DE3212814C2

DE3212814C2 -

Info

Publication number: DE3212814C2
Application number: DE19823212814
Authority: DE
Inventors: Helmgard Gauhl; Hans Dr.Rer.Nat. 8132 Tutzing De Seidel
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1982-04-05
Filing date: 1982-04-05
Publication date: 1990-01-11
Also published as: DE3212814A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Glucose-Isomerase gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Glucose-Isomerase ist ein Enzym, das die Umwandlung von Glucose in Fructose katalysiert. Fructose hat als Zuckeraustauschstoff insbesondere für Diabetiker Bedeu tung. Um Fructose in genügender Menge zur Verfügung zu stellen, ist es notwendig, sie aus Glucose, die reich lich vorhanden ist, umzuwandeln. Dazu ist es nötig, Glucose-Isomerase in ausreichender Menge und mit ausreichend hoher Aktivität zu gewinnen.

Ferner kann man mit Glucose-Isomerase Xylose, die der Baustein der Hemicellulosen ist, in Xylulose umwandeln, die von Alkoholhefen verwertet werden kann. Auf diesem Wege können hydrolysierte Hemicellulosen mit Hilfe von Glucose-Isomerase der Alkoholfermentation zugeführt werden.

Verfahren zur Gewinnung von Glucose-Isomerase aus verschiedenen Mikroorganismen sind bekannt. Um die Synthese der Glucose-Isomerase zu induzieren, wird dem Nährmedium Xylose zugesetzt. Die bisher bekannten Verfahren, wie z. B. das in der DE-OS 24 00 323 offenbarte, benötigen im Nährmedium viel Xylose, einen relativ teuren Zucker.

Außerdem liefern die bisher bekannten Verfahren nur relativ geringe Enzym-Aktivitäten. Die Fermentations zeiten sind bei allen als Quelle für das gewünschte Enzym bekannten Mikroorganismen außerordentlich lang. Bei einer Fermentationsdauer, die abhängig von den einzelnen Mikroorganismen 25 bis 120 Stunden betragen kann, ist es nicht einmal möglich, einen Ansatz pro Tag durchzuführen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zu schaffen, das mit Hilfe eines schnell wachsenden Mikroorganismus in kurzer Zeit Glucose- Isomerase in hoher Aktivität liefert bei geringem Xyloseverbrauch.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Gewinnung von Glucose-Isomerase durch Züchtung eines Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium und Isolierung des Enzyms aus den Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Bacillus caldovelox DSM 411 verwendet.

Es hat sich gezeigt, daß Bacillus caldovelox DSM 411, ein sporenbildender, thermophiler Mikroorganismus, verschiedene Eigenschaften besitzt, die seine Verwendung zur Gewinnung von Glucose-Isomerase besonders begünstigen. Bacillus caldovelox DSM 411 ist ein besonders schnell wachsender Mikroorganismus, dessen Züchtung problemfrei ist. Schon 3 bis 3½ Stunden nach der Beimpfung eines Nährmediums kann das Enzym aus den Zellen des Mikroorganismus gewonnen werden. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, pro Tag mehrere Ansätze vorzunehmen. Aus diesem Grunde sind die Ausbeuten an Enzym mit Bacillus caldovelox DSM 411 um ein vielfaches höher als mit den bisher bekannten, langsam wachsenden Mikroorganismen.

Das Enzym wird nur intracellulär gefunden, im Nährmedium ist es nicht nachweisbar. Dadurch wird die Aufarbeitung sehr vereinfacht gegenüber Verfahren, bei denen das Enzym intracellulär und extracellulär auftritt.

Ferner liefert Bacillus caldovelox DSM 411 Glucose- Isomerase mit besonders hoher Aktivität. Ein weiterer Vorteil ist die Gewinnung der Glucose-Isomerase als "thermophiles" Enzym, d. h. ein Enzym, das auch noch bei höheren Temperaturen stabil ist.

Die Züchtung erfolgt auf einem geeigneten Nährmedium. Als besonders geeignet erwies sich ein Medium mit der folgenden Zusammensetzung: 0,5 bis 1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 bis 1 Gew.-% Ammoniumchlorid, 0,01 bis 1 Gew.-% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,01 bis 0,5 Gew.-% Magnesium sulfat, 0,001 bis 0,01 Gew.-% Mangansulfat, 1,5 bis 3 Gew.-% Agar. Der pH-Wert dieses Minimalmediums liegt im allgemeinen zwischen 5 und 7. Der Hefeextrakt wird am günstigsten in einer Menge von 0,6 bis 0,8 Gew.-% zugesetzt. Bei Mengen über 1% sinkt die Ausbeute an Glucose-Isomerase ebenso wie bei geringeren Mengen als 0,5%.

Bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge mäßen Verfahrens wird die Synthese der Glucose- Isomerase bei Bacillus caldovelox induziert durch Zugabe von Xylose, einem C₅-Zucker, zum Medium. Dabei erhält man die besten Ergebnisse, wenn man den Bacillus-caldo velox-Stamm vorher an Xylose adaptiert hat. Dazu wird der Stamm auf xylosehaltigem Nährmedium vorgezogen. Es ist zweckmäßig, dazu dem Nährmedium 0,3 bis 2%, vorzugsweise 0,5 bis 1,5% Xylose zuzusetzen. Die besten Ergebnisse werden dann erzielt, wenn mehrstufig mit von Stufe zu Stufe zunehmendem Xylosegehalt vorkultiviert wird, insbesondere wenn in einer ersten Kultur mit etwa 0,3 bis 0,7 Gew./Vol.-% Xylose, in einer zweiten Kultur mit erhöhtem, etwa 0,7 bis 1,2 Gew./Vol.-% betragenden Xylosegehalt vorkultiviert und auf ein xylosefreies Nährmedium überimpft wird. Sobald aber die Log-Phase erreicht ist, was nach 1 bis 3 Stunden der Fall ist, wird dem Medium bei dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Xylose zudosiert, um die Synthese der Glucose-Isomerase zu induzieren.

Bevorzugt ist eine Xylose-Konzentration im Fermenter während der Induktionsphase von 0,05 bis 0,5%. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 0,1 bis 0,3%. Diese Xylose-Konzentration wird während der gesamten Induktionsphase, die etwa 1 bis 2 Stunden dauert, aufrechterhalten. Besonders bevorzugt erfolgt eine gleichmäßige Zudosierung, da bei zu hoher Xylosekonzen tration die Aktivität der Mikroorganismen absinkt, während bei zu geringer Xylosekonzentration der Mikroorganismus versport und die Enzymbildung stagniert.

Da es sich bei Bacillus caldovelox um einen thermophilen Mikroorganismus handelt, ist es zweckmäßig, im Fermenter eine Temperatur zwischen 50 und 80°C einzuhalten. Besonders bevorzugt ist der Bereich zwischen 55 und 65°C. Temperaturen unter 50°C und über 80°C erwiesen sich als weniger günstig.

Die Gewinnung der Biomasse kann nach bekannten Methoden erfolgen. Bevorzugt wird ein Verfahren angewendet, bei dem die Biomasse möglichst sofort auf Raumtemperatur gebracht und vom Medium abzentrifugiert wird. Die Feuchtmasse kann dann eingefroren und später verarbeitet oder aber gleich aufgeschlossen werden. Der Aufschluß erfolgt vorzugsweise mit Lysozym oder mit Ultraschall, jedoch sind auch andere bekannte Aufschlußmethoden geeignet.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung von Glucose-Isomerase geschaffen, das sich durch sehr kurze Kultivierungszeit und sehr hohe Enzymaktivität- Ausbeute auszeichnet. Mit Hilfe dieses Verfahrens besteht die Möglichkeit, mehrere Ansätze pro Tag zu fahren; außerdem kann der Energie- und Überwachungsauf wand auf etwa 10 bis 20% des bei anderen Verfahren erforderlichen Aufwandes gesenkt werden. Es wird somit ein Verfahren zur Verfügung gestellt, das hohe Ausbeuten an Glucose-Isomerase liefert bei geringem Aufwand.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Bacillus caldovelox DSM 411 wird auf Schrägagar mit folgender Zusammensetzung gehalten: Medium J: (alle Prozentangaben sind auf Gewicht bezogen)

0,75% Hefe-Extrakt,
0,3% NH₄Cl,
0,1% K₂HPO₄,
0,05% MgSO₄ × 7 H₂O,
0,005% MnSO₄ × 7 H₂O,
1% Xylose,
2% Agar
pH 7.

Die Bebrütung findet bei 60°C statt.

Zur Vorkultivierung werden 100 ml Medium J mit einem Xylosegehalt von 0,5% vom Schrägröhrchen beimpft, 3 bis 4 Stunden bei 60°C geschüttelt (Log-Phase) und nochmals zu 5% in 100 ml Medium mit 1% Xylose über führt und kultiviert. Aus der zweiten Vorkultur (Log- Phase) wird in den Fermenter zu 5% überimpft.

Bei der Hauptkultivierung wird Medium J ohne weitere C-Quelle außer Hefeextrakt verwendet und nach Beimpfung ca. 1 Stunde fermentiert, bis der Organismus die Log-Phase erreicht hat. Dann werden etwa 0,2% Xylose gleichmäßig zu 0,1% pro Stunde zudosiert, wobei die Aktivität sofort ansteigt. 3 bis 3,5 Stunden nach Beimpfung, wenn die Kultur sich bereits in der stationären Phase befindet, wird die Ernte vorgenommen. Es werden ca. 9 g/l Feuchtmasse mit 600 U/l Kulturlösung erhalten.

Beispiel 2

Das Verfahren nach Beispiel 1 läßt sich auch durchführen, wenn man Vorkultur auf glycerinhaltigem Nährmedium züchtet.

Dazu werden wie in Beispiel 1 100 ml Medium J aus dem xylosehaltigen Schrägröhrchen einer zweiten Vorkulti vierung beimpft. Im Unterschied zu Beispiel 1 enthält das Nährmedium jedoch an Stelle von Xylose 0,5% Glycerin. Es wird dann bei 60°C 3 bis 4 Stunden geschüttelt, bis die Log-Phase erreicht ist und dann zu 5% in 100 ml Medium überführt, das keine Xylose, aber 1% Glycerin enthält, und kultiviert. Aus dieser weiteren Vorkultur (Log-Phase) wird in den Fermenter zu 5% überimpft. Das Nährmedium im Fermenter enthält 0,2% Glycerin. Es wird im Fermenter bis zum völligen Verbrauch des Glycerins vorgezüchtet, danach wird mit Xylose die Synthese von Glucose-Isomerase induziert.

Bei dieser Verfahrensvariante werden größere Biomassen erhalten und zwar etwa 13 g Feuchtmasse pro Liter Kulturlösung. Außerdem können mit diesem Verfahren höhere Aktivitäten bis zu 750 U/l erreicht werden. An Stelle von Glycerin kann auch Glucose verwendet werden.

Beispiel 3

Die Aktivität der Glucose-Isomerase wurde auf folgende Weise bestimmt:
10 ml Kulturlösung wurden zentrifugiert, einmal mit 0,05 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,5, gewaschen und im gleichen Volumen in Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden mit Ultraschall oder Lysozym aufgeschlossen.

Inkubation: 275 ml nicht aufgeschlossene Zellsuspension in Puffer,
0,50 ml MgSO₄, 0,1 mol/l,
0,50 ml CoCl₂, 0,05 mol/l,
0,75 ml Phosphatpuffer, 0,2 mol/l, pH 8,
0,10 ml Lysozym 1 g/l.

Es wurde 10 Minuten bei 80°C vorinkubiert. Dann wurden 0,50 ml 1 mol/l-Glucoselösung zugegeben. Die Probenahme erfolgt nach 5, 10 und 15 Minuten. Der Enzym-Stop wurde 1 : 1 mit 0,5 mol/l HClO₄ durchgeführt. Zur Erfassung der Aktivität wurde die Carbazol-Methode für Ketohexosen nach Dische und Borenfreund (J. Biolog. Chemistry 192, 583 (1951)) verwendet:

0,5 ml gestoppte und zentrifugierte Inkubationslösung,
10 ml H₂SO₄/H₂O 70/30 vv,
0,20 ml Cysteinhydrochlorid,
0,20 ml Carbazol 0,12% in Äthanol.

Nach 90 Minuten Reaktionszeit erfolgt die Messung der Färbung bei 564 nm. Die Menge der enzymatisch aus Glucose gebildeten Fructose wurde mit Hilfe einer unter Versuchsbedingungen mit Fructose erstellten Eichkurve ermittelt.

Beispiel 4

Es wurden verschiedene bekannte Mikroorganismen, die Glucose-Isomerase produzieren, mit den jeweils bekannten Verfahren gezüchtet. Dabei wurden die folgen den Werte ermittelt:

Aus diesen Werten ist ersichtlich, daß die Fermentations zeit bei Bacillus caldovelox umd ein Mehrfaches geringer ist als bei den bisher bekannten Verfahren.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Glucose-Isomerase, durch Züchtung eines Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium und Isolierung des Enzyms aus den Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismus Bacillus caldovelox DSM 411 züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Ge genwart von Xylose als Induktionsmittel züchtet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Anwachsphase keine Xylose zugibt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Xylose während der Log-Phase zugibt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Log-Phase 0,05 bis 0,5% Xylose zugibt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Log-Phase 0,1 bis 0,3% Xylose zugibt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorkultur auf einem Nährmedium, das Glycerin enthält, gezogen wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorkultur auf einem Nährmedium, das Xylose enthält, gezogen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei 55 bis 65°C züchtet.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß der Zellen in Gegenwart von Lysozym oder mit Ultraschall erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in mindestens 2 Kulturen mit zunehmendem Xylose-Gehalt vorkultiviert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß in der ersten Vorkultur 0,3 bis 0,7% und in der zweiten Vorkultur 0,7 bis 1,2% Xylose eingesetzt werden.