絲胺酸-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)使高絲胺酸轉化為高絲胺酸-CoA。可藉由高絲胺酸-CoA去胺酶(EC 4.3.1.a)使高絲胺酸-CoA轉化為4-羥基丁-2-烯醯基-CoA。可藉由4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-羥基丁-2-烯醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁-2-烯醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)使4-羥基丁-2-烯酸轉化為4-羥基丁-2-烯醯基-CoA。或者，可藉由4-羥基丁-2-烯酸還原酶(EC 1.3.1.a)使4-羥基丁-2-烯酸轉化為4-羥基丁酸。可藉由4-羥基丁醯基-CoA轉移酶(EC 2.8.3.a)、4-羥基丁醯基-CoA水解酶(EC 3.1.2.a)或4-羥基丁醯基-CoA連接酶(或4-羥基丁醯基-CoA合成酶)(EC 6.2.1.a)使4-羥基丁酸轉化為4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁-2-烯醯基-CoA還原酶(EC 1.3.1.a)使4-羥基丁-2-烯醯基-CoA轉化為4-羥基丁醯基-CoA。可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)(EC 1.1.1.c)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為1,4-丁二醇。或者，可藉由4-羥基丁醯基-CoA還原酶(或4-羥基丁醛去氫酶)(EC 1.2.1.b)使4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛。可藉由1,4-丁二醇去氫酶(EC 1.1.1.a)使4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
表23. 由高絲胺酸起始之BDO路徑。
整個本申請案中參考多個公開案。在本申請案中此等公開案之揭示內容是以全文引用的方式併入本文中，以更充分描述本發明所屬技術之發展狀態。儘管已關於以上提供之實例描述本發明，但應瞭解。在不悖離本發明之精神的情況下可進行各種修改。
圖1為展示製備4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇之生物化學路徑之示意圖。前5個步驟對大腸桿菌為內源性，而其餘部分可異源表現。催化生物合成反應之酶為：(1)琥珀醯基-CoA合成酶；(2)CoA非依賴性琥珀酸半醛去氫酶；(3)α-酮戊二酸去氫酶；(4)麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶；(5)麩胺酸去羧酶；(6)CoA依賴性琥珀酸半醛去氫酶；(7)4-羥基丁酸去氫酶；(8)α-酮戊二酸去羧酶；(9)4-羥基丁醯基CoA：乙醯基-CoA轉移酶；(10)丁酸激酶；(11)磷酸轉丁醯酶；(12)醛去氫酶；(13)醇去氫酶；
圖2為展示大腸桿菌中高絲胺酸生物合成之示意圖；
圖3展示在葡萄糖基本培養基中使用具有表現各種組合之4-HB路徑基因之質體的大腸桿菌株製備4-HB。(a)培養液中之4-HB濃度；(b)培養液中之琥珀酸濃度；(c)在600nm下量測之培養物OD。條帶簇表示24小時、48小時及72小時時間點(若量測)。沿X軸之代碼指示所用之菌株/質體組合。第一指數係指宿主菌株：1，MG1655 lacIQ ；2，MG1655 ΔgabD lacIQ ；3，MG1655 ΔgabD ΔaldA lacIQ 。第二指數係指所用之質體組合：1，pZE13-0004-0035及pZA33-0036；2，pZE13-0004-0035及pZA33-0010n；3，pZE13-0004-0008及pZA33-0036；4，pZE13-0004-0008及pZA33-0010n；5，對照載體pZE13及pZA33；
圖4展示在表現來自結核分枝桿菌之α-酮戊二酸去羧酶之大腸桿菌株中由葡萄糖製備4-HB。菌株1-3含有pZE13-0032及pZA33-0036。菌株4僅表現空載體pZE13及pZA33。宿主菌株如下：1及4，MG1655 lacIQ ；2，MG1655 ΔgabD lacIQ ；3，MG1655 ΔgabD ΔaldA lacIQ 。條帶係指24小時及48小時之濃度；
圖5展示在重組大腸桿菌株中由10mM 4-HB製備BDO。經編號位置與實驗對應，其中MG1655 lacIQ 含有pZA33-0024，其表現來自牙齦卟啉單胞菌之cat2，且以下基因表現於pZE13上：1，無(對照)；2，0002；3，0003；4，0003n；5，0011；6，0013；7，0023；8，0025；9，0008n；10，0035。表6中定義基因編號。對於各位置，條帶分別係指有氧、微氧及缺氧條件。微氧條件係藉由密封培養管但不將其抽空而產生；
圖6展示藉由在補充有4g/L未標記葡萄糖(a、c、e及g)及均一標記13 C-葡萄糖(b、d、f及h)之M9基本培養基中生長的MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036製備之4-HB及BDO之質譜。(a)及(b)，衍生之BDO之質量116特徵片段，含有2個碳原子；(c)及(d)，衍生之BDO之質量177特徵片段，含有1個碳原子；(e)及(f)，衍生之4-HB之質量117特徵片段，含有2個碳原子；(g)及(h)，衍生之4-HB之質量233特徵片段，含有4個碳原子；
圖7為製備γ-丁內酯之生物方法之示意製程流程圖。畫面(a)說明分批進料醱酵及分批分離且畫面(b)說明分批進料醱酵及連續分離；
圖8A及8B展示例示性1,4-丁二醇(BDO)路徑。圖8A展示由琥珀醯基-CoA起始之BDO路徑。圖8B展示由α-酮戊二酸起始之BDO路徑；
圖9A-圖9C展示例示性BDO路徑。圖9A及圖9B展示由4-胺基丁酸起始之路徑。圖9C展示乙醯乙醯基-CoA至4-胺基丁酸之路徑；
圖10展示由α-酮戊二酸起始之例示性BDO路徑；
圖11展示由麩胺酸起始之例示性BDO路徑；
圖12展示由乙醯乙醯基-CoA起始之例示性BDO路徑；及
圖13展示由高絲胺酸起始之例示性BDO路徑。
(無元件符號說明)

Claims (20)

  1. 一種非天然存在之微生物，其包含編碼1,4-丁二醇(BDO)路徑酶之核酸，該微生物包含至少一種以足以製備BDO之量表現之編碼BDO路徑酶的外源核酸，其中該等BDO路徑酶包含(a)3-羥基丁醯基-CoA去氫酶，其將乙醯乙醯基-輔酶A(CoA)轉化為3-羥基丁醯基-CoA；(b)3-羥基丁醯基-CoA脫水酶，其將3-羥基丁醯基-CoA轉化為巴豆醯基-CoA；(c)乙烯基乙醯基-CoA△-異構酶，其將巴豆醯基-CoA轉化為乙烯基乙醯基-CoA；及(d)4-羥基丁醯基-CoA脫水酶，其將乙烯基乙醯基-CoA轉化為4-羥基丁醯基-CoA；且其中該微生物進一步包含至少一種編碼選自下列之酶之外源核酸：(e)4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)，其將4-羥基丁醯基-CoA轉化為1,4-丁二醇；(f)4-羥基丁醯基-CoA還原酶，其將4-羥基丁醯基-CoA轉化為4-羥基丁醛；及(g)1,4-丁二醇去氫酶，其將4-羥基丁醛轉化為1,4-丁二醇。
  2. 如請求項1之非天然存在之微生物，其中該微生物包含二或多種編碼該BDO路徑酶之外源核酸。
  3. 如請求項1之非天然存在之微生物，其中該微生物包含三或多種編碼該BDO路徑酶之外源核酸。
  4. 如請求項1之非天然存在之微生物，其中該微生物包含編碼(a)3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、(b)3-羥基丁醯基-CoA脫水酶、(c)乙烯基乙醯基-CoA△-異構酶及(d)4-羥 基丁醯基-CoA脫水酶之外源核酸。
  5. 如請求項1至4中任一項之非天然存在之微生物，其中該微生物包含(e)4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)。
  6. 如請求項1至4中任一項之非天然存在之微生物，其中該微生物包含(f)4-羥基丁醯基-CoA還原酶及(g)1,4-丁二醇去氫酶。
  7. 如請求項1至4中任一項之非天然存在之微生物，其中該微生物包含(e)4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)、(f)4-羥基丁醯基-CoA還原酶及(g)1,4-丁二醇去氫酶。
  8. 如請求項1至4中任一項之非天然存在之微生物，其中該外源核酸為異源核酸。
  9. 如請求項1至4中任一項之非天然存在之微生物，其中該非天然存在之微生物處於實質上缺氧之培養基中。
  10. 一種製備BDO之方法，其包含在一定條件下且歷時足以製備BDO之時段培養如請求項1至9中任一項之非天然存在之微生物。
  11. 如請求項10之方法，其中該微生物包含二或多種編碼該BDO路徑酶之外源核酸。
  12. 如請求項10之方法，其中該微生物包含三或多種編碼該BDO路徑酶之外源核酸。
  13. 如請求項10之方法，其中該微生物包含編碼(a)3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、(b)3-羥基丁醯基-CoA脫水酶、(c)乙烯基乙醯基-CoA△-異構酶及(d)4-羥基丁醯基-CoA脫水酶之外源核酸。
  14. 如請求項10之方法，其中該微生物包含(e)4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)。
  15. 如請求項10之方法，其中該微生物包含(f)4-羥基丁醯基-CoA還原酶及(g)1,4-丁二醇去氫酶。
  16. 如請求項10之方法，其中該微生物包含(e)4-羥基丁醯基-CoA還原酶(醇形成)、(f)4-羥基丁醯基-CoA還原酶及(g)1,4-丁二醇去氫酶。
  17. 如請求項10之方法，其中該非天然存在之微生物處於實質上缺氧之培養基中。
  18. 如請求項10之方法，其中該至少一種外源核酸為異源核酸。
  19. 如請求項10之方法，其中該BDO係與微生物培養物中之其他組份分離。
  20. 如請求項19之方法，其中該BDO係藉由蒸餾分離。
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