DE3878564T2 - Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 1,3-propandiol aus glycerin. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glycerin in Wachstumsmedien geeigneter Bakterienstämme unter Zusatz eines Cosubstrates als H-Donator und Abtrennung des gebildeten Propandiols.
• Verfahren zur Herstellung von 1,3-Propandio bzw. Trimethylenglykol (TMG) aus Glycerin sind bekannt. Bei ihrer Durchführung sind im wesentlichen folgende Gesichtspunkte zu bedenken: Bakterienstämme, die zur Umwandlung von Glycerin in 1,3-Propandiol in der Läge sind, finden sich beispielsweise in den Gattungen Klebsiella (vgl. J. Bacteriol., 1982, 149, 413-419), Citrobacter (vgl. J. Bacteriol., 1944, 39, 409-415), Clostridium (vgl. Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53, 639-643), Ilyobacter (vgl. Arch. Microbiol., 1984, 140, 139-146) und Lactobacillus (vgl. Sytem. Appl. Microbiol., 1984, 5, 169-178). Dabei kann es nicht ausgeschlossen werden, daß weitere obligate oder fakultative Gärer ebenfalls 1,3-Propandiol als Fermentationsprodukt bilden. Innerhalb der Gattung Citrobacter ist dem Fachmann insbesondere C. freundii als Produzent von 1,3-Propandiol bekannt. Mehrere Stämme (z.B. DSM 30039, 30040 und 30041) stehen zur Verfügung.
• Je nach verwendetem Bakterienstamm können mineralische Medien mit Glycerin oder Komplexmedien mit Glycerin für das Wachstum und die damit verbundene Produktion von 1,3-Propandiol eingesetzt werden. Auch die Milieubedingungen, wie pH und Temperatur, sind von dem eingesetzten Stamm abhängig. In jedem Fall wird anaeroben Wachstumsbedingungen der Vorzug gegeben, weil die Enzyme für die Transformation von Glycerin in 1,3-Propandiol nur unter anaeroben Bedingungen gebildet werden. Auch muß eine ausreichende Versorgung der Bakterien mit Kobaltionen gewährleistet sein, da das beteiligte Enzym Glycerin-Dehydratase Coenzym B&sub1;&sub2; enthält (vgl. Arch. Biochem. Biophys., 1962, 97,538-543).
• Eine 1,3-Propandiol- Produktion kann mit den erwähnten Bakterienstämmen chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Bei der chargenweisen anaeroben Fermentation von Glycerin wurden, je nach Gattung, unterschiedliche Ausbeuten an 1,3-Propandiol erzielt: 78 % bei Lactobacillus buchneri, 61 % bei Clostridium butylicum, 40 % bei Ilyobacter polytropus und 50 % bei Citrobacter freundii Bei der Gattung Lactobacillus muß berücksichtigt werden, daß nicht Glycerin allein fermentiert werden kann, sondern nur ein Gemisch aus Glycerin und Glukose (2:1). Je nach Bakteriengattung treten bei der Fermentation von Glycerin unterschiedliche Spektren an Nebenprodukten auf, hauptsächlich Acetat, Butyrat, Lactat, Formiat, Succinat, Ethanol, Butanol und Hydroxypropionat (im Falle von Ilyobacter polytropus).
• Während es sich bei den oben erwähnten Fermentationen um chargenweise arbeitende Kulturen handelt, wurden 1987 erstmals Ergebnisse einer kontinuierlichen Fermentation von Glycerin zur Produktion von 1,3-Propandiol veröffentlicht (vgl. Appl. Environ. Microbiol., 1987, Bd. 53, 639-643). Die Fermentation wurde mit Clostridium butylicum B 593, einem obligaten Gärer durchgeführt. Dem chemisch definierten Medium wurde 3,8 % Glycerin zugesetzt. Davon wurden 97 % durch die Bakterien umgesetzt. Notwendig war auch eine Zugabe von 0,2 % Hefeextrakt zum Medium. In der Casphase befand sich sauerstofffreies Kohlendioxid, die Verweilzeit der Bakterien im Reaktor betrug 10 Stunden und die Temperatur 35ºC. Die kontinuierliche Fermentation gab folgendes Produktspektrum, analysiert mit HPLC und GC: 61 % 1,3-Propandiol, 6,6 % Acetat, 1,6 % Butyrat, 0,9 % Lactat, 0,6 % Butanol und 0,6 % Ethanol.
• Aufgrund obiger Ausführungen scheint eine 1,3-Propandiol-Synthese ohne Nebenprodukte mit Bakterien nicht möglich zu sein, da ein Teil des Glycerins oxidiert werden muß, um Energie zu gewinnen, während die Reduktion von Glycerin zu 1,3-Propandiol zur Eliminierung anfallenden Wasserstoffs dient. Bei einer Absenkung des pH-Wertes von 6,5 auf 4,9 wird das Wachstum der Bakterien und die Produktion von 1,3-Propandiol reduziert. Als Zwischenprodukt bei der Synthese von 1,3-Propandiol tritt 3-Hydroxypropionaldehyd auf, dessen Produktion ebenfalls Ziel einiger Fermentationsversuche war (vgl. Appl. Environ. Microbiol., 1983, Bd. 46, No. 1: 62-67). Bei der anaeroben Fermentation von Glycerin mit Klebsiella pneumoniae wurde durch Zugabe von Semicarbazidhydrochlorid die Geschwindigkeit der enzymatischen Umsetzung verschoben. Die Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd lief wesentlich schneller als die nachfolgende Reduktion zu 1,3-Propandiol ab und führte somit zu einer Akkumulation von 3-Hydroxypropionaldehyd. Bei Glycerin-Lösungen von 30 g/l wurde eine Ausbeute an 3-Hydroxypropionaldehyd von 13,1 g/l erzielt.
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das eingangs bezeichnete Verfahren so zu verbessern, daß es eine einfache, wirtschaftliche, schnelle und kontinuierliche Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glycerin in hoher Ausbeute und unter weitgehendem Ausschluß umweltschädlicher Nebenprodukte ermöglicht.
• Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß a) aus dem gewahlten Bakterienstamm unter Füttern mit Glycerin und, sofern erforderlich, unter weitgehendem Ausschluß des H-Donators in einer Wachstumsstufe so lange Biomasse gebildet wird, bis sich eine stationäre Wachstumsphase eingestellt hat, und b) zur vermehrten Bildung von 1,3-Propandiol zu der entstandenen ruhenden Zellsuspension weiteres Glycerin sowie ein auf die Biomasse abgestimmter H-Donator gegeben werden.
• Das Wesen des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht also darin, daß zunächst in einer Verfahrensstufe a) so lange Biomasse gebildet wird, bis sich eine stationäre Wachstumsphase bzw. eine ruhende Zellsuspension eingestellt hat. Dabei ist es für die Mehrzahl der im Rahmen der Erfindung einsetzbaren Bakterienstämme nötig, in dieser Verfahrensstufe a) einen H-Donator weitestgehend auszuschließen. Dies gilt insbesondere für die Stämme von Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridium autobutylicum und Clostridium butylicum. Es gibt jedoch eine Anzahl von Bakterienstämmen, die in der Wachstumsphase in Gegenwart eines H-Donators wachsen und diesen gegebenenfalls auch nötig haben, wie z.B. Lactobacillus brevis und Lactobacillus buchneri. Die Mehrzahl der erfindungsgemäß insbesondere in Frage kommenden Bakterienstämme wird in ihrem Wachstum jedoch durch die Gegenwart eines H-Donators gestört. In diesen Fällen empfiehlt es sich, diesen weitestgehend auszuschließen. Dieser Gesichtspunkt ist auch bei der qualitativen Bewertung der glycerinhaltigen Ausgangsmaterialien zu bedenken. Wäre nämlich beispielsweise in dem Glycerinausgangsmaterial bereits ein merklicher Zuckeranteil vorhanden, wie Glukose, dann könnte dieser Anteil für eine Störung der Verfahrensstufe a) verantwortlich sein. Ansonsten unterliegt das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf das Glycerinausgangsmaterial keinen wesentlichen Beschränkungen. So kann es sich dabei beispielsweise handeln um Glycerin-Spaltwasser aus der Hochdruckspaltung, um Glycerinwasser aus der Seifenspaltung oder um Glycerinwasser aus der Methanolyse von Fetten oder Ölen, wie von Fischöl, Cocosöl oder Palmkernöl.
• Bezüglich der Wahl des geeigneten Bakterienstammes gelten die vorstehenden Erläuterungen. Vertreter der Gattung Citrobacter werden mit besonderem Vorteil eingesetzt, wie Citrobacter freundii. Als besonders geeignet haben sich insbesondere die Stämme DSM 30039, 30040 und 30047 erwiesen.
• Bei der Verfahrensstufe a) geht man z.B. zweckmäßigerweise wie folgt vor, wobei bei dieser Beschreibung auf Citrobacter freundii DSM 30040 eingegangen werden soll, diese Aufführungen aber entsprechend auch für andere Bakterienstämme gelten sollen. Eine mineralische Lösung wird bereitet, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Als Besonderheit enthält sie aber ein Kobaltsalz, wie insbesondere Kobaltchlorid, in erhöhter Konzentration (250-550 ug CoCl&sub2;/l) und ein Ammoniumsalz, wie insbesondere Ammoniumsulfat, als wachstumslimitierende N-Quelle. Je nach der gewünschten Konzentration an Biomasse kann die Ammoniumsulfatkonzentration etwa 0,4 bis 1,5 g/l betragen. Nach Zusatz von Glycerin (z.B. etwa 0,3 mol/l) und einer Vorkultur vom Stamm DSM 30040 erfolgt Inkubation bei etwa 37ºC unter anaeroben Bedingungen. Die wachsende Kultur mündet dann nach etwa 12 bis 20 Stunden in die für die Verfahrensstufe b) erforderliche stationäre Phase ein.
• Die Konzentration des Glycerins bei der Verfahrensstufe a) ist nicht kritisch. Sie könnte in einem weiten Bereich liegen, z.B. bei etwa 0,001 bis 1 mol/l, obwohl dieser Bereich auch verlassen werden kann. Der Bereich von etwa 0,1 bis 0,4 mol/l wird bevorzugt, insbesondere etwa 0,3 mol/l.
• Für die Durchführung der Verfahrensstufe a) ist es nicht kritisch, ob sie anaerob oder aerob geführt wird. Vorzugsweise erfolgt eine anaerobe Verfahrensführung, damit die für die gewünschte Umwandlung von Glycerin in 1,3-Propandiol besonders geeigneten Enzyme optimal gebildet werden. Hat die Verfahrensstufe a) die gewünschte Menge an Biomasse entstehen lassen, dann werden Maßnahmen zur Beendigung des Wachstums ergriffen. Bevorzugt erfolgt das dadurch, daß das Wachstumsende durch die Zugabe einer vorgegebenen Menge an Phosphat- oder Stickstoffquelle gesteuert wird. Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen.
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist sowohl in einem komplexen Medium als auch in einem mineralischen Medium durchführbar. Dem mineralischem Medium ist der Vorzug zu geben, weil es preisgünstiger, einfacher handhabbar und bei Verfahrensabschluß leichter zu entsorgen ist. Unter einem mineralischen Medium versteht man ein Medium, das nur anorganische Salze und zusätzlich Glycerin und eventuell Cystein (als Reduktionsmittel) enthält. Das komplexe Medium unterscheidet sich hiervon durch den Gehalt von vorzugsweise etwa 1 % Hefeextrakt.
• Die nach der Verfahrensstufe a) entstandene Biomasse kann unmittelbar der Verfahrensstufe b) zugeführt werden. Es bietet sich auch an, die Biomasse durch Zentrifugieren aufzukonzentrieren oder zu immobilisieren. Die Immobilisierung kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, so beispielsweise durch Calciumalginat, Karrageenan oder Polyurethane. Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung mit dem leicht verfügbaren, handelsüblichen Calciumalginat (Protanal-LF-20/60). Die immobilisierte Form der Biomasse kann beispielsweise in eine Säule eingefüllt werden, der die zu behandelnde Glycerinlösung kontinuierlich aufgegeben wird. Dies führt zu dem besonderen Vorteil der kontinuierlichen Verfahrensführung, wobei die Biomasse wochenlang ohne Beeinträchtigung ihrer Leistungsfähigkeit zur Gewinnung von 1,3-Propandiol aus Glycerin eingesetzt werden kann. Es wurden bereits Versuche gefahren, bei denen die Biomasse mehr als 42 Tage unbeeinträchtigt aktiv war.
• Für die Verfahrensstufe b) ist zur Fütterung der Mikroorganismen nicht Glycerin wesentlich, vielmehr ist die Kombination Glycerin/H-Donator heranzuziehen. Bei der Wahl des H-Donators unterliegt der Fachmann keinen wesentlichen Beschränkungen. Vielmehr wird er diesen H-Donator anhand seiner Fachkenntnisse und im Hinblick auf den jeweils gewählten Bakterienstamm auswählen. Im allgemeinen sind als H-Donator Di- und Monosaccharide geeignet, insbesondere Fruktose und Glukose. In Verbindung mit Citrobacter freundii als Bakterienstamm hat sich insbesondere Glukose als besonders vorteilhaft erwiesen.
• Um in der Verfahrensstufe b) keine frühzeitige Inhibierung zu erhalten, ist eine pH-Wertkontrolle zweckmäßig. Der pH-Wert sollte möglichst in dem Bereich von etwa 5,5 bis 8,5 liegen. Der Bereich von etwa 6,5 bis 7,5 und insbesondere der Wert von etwa 7 sind bevorzugt. Hier liegen optimale Biotransformationsbedingungen für die Bildung von 1,3-Propandiol aus Glycerin vor.
• Zur weiteren Optimierung des Verfahrens stimmt man den H-Donator und das Glycerin quantitativ ab. Die genauen Zahlenwerte hierfür hängen von der Art des H-Donators sowie auch von der Art des gewählten Bakterienstammes ab. Eine allgemeine Richtlinie läßt sich hier nicht angeben. Für den vorzugsweise eingesetzten Bakterienstamm Citrobacter freundii und einen H-Donator in Form von Glukose besteht zwischen der Glukose sowie dem Glycerin ein Molverhältnis von vorzugsweise etwa 1 : 7 bis 1 : 8. Das Molverhältnis zwischen Glucose und Glycerin könnte im allgemeinen im Hinblick auf praktische Vorteile etwa 1 : 1 bis 1 : 25, insbesondere 1 : 5 bis 1 : 10 betragen.
• Auch in der Verfahrensstufe b) wird vorzugsweise in mineralischem Medium gearbeitet. Um das gestellte Verfahrenziel optimal zu erreichen, spielt die Konzentration des Glycerins in dem Medium der Verfahrensstufe b) eine gewisse Rolle. Zu hohe Glycerinkonzentrationen bedingen eine Inhibierung der beteiligten Enzymsysteme. Zu niedrige Glycerinkonzentrationen führen zu unerwünscht hohen Aufarbeitungskosten. Als optimal für das während der Verfahrensstufe b) behandelte Medium kann eine etwa 0,2 bis 1,5-molare Glycerinlösung, insbesondere etwa 1-molare Glycerinlösung angegeben werden.
• Die Erfindung läßt sich weiteren an sich bekannten Modifikationen unterziehen, ohne damit von deren Wesen abzuweichen. Beispielhaft könnte hier folgendes angeführt werden:
• Verfahrensstufe a): Veränderung der mineralischen Nährlösung hinsichtlich der Konzentrationen der einzelnen Komponenten; Konzentration des Glycerins, wobei auch die herkunftbedingten Verunreinigungen in Art und Konzentration sehr verschieden sein können; Art der Durchmischung der Kulturlösung durch Rühren, Pumpen oder Begasen; Herstellung anaerober Bedingungen durch Reduktionsmittel und inerte Gase.
• Verfahrensstufe b): Konzentration der Biomasse; Betriebs-pH und -Temperatur; Art des Nachfütterns von Glycerin; Art und Konzentration des H-Donators.
• Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt gegenüber den bisher bekannten Verfahren dieser Art vielfältige Vorteile: Durch die 2-stufige Verfahrensführung, d. h. Wachstumsphase in einer ersten Verfahrensstufe mit Überführung in eine stationäre Phase und anschließende Biotransformationsphase, läßt sich die Ausbeute an 1,3-Propandiol auf über 90 % steigern. Wenn die in der ersten Verfahrensstufe entstandene Biomasse immobilisiert und in eine Säule gegeben wird, dann ist damit eine langzeitige kontinuierliche Verfahrensführung möglich, beispielsweise von mehr als 40 Tagen. Das Glycerin wird speziell in 1,3-Propandiol umgesetzt, und es fallen Nebenprodukte in unbedenklich geringer Menge an. In Einzelfällen kann es sich dabei um Acetat und Lactat handeln, die einfach zu entfernen und für die Umwelt völlig unbedenklich sind. Darüber hinaus läßt sich ein preiswertes Nährmedium in der Verfahrensstufe a) einsetzen. In beiden Stufen lassen sich in dem eingesetzten Medium vergleichsweise hohe Konzentrationen an Glycerin wähien. Hierbei ist man nicht auf eine besondere Reinheit des Ausgangsglycerins angewiesen.
• Vielmehr lassen sich auch technische Glycerine heranziehen, sofern darin keine die Mikroorganismen störenden Nebenprodukte vorliegen (technische Glycerine bzw. Rohglycerine). Es kann durchaus möglich sein, daß das fragliche technische Glycerin für die Verfahrensstufe a) nicht geeignet ist, so daß hier reinere Glycerinausgangsmaterialien heranzuziehen wären, während das unreinere Produkt in der zweiten Verfahrensstufe verwendet werden kann. Das bedeutet auch einen weitergehenden Vorteil, da für die Ausbildung der stationären Phase bzw. der für die zweite Verfahrensstufe nötigen Biomasse eine verhältnismäßig kleine Menge an Glycerin im Vergleich zu der zweiten Verfahrensstufe notwendig ist. Dieses ermöglicht eine flexiblere Verfahrensführung.
• Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Beispiels noch näher erläutert werden.
Beispiel
• Der Verlauf der Verfahrensstufe a) ist in Abb. 1 dargestellt. Citrobacter freundii wird in folgendem Mineralmedium unter Ammoniumlimitierung wachsen gelassen: KH&sub2;PO&sub4;, 6g/l;K&sub2;HPO&sub4; 3H&sub2;O, 14 g/l; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,04 g/l; MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 0,2 g/l; CaCl&sub2;, 0,1 g/l; Cystein HCl, 0,1 g/l; Spurenelementlösung (1 l enthält 5 g EDTA (Dinatriumsalz), 0,3g H&sub3;BO&sub4; 4H&sub2;O, 0,03 g MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 0,02 g CoCl&sub2; 6H&sub2;O, 2 g FeSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,1 g ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,03 g NaMoO&sub4; 2H&sub2;O, 0,02 g NiCl&sub2; 6H&sub2;O, und 0,01 g CuCl&sub2; 2H&sub2;O) (vgl. Arch. Microbiol., 1966, 55, 245-256), 1 ml/l; CoCl&sub2;, 550 ug/l, Glycerin, 880 mmol/l. Nach dem Animpfen (20 ml Vorkultur/1,2 l Hauptkultur) wurde bei 37ºC und einem konstant bei 7,5 gehaltenen pH-Wert inkubiert. Die Kultur geht nach 20 Stunden in die stationäre Phase über; in dieser Phase wird Glycerin weiterhin zu 1,3-Propandiol umgesetzt.
• Die Umsetzung von Glycerin zu 1,3-Propandiol in Gegenwart von Glucose als H-Donator durch die Zellsuspension von C. freundii gemäß Verfahrensstufe b) ist in Abb. 2 dargestellt. Hier wurden Zellen in Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 in einer Konzentration von 3 mg Trockengewicht/ml suspendiert; nach Zugabe von 240 mmol/l Glycerin und 42 mmol/l Glucose wurde in Abwesenheit von Sauerstoff (N&sub2;-Atmosphäre) bei 37ºC inkubiert. Der pH-Wert wurde bei 7,5 mittels Titration mit 2 N KOH gehalten. Aus 211 mmol Glycerin wurden 191 mmol 1,3-Propandiol gebildet; das sind 91 % auf molarer Basis und 75 % auf Gewichtsbasis (maximal möglicher Wert: 83 %).
• Nähere Erläuterungen zu den Abbildungen 1 bis 4:
• Abb. 1: Sie stellt den Verlauf der TMG-Produktion aus Glycerin in ammoniumlimitierter statischer Kultur in Gegenwart 11fach erhöhter Co²&spplus;-Konzentration dar. Die TMG-Produktion und das Wachstum wurden in einer 1,2-1 Kultur in Mineralmedium mit 0,04 % Ammoniumsulfat, 880 mM Glycerin und 550 ug Co²&spplus;/l verfolgt, wobei der pH konstant auf 7,5 gehalten wurde. Neben TMG ( ) wurden Acetat ( ), Ethanol ( ), Laktat ( ) und Pyruvat ( ) gebildet. Optische Dichte ( ), Glycerin (Δ).
• Abb. 2: Sie stellt den Verlauf der TMG-Produktion durch Zellsuspensionen unter Konstanthaltung des pH-Wertes mittels KOH-Titration dar. Die TMG-Produktion aus Glycerin in Gegenwart von 42 mM Glucose durch verdünnte Zellsuspensionen (3 mg/ml) in KPO&sub4;-Puffer, pH 7,5 wurde verfolgt. Die Konstanthaltung des pH-Wertes erfolgte mittels Titration mit 2 N KOH.
• Glycerin ( ) und TMG ( ) in Gegenwart von KOH.
• Abb. 3: Vergleich der TMG-Produktion aus Glycerin durch ruhende Zellen bei verschiedenen konstanten pH-Werten. Die Versuche wurden in 4 ml Zellsuspensionen (Protein-Konzentration: 1,8 mg/ml) bei konstanten pH-Werten von 6,6 (A), 7,0 (B), 7,9 (C) und 8,0 (D) durchgeführt. Die Konstanthaltung des pH-Wertes erfolgte durch Titration mit 0,6 N NaOH. Verwendete Puffer: 248 mM KPO&sub4; (A-C) und 100 mM Tris/HCl (D).
• Glycerin ( ), TMG ( ), Acetat ( ), Ethanol ( ).
• Abb. 4: Vergleich der TMG-Produktion aus Glycerin durch ruhende Zellen in Abwesenheit (A) oder Gegenwart (B) von Glucose.
• Der Verlauf der TMG-Produktion aus Glycerin durch Zellsuspensionen (Proteinkonzentration: 2,4 mg/ml) in KPO&sub4;-Puffer wurde bei einem konstanten pH von 7,5 verfolgt. Mischung B enthielt zusätzlich 84 mM Glucose.
• Glycerin ( ), TMG ( ), Glucose ( ).

Claims (15)

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 1,3-Propandiol aus Glycerin in Wachstumsmedien geeigneter Bakterienstämme unter Zusatz eines Cosubstrates in Form eines H-Donators und Abtrennung des gebildeten 1,3-Propandiols, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine Biomasse durch Kultivieren des gewählten Bakterienstammes in der Wachstumsphase in einem Glycerin enthaltenden Wachstumsmedium, jedoch unter weitgehendem Ausschluß von jeglichem H-Donator, gebildet wird,

b) die Bakterienzellen in eine stationäre Phase überführt werden und die Biotransformation bewirkt wird, indem man weiteres Glycerin sowie einen auf die Biomasse abgestimmten H-Donator zufügt, was von einer die Hauptstufe seiner Herstellung darstellenden verstärkten Bildung von 1,3- Propandiol begleitet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe b) ein Zucker als H-Donator zugefügt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm ein Stamm der Gattung Citrobacter ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm ein Stamm von Citrobacter freundii ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein H- Donator zu der Wachstumsphase gegeben wird, wenn der gewählte Bakterienstamm in Gegenwart eines H-Donators wächst oder dessen bedarf.

6. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe a) anaerob abläuft.

7. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe b) anaerob abläuft.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichent, daß in den Stufen a) und b) ein pH-Wert von etwa 6,5 bis 8,5 aufrechterhalten wird.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen a) und b) in einem mineralischen Medium durchgeführt werden.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Überführung der wachsenden Zellen in die stationäre Phase durch Zugabe einer vorherbestimmten Menge einer Phosphat- oder Stickstoffquelle erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Ammoniumsalz als Stickstoffquelle oder ein Kaliumdihydrogenphosphat als Phosphatquelle verwendet wird.

12. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin anfangs in Stufe b) in einer molaren Konzentration von etwa 0,2 bis 1,5 vorliegt.

13. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin anfangs in Stufe a) in einer molaren Konzentration von etwa 0,1 bis 0,4 vorliegt.

14. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die in Stufe a) erhaltene Biomasse vor der Stufe b) immobilisiert wird.

15. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung mit Calciumalginat erfolgt.