JP3820418B2 - 新規キチナーゼ及びその製造方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、ビブリオ属に属する微生物によって生産される新規キチナーゼC−1およびキチナーゼC−3に関するものである。本発明の酵素は、種々の用途に利用されるキチンを効率的に分解するので、キチンの有効利用を図る上で、極めて重要である。
【0002】
【従来の技術】
キチンは、N−アセチル−D−グルコサミンが多数β−(1,4)−結合した多糖であり、自然界に幅広く分布している。キチナーゼは、キチンを加水分解し、N−アセチルキトオリゴ糖を経て、N−アセチルキトビオースにまで分解する。キチナーゼ(EC3・2・1・14)は、微生物界に幅広く分布し、ストレプトマイセス属微生物を中心に研究が行われている。一方、ビブリオ属微生物が生成するキチナーゼに関する研究は、内田ら(発酵工学 第57巻 第3号 131-140 1979)によって最初に報告されている。さらに、最近、高橋ら(J. Ferment. Bioeng. Vol-75 457-459 1993)によっても報告されている。
【0003】
しかしながら、上記キチナーゼは、キチナーゼ活性及び熱安定性の点で満足できるものではなかった。すなわち、これらの酵素の活性は、いずれもタンパク質1mg当たり10ユニット未満であり、熱安定性においても、50℃で1時間以上安定性を保持することはできなかった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高いキチナーゼ活性を有し、かつ高い熱安定を有する新規なキチナーゼを提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、海洋性細菌由来のキチナーゼの探索を行った結果、ビブリオ属に属するH−8株が、高いキチナーゼ活性を有し、かつ熱安定性にも優れる新規なキチナーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
【0006】
即ち、本発明は、下記の酵素化学的性質を有するキチナーゼC−1又はキチナーゼC−3である。
A.キチナーゼC−1
(1)キチンに作用し、キチンを可溶性のN−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
(2)至適 pH :40℃で7.8−8.2
(3)至適温度:pH8.0で50℃
(4)pH安定性:40℃で5.5−9.0で安定
(5)熱安定性:pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
(6)分子量:約69000(SDS−PAGE法)
(7)等電点:3.6
B.キチナーゼC−3
(1)キチンに作用し、キチンを可溶性のN−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
(2)至適 pH :40℃で7.8−8.2
(3)至適温度:pH8.0で50℃
(4)pH安定性:40℃で5.5−9.0で安定
(5)熱安定性:pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
(6)分子量:約81000(SDS−PAGE法)
(7)等電点:3.9
また、本発明は、ビブリオ属に属し、キチナーゼC−1またはキチナーゼC−3産生能を有する微生物を培養し、その培養物からキチナーゼC−1またはキチナーゼC−3を採取することを特徴とするキチナーゼC−1またはキチナーゼC−3の製造方法である。
【0007】
以下、本発明を詳細に説明する。
H−8株は、静岡県浜名湖にて採取した底泥より分離された。
H−8株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンアガー(Bacto Marine Agar 2216)(Difco 社製)あるいはマリンブロス(Bacto Marine Broth 2216)(Difco社製)を用いた。これらの培地に本菌株を植菌し30℃で24から48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて形態観察を行った。また、本菌株は、塩化ナトリウムを要求することから、生化学的性状の試験は75%人工海水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に3%塩化ナトリウムを添加することによって行った。
【0008】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第8版の分類基準に従って公知の菌株と比較した結果、グラム陰性桿菌で、極毛性の鞭毛を有し、通性嫌気性、またOFテストで発酵性であり、好塩性で発光性をもたず、オキシダーゼ陽性、GC含量が45.8%である等の理由から本菌株は、ビブリオ属に所属すると考えられた。そして、本菌株は、ビブリオsp.H−8株として工業技術院生命工学技術研究所に寄託番号FERM P-14737として寄託されている(寄託日:平成7年1月19日)。
【0013】
キチナーゼC−1及びキチナーゼC−3は、ビブリオ属に属するキチナーゼ生産菌を培地で培養し、培養物から得ることができる。キチナーゼ生産菌としては、ビブリオ属に属し、キチナーゼC−1及びキチナーゼC−3を産生するものであれば、いずれの菌株でも用いることができる。また、これら微生物の人工的変異方法、例えば紫外線照射、X線照射、変異誘起剤処理など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でもキチナーゼC−1又はキチナーゼC−3を生産するものであればいずれも本発明に用いることができる。このようなキチナーゼ生産能を有する菌株を選定するには、菌株の培養物を取り出し、そのキチナーゼ活性を測定することにより行うことができる。キチナーゼ生産株のうち、代表的な株としては、ビブリオsp.H−8株(FERM P-14737) を挙げることができる。
【0014】
本発明の微生物の培養には微生物の培養に一般的に用いられる培養方法を用いることができる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。本酵素は、誘導酵素のため炭素源として、キチン又はキチンオリゴ糖を用いることが必須である。また、そのほかに炭素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、麦芽糖、マンノース、フラクトース、シュークロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更に使用菌の生育やキチナーゼの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【0015】
培養法としては、一般の培養方法が用いられるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は16〜60℃、特に30〜42℃が適当であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、6〜11、特に7〜9に維持することが望ましい。液体培養で通常6〜96時間培養をおこなうと、目的物質のキチナーゼC−1及びキチナーゼC−3が菌体外に生成される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【0016】
培養物からキチナーゼC−1及びキチナーゼC−3の分離、精製は、酵素をその培養物から単離精製するために常用される方法に従っておこなわれる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分け、培養ろ液を硫酸アンモニウム等を用い、塩析によって沈澱物を得る。この沈澱物を溶解、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の手順で精製することができる。
【0017】
以上の手順で生成されたキチナーゼC−1は、以下の酵素化学的性質を有している。
(1)キチンに作用し、キチンを可溶性のN−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
(2)至適 pH :40℃で7.8−8.2
(3)至適温度:pH8.0で50℃
(4)pH安定性:40℃で5.5−9.0で安定
(5)熱安定性:pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
(6)分子量:約69000(SDS−PAGE法)
(7)等電点:3.6
キチナーゼC−3は、以下の酵素化学的性質を有している。
(1)キチンに作用し、キチンを可溶性のN−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
(2)至適 pH :40℃で7.8−8.2
(3)至適温度:pH8.0で50℃
(4)pH安定性:40℃で5.5−9.0で安定
(5)熱安定性:pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
(6)分子量:約81000(SDS−PAGE法)
(7)等電点:3.9
以上の酵素化学的性質及び後述の酵素活性について、本発明のキチナーゼと公知のキチナーゼとを比較したところ、50℃で1時間以上安定である点、及び、酵素活性がタンパク質1mg当たり、10ユニット以上である点で、公知のキチナーゼと明らかに相違する。そこで、キチナーゼC−1及びキチナーゼC−3を新規酵素と認定した。
【0018】
本発明の酵素の用途としては、例えばカビのプロトプラスト化のための試薬または、Nアセチルキトビオースの製造のために用いることができる。
【0019】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
[実施例1]
キチン粉末5g/L 、ペプトン5g/L 、酵母エキス1g/L 、グルコース5g/L 、りん酸第二鉄0.01g/L 、天然海水1000mlの組成を有する前培養培地(殺菌前 pH 7.5) 30mlを300ml フラスコに加え、ビブリオsp.H−8株を種菌として植菌し、37℃、24時間培養した。このようにして得られた前培養液を 100L容量の発酵槽中の上記組成と同一組成の培地30Lに5%v/v の割合で植菌し、40℃で通気攪拌方式(回転数100rpm, 通気量0.7vvm) により18時間培養を行った。この際、pHは7.8になるように調整しながら培養した。
[実施例2]
実施例1で得られた培養液30Lを1000rpm で遠心分離し、培養上清を得た。上清を硫酸アンモニウムで塩析し(80%飽和)、沈澱物をろ過後、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)2Lに懸濁し、再び濾過後、そのろ液を粗酵素液とした。次に、50FT-C-110透析チューブ(三光純薬製) に上記粗酵素を入れ、20mM酢酸ナトリウム緩衝液40Lを透析液として透析を行った。透析した酵素懸濁液をDEAEトヨパール HW-55(東ソー社製) を用いて、キチナーゼ活性画分の分画を行った。このDEAEトヨパールHW-55 による分画を2回行うことで、精製キチナーゼC−1を140mg 及び精製キチナーゼC−3を120mg 得ることができた。
[実施例3]
キチナーゼC−1及びキチナーゼC−3の活性の測定には、シャーレの変法(Agr. Biol. Chem. Vol 35, No.7, 1154-1156, 1971) を用いた。なお、キチナーゼ1ユニットは、1分間に1μmol のN−アセチルグルコサミンを遊離する活性を有する量とする。
【0020】
上記方法に従って、キチナーゼC−1及びキチナーゼC3の活性を測定した。その結果、タンパク質1mgあたり、キチナーゼC−1の活性は、11.5ユニットまた、キチナーゼC−3の活性は、10.8ユニットであった。
【0021】
【発明の効果】
本発明は、高活性で、かつ、熱安定性に優れる新規なキチナーゼを提供する。
Claims (2)
- 下記の酵素化学的性質を有するキチナーゼC−1又はキチナーゼC−3。
A.キチナーゼC−1
(1)キチンに作用し、キチンを可溶性のN−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
(2)至適 pH :40℃で7.8−8.2
(3)至適温度:pH8.0で50℃
(4)pH安定性:40℃で5.5−9.0で安定
(5)熱安定性:pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
(6)分子量:約69000(SDS−PAGE法)
(7)等電点:3.6
B.キチナーゼC−3
(1)キチンに作用し、キチンを可溶性のN−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
(2)至適 pH :40℃で7.8−8.2
(3)至適温度:pH8.0で50℃
(4)pH安定性:40℃で5.5−9.0で安定
(5)熱安定性:pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
(6)分子量:約81000(SDS−PAGE法)
(7)等電点:3.9 - 請求項1記載のキチナーゼC−1又はキチナーゼC−3の製造方法であって、ビブリオ属に属し、該キチナーゼC−1又はキチナーゼC−3産生能を有する微生物を培養し、その培養物からキチナーゼC−1又はキチナーゼC−3を採取することを特徴とする前記方法。
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