JPS6140790A - キチナ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトマイセス属の新種によるキチナー
ゼの生産に関する。

一般に、セルラーゼはキチ′プ・−ゼおよびキトビアー
ゼなどと呼ばれる多様な酵素成分からなる複合酵素系を
指しており、その作用としてはキチンを分解してこれを
Ｎ−？セチルグルコサミンあるいはオリゴ糖にまで糖化
することが挙げられる。

羊チンは、下等動物、特に節足動物、に多く含まれる、
アミノ糖に属する多糖類の一種である。

その生合成される量は莫大なものであって、年間数十億
トンと推定されており、そのようなところからキチンは
未利用の天然資源として最近脚光を浴びているものの−
うである。

キナ２４反痣性に乏しく、セルロースより更に安定であ
るので、これを酵素、すなわちキチナーゼ、で分解して
低分子化することが考えられる。

友丘五呈 キチナーゼはカタツムリの消化液等の中に含まれている
とと６に、糸状菌や細菌によっても生成するこ□とが知
られている（たとえば、「化学大辞典」、第２巻、第７
４５頁（共立出版（株））。

微生物によるものとしては、キチ”ン市販品のカタログ
によれば、ストレプトマイセス・グリセウスＪ３よびセ
ラチア・マルセセン“スから得られており、また最近の
発表によれば、アエロモナス底の菌からも得られるよう
である。

１豆鬼且１ 本発明者らは粉末キチンの分解力がすぐれかつＮ−アセ
チルグルコサミンへの糖化能力の強いキチナーゼ生産菌
を広く土壌中から検索した結果、ストレプトマイセス・
５ｐ−ＷＡＫ−８３株が強力なキチン分解活性とＮ−７
セチルグルコサミン生成能を有するキチナーゼを培地中
に産生蓄積する事実を見出して、本発明を完成するに到
った。

従って、本発明によるキチナーゼの製造法は、ストレプ
トマイセス属のＷＡＫ−８３株が属する種の微生物を培
養すること、を特徴とするものである。

１里 本発明によって提供されるキチナーゼは、キチン分解活
性およびＮ−７セチルグルコサミン生成能が大きい。

従って、このキチナーゼによればキチンを有利に分解す
ることができる。

発明の詳細な説明 本発明にｌ与づる微生物は、ストレプトマイセス届のＷ
ＡＫ−８３株が属する種のものである。

この種（ＳｐｅＣｉ　ｅｓ）の微生物の代表例はストレ
プトマイセス る。の菌は、１９８３年１２月に広島県高田郡甲田町株
地の土壌から分離されたものであって、工業技術院微生
物工業技術研究所に、昭和５９年７月１３日に「微工研
菌寄第７７１４号（ＦＥＲＭｐ−７７１４）として受託
されており、またその菌学的性質は以下の通りである。

なお、以下において色の記載は、日本色彩研究所の色名
帖（新寿堂）によったものである。

■．形態学的性質 本菌株は各種培地上で気菌糸を形成し、菌糸は分枝する
．胞子のうは形成しない。胞子に運動性はない。気菌糸
上に成熟した胞子の色は黄色で、その胞子鎖は真直ぐか
らやや曲っている（　ＲｅｃｔｕｓＦｌｃｘｉｂｉｌｉ
ｓに属する）。胞子は円筒形（２〜３μ×０．８〜１．
２μ）で胞子鎖中に２０個ないしそれ以上形成される。

胞子の表面は平滑である。

また、本菌株の著しい特徴は、ペンネット培地／２８℃
／１４日間培養でピクニデイウムを作ることである。

■．各種培地上の性状 １　しょ糖・硝酸塩寒天培地 生育：よく胞子形成する。コロニー表面はクリーム色を
呈する．１面は錆赤色。

２　グルコース・アスパラギン寒天培地生育：非常によ
く胞子形成する。コロニー表面は肉色、裏面は鮮色。

３　グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：胞子形成
するが、コロニーはあまり広がらない７淡黄色コロニー
、裏面は鮮 色。

４　殿粉・無機塩寒天培地 生育：よく胞子形成する。コロニー表面は淡黄色、裏面
は灰桃色。

５　チロシン・寒天培地 生育：胞子形成は少ないが、気菌糸は形成する。コロニ
ーはシワ状にはならない。

表面は白色から淡黄色、裏面は鈍赤黄 橙色である。

可溶性色素：なし ６　栄養寒天培地 生育：黄色の基生菌糸上に白色の気菌糸が広がる。胞子
形成はあまり良くない。裏 面は黄橙色。

７　イースト・麦芽寒天培地 生育＝７シワ状に生育し、反り返った状態となる。コロ
ニー表面は肌色から淡黄色、 裏面は鈍赤黄橙色である。

８、ｔ−１−ミール・寒天培地 生育：シワ状には生育しない。コロニー表面は白色から
淡黄色、裏面は淡黄色であ る。

９　ペプトン・イースト鉄培地 生育：シワ状に生育するが気菌糸をほとんど形成せず、
胞子形成もしない。コロニ −表面は淡橙褐色で裏面も同色である。

■、生理的性質 １−生育温度範囲：２０〜３７℃。最適生育温度は２８
℃。３７℃ではあまり くない ２　ゼラチンの液化：陽性 ３　殿粉の加水分解：陽性 ４　ミルクに対する作用：生育しない ５　メラニン様色素の生成：陽性 ■、炭素源の資化性 プリドハム・ゴツトリーブ寒天培地に培養して調べた結
果は、下記のとおりである。

生　　育１ Ｌ−７ラビノース　　　＋ Ｄ−キシロース　　＋ Ｄ−グリコース　　＋ Ｄ−フラクトース　　　＋ シュークロース　　　士 Ｉ−イノシトール　　　＋ Ｌ−ラムノース　　− ラフィノース　　− Ｄ−マンニトール　　　＋ 烈添加　　　　　　　　− ＊　−ト生育する、−生育しない Ｖ、同定 以上の諸性質からＷＡＫ−８３株はストレア１−ミセス
属に属するものと考えられ、胞子鎖が直線状からややカ
ーブし、気菌糸が白色しない黄色で、胞子表面が平滑で
可溶性色素を生産しなｌ、）ことから、バーシーズφマ
ニュアル・オプφデイターミネイティブ・バクテリオＯ
ジー第８版（１９７５年）の中から検索すると、イエロ
シリーズの４６菌種が該当する。しかし、４６菌種の中
には本菌種の著しい特徴の一つであるピクニデイウムを
形成するものはなく、従って本国ｔよ４６菌種とは異な
る。ビクニデイウムを形成する菌種を、バーシーズ・マ
ニュアル・オブ・デイターミネイティブ・バクイリオロ
ジー第８版（１９７５年）、シ１？−リング及びボラト
リ−１のＩＳＰ菌株、ならびにワックスマン著［ザ、ア
クチノマイセテス」に記載の既知菌株の中から検索する
と、ストレプトマイセス・シンデネンシス（ＩＳＰ５２
５５）の１株のみがあげられる。しかし、ストレプトマ
イセス・シンデネンシスはピンク色のビクニディウムを
形成するがＷＡＫ−８３株は淡黄色のビクニディウムを
作ることから、両者は全　−く異なる菌種である。

これらの結果から、本菌株に該当する既知菌株は存在せ
ず、本菌株は新菌種であると認められ、本発明者らはこ
れをストレプトマイセス・Ｓｐ。

Ｎｏ、ＷＡＫ−８３と命名した。

微生物の培養 本菌株の培養には、通常の放線菌の培養方法が用いられ
る。培養基の炭素源としては種々のものが用いられるが
、例えばブドウ糖、殿粉、果糖、グリセリン、マンニト
ール、などを単独でまたは組み合せて用いることができ
る。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、硝酸ナトリウム、大豆粉、酵母エキス、ペプトン
、肉エキス、カザミノ酸などが単独でまたは組み合せて
用いられる。

その他必要に応じて無機塩、例えば食塩、硝酸塩、ＩＡ
酸カルシウム、塩化カリウム、塩化コバルト、硫酸鉄な
ど、ならびに微量の重金属を添加することができる。更
に、菌の発育を助けて１チナーピの生産を促進する有機
物質を適宜に添加することができる。

培養方法としては、固体培地上での培養も可能であるが
、一般酵素生産の方法と同様に液体培養を用いることが
好ましい。培養は好気的電性下で行われ、培養温度は一
般に２０〜３０℃であって、２８℃付近が好ましい。

キチナーゼの生産は、たとえばタンク培養によって行な
うことができる。その場合は、２〜４日間培養を行うと
キチナーゼが培養液中に生産蓄積される。１ｇ！ｉ液中
の生産量が最大に達した時点で培養を停止し、培養物か
ら目的のキチナーゼを単離精製する。得られた培養液を
遠心分離かるか、ｉ濾過助剤を加えて濾過すれば、粗酵
素液が得られる。

得られた培養液を遠心分離、濾過等に付して菌体を分離
して得られる培養液は、そのまま粗酵素液と−して使用
することもできるが、濾液を濃縮してアセトン、エタノ
ールなどの有機溶剤を加えて沈降させるか、硫安などの
塩析剤で沈澱させるなどして、強力な活性を有する粗酵
素剤を得ることができる。このようにして得られる粗酵
素剤は、公知の方法によって１１製結晶化して精製酸素
とす６　ることができる。

％罷１ 上記のようにして得られる粗酵素剤は、下記の性質を有
する。

（１）作用および基質特異性 粉末キチン、キチンフレーク、コロイダルチキン、エチ
レングリコールキチン等に作用し、これを分解させて、
Ｎ−アセチルグルコサミンを生成する。後記第１表をも
参照されたい。

（２）至適ｐＨおよび安定性 ３７℃における至適ｐＨは５．５〜６．０である。また
、この酵素はｐＨ３，５〜８．０の範囲で安定である。

（３）最適作用温度および安定性 ｐＨ５，５／３時間反応で至適作用温度（よ３７℃であ
った。また、３０℃以下では２４時間以上安定であった
。

（４）精製 粗酵素剤中の夾雑物質はキチンカラムによる吸着クロマ
トグラフィー、および通常のイオン交換り０マドグラフ
イー、バイオゲルによるゲル罐過等により除くことがで
き、それによって高度に精製された酵素剤を得ることが
できる。

本発明により生産されるキチナーゼは、暫チン粉末に対
して従来の酵素より一層よく作用する特徴がある。例え
ば市販されているシグマ社製キチナーゼは４８時間の反
応でゆっくり還元糖を生成するが、本酵素では３時間の
反応で同等量の還元糖を生成することができる。

第１表は本発明により得られるキチナーゼの種々の基質
に対する活性を示すものである。なお、活性の測定は、
エチレングリコールキチンにお０てはツカモト等の方法
（アグリカルチャ・オプ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第４８巻、第９３１ページ、１９８４年）に準じて
行い、粉末キチンおよびキチンゲルは１％入れたものを
基質とした。酵素活性は、次に示すような酵素反応によ
るＮ−アセチルグルコサミンの増加を測定する方法（例
えば、モルガン・エルラン法など）で測定した。１％粉
末キチン（牛丼化学製）１ｍを基質とし、これに適当濃
度の酵素液１１ｄを加え、更に０．０２５Ｍリン酸−酢
酸緩衝液ｐＨ５，５を３１ｄ加え、３７℃で３時間反応
させた。この条件で１分間に１μｌ１ａｔのＮ−アセチ
ルグルコサミンを生成する酊素量を１単位とした。

第１表 ＊平野らの方法により調製した（「バイオボリマーズ」
第１５巻、第１６８５ページ、１９７６年） 表から明らかなように、本発明により生成するキチナー
ゼはエチレングリコールキチンとキチングルをよく分解
する。

実験例 実施例 ストレプトマイセス・５ｐ−ＷＡＫ−８３株をベンネツ
Ｉ・培地スラント上で２８℃で４日間培養し、２．５ｄ
の殺菌水をスラントに加えて胞子懸濁液を作る。その２
．５ｄを１００ｄ、１５００ｄ容のフラスコの次の組成
の培地に接種し、温度２８℃で３日間往復振諭培養した
。

培−地組成 酵母エキス　　　　　３．０９７リツトルボリベブトン
　　　　３．０ＳＦ／リツトルグルコース　　　　　２
．０９７リツトルコロイダルキチン　　４．Ｏ５ｉ＋／
リットルこの培養液を遠心分離して残渣を除去して得ら
れる粗酵素液は、キチン粉末に対して１．１２■Ｕ／ｊ
Ｉｉ！の酵素活性を示した。

１亙コ コロイダルキチンの調製法は、下記の通りである。

１０ＯＩＩ＆の蒸留水に４ｇの粉末キチンを加えたもの
と、別に濃硫酸１００−とを用意してそれぞれ水中で３
時１５１あらかじめ冷やしておく。３時間後、両方をゆ
っくり混ぜ合わせる。ロー斗の中にグラスウールをつめ
たもので濾過する。濾過、したものを１８０ｍの蒸留水
に加える。そののち、３０００　ｒｌ）■で遠心し、残
漬に蒸留水を加、えて再び遠心する。この操作を繰り返
し、洗浄液がｐＨ６になるまで繰り返す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本国ストレプトマイセス、ｓｐ。 ＷＡＫ−８３の胞子の透過型電子顕微鏡写真、第２図は
本国によって作られるビクニデイウムの光学顕微鏡写真
、第３図は本国の胞子鎖の光学顕微鏡写真である、第４
図は生産された酵素の至適ｐＨ，第５図は作用至適温度
、第６図１．１安定温度範囲をそれぞれ示したグラフで
ある。 ゛出願人代理人　　猪　　股　　　　清第４図 ｐＨ 第５図 温度　（’Ｃ） ８　補正の内容 手続ネ１１正書 昭和５９年９月７０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス属のＷＡＫ−８３株が属する種
   の微生物を培養することを特徴とする、キチナーゼの製
   造法。 ２、微生物がストレプトマイセス・ｓｐ・ ＷＡＫ−８３株である。特許請求の範囲第１項記載の方
   法。