DE3527649A1 - Mikroorganismus einer neuen art der gattung streptomyces - Google Patents
Mikroorganismus einer neuen art der gattung streptomycesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft allgemein Mikroorganismen der
Gattung Streptomyces und Chitinase. Die Erfindung betrifft insbesondere einen Mikroorganismus einer neuen
Art der Gattung Streptomyces und ein Verfahren zur Herstellung von Chitinase daraus.
Im allgemeinen bezieht sich die Bezeichnung "chitinolytisches
Enzym" auf ein zusammengesetztes Enzymsystem, das eine Vielzahl von Enzymkomponenten, zum Beispiel
Chitinase und Chitobiase, enthält. Ihre Funktion ist es, Chitin gleichmäßig zu N-Acetylglucosamin oder Oligosacchariden
zu zersetzen.
Chitin ist eines der Polysaccharide die zu Aminozuckern gehören. Es ist in umfangreichem Maß in niedrigen Tieren,
insbesondere Arthropoden enthalten. Die jährlich biosynthetisch hergestellte Menge an Chitin ist so umfangreich,
daß sie als mehrere Billionen Tonnen zu schätzen ist. Chitin stellt daher einen der natürlichen, nicht
verwerteten Rohstoffe dar, der im Rampenlicht der letzten Jahre gestanden ist.
Chitin ist wenig reaktiv und stabiler als Cellulose, so daß die Zersetzung von Chitin mit einem Enzym, zum Beispiel
Chitinase, zu einer niedermolekularen Substanz vorgeschlagen werden kann.
Chitinase ist beispielsweise in den Verdauungsflüssigkeiten
von Schnecken enthalten. Weiterhin ist bekannt, daß es von fadenförmigen Pilzen oder Bakterien hergestellt
wird (zum Beispiel "Encyclopaedia Chimica" Band 2, Seite 745, Kyöritsu Shuppan K.K., Tokyo).
Gemäß einem Katalog von Handelsprodukten wird Chitinase von Mikroorganismenquellen aus Streptömyces griseus und
Serratia marcescens erhalten. Neuerdings wurde auch über Chitinase berichtet, die von Mikroorganismen der Gattung
Aeromonas abgeleitet ist.
Es wurden nun Untersuchungen nach Mikroorganismen angestellt, die Chitinase mit hoher Fähigkeit zur Zersetzung
von pulverförmigem Chitin und Verzuckerung zu N-Acetylglucosamin erzeugen
könnten. Es wurde eine weite Vielzahl von Bodenproben untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß
der Stamm Streptömyces sp. WAK-83 in einem Kulturmedium
Chitinase erzeugt, welche eine hohe chitinzersetzende Aktivität gekuppelt mit der Fähigkeit zur Erzeugung von
N-Acetylglucosamin, besitzt.
Somit gehört die erfindungsgemäße chitinaseerzeugende
neue Art der Gattung Streptömyces zu der Art, die den Stamm WAK-83 der Gattung Streptömyces einschließt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von
Chitinase geht man so vor, daß man einen Mikroorganismus einer Art, die den Stamm WAK-83 der Gattung Streptömyces
einschließt, kultiviert bzw. züchtet.
Die erfindungsgemäß erhaltene Chitinase hat eine hohe
chitinzersetzende Aktivität und eine hohe Fähigkeit zur Erzeugung von N-Acetylglucosamin.
Aus diesem Grund ist es möglich, mit dieser Chitinase in vorteilhafter Weise Chitin zu zersetzen.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
35
35
Figur T: eine Fotografie der Spore des erfindungsgemäßen
Stammes Streptomyces sp. WAK-83, aufgenommen durch ein
Elektronenmikroskop vom Transmissionstyp;
Figur 2: eine optische Mikrofotografie des durch den
erfindungsgemäßen Stamm erzeugten Pycnidiums;
Figur 3: eine optische Mikrofotografie der Sporenkette des erfindungsgemäßen Stamms; und die
Figuren 4, 5 und 6: Diagramme, die jeweils den optimalen
pH, die optimale Temperatur und den die Stabilität beibehaltenden Temperaturbereich eines Enzyms, das aus einem
Mikroorganismus gemäß der Erfindung hergestellt worden ist, zeigen.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind Bakterien
der Art, zu der der Stamm WAK-83 der Gattung Streptomyces gehört.
Ein typisches Beispiel der Stämme dieser Art ist der
Stamm Streptomyces sp. WAK-83. Dieser Stamm wurde von der Erde in Sukumoji, Koda-cho, Takata-gun, Hiroshimaken,
Japan im Dezember 1983 isoliert und am 13. Juli 1984 bei dem Fermentation Research Institute, Agency
of Industrial Science and Technologie, Ministry of International Trade and Industry of Japan, 1-3, Higashi
1 chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305,
Japan unter der Aufnahmenummer FERM P-7714 hinterlegt.
Der Stamm trägt nun die Aufnahmenummer bzw. Hinterlegungsnummer
FERM BP-826 unter dem Budapester Vertrag. Die Hinterlegungsstelle erfüllt alle Voraussetzungen
der Regeln des Budapester Vertrags. Sie erfüllt insbesondere die Erfordernisse der Regel 11.3 des Budapester
Vertrags, der zufolge der Organismus der Öffentlichkeit
bei Patenterteilung verfügbar ist und die Erfordernisse
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der Regel 9 des Budapester Vertrags, welche die Aufrechterhaltung
des Organismus über einen Zeitraum von mindestens 30 Jahren nach dem Hinterlegungstag vorschreibt.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms WAK-83
sind wie folgt. Die Farbnamen wurden entsprechend der Farbnamenliste (Shinju-do), herausgegeben von Japan
Color Research Institute, zugeordnet.
I. Morphologische Eigenschaften
Der Stamm WAK-83 dehnt Lufthyphen auf verschiedenen Medien aus. Die Hyphen sind verzweigt. Es
wird kein Sporangium gebildet. Die Sporen sind nicht beweglich. Die reifen Sporen auf dem Luftmycelium
sind gelb, und die Sporenkette ist geradlinig oder leicht gekrümmt (Rectus Flexibilis).
Die Sporen haben eine zylindrische Gestalt (2-3 μΐη
χ 0,8 - 1,2 μΐη) und 20 oder mehrere Sporen bilden
eine Kette. Die Oberfläche der Sporen ist glatt.
Ein auffallendes Charakteristikum dieses Stamms
ist die Bildung von Pycnidium nach Inkubierung bei 280C über 14 Tage auf dem Bennett-Medium.
II. Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien 5 1. Saccharosenitrat—Agar
Gutes Wachstum mit erheblichen Sporen. Die Oberfläche der Kolonien ist gelb und die Rückseite
rostrot.
2. Glucose-Asparagin-Agar
Üppiges Wachstum mit üppigen Sporen. Die Ober
fläche der Kolonien ist fleischfarben und die Rückseite lachsrosa.
3. Glycerin-Asparagin-Agar
Mäßiges Wachstum mit mäßiger Anzahl von Sporen. Die Kolonien breiten sich nicht sehr weit aus.
Die Oberfläche der Kolonien ist hellgelb und die Rückseite ist lachsrosa.
Α. Stärke -/anorganische Salze-Agar
Gutes Wachstum mit erheblichen Sporen. Die Oberfläche der Kolonien ist hellgelb und die
Rückseite ist grau-rosa .
5. Tyrosin-Agar
5. Tyrosin-Agar
Dürftiges Wachstum mit dürftigen Sporen und mäßiges Luftmycelium. Die Kolonien sind nicht
faltig. Die Oberfläche der Kolonien ist weiß bis hellgelb, und die Rückseite ist mattrötlieh/gelblich
orange. Kein lösliches Pigment.
6. Nährmittel-Agar
Weißes Luftmycelium breitet sich auf dem gelben Substratmycelium mit dürftigen Sporen aus. Die
Rückseite ist gelblich orange. 7. Hefe-/Malzextrakt-Agar
Der Stamm wächst im faltigen Zustand und wird umgekehrt gekrümmt. Die Oberfläche der Kolonien
ist hautfarben bis hellgelb und die Rückseite mattrötlich /gelblich orange.
8. Hafermehl-Agar
Der Stamm wächst nicht im gefalteten Zustand. Die Oberfläche der Kolonien ist weiß bis hellgelb
und die Rückseite hellgelb. 9. Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar
Der Stamm wächst im gefalteten Zustand mit
einem dürftigen Luftmycelium und keinen Sporen.
Sowohl die Oberfläche als auch die Rückseite der Kolonien ist hel]orange-braun.
III. Physiologische Eigenschaften
1. Temperaturerfordernisse
1. Temperaturerfordernisse
Wachstum wird zwischen 20 und 370C erhalten,
wobei die optimale Temperatur 280C beträgt. Das
Wachstum bei 37°C ist schlecht.
2. Gelatineverflüssigung: positiv
3. Stärkehydrolyse: positiv
4. Wachstum in Milch: kein Wachstum
5. Produktion von Melanoidpigment: negativ
IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen Die beim Inkubieren in Pridham-Gottlieb-Agar—Medium
erhaltenen Ergebnisse sind wie folgt.
Kohlenstoffquelle Wachstum*
L - Ar ab ino se +
D-Xylose +
D-Glucose +
D-Fructose +
Saccharose +
i-Inosit + L-Rhamnose
Raffinose
Raffinose
D-Mannit + ohne Zusatz
* + = Wachstum
- = kein Wachstum
V. Identifizierung
Angesichts der oben angegebenen Charakteristiken nimmt man an, daß der Stamm WAK-83 zu Streptomyces
gehört. Die Sporenkette ist gerade bis leicht gekrümmt. Das Luftmycelium ist weiß oder gelb. Die
Oberfläche der Sporen ist glatt und es wird kein lösliches Pigment erzeugt. Nach Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1975) kann dieser Stamm als Stamm der gelben Reihe (46 Arten)
identifiziert werden.
5 Jedoch bildet keiner der Stämme der 46 Arten Pycnidium,
dessen Bildung eines der herausragenden Merkmale des Stamms WAK-83 ist. Daher unterscheidet sich
der Stamm WAK-83 von den Stämmen der 46 Arten. Wenn man
unter bekannten Stämmen, wie sie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1975), ISP-Stämme
von Shirling, E. B. und Gottlieb beschrieben werden und Stämmen die in Waksman's The Actinomycetes
beschrieben werden, Stämme sucht die Pycnidium bilden, dann ist der Stamm Streptomyces sindenensis (ISP 5255)
der einzige Stamm, der Pycnidium bildet. Jedoch bildet Streptomyces sindenensis ein rosa Pycnidium, während
der Stamm WAK-83 ein gelbes Pycnidium bildet. Diese Stämme sind daher vollständig verschiedene Stämme.
Es kann somit festgestellt werden, daß kein bekannter
Stamm gefunden wurde, der mit dem Stamm WAK-83 identisch ist. Der Stamm ist daher als ein Stamm einer neuen
Mikroorganismenart anzusehen, und er wurde als Streptomyces
sp. WAK-83 bezeichnet.
Es ist möglich, von diesem Stamm einen Mutantenstamm zu erhalten, der in hohem Ausmaß dazu imstande ist, Chitinase
zu erzeugen. Dies kann nach herkömmlichen Mutationsverfahren für Mikroorganismen geschehen, wie zum Beispiel
physikalische Behandlung mit UV-Strahlen, Röntgenstrahlen oder ^/-Strahlen oder durch chemische Behandlung mit
Reagenzien, wie Nitrosoguanidin. Es ist auch möglich, chitinaseerzeugende Mikroorganismen durch Genmanipulierungsverfahren
herzustellen, beispielsweise indem man das Gen DNA des obigen Stammes, das die genetische Information
zur Produktion von Chitinase trägt, in einen geeigneten Vektor einführt, der seinerseits durch Transformierung
in einen Mikroorganismus einer anderen Gattung als Streptomyces transferiert wird, oder indem man die
Gen DNA in einen Mikroorganismus einer anderen Gattung durch Zellfusion aufnehmen läßt. Mikroorganismen, die
5 aus dem obigen Stamm durch Mutation erhalten worden sind, sollen ebenfalls unter die vorliegende Erfindung fallen.
Der erfindungsgemäße Stamm kann durch herkömmliche
Methoden zur Züchtung von Actinomyceten gezüchtet werden. Eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen, wie Glucose,
Stärke, Fructose, Glycerin und Mannit können entweder einzeln oder in Kombination in ein Kulturmedium eingebracht
werden. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Sojabohnenmehl,
Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und Kasaminosäure (Produkt von Difco Laboratories), entweder
einzeln oder in Kombination.
Gewünschtenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid,
Nitrate, Kaliumcarbonat, Kaliumchlorid, Kobaltchlorid,
Eisensulfat und Spurenmengen von Schwermetallen zugesetzt werden. Einige organische Substanzen, die das
Wachstum der Mikroorganismen zur Förderung der Produktion von Chitinase anregen, können gleichfalls zugegeben
werden, wenn es gewünscht wird.
Obgleich der erfindungsgemäße Stamm auch in einem festen
Kulturmedium gezüchtet werden kann, wird ein flüssiges Medium bevorzugt, wie es bei den üblichen Methoden zur
Herstellung von Enzymen der Fall ist. Das Züchten erfolgt unter aeroben Bedinungen, im allgemeinen bei einer
Temperatur von 2O0C bis 300C, vorzugsweise um 280C.
Die Produktion der Chitinase kann beispielsweise durch
Tankfermentierung erfolgen. In diesem Falle wird die Chitinase erzeugt und in der Kulturflüssigkeit nach
2 bis 4tägiger Fermentierung angesammelt. Wenn die Produktionsausbeute der Chitinase in der Kulturflüssigkeit
ein Maximum erreicht, dann wird die Fermentierung abgebrochen und die gewünschte Chitinase wird aus der
Kultur isoliert und wie folgt gereinigt.
Die resultierende Kultur wird zentrifugiert oder mit
einem Filterhilfsmittel filtriert, wodurch eine rohe Enzymlösung erhalten wird. Die Flüssigkeit, die durch
Zentrifugieren oder Filtrieren der von der Fermentation herrührenden Kultur erhalten wird, kann als rohe Enzymlösung
ohne eine weitere Behandlung angewendet werden oder sie kann zur Bewirkung einer Sedimentierung mit
einem organischen Lösungsmittel wie Aceton und Ethanol konzentriert werden. Sie kann auch zur Bewirkung einer
Ausfällung mit einem Aussalzmittel, wie Ammoniumsulfat, behandelt werden, wodurch ein rohes Enzymmittel erhalten
wird. Das auf diese Weise erhaltene rohe Enzymmittel kann nach bekannten Methoden gereinigt und kristallisiert
werden, wodurch ein gereinigtes Enzym erhalten wird.
Das auf die obige Weise erhaltene rohe Enzymmittel hat die folgenden Eigenschaften.
1) Aktivität und Substratspezifität
Dieses Enzym wirkt auf pulverförmiges Chitin, Chitinflocken, kolloidales Chitin oder Ethylenglycolch.itin
und zersetzt es unter Bildung von N-Acetylglucosamin
(siehe die unten stehende Tabelle I).
2) Optimaler pH und Stabilität
Der optimale pH bei 370C ist 5,5 bis 6,0. Dieses
Enzym ist im pH-Bereich von 3,5 bis 8,0 stabil.
3) Optimale Temperatur und Stabilität
Die optimale Temperatur für die Wirkung dieses Enzyms
war 370C bei einem pH von 5,5 in einer 3stündigen
Reaktion. Bei Temperaturen von 3O0C oder niedriger war das Enzym über einen Zeitraum von 24 Stunden oder
langer stabil.
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(4) Reinigung
Verunreinigungen in dem rohen Enzymmittel können durch Adsorptionschromatografie auf einer Chitinsäule,
durch herkömmliche Ionenaustauscherchromatografie oder durch Gelfiltration mit einem Biogel
entfernt werden, wodurch ein hochgereinigtes Enzym erhalten werden kann.
Die erfindungsgemäß hergestellte Chitinase hat das vorteilhafte
Merkmal, daß sie auf Chitinpulver wirksamer als herkömmliche Enzyme einwirkt. So erzeugt zum Beispiel
von Sigma Chemical Co. erhältliche handelsübliche Chitinase reduzierenden Zucker allmählich in 48 Reaktionsstunden,
während das erfindungsgemäß erhaltene Enzym dazu imstande ist, eine gleiche Menge von reduzierendem
Zucker in 3 Reaktionsstunden herzustellen.
Die Tabelle I zeigt die Aktivität der erfindungsgemäß
erhaltenen Chitinase auf verschiedene Substrate. Die Aktivität wurde für Ethylenglycolchitin im wesentlichen
auf der Basis der Verfahrensweise von Tsukamoto et al (Agriculture of Biological Chemistry, Band 48, Seite
(1984) ) gemessen. Für pulverförmiges Chitin und Chitingcl wurden
die Substrate verwendet, die jeweils 1% pulverförmiges Chitin oder Chitingel enthielten. Die enzymatische
Aktivität wurde nach der folgenden Methode gemessen. Es wird die Erhöhung des N-Acetylglucosamins gemessen,
die durch eine Enzymreaktion bewirkt wird (zum Beispiel Morgan-Elson-Verfahren).
Zu 1 ml 1%igem pulverförmigem Chitin (von Nakarai Kagaku,
Japan) als Substrat, wurden 1 ml einer Enzymlösung geeigneter Konzentration und sodann 3 ml 0,025M Phosphatacetatpufferlösung
(pH 5,5) gegeben, um eine Reaktion bei 37°C über 3 Stunden zu bewirken. Die Enzymmenge, die
unter diesen Bedingungen 1 μΐηοΐ/min N-Acetylglucosamin
erzeugt, ist als eine Einheit definiert.
Erfindungsgemäß erhaltene Chitinase mE/mg Protein |
|
Ethylenglycolchitin (Nakarai Kagaku) |
720 |
Pulverförmiges Chitin (Nakarai Kagaku) |
4 |
Chitingel* | 42 |
♦Hergestellt nach der Verfahrensweise von Hirano et al
("Biopolymers" Band 15, Seite 1685 (1976))
Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäß
erhaltene Chitinase Ethylenglycolchitin und Chitingel wirksam zersetzt. Die Erfindung wird in den
Beispielen erläutert.
" Der Stamm Streptomyces sp. WAK-83 wurde bei 28°C 4 Tage
auf ein Bennett Schrägmedium inkubiert, zu dem 2,5 ml steriles Wasser gegeben worden war, um eine Spcrensuspension
herzustellen. 2,5 ml Suspension wurden jeweils in Kulturmedien der folgenden Zusammensetzung inokuliert
bzw. in 100 ml und 500 ml Kolben gegeben, und es wurde eine 3tägige Kultivierung bei 280C unter Schütteln
durchgeführt.
Bestandteile
Hefeextrakt 3,0 g/Liter
Polypepton 3,0 g/Liter
Glucose 2,0 g/Liter
Kolloidales Chitin 4,0 g/Liter
Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um den Rückstand zu entfernen, wodurch eine rohe Enzymlösung
erhalten wurde, die eine enzymatische Aktivität von 1,12 mE/ml auf pulverförmiges Chitin zeigte.
Referenzbeispiel Kolloidales Chitin wurde wie folgt hergestellt.
100 ml destilliertes Wasser, das 4 g pulverförmiges Chitin enthielt, und 100 ml konzentrierte Schwefelsäure
wurden gesondert· mit Eis 3 Stunden lang gekühlt. Nach 3 Stunden wurden die zwei Lösungen langsam miteinander
vermischt. Das Gemisch wurde durch einen Trichter, der mit Glaswolle filtriert war, gefüllt. Das Filtrat wurde
zu 180 ml destilliertem Wasser gegeben und bei 3000 Upm zentrifugiert. Zum Rückstand wurde destilliertes Wasser
5 gegeben, und die Zentrifugierung wurde wieder aufgenommen. Diese Verfahrensweise wurde wiederholt/bis der
pH-Wert des Waschwassers 6 betrug.
Claims (6)
1. Mikroorganismus einer neuen Art der Gattung Streptomyces,
der dazu imstande ist, Chitinase zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet , daß die neue Art \
den Stamm WAK-83 der Gattung Streptomyces einschließt.
5
2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus der
Stamm Streptomyces WAK-8 3 oder ein davon abgeleiteter Mikroorganismus ist.
3. Verfahren zur Herstellung von Chitinase, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus
einer Art, die den Stamm WAK-83 der Gattung Streptomyces einschließt, züchtet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß der Mi]<xoorganismus der Stamm Streptomyces
WAK-83 oder ein davon abgeleiteter Mikroorganismus ist.
BAD ORIGINAL
5. Verfahren zur Herstellung von Chitinase, dadurch gekennzeichnet , daß man den Stamm WAK-83
der Gattung Streptomyces oder einen davon abgeleiteten Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, die Chitinase
auf einem Medium das dazu imstande ist, den genannten Streptomyces oder den davon abgeleiteten Mikroorganismus,
wachsen zu lassen, züchtet und daß man die genannte Chitinase aus dem Züchtungsprodukt sammelt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß der Mikroorganismus der Stamm
WAK-8 3 der Gattung Streptomyces ist.
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