JPH09296A - シアル酸量の測定法 - Google Patents
シアル酸量の測定法Info
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- JPH09296A JPH09296A JP15815095A JP15815095A JPH09296A JP H09296 A JPH09296 A JP H09296A JP 15815095 A JP15815095 A JP 15815095A JP 15815095 A JP15815095 A JP 15815095A JP H09296 A JPH09296 A JP H09296A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ノイラミニダーゼを用いて、コロミン酸及び
他のシアル酸含有物質を含む混合物中のコロミン酸由来
のシアル酸量を測定する方法、ならびにビブリオ属に属
する微生物由来のノイラミニダーゼを用いて、コロミン
酸及び他のシアル酸含有物質を含む混合物中のコロミン
酸由来のシアル酸量を測定する方法。 【効果】 １種類のノイラミニダーゼで、コロミン酸及
びその他のシアル酸含有物質を含む混合物中におけるコ
ロミン酸以外のシアル酸含有物質由来のシアル酸量及び
全シアル酸量を測定することができる。
他のシアル酸含有物質を含む混合物中のコロミン酸由来
のシアル酸量を測定する方法、ならびにビブリオ属に属
する微生物由来のノイラミニダーゼを用いて、コロミン
酸及び他のシアル酸含有物質を含む混合物中のコロミン
酸由来のシアル酸量を測定する方法。 【効果】 １種類のノイラミニダーゼで、コロミン酸及
びその他のシアル酸含有物質を含む混合物中におけるコ
ロミン酸以外のシアル酸含有物質由来のシアル酸量及び
全シアル酸量を測定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、コロミン酸及びそれ以
外のシアル酸含有物質を含む混合物中のコロミン酸由来
のシアル酸量を測定する方法に関する。
外のシアル酸含有物質を含む混合物中のコロミン酸由来
のシアル酸量を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ノイラミニダーゼは、糖蛋白質、糖脂
質、オリゴ糖及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在する
シアル酸残基を遊離させる反応を触媒するため、血清等
の生体中のシアル酸含有物質の定量や、シアル酸を除去
したアシアロ体の調製に広く用いられている。
質、オリゴ糖及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在する
シアル酸残基を遊離させる反応を触媒するため、血清等
の生体中のシアル酸含有物質の定量や、シアル酸を除去
したアシアロ体の調製に広く用いられている。
【０００３】ノイラミニダーゼの供給源としては、工業
的規模で製造可能であり、しかも活性の安定したものが
得られること等の理由により、微生物由来のものが大半
を占めている。例えば、ビブリオ・コレラ（Vibrio cho
lerae）、クロストリディウム・パーフリンゲン（Clost
ridium perfringens）、ストレプトコッカス スピーシ
ーズ（Streptococcus sp.）、ストレプトマイセス ス
ピーシーズ（Streptomyces sp.）等の微生物は、培養液
中へノイラミニダーゼを生産することが知られており、
またコリネバクテリウム・ディフテリア（Corynebacter
ium diphtheriae）、クレブシエラ・アエロゲネス（Kle
bsiella aerogenes）等では、大部分が膜結合型として
存在することが知られている。
的規模で製造可能であり、しかも活性の安定したものが
得られること等の理由により、微生物由来のものが大半
を占めている。例えば、ビブリオ・コレラ（Vibrio cho
lerae）、クロストリディウム・パーフリンゲン（Clost
ridium perfringens）、ストレプトコッカス スピーシ
ーズ（Streptococcus sp.）、ストレプトマイセス ス
ピーシーズ（Streptomyces sp.）等の微生物は、培養液
中へノイラミニダーゼを生産することが知られており、
またコリネバクテリウム・ディフテリア（Corynebacter
ium diphtheriae）、クレブシエラ・アエロゲネス（Kle
bsiella aerogenes）等では、大部分が膜結合型として
存在することが知られている。
【０００４】ところでコロミン酸は、シアル酸がα２→
８で結合したポリマーであって、大腸菌、骨膜炎双球菌
などの血清型分類の基準となる多糖体である。従って、
血清中で他のシアル酸含有物質と混在しているコロミン
酸由来のシアル酸量を測定することによりコロミン酸を
定量することは、上記血清型分類においては非常に重要
である。
８で結合したポリマーであって、大腸菌、骨膜炎双球菌
などの血清型分類の基準となる多糖体である。従って、
血清中で他のシアル酸含有物質と混在しているコロミン
酸由来のシアル酸量を測定することによりコロミン酸を
定量することは、上記血清型分類においては非常に重要
である。
【０００５】しかしながら、従来の微生物由来のノイラ
ミニダーゼでは、コロミン酸及びそれ以外のシアル酸含
有物質を含む混合物中の各成分由来のシアル酸量を測定
するには、コロミン酸に作用しないノイラミニダーゼと
全ての基質に対して作用するノイラミニダーゼの２種類
の酵素を準備する必要があり、非常に煩雑であった。
ミニダーゼでは、コロミン酸及びそれ以外のシアル酸含
有物質を含む混合物中の各成分由来のシアル酸量を測定
するには、コロミン酸に作用しないノイラミニダーゼと
全ての基質に対して作用するノイラミニダーゼの２種類
の酵素を準備する必要があり、非常に煩雑であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、１種
類のノイラミニダーゼを用いて、種々のシアル酸含有物
質を含む試料中のシアル酸量を、由来する物質毎に測定
する方法を提供することである。
類のノイラミニダーゼを用いて、種々のシアル酸含有物
質を含む試料中のシアル酸量を、由来する物質毎に測定
する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、ビブリオ属に属する微生物由来
のノイラミニダーゼを用いて、試料中のｐＨを所定値に
調整するとともに二価金属イオンを添加し又は添加せず
に反応させることにより、コロミン酸以外のシアル酸含
有物質由来のシアル酸量及び全シアル酸量を測定するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
の結果、本発明者らは、ビブリオ属に属する微生物由来
のノイラミニダーゼを用いて、試料中のｐＨを所定値に
調整するとともに二価金属イオンを添加し又は添加せず
に反応させることにより、コロミン酸以外のシアル酸含
有物質由来のシアル酸量及び全シアル酸量を測定するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は、ノイラミニダーゼを用い
て、コロミン酸及び他のシアル酸含有物質を含む混合物
中のコロミン酸由来のシアル酸量を測定する方法であ
る。また、本発明は、ビブリオ属に属する微生物由来の
ノイラミニダーゼを用いて、コロミン酸及び他のシアル
酸含有物質を含む混合物中のコロミン酸由来のシアル酸
量を測定する方法である。
て、コロミン酸及び他のシアル酸含有物質を含む混合物
中のコロミン酸由来のシアル酸量を測定する方法であ
る。また、本発明は、ビブリオ属に属する微生物由来の
ノイラミニダーゼを用いて、コロミン酸及び他のシアル
酸含有物質を含む混合物中のコロミン酸由来のシアル酸
量を測定する方法である。
【０００９】さらに、本発明は、コロミン酸及び他のシ
アル酸含有物質を含む混合物中に、(a) 二価金属イオン
を添加することなく、ビブリオ属に属する微生物由来の
ノイラミニダーゼを添加し、混合物のｐＨを７．５以上
に調整して反応させることにより、コロミン酸以外のシ
アル酸含有物質由来のシアル酸量を測定するとともに、
(b) ビブリオ属に属する微生物由来のノイラミニダーゼ
及び二価金属イオンを添加し、混合物のｐＨを７．５以
上に調整して反応させることにより、全シアル酸量を測
定し、この全シアル酸量と、工程(a) で測定したコロミ
ン酸以外のシアル酸含有物質由来のシアル酸量との差か
ら、コロミン酸由来のシアル酸量を算出することを特徴
とする、コロミン酸由来のシアル酸量の測定法である。
アル酸含有物質を含む混合物中に、(a) 二価金属イオン
を添加することなく、ビブリオ属に属する微生物由来の
ノイラミニダーゼを添加し、混合物のｐＨを７．５以上
に調整して反応させることにより、コロミン酸以外のシ
アル酸含有物質由来のシアル酸量を測定するとともに、
(b) ビブリオ属に属する微生物由来のノイラミニダーゼ
及び二価金属イオンを添加し、混合物のｐＨを７．５以
上に調整して反応させることにより、全シアル酸量を測
定し、この全シアル酸量と、工程(a) で測定したコロミ
ン酸以外のシアル酸含有物質由来のシアル酸量との差か
ら、コロミン酸由来のシアル酸量を算出することを特徴
とする、コロミン酸由来のシアル酸量の測定法である。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
使用するノイラミニダーゼは、一定の条件下では、コロ
ミン酸を含めて全てのシアル酸含有物質に作用し、他の
条件下ではコロミン酸に対してのみ作用しないノイラミ
ニダーゼであればいかなるものであってもよく、例えば
ノイラミニダーゼ２０５、ノイラミニダーゼ２２０等を
用いることができる。
使用するノイラミニダーゼは、一定の条件下では、コロ
ミン酸を含めて全てのシアル酸含有物質に作用し、他の
条件下ではコロミン酸に対してのみ作用しないノイラミ
ニダーゼであればいかなるものであってもよく、例えば
ノイラミニダーゼ２０５、ノイラミニダーゼ２２０等を
用いることができる。
【００１１】ノイラミニダーゼ２０５は新規なノイラミ
ニダーゼであって、新菌種ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２０５を培地に培養し、菌体外にノイラミニダーゼ２
０５を生産させ、これを採取することにより得ることが
できる。このノイラミニダーゼの一例である、後述の製
造例１で得られるノイラミニダーゼ２０５の酵素的諸性
質を以下に述べる。
ニダーゼであって、新菌種ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２０５を培地に培養し、菌体外にノイラミニダーゼ２
０５を生産させ、これを採取することにより得ることが
できる。このノイラミニダーゼの一例である、後述の製
造例１で得られるノイラミニダーゼ２０５の酵素的諸性
質を以下に述べる。
【００１２】（１）作用 糖鎖の非還元末端にα配位ケトシド結合したシアル酸を
加水分解的に遊離する。 （２）基質特異性 （試験方法）α２−３シアリルラクトース、α２−６シ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質（ガングリオシ
ドＧＭ３、ＧＤ３）、糖蛋白質（ムチン、フェツイン）
を基質として用い、これらに含まれるシアル酸量を１０
０ｎｍｏｌに統一し、０．００１〜０．００５単位のノ
イラミニダーゼ２０５によって基質から遊離するシアル
酸量を測定することで各基質への作用の差を比較する。
加水分解的に遊離する。 （２）基質特異性 （試験方法）α２−３シアリルラクトース、α２−６シ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質（ガングリオシ
ドＧＭ３、ＧＤ３）、糖蛋白質（ムチン、フェツイン）
を基質として用い、これらに含まれるシアル酸量を１０
０ｎｍｏｌに統一し、０．００１〜０．００５単位のノ
イラミニダーゼ２０５によって基質から遊離するシアル
酸量を測定することで各基質への作用の差を比較する。
【００１３】具体的には、１００ｎｍｏｌのシアル酸を
含む基質溶液２５μｌと０．００３単位／５μｌの酵素
液を５０ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．
５）＋２０ｍＭ ＭｇＣｌ2中、３７℃、１０分間作用
させた後、遊離したシアル酸量をＴＢＡ法で定量し、各
基質から遊離されたシアル酸量を、α２−３シアリルラ
クトースを基質とした場合を基準として比較する。 （結果）結果は表１の通りである。
含む基質溶液２５μｌと０．００３単位／５μｌの酵素
液を５０ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．
５）＋２０ｍＭ ＭｇＣｌ2中、３７℃、１０分間作用
させた後、遊離したシアル酸量をＴＢＡ法で定量し、各
基質から遊離されたシアル酸量を、α２−３シアリルラ
クトースを基質とした場合を基準として比較する。 （結果）結果は表１の通りである。
【００１４】
【表１】 ─────────────────────────── 基 質 相対反応速度（％） ─────────────────────────── α２−３シアリルラクトース 100 α２−６シアリルラクトース 37.9 コロミン酸 51.4 ガングリオシドＧＭ３ 74.5 ガングリオシドＧＤ３ 76.5 フェツイン 117 ムチン 45.5 ───────────────────────────
【００１５】表１から、ノイラミニダーゼ２０５は、α
２−３，α２−６、α２−８結合したシアル酸を含むシ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質、糖蛋白質によ
く作用し、これらのシアロ糖複合体の各種Ｎ−アセチル
ノイラミン酸ケトシドを加水分解できる。
２−３，α２−６、α２−８結合したシアル酸を含むシ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質、糖蛋白質によ
く作用し、これらのシアロ糖複合体の各種Ｎ−アセチル
ノイラミン酸ケトシドを加水分解できる。
【００１６】（３）作用最適ｐＨ 最適ｐＨは、３７℃、１０分間の反応で、ｐＨ５〜７の
間にある。 （４）安定ｐＨ範囲 ４℃、２４時間では、ｐＨ５〜１０においても活性の低
下はほとんど見られない。
間にある。 （４）安定ｐＨ範囲 ４℃、２４時間では、ｐＨ５〜１０においても活性の低
下はほとんど見られない。
【００１７】（５）力価の測定方法 ノイラミニダーゼの酵素活性は、反応液中に遊離される
シアル酸量をチオバルビツール酸（ＴＢＡ）法によって
求める。すなわち、５０ｍＭ イミダゾール塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）中、１％濃度（ｗ／ｖ）にコロミン
酸を溶解した基質溶液２５μｌと５μｌの酵素液を加え
て３７℃、１０〜２０分間作用させる。この反応溶液に
２５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを１２５μｌ加え
て３７℃、３０分間インキュベートした後、２％（ｗ／
ｖ）亜ヒ素酸ナトリウム溶液を１００μｌを添加、０．
１Ｍ チオバルビツール酸１ｍｌを加え、沸騰水浴中、
７分３０秒間加熱後、氷冷し、ｎ−ブタノール：塩酸
（９５：５）２ｍｌを加え、遠心分離後の紫紅色の上清
の５４９ｎｍにおける吸光度を測定する。上記測定条件
で、１分間に１μｍｏｌのシアル酸を遊離させる酵素量
を１単位とした。
シアル酸量をチオバルビツール酸（ＴＢＡ）法によって
求める。すなわち、５０ｍＭ イミダゾール塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）中、１％濃度（ｗ／ｖ）にコロミン
酸を溶解した基質溶液２５μｌと５μｌの酵素液を加え
て３７℃、１０〜２０分間作用させる。この反応溶液に
２５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを１２５μｌ加え
て３７℃、３０分間インキュベートした後、２％（ｗ／
ｖ）亜ヒ素酸ナトリウム溶液を１００μｌを添加、０．
１Ｍ チオバルビツール酸１ｍｌを加え、沸騰水浴中、
７分３０秒間加熱後、氷冷し、ｎ−ブタノール：塩酸
（９５：５）２ｍｌを加え、遠心分離後の紫紅色の上清
の５４９ｎｍにおける吸光度を測定する。上記測定条件
で、１分間に１μｍｏｌのシアル酸を遊離させる酵素量
を１単位とした。
【００１８】（６）作用最適温度 ｐＨ５．０、１０分間の反応で、５０℃に至適温度があ
る（図１）。 （７）温度安定性 ｐＨ５．０、１０分間の反応で５０℃までは安定である
が５０℃以上では部分的に失活する。 （８）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で分子量は約６５，００
０、セファクリルＳ−２００ＨＲ（ファルマシア製）を
用いたゲル濾過法で測定したところ、約６２，０００で
ある。
る（図１）。 （７）温度安定性 ｐＨ５．０、１０分間の反応で５０℃までは安定である
が５０℃以上では部分的に失活する。 （８）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で分子量は約６５，００
０、セファクリルＳ−２００ＨＲ（ファルマシア製）を
用いたゲル濾過法で測定したところ、約６２，０００で
ある。
【００１９】（９）等電点 等電点をＰｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア製）
でＰｈａｓｔ−ＧｅｌＩＥＦ ４．０−６．５を用いて
測定した結果、４．８であった。 （１０）Ｎ末端アミノ酸配列 Ｎ末端アミノ酸配列はアプライドバイオシステムズ社の
自動アミノ酸配列分析装置（モデル４７０Ａ）に供して
以下のように決定できる。 ＶＡＰＮＶＲＤＶＶＶＦＱＧＧＥＧＧ
でＰｈａｓｔ−ＧｅｌＩＥＦ ４．０−６．５を用いて
測定した結果、４．８であった。 （１０）Ｎ末端アミノ酸配列 Ｎ末端アミノ酸配列はアプライドバイオシステムズ社の
自動アミノ酸配列分析装置（モデル４７０Ａ）に供して
以下のように決定できる。 ＶＡＰＮＶＲＤＶＶＶＦＱＧＧＥＧＧ
【００２０】以上の酵素的諸性質を有するノイラミニダ
ーゼ２０５の製造に用いることのできる微生物として
は、例えばビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５が挙げ
られる。このビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５は海
洋性細菌であり、本発明者らが相模湾の海水から分離採
取したものである。
ーゼ２０５の製造に用いることのできる微生物として
は、例えばビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５が挙げ
られる。このビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５は海
洋性細菌であり、本発明者らが相模湾の海水から分離採
取したものである。
【００２１】この微生物、ＪＴ０２０５の天然界からの
スクリーニング方法を以下に示す。海水、海砂、もしく
は海泥を微生物源として、直接、コロミン酸、バクト
イースト ニトロゲン ベース W/O アミノ アシッ
ド、および海水からなる滅菌培地に接種する。本培地で
増殖した微生物は常法にしたがってシングルコロニーア
イソレーションした後、得られた微生物の培養液を酵素
源として、常法によりノイラミニダーゼ２０５活性を測
定し、該酵素活性を示す菌株より本菌株を得ることがで
きる。
スクリーニング方法を以下に示す。海水、海砂、もしく
は海泥を微生物源として、直接、コロミン酸、バクト
イースト ニトロゲン ベース W/O アミノ アシッ
ド、および海水からなる滅菌培地に接種する。本培地で
増殖した微生物は常法にしたがってシングルコロニーア
イソレーションした後、得られた微生物の培養液を酵素
源として、常法によりノイラミニダーゼ２０５活性を測
定し、該酵素活性を示す菌株より本菌株を得ることがで
きる。
【００２２】このようにして得られるＪＴ０２０５の菌
学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １）形態 （１）細胞の形態は桿菌で、大きさは1 ×0.5 〜2 ×1
μm （２）運動性を示し、鞭毛を有する。 （３）グラム染色性は陰性 （４）胞子は形成しない。 ２）生理的性質 （１）生育温度 ４℃では生育せず ３０℃では生育する ３５℃では生育する ４０℃では生育せず （２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず （３）Ｏ−Ｆテスト Ｆ （４）カタラーゼテスト 陽性 （５）オキシダーゼテスト 陽性 （６）グルコースからガスの生成 無し （７）Ｖ−Ｐ反応 陰性 （８）ゼラチン分解能 有り （９）デンプン分解能 有り （１０）硝酸塩還元能 有り （１１）発光性 無し （１２）酸素に対する態度 通性嫌気性 （１３）ＰＨＢの蓄積 β-ヒドロキシ酪酸を基質 有り グルコースを基質 無し （１４）β-ヒドロキシ酪酸の利用能 有り （１５）ＮａＣｌ要求性 有り （１６）リパーゼ活性 有り （１７）マンニトールの資化性 有り （１８）プテリジン誘導体に対する感受性 １０μｇ 感受性 １５０μｇ 感受性 （１９）キノン系 Ｑ−８ （２０）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）* ４６ （２１）アルギニンジヒドラーゼ活性 有り （２２）資化性 Ｄ−キシロース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース ＋ シュークロース ＋ セロビオース ＋ Ｄ−グルコン酸塩 ＋ ヘプタン酸 ＋ Ｄ−ソルビトール − エタノール − γ−アミノ酪酸 − Ｌ−プロリン ＋ プトレスシン − 注）＊：ＨＰＬＣ法によって行なった。
学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １）形態 （１）細胞の形態は桿菌で、大きさは1 ×0.5 〜2 ×1
μm （２）運動性を示し、鞭毛を有する。 （３）グラム染色性は陰性 （４）胞子は形成しない。 ２）生理的性質 （１）生育温度 ４℃では生育せず ３０℃では生育する ３５℃では生育する ４０℃では生育せず （２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず （３）Ｏ−Ｆテスト Ｆ （４）カタラーゼテスト 陽性 （５）オキシダーゼテスト 陽性 （６）グルコースからガスの生成 無し （７）Ｖ−Ｐ反応 陰性 （８）ゼラチン分解能 有り （９）デンプン分解能 有り （１０）硝酸塩還元能 有り （１１）発光性 無し （１２）酸素に対する態度 通性嫌気性 （１３）ＰＨＢの蓄積 β-ヒドロキシ酪酸を基質 有り グルコースを基質 無し （１４）β-ヒドロキシ酪酸の利用能 有り （１５）ＮａＣｌ要求性 有り （１６）リパーゼ活性 有り （１７）マンニトールの資化性 有り （１８）プテリジン誘導体に対する感受性 １０μｇ 感受性 １５０μｇ 感受性 （１９）キノン系 Ｑ−８ （２０）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）* ４６ （２１）アルギニンジヒドラーゼ活性 有り （２２）資化性 Ｄ−キシロース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース ＋ シュークロース ＋ セロビオース ＋ Ｄ−グルコン酸塩 ＋ ヘプタン酸 ＋ Ｄ−ソルビトール − エタノール − γ−アミノ酪酸 − Ｌ−プロリン ＋ プトレスシン − 注）＊：ＨＰＬＣ法によって行なった。
【００２３】このＪＴ０２０５菌株の上記の菌学的性質
について、バージーズ マニュアルオブ デタミネイテ
ィブ バクテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて
検討した結果、ＪＴ０２０５菌株はビブリオ属に属する
微生物であると同定された。次いでこのＪＴ０２０５菌
株の菌学的性質をビブリオ属に属する類縁の公知種と比
較検討したところ、表２に示すとおり、ＪＴ０２０５の
菌学的性質はその全項目においてビブリオ・ツビアッシ
ー（Vibrio tubiashii）のそれらとほぼ一致しているこ
とが判った。しかし、ビブリオ・ツビアッシーのType s
train であるATCC 19109は、コロミン酸を資化すること
ができず、ノイラミニダーゼの酵素活性は認められなか
った。したがって、ＪＴ０２０５菌株は、ビブリオ属に
属する公知種とは明らかに区別され、新菌種であると認
定し、ビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５と同定し
た。そして、このビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年５月
３０日に寄託し、その寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５１
１７である。
について、バージーズ マニュアルオブ デタミネイテ
ィブ バクテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて
検討した結果、ＪＴ０２０５菌株はビブリオ属に属する
微生物であると同定された。次いでこのＪＴ０２０５菌
株の菌学的性質をビブリオ属に属する類縁の公知種と比
較検討したところ、表２に示すとおり、ＪＴ０２０５の
菌学的性質はその全項目においてビブリオ・ツビアッシ
ー（Vibrio tubiashii）のそれらとほぼ一致しているこ
とが判った。しかし、ビブリオ・ツビアッシーのType s
train であるATCC 19109は、コロミン酸を資化すること
ができず、ノイラミニダーゼの酵素活性は認められなか
った。したがって、ＪＴ０２０５菌株は、ビブリオ属に
属する公知種とは明らかに区別され、新菌種であると認
定し、ビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５と同定し
た。そして、このビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年５月
３０日に寄託し、その寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５１
１７である。
【００２４】
【表２】
【００２５】本発明におけるビブリオ・スピーシーズＪ
Ｔ０２０５を培養するには、通常のこの分野の微生物の
一般的な栄養培地を使用できるが、ＮａＣｌ要求性の細
菌であるため、０．５％以上、好ましくは３％程度のＮ
ａＣｌを培地に加える必要があり、天然海水や人工海水
に栄養源として０．２〜２％程度のコロミン酸あるいは
Ｎ−アセチルマンノサミンと０．１〜１％程度の酵母エ
キスを添加した培地を使用することができる。
Ｔ０２０５を培養するには、通常のこの分野の微生物の
一般的な栄養培地を使用できるが、ＮａＣｌ要求性の細
菌であるため、０．５％以上、好ましくは３％程度のＮ
ａＣｌを培地に加える必要があり、天然海水や人工海水
に栄養源として０．２〜２％程度のコロミン酸あるいは
Ｎ−アセチルマンノサミンと０．１〜１％程度の酵母エ
キスを添加した培地を使用することができる。
【００２６】培養は、２０〜３０℃で２０〜４８時間好
気的に行なわれ、これにより培養液中にノイラミニダー
ゼ２０５が生成、蓄積される。培養液からのノイラミニ
ダーゼ２０５の採取時期は、ノイラミニダーゼ２０５の
産生量が菌の増殖とともに増加するので適宜、設定すれ
ば良い。培養物中に産生されるノイラミニダーゼ２０５
は、培養終了後の培養物をそのまま遠心分離して菌体を
除去し、得られる上清を粗酵素液として採取することも
できる。この粗酵素液はさらに酵素の分野で通常用いら
れている方法で精製することができる。この精製方法と
しては、例えば、硫安分画法や限外濾過膜を用いて酵素
を濃縮した後、イオン交換カラムクロマトグラフィー、
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等で行なえば良い。
気的に行なわれ、これにより培養液中にノイラミニダー
ゼ２０５が生成、蓄積される。培養液からのノイラミニ
ダーゼ２０５の採取時期は、ノイラミニダーゼ２０５の
産生量が菌の増殖とともに増加するので適宜、設定すれ
ば良い。培養物中に産生されるノイラミニダーゼ２０５
は、培養終了後の培養物をそのまま遠心分離して菌体を
除去し、得られる上清を粗酵素液として採取することも
できる。この粗酵素液はさらに酵素の分野で通常用いら
れている方法で精製することができる。この精製方法と
しては、例えば、硫安分画法や限外濾過膜を用いて酵素
を濃縮した後、イオン交換カラムクロマトグラフィー、
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等で行なえば良い。
【００２７】ビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５より
ノイラミニダーゼ２０５を生産する具体的方法は、該微
生物を天然海水中に１％Ｎ-アセチルマンノサミン、
０．６７％ バクト イースト ニトロゲン ベース
ｗ／ｏ アミノ アシッド（Ｄｉｆｃｏ社製）を加えた
培地中で培養温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０
℃、ｐＨ６．８〜８．８、好ましくは７．２〜８．２、
培養時間、１０〜４８時間、好ましくは１６〜３６時間
培養することにより行われる。
ノイラミニダーゼ２０５を生産する具体的方法は、該微
生物を天然海水中に１％Ｎ-アセチルマンノサミン、
０．６７％ バクト イースト ニトロゲン ベース
ｗ／ｏ アミノ アシッド（Ｄｉｆｃｏ社製）を加えた
培地中で培養温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０
℃、ｐＨ６．８〜８．８、好ましくは７．２〜８．２、
培養時間、１０〜４８時間、好ましくは１６〜３６時間
培養することにより行われる。
【００２８】目的とする酵素は主に菌体外に分泌される
ため、培養液を遠心分離して菌体を除去すれば、高いノ
イラミニダーゼ活性（約１単位／ｍｌ）を有する粗酵素
液が得られる。さらに、この時点での酵素の比活性は約
５０単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、この値は現在
市販されているノイラミニダーゼの中でも高品質のもの
に相当する。さらに、研究や検査に使用する際に問題と
なるプロテアーゼや各種グリコシダーゼ活性をほとんど
含まないことが確認された。すなわち、ビブリオ・スピ
ーシーズＪＴ０２０５を用いれば、培養液上清を直接、
酵素液として用いることができることから、ノイラミニ
ダーゼを安価でしかも簡便に製造することができるとい
う優れた利点を有している。
ため、培養液を遠心分離して菌体を除去すれば、高いノ
イラミニダーゼ活性（約１単位／ｍｌ）を有する粗酵素
液が得られる。さらに、この時点での酵素の比活性は約
５０単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、この値は現在
市販されているノイラミニダーゼの中でも高品質のもの
に相当する。さらに、研究や検査に使用する際に問題と
なるプロテアーゼや各種グリコシダーゼ活性をほとんど
含まないことが確認された。すなわち、ビブリオ・スピ
ーシーズＪＴ０２０５を用いれば、培養液上清を直接、
酵素液として用いることができることから、ノイラミニ
ダーゼを安価でしかも簡便に製造することができるとい
う優れた利点を有している。
【００２９】ノイラミニダーゼ２２０は新規なノイラミ
ニダーゼであって、新菌種ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２２０を培地に培養し、菌体外にノイラミニダーゼ２
２０を生産させ、これを採取することにより得ることが
できる。このノイラミニダーゼの一例である、後述の製
造例２で得られるノイラミニダーゼ２２０の酵素的諸性
質を以下に述べる。
ニダーゼであって、新菌種ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２２０を培地に培養し、菌体外にノイラミニダーゼ２
２０を生産させ、これを採取することにより得ることが
できる。このノイラミニダーゼの一例である、後述の製
造例２で得られるノイラミニダーゼ２２０の酵素的諸性
質を以下に述べる。
【００３０】（１）作用 糖鎖の非還元末端にα配位ケトシド結合したシアル酸を
加水分解的に遊離する。 （２）基質特異性 （試験方法）前述したノイラミニダーゼ２０５と同様で
ある。 （結果）結果は表３の通りである。
加水分解的に遊離する。 （２）基質特異性 （試験方法）前述したノイラミニダーゼ２０５と同様で
ある。 （結果）結果は表３の通りである。
【００３１】
【表３】 ─────────────────────────── 基 質 相対反応速度（％） ─────────────────────────── α２−３シアリルラクトース 100 α２−６シアリルラクトース 53.6 コロミン酸 22.4 ガングリオシドＧＭ３ 70.5 ガングリオシドＧＤ３ 56.5 フェツイン 125 ムチン 56.8 ───────────────────────────
【００３２】表３から、ノイラミニダーゼ２２０は、α
２−３，α２−６、α２−８結合したシアル酸を含むシ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質、糖蛋白質によ
く作用し、これらのシアロ糖複合体の各種Ｎ−アセチル
ノイラミン酸ケトシドを加水分解できる。
２−３，α２−６、α２−８結合したシアル酸を含むシ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質、糖蛋白質によ
く作用し、これらのシアロ糖複合体の各種Ｎ−アセチル
ノイラミン酸ケトシドを加水分解できる。
【００３３】（３）作用最適ｐＨ 最適ｐＨは、３５℃、１０分間の反応で、ｐＨ５．０〜
５．５の間にある（図２）。 （４）安定ｐＨ範囲 ４℃、２４時間では、ｐＨ５〜１０においても活性の低
下はほとんど見られない。 （５）力価の測定方法 前述したノイラミニダーゼ２０５と同様である。
５．５の間にある（図２）。 （４）安定ｐＨ範囲 ４℃、２４時間では、ｐＨ５〜１０においても活性の低
下はほとんど見られない。 （５）力価の測定方法 前述したノイラミニダーゼ２０５と同様である。
【００３４】（６）作用最適温度 ｐＨ５．０、１０分間の反応で、３５℃に至適温度があ
る（図３）。 （７）温度安定性 ｐＨ５．０、１０分間の反応で３５℃までは安定である
が４５℃以上では部分的に失活する。 （８）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で分子量は約９３，０００
である。
る（図３）。 （７）温度安定性 ｐＨ５．０、１０分間の反応で３５℃までは安定である
が４５℃以上では部分的に失活する。 （８）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で分子量は約９３，０００
である。
【００３５】以上の酵素的諸性質を有するノイラミニダ
ーゼ２２０の製造に用いる微生物としては、例えばビブ
リオ・スピーシーズＪＴ０２２０が挙げられる。このビ
ブリオ・スピーシーズＪＴ０２２０は海洋性細菌であ
り、大分県北部の沿岸海水から分離されたものである。
この微生物、ＪＴ０２２０の天然界からのスクリーニン
グ方法を以下に示す。
ーゼ２２０の製造に用いる微生物としては、例えばビブ
リオ・スピーシーズＪＴ０２２０が挙げられる。このビ
ブリオ・スピーシーズＪＴ０２２０は海洋性細菌であ
り、大分県北部の沿岸海水から分離されたものである。
この微生物、ＪＴ０２２０の天然界からのスクリーニン
グ方法を以下に示す。
【００３６】海水、海砂、もしくは海泥を微生物源とし
て、直接、コロミン酸、バクト イースト ニトロゲン
ベース W/O アミノ アシッド、および海水からな
る滅菌培地に接種する。本培地で増殖した微生物は常法
にしたがってシングルコロニーアイソレーションした
後、得られた微生物の培養液を酵素源として、常法によ
りノイラミニダーゼ２２０活性を測定し、該酵素活性を
示す菌株より本菌株を得ることができる。
て、直接、コロミン酸、バクト イースト ニトロゲン
ベース W/O アミノ アシッド、および海水からな
る滅菌培地に接種する。本培地で増殖した微生物は常法
にしたがってシングルコロニーアイソレーションした
後、得られた微生物の培養液を酵素源として、常法によ
りノイラミニダーゼ２２０活性を測定し、該酵素活性を
示す菌株より本菌株を得ることができる。
【００３７】このようにして得られるＪＴ０２２０の菌
学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １）形態 （１）細胞の形態は桿菌で、大きさは１×０．５〜２×
１μｍ （２）運動性を示し、鞭毛を有する。 （３）グラム染色性は陰性 （４）胞子は形成しない。 ２）生理的性質 （１）生育温度 ４℃ 生育せず ３０℃ 生育する ３５℃ 生育する ４０℃ 生育せず （２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず （３）Ｏ−Ｆテスト Ｆ （４）カタラーゼテスト 陽性 （５）オキシダーゼテスト 陽性 （６）グルコースからガスの生成 無し （７）Ｖ−Ｐ反応 陰性 （８）ゼラチン分解能 有り （９）デンプン分解能 有り （１０）硝酸塩還元能 有り （１１）発光性 無し （１２）酸素に対する態度 通性嫌気性 （１３）ＰＨＢの蓄積 β−ヒドロキシ酪酸を基質 試験用培地に生育せず グルコースを基質 無し （１４）β−ヒドロキシ酪酸の利用能 無し （１５）ＮａＣｌ要求性 有り （１６）リパーゼ活性 有り （１７）マンニトールの資化性 有り （１８）プテリジン誘導体に対する感受性 １０μｇ 感受性 １５０μｇ 感受性 （１９）キノン系 Ｑ−８ （２０）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）* ４４ （２１）アルギニンジヒドラーゼ活性 有り （２２）資化性 Ｄ−キシロース − シュークロース ＋ セロビオース ＋ Ｄ−グルコン酸塩 − γ−アミノ酪酸 − Ｌ−プロリン ＋ プトレスシン ＋ Ｄ−マンノース ＋ ガラクチュロン酸 − ヘプタン酸 − Ｄ−ソルビトール ＋ エタノール − 注）* ：ＨＰＬＣ法によって行なった。
学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １）形態 （１）細胞の形態は桿菌で、大きさは１×０．５〜２×
１μｍ （２）運動性を示し、鞭毛を有する。 （３）グラム染色性は陰性 （４）胞子は形成しない。 ２）生理的性質 （１）生育温度 ４℃ 生育せず ３０℃ 生育する ３５℃ 生育する ４０℃ 生育せず （２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず （３）Ｏ−Ｆテスト Ｆ （４）カタラーゼテスト 陽性 （５）オキシダーゼテスト 陽性 （６）グルコースからガスの生成 無し （７）Ｖ−Ｐ反応 陰性 （８）ゼラチン分解能 有り （９）デンプン分解能 有り （１０）硝酸塩還元能 有り （１１）発光性 無し （１２）酸素に対する態度 通性嫌気性 （１３）ＰＨＢの蓄積 β−ヒドロキシ酪酸を基質 試験用培地に生育せず グルコースを基質 無し （１４）β−ヒドロキシ酪酸の利用能 無し （１５）ＮａＣｌ要求性 有り （１６）リパーゼ活性 有り （１７）マンニトールの資化性 有り （１８）プテリジン誘導体に対する感受性 １０μｇ 感受性 １５０μｇ 感受性 （１９）キノン系 Ｑ−８ （２０）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）* ４４ （２１）アルギニンジヒドラーゼ活性 有り （２２）資化性 Ｄ−キシロース − シュークロース ＋ セロビオース ＋ Ｄ−グルコン酸塩 − γ−アミノ酪酸 − Ｌ−プロリン ＋ プトレスシン ＋ Ｄ−マンノース ＋ ガラクチュロン酸 − ヘプタン酸 − Ｄ−ソルビトール ＋ エタノール − 注）* ：ＨＰＬＣ法によって行なった。
【００３８】このＪＴ０２２０菌株の上記の菌学的性質
について、バージーズ マニュアルオブ デタミネイテ
ィブ バクテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて
検討した結果、ＪＴ０２２０菌株はビブリオ属に属する
微生物であると同定された。次いでこのＪＴ０２２０菌
株の菌株的性質をビブリオ属に属する類縁の公知種々と
比較検討したところ、表４に示す通り、ＪＴ０２２０の
菌株的性質はその全項目において一致するものはなかっ
た。その中でも近種であると考えられる４種と比較した
ところ、ビブリオ・ツビアッシー（Vibrio tubiashii）
とはキシロース、グルコン酸塩、ストレプトマイシンの
資化性において、ビブリオ・スプレンディダス（Vibrio
splendidus) とは発光性、キシロース、ソルビトー
ル、ストレプトマイシンの資化性において、ビブリオ・
メディテラーネ(Vibrio mediterranei) とはアルギニン
ジヒドロラーゼの有無、ゼラチンの分解において、ビブ
リオ・オリエンタリス（Vibrio orientalis ）とは発光
性、生育温度、グルコン酸の資化性においてそれぞれ異
なる。したがって、ＪＴ０２２０菌株は、ビブリオ属に
属する公知種とは明らかに区別され、新菌種であると認
定し、ビブリオ・スピースーズＪＴ０２２０と同定し
た。このビブリオ・スピーシーズＪＴ０２２０は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に平成７年５月３０日に
寄託し、その寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５１１９であ
る。
について、バージーズ マニュアルオブ デタミネイテ
ィブ バクテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて
検討した結果、ＪＴ０２２０菌株はビブリオ属に属する
微生物であると同定された。次いでこのＪＴ０２２０菌
株の菌株的性質をビブリオ属に属する類縁の公知種々と
比較検討したところ、表４に示す通り、ＪＴ０２２０の
菌株的性質はその全項目において一致するものはなかっ
た。その中でも近種であると考えられる４種と比較した
ところ、ビブリオ・ツビアッシー（Vibrio tubiashii）
とはキシロース、グルコン酸塩、ストレプトマイシンの
資化性において、ビブリオ・スプレンディダス（Vibrio
splendidus) とは発光性、キシロース、ソルビトー
ル、ストレプトマイシンの資化性において、ビブリオ・
メディテラーネ(Vibrio mediterranei) とはアルギニン
ジヒドロラーゼの有無、ゼラチンの分解において、ビブ
リオ・オリエンタリス（Vibrio orientalis ）とは発光
性、生育温度、グルコン酸の資化性においてそれぞれ異
なる。したがって、ＪＴ０２２０菌株は、ビブリオ属に
属する公知種とは明らかに区別され、新菌種であると認
定し、ビブリオ・スピースーズＪＴ０２２０と同定し
た。このビブリオ・スピーシーズＪＴ０２２０は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に平成７年５月３０日に
寄託し、その寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５１１９であ
る。
【００３９】
【表４】
【００４０】本発明においてビブリオ・スピーシーズＪ
Ｔ０２２０を培養するには、通常のこの分野の微生物の
一般的な栄養培地を使用できるが、ＮａＣｌ要求性の細
菌であるため、０．５％以上、好ましくは３％程度のＮ
ａＣｌを培地に加える必要があり、天然海水や人工海水
に栄養源として０．２〜２％程度のコロミン酸あるいは
Ｎ−アセチルマンノサミンと０．１〜１％程度の酵母エ
キスを添加した培地を使用することができる。
Ｔ０２２０を培養するには、通常のこの分野の微生物の
一般的な栄養培地を使用できるが、ＮａＣｌ要求性の細
菌であるため、０．５％以上、好ましくは３％程度のＮ
ａＣｌを培地に加える必要があり、天然海水や人工海水
に栄養源として０．２〜２％程度のコロミン酸あるいは
Ｎ−アセチルマンノサミンと０．１〜１％程度の酵母エ
キスを添加した培地を使用することができる。
【００４１】培養は、２０〜３０℃で２０〜４８時間好
気的に行なわれ、これにより培養液中にノイラミニダー
ゼ２２０が生成、蓄積される。培養液からのノイラミニ
ダーゼ２２０の採取時期は、ノイラミニダーゼ２２０の
産生量が菌の増殖とともに増加するので適宜、設定すれ
ば良い。培養物中に産生されるノイラミニダーゼ２２０
は、培養終了後の培養物をそのまま遠心分離して菌体を
除去し、得られる上清を粗酵素液として採取することも
できる。この粗酵素液はさらに酵素の分野で通常用いら
れている方法で精製することができる。この精製方法と
しては、例えば、硫安分画法や限外濾過膜を用いて酵素
を濃縮した後、イオン交換カラムクロマトグラフィー、
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等で行なえば良い。
気的に行なわれ、これにより培養液中にノイラミニダー
ゼ２２０が生成、蓄積される。培養液からのノイラミニ
ダーゼ２２０の採取時期は、ノイラミニダーゼ２２０の
産生量が菌の増殖とともに増加するので適宜、設定すれ
ば良い。培養物中に産生されるノイラミニダーゼ２２０
は、培養終了後の培養物をそのまま遠心分離して菌体を
除去し、得られる上清を粗酵素液として採取することも
できる。この粗酵素液はさらに酵素の分野で通常用いら
れている方法で精製することができる。この精製方法と
しては、例えば、硫安分画法や限外濾過膜を用いて酵素
を濃縮した後、イオン交換カラムクロマトグラフィー、
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等で行なえば良い。
【００４２】ビブリオ・スピーシーズＪＴ０２２０より
ノイラミニダーゼ２２０を生産する具体的方法は、該微
生物を天然海水中に１％Ｎ-アセチルマンノサミン、
０．６７％ バクト イースト ニトロゲン ベース
ｗ／ｏ アミノ アシッド（Ｄｉｆｃｏ社製）を加えた
培地中で培養温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０
℃、ｐＨ６．８〜８．８、好ましくは７．２〜８．２、
培養時間、１０〜４８時間、好ましくは１６〜３６時間
培養することにより行われる。
ノイラミニダーゼ２２０を生産する具体的方法は、該微
生物を天然海水中に１％Ｎ-アセチルマンノサミン、
０．６７％ バクト イースト ニトロゲン ベース
ｗ／ｏ アミノ アシッド（Ｄｉｆｃｏ社製）を加えた
培地中で培養温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０
℃、ｐＨ６．８〜８．８、好ましくは７．２〜８．２、
培養時間、１０〜４８時間、好ましくは１６〜３６時間
培養することにより行われる。
【００４３】目的とする酵素は主に菌体外に分泌される
ため、培養液を遠心分離して菌体を除去すれば、高いノ
イラミニダーゼ活性（約０．５単位／ｍｌ）を有する粗
酵素液が得られる。さらに、この時点での酵素の比活性
は約２０単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、この値は
現在市販されているノイラミニダーゼの中でも高品質の
ものに相当する。さらに、研究や検査に使用する際に問
題となるプロテアーゼや各種グリコシダーゼ活性をほと
んど含まないことが確認された。すなわち本発明のビブ
リオ・スピーシーズＪＴ０２２０を用いれば、培養液上
清を直接、酵素液として用いることができることから、
ノイラミニダーゼを安価でしかも簡便に製造することが
できるという優れた利点を有している。
ため、培養液を遠心分離して菌体を除去すれば、高いノ
イラミニダーゼ活性（約０．５単位／ｍｌ）を有する粗
酵素液が得られる。さらに、この時点での酵素の比活性
は約２０単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、この値は
現在市販されているノイラミニダーゼの中でも高品質の
ものに相当する。さらに、研究や検査に使用する際に問
題となるプロテアーゼや各種グリコシダーゼ活性をほと
んど含まないことが確認された。すなわち本発明のビブ
リオ・スピーシーズＪＴ０２２０を用いれば、培養液上
清を直接、酵素液として用いることができることから、
ノイラミニダーゼを安価でしかも簡便に製造することが
できるという優れた利点を有している。
【００４４】以上説明したビブリオ属に属する微生物由
来のノイラミニダーゼは、ｐＨが７．５以上の条件の
下、コロミン酸に対しては、反応液に二価金属イオンを
加えなければほとんど作用せず、反対に反応液に二価金
属イオンを添加することによってコロミン酸に対する酵
素活性が上昇する。一方、その他のシアル酸含有物質、
例えば、シアリルラクトースに対しては、ｐＨ７．５以
上の範囲でも二価金属イオンの添加の有無に関わらず、
上記酵素は作用する。
来のノイラミニダーゼは、ｐＨが７．５以上の条件の
下、コロミン酸に対しては、反応液に二価金属イオンを
加えなければほとんど作用せず、反対に反応液に二価金
属イオンを添加することによってコロミン酸に対する酵
素活性が上昇する。一方、その他のシアル酸含有物質、
例えば、シアリルラクトースに対しては、ｐＨ７．５以
上の範囲でも二価金属イオンの添加の有無に関わらず、
上記酵素は作用する。
【００４５】従って、コロミン酸とシアリルラクトース
をはじめとするシアル酸含有物質とが混在する試料中の
シアル酸含量を測定する場合に、ｐＨを７．５以上に調
整するとともに二価金属イオンを添加せずに測定すれ
ば、コロミン酸以外のシアル酸含有物質由来のシアル酸
量（Ｓ１）が求められ、二価金属イオンを添加して測定
すれば試料中の全シアル酸量（Ｓ２）が求められる。さ
らに、両者の差（Ｓ２−Ｓ１）からは、コロミン酸由来
のシアル酸量が算出される。
をはじめとするシアル酸含有物質とが混在する試料中の
シアル酸含量を測定する場合に、ｐＨを７．５以上に調
整するとともに二価金属イオンを添加せずに測定すれ
ば、コロミン酸以外のシアル酸含有物質由来のシアル酸
量（Ｓ１）が求められ、二価金属イオンを添加して測定
すれば試料中の全シアル酸量（Ｓ２）が求められる。さ
らに、両者の差（Ｓ２−Ｓ１）からは、コロミン酸由来
のシアル酸量が算出される。
【００４６】従来の技術では、このような測定を行うに
は、コロミン酸に作用しないノイラミニダーゼと全ての
基質に対して作用するノイラミニダーゼの２種類の酵素
を準備する必要があったが、本発明によれば、１種類の
酵素を使用するだけで上記のような各成分毎のシアル酸
含量の測定を行うことができる。ｐＨの調整は常法によ
って行えばよく、例えば７．５以上のｐＨ領域で緩衝作
用を有するバッファーとしてイミダゾール塩酸、トリス
塩酸等が使用できる。
は、コロミン酸に作用しないノイラミニダーゼと全ての
基質に対して作用するノイラミニダーゼの２種類の酵素
を準備する必要があったが、本発明によれば、１種類の
酵素を使用するだけで上記のような各成分毎のシアル酸
含量の測定を行うことができる。ｐＨの調整は常法によ
って行えばよく、例えば７．５以上のｐＨ領域で緩衝作
用を有するバッファーとしてイミダゾール塩酸、トリス
塩酸等が使用できる。
【００４７】本発明で使用することのできる二価金属の
イオンとしては、例えばＭｇ2+、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ
2+、Ｂａ2+、Ｃａ2+、Ｓｒ2+等が挙げられる。その好ま
しい添加量は、１０〜３０ｍＭの範囲内である。反応温
度及び反応時間は、通常行われる温度及び時間であれば
よく、２０〜４０℃で１０〜６０分間程度が好ましい。
上記ノイラミニダーゼは、シアル酸含有物質からシアル
酸残基を遊離させる反応を触媒するが、遊離したシアル
酸量の定量は常法によって行えばよい。例えば、ＴＢＡ
（チオバルビツール酸）法によって行うことができる。
イオンとしては、例えばＭｇ2+、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ
2+、Ｂａ2+、Ｃａ2+、Ｓｒ2+等が挙げられる。その好ま
しい添加量は、１０〜３０ｍＭの範囲内である。反応温
度及び反応時間は、通常行われる温度及び時間であれば
よく、２０〜４０℃で１０〜６０分間程度が好ましい。
上記ノイラミニダーゼは、シアル酸含有物質からシアル
酸残基を遊離させる反応を触媒するが、遊離したシアル
酸量の定量は常法によって行えばよい。例えば、ＴＢＡ
（チオバルビツール酸）法によって行うことができる。
【００４８】
【実施例】以下、製造例、試験例及び実施例により本発
明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。 〔製造例１〕 ノイラミニダーゼ２０５の製造 (1) 酵素の採取 天然海水３５０ｍｌを１２１℃で１５分間滅菌した後、
蒸留水で３ｇのコロミン酸と２ｇのバクト イースト
ニトロゲン ベース ｗ／ｏ アミノ アシッドを溶解
して、滅菌フィルターを用いて無菌的に添加した。これ
に、ビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５の前培養液３
ｍｌを接種し、好気的培養条件下で２７℃で４８時間培
養した。培養終了後、培地を８，０００ｘｇで１５分間
遠心し、菌体を除去して上清液３００ｍｌを得た。この
上清を粗酵素液とした。この粗酵素液の活性と比活性は
それぞれ、０．９６単位／ｍｌ、５０単位／ｍｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎであった。
明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。 〔製造例１〕 ノイラミニダーゼ２０５の製造 (1) 酵素の採取 天然海水３５０ｍｌを１２１℃で１５分間滅菌した後、
蒸留水で３ｇのコロミン酸と２ｇのバクト イースト
ニトロゲン ベース ｗ／ｏ アミノ アシッドを溶解
して、滅菌フィルターを用いて無菌的に添加した。これ
に、ビブリオ・スピーシーズＪＴ０２０５の前培養液３
ｍｌを接種し、好気的培養条件下で２７℃で４８時間培
養した。培養終了後、培地を８，０００ｘｇで１５分間
遠心し、菌体を除去して上清液３００ｍｌを得た。この
上清を粗酵素液とした。この粗酵素液の活性と比活性は
それぞれ、０．９６単位／ｍｌ、５０単位／ｍｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎであった。
【００４９】(2) 酵素の精製 上記(1) において得られた粗酵素液を以下の操作で精製
した。粗酵素液３００ｍｌを充分量の２５ｍＭ イミダ
ゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に対して透析した
後、同じバッファーで平衡化した５０ｍｌのＱＡＥ−ト
ヨパールを加えて穏やかに撹拌しながら酵素を吸着させ
た。これを空カラムに移して担体と上澄みを分けた。担
体は１００ｍｌの２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファ
ー（ｐＨ７．５）で洗浄後、２５ｍＭ イミダゾール塩
酸バッファー＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で担
体に吸着している酵素を溶出させた。活性画分はまとめ
て透析後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ（ファルマシア
製）に付加し、吸着させ、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌのリ
ニアーグラジエントで溶出した。溶出後の活性画分は、
さらにゲル濾過にかけることにより、電気泳動的に単一
バンドの精製ノイラミニダーゼ２０５ ２．１ｍｇを取
得した。この精製酵素の比活性は１１３単位／ｍｇprot
ein であり、出発粗酵素液に比べ精製度が約２倍に上昇
し、その収率は５６％であった。
した。粗酵素液３００ｍｌを充分量の２５ｍＭ イミダ
ゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に対して透析した
後、同じバッファーで平衡化した５０ｍｌのＱＡＥ−ト
ヨパールを加えて穏やかに撹拌しながら酵素を吸着させ
た。これを空カラムに移して担体と上澄みを分けた。担
体は１００ｍｌの２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファ
ー（ｐＨ７．５）で洗浄後、２５ｍＭ イミダゾール塩
酸バッファー＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で担
体に吸着している酵素を溶出させた。活性画分はまとめ
て透析後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ（ファルマシア
製）に付加し、吸着させ、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌのリ
ニアーグラジエントで溶出した。溶出後の活性画分は、
さらにゲル濾過にかけることにより、電気泳動的に単一
バンドの精製ノイラミニダーゼ２０５ ２．１ｍｇを取
得した。この精製酵素の比活性は１１３単位／ｍｇprot
ein であり、出発粗酵素液に比べ精製度が約２倍に上昇
し、その収率は５６％であった。
【００５０】〔試験例１〕 二価金属イオンのノイラミ
ニダーゼ２０５の酵素活性への影響 精製したノイラミニダーゼ２０５の酵素活性に対する二
価イオンの影響を詳細に検討するために、基質としてコ
ロミン酸を用い、５０ｍＭイミダゾール塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）中、各種の二価金属イオン（Ｍｇ2+，Ｃ
ｏ2+，Ｃｕ2+，Ｚｎ2+，Ｂａ2+，Ｃａ2+，Ｓｒ2+）をそ
れぞれ２０ｍＭ濃度になるように添加してノイラミニダ
ーゼ２０５の活性を測定した。具体的には、１％（ｗ／
ｖ）濃度のコロミン酸溶液（５０ｍＭイミダゾール塩酸
（ｐＨ７．５）中）２２μｌと０．００３単位／５μｌ
の酵素液と２００ｍＭの二価金属イオン溶液３μｌから
なる反応溶液を３７℃、１０分間インキュベートした
後、遊離したシアル酸量をＴＢＡ法で定量し、二価金属
イオンの替わりに５０ｍＭイミダゾール塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）を３μｌ添加して活性を測定したコント
ロール値を基準として比較した。結果を表５及び図４に
示す。
ニダーゼ２０５の酵素活性への影響 精製したノイラミニダーゼ２０５の酵素活性に対する二
価イオンの影響を詳細に検討するために、基質としてコ
ロミン酸を用い、５０ｍＭイミダゾール塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）中、各種の二価金属イオン（Ｍｇ2+，Ｃ
ｏ2+，Ｃｕ2+，Ｚｎ2+，Ｂａ2+，Ｃａ2+，Ｓｒ2+）をそ
れぞれ２０ｍＭ濃度になるように添加してノイラミニダ
ーゼ２０５の活性を測定した。具体的には、１％（ｗ／
ｖ）濃度のコロミン酸溶液（５０ｍＭイミダゾール塩酸
（ｐＨ７．５）中）２２μｌと０．００３単位／５μｌ
の酵素液と２００ｍＭの二価金属イオン溶液３μｌから
なる反応溶液を３７℃、１０分間インキュベートした
後、遊離したシアル酸量をＴＢＡ法で定量し、二価金属
イオンの替わりに５０ｍＭイミダゾール塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）を３μｌ添加して活性を測定したコント
ロール値を基準として比較した。結果を表５及び図４に
示す。
【００５１】
【表５】 ──────────────────────── 二価金属イオン 活性 (ΔOD549/10min.) ──────────────────────── コントロール ０．１８ Ｍｇ2+ １．８１ Ｃｏ2+ １．５８ Ｃｕ2+ １．３８ Ｚｎ2+ １．００ Ｂａ2+ １．１０ Ｃａ2+ ０．５２ Ｓｒ2+ ０．６１ ──────────────────────── この表５から、ノイラミニダーゼ２０５は二価金属イオ
ンによりその酵素活性が高められることが判る。
ンによりその酵素活性が高められることが判る。
【００５２】〔試験例２〕 ノイラミニダーゼ２０５の
ｐＨによる作用性 コロミン酸に作用しないｐＨ範囲を明らかにするため、
各ｐＨ範囲でのＭｇＣｌ2存在下、非存在下での活性を
以下のようにして調べた。すなわち、２５μｌの１％コ
ロミン酸溶液を５μｌの０．００３単位の酵素液（ノイ
ラミニダーゼ２０５）と以下のバッファー中で反応させ
た。別個に、各バッファーに２０ｍＭのＭｇＣｌ2を添
加した溶液中での活性を測定した。その結果を図５に示
す。
ｐＨによる作用性 コロミン酸に作用しないｐＨ範囲を明らかにするため、
各ｐＨ範囲でのＭｇＣｌ2存在下、非存在下での活性を
以下のようにして調べた。すなわち、２５μｌの１％コ
ロミン酸溶液を５μｌの０．００３単位の酵素液（ノイ
ラミニダーゼ２０５）と以下のバッファー中で反応させ
た。別個に、各バッファーに２０ｍＭのＭｇＣｌ2を添
加した溶液中での活性を測定した。その結果を図５に示
す。
【００５３】図５からＭｇＣｌ2無添加の場合にコロミ
ン酸にほとんど作用しないｐＨ範囲は７．５以上であっ
た。したがってｐＨ７．５以上かつＭｇＣｌ2無添加の
条件でコロミン酸に本酵素を作用させれば、コロミン酸
に作用させずに他のシアル酸含有物質由来のシアル酸量
を測定できる。
ン酸にほとんど作用しないｐＨ範囲は７．５以上であっ
た。したがってｐＨ７．５以上かつＭｇＣｌ2無添加の
条件でコロミン酸に本酵素を作用させれば、コロミン酸
に作用させずに他のシアル酸含有物質由来のシアル酸量
を測定できる。
【００５４】〔実施例１〕５０ｍＭ イミダゾール塩酸
（ｐＨ７．５）中にコロミン酸、α２−３シアリルラク
トース、ガングリオシドＧＭ３、フェツインをそれぞれ
シアル酸含量として１００ｎｍｏｌ含む基質溶液２５μ
ｌに０．００３単位の上記バッファーに対して徹底的に
透析した酵素液（ノイラミニダーゼ２０５）５μｌ加え
て３７℃、１０分間反応させた。また、５０ｍＭ イミ
ダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．５）＋２０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2中で同様の反応を行い、反応で生じたシアル酸
量をＴＢＡ法で測定した。その結果を表６に示す。
（ｐＨ７．５）中にコロミン酸、α２−３シアリルラク
トース、ガングリオシドＧＭ３、フェツインをそれぞれ
シアル酸含量として１００ｎｍｏｌ含む基質溶液２５μ
ｌに０．００３単位の上記バッファーに対して徹底的に
透析した酵素液（ノイラミニダーゼ２０５）５μｌ加え
て３７℃、１０分間反応させた。また、５０ｍＭ イミ
ダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．５）＋２０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2中で同様の反応を行い、反応で生じたシアル酸
量をＴＢＡ法で測定した。その結果を表６に示す。
【００５５】
【表６】 ─────────────────────────── 基 質 活性 (ΔOD549/10min.) ───────────── (-Mg2+) (20mM Mg2+) ─────────────────────────── α２−３シアリルラクトース 0.681 0.650 コロミン酸 0.002 0.334 ガングリオシドＧＭ３ 0.510 0.497 フェツイン 0.792 0.760 ───────────────────────────
【００５６】表６により、新規なノイラミニダーゼ２０
５が生成したシアル酸量は、コロミン酸が基質である場
合を除いて、反応液中のＭｇＣｌ2の存在に関わらず、
ほぼ同程度のシアル酸を遊離させた。一方、コロミン酸
に本酵素を作用させた場合、ＭｇＣｌ2を反応液中に添
加しない場合はシアル酸をほとんど遊離しなかったが、
ＭｇＣｌ2を添加した場合はシアル酸を遊離した。
５が生成したシアル酸量は、コロミン酸が基質である場
合を除いて、反応液中のＭｇＣｌ2の存在に関わらず、
ほぼ同程度のシアル酸を遊離させた。一方、コロミン酸
に本酵素を作用させた場合、ＭｇＣｌ2を反応液中に添
加しない場合はシアル酸をほとんど遊離しなかったが、
ＭｇＣｌ2を添加した場合はシアル酸を遊離した。
【００５７】試験例２及び実施例１より、以下のことが
分かる。即ち、ノイラミニダーゼ２０５はコロミン酸に
作用する場合に限り、反応液に二価金属イオンを添加す
ることによってその活性が上昇する。しかし、ｐＨが
７．５以上の範囲では二価金属イオンを反応液中に加え
なければ該酵素はコロミン酸に対してほとんど作用しな
い。一方、その他の基質例えば、シアリルラクトースに
対してはｐＨ７．５以上でも二価金属イオンの添加、無
添加に関わらず該酵素は作用する。
分かる。即ち、ノイラミニダーゼ２０５はコロミン酸に
作用する場合に限り、反応液に二価金属イオンを添加す
ることによってその活性が上昇する。しかし、ｐＨが
７．５以上の範囲では二価金属イオンを反応液中に加え
なければ該酵素はコロミン酸に対してほとんど作用しな
い。一方、その他の基質例えば、シアリルラクトースに
対してはｐＨ７．５以上でも二価金属イオンの添加、無
添加に関わらず該酵素は作用する。
【００５８】〔製造例２〕 ノイラミニダーゼ２２０の
製造 (1) 酵素の採取 天然海水１００ｍｌを１２１℃で１５分間滅菌した後、
蒸留水で１ｇのＮ−アセチルマンノサミンと０．６７ｇ
のバクト イースト ニトロゲン ベース ｗ／ｏ ア
ミノ アシッドを溶解して、滅菌フィルターを用いて無
菌的に添加した。これに、ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２２０の前培養液１ｍｌを接種し、好気的培養条件下
で２７℃で４８時間培養した。培養終了後、培地を８，
０００ｘｇで１５分間遠心し、菌体を除去して上清液９
０ｍｌを得た。この上清を粗酵素液とした。この粗酵素
液の活性と比活性はそれぞれ、０．５２単位／ｍｌ、２
５単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。
製造 (1) 酵素の採取 天然海水１００ｍｌを１２１℃で１５分間滅菌した後、
蒸留水で１ｇのＮ−アセチルマンノサミンと０．６７ｇ
のバクト イースト ニトロゲン ベース ｗ／ｏ ア
ミノ アシッドを溶解して、滅菌フィルターを用いて無
菌的に添加した。これに、ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２２０の前培養液１ｍｌを接種し、好気的培養条件下
で２７℃で４８時間培養した。培養終了後、培地を８，
０００ｘｇで１５分間遠心し、菌体を除去して上清液９
０ｍｌを得た。この上清を粗酵素液とした。この粗酵素
液の活性と比活性はそれぞれ、０．５２単位／ｍｌ、２
５単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００５９】(2) 酵素の精製 上記(1) より得られた粗酵素液を以下の操作で精製し
た。粗酵素液９０ｍｌを充分量の２５ｍＭ イミダゾー
ル塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に対して透析した後、
同じバッファーで平衡化した４０ｍｌのＱＡＥ−トヨパ
ールを加えて穏やかに撹拌しながら酵素を吸着させた。
これを空カラムに移して担体と上澄みを分けた。担体は
１００ｍｌの２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）で洗浄後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸
バッファー＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で担体
に吸着している酵素を溶出させた。活性画分はまとめて
透析後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ
７．５）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ（ファルマシア製）
に付加し、吸着させ、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。
溶出された活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥしたところ、電
気泳動的に単一のバンドの精製ノイラミニダーゼ２２０
０．７２ｍｇを取得した。この精製酵素の比活性は５
５単位／ｍｇ proteinであり、出発粗酵素液に比べて
２．２倍に上昇し、全活性は４０単位、活性収率は８５
％であった。
た。粗酵素液９０ｍｌを充分量の２５ｍＭ イミダゾー
ル塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に対して透析した後、
同じバッファーで平衡化した４０ｍｌのＱＡＥ−トヨパ
ールを加えて穏やかに撹拌しながら酵素を吸着させた。
これを空カラムに移して担体と上澄みを分けた。担体は
１００ｍｌの２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）で洗浄後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸
バッファー＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で担体
に吸着している酵素を溶出させた。活性画分はまとめて
透析後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ
７．５）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ（ファルマシア製）
に付加し、吸着させ、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。
溶出された活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥしたところ、電
気泳動的に単一のバンドの精製ノイラミニダーゼ２２０
０．７２ｍｇを取得した。この精製酵素の比活性は５
５単位／ｍｇ proteinであり、出発粗酵素液に比べて
２．２倍に上昇し、全活性は４０単位、活性収率は８５
％であった。
【００６０】〔実施例２〕製造例２で得られた精製酵素
を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し
て透析した後、同緩衝液で蛋白質濃度が３５μｇ／ｍｌ
になるように酵素液を調製した。２５μｌの基質溶液
（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１％
（Ｗ／Ｖ）濃度にコロミン酸を溶解）に酵素液５μｌを
添加することにより反応を開始させ、３５℃で１５分間
反応させた。
を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し
て透析した後、同緩衝液で蛋白質濃度が３５μｇ／ｍｌ
になるように酵素液を調製した。２５μｌの基質溶液
（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１％
（Ｗ／Ｖ）濃度にコロミン酸を溶解）に酵素液５μｌを
添加することにより反応を開始させ、３５℃で１５分間
反応させた。
【００６１】一方、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して精製酵素を
透析した後、上記と同様の蛋白質濃度となるように酵素
液を調製した。１０ｍＭのＥＤＴＡを含む基質溶液（同
上）に酵素液５μｌを添加することにより反応を開始さ
せ、３５℃で１５分間反応させた。両者の反応によって
生じたシアル酸量をＴＢＡ法によって測定した。
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して精製酵素を
透析した後、上記と同様の蛋白質濃度となるように酵素
液を調製した。１０ｍＭのＥＤＴＡを含む基質溶液（同
上）に酵素液５μｌを添加することにより反応を開始さ
せ、３５℃で１５分間反応させた。両者の反応によって
生じたシアル酸量をＴＢＡ法によって測定した。
【００６２】その結果、ＥＤＴＡを含まない緩衝液中で
測定した値（ΔＯＤ５４９／１５ｍｉｎ）とＥＤＴＡを
含む緩衝液中で測定した値は、それぞれ０．１６３及び
０．００２であった。ＥＤＴＡは金属イオンが酵素活性
に与える影響を除去する作用を有するため、ＥＤＴＡの
添加により反応液中に存在する二価金属イオンの酵素に
対する作用が阻害されて、コロミン酸由来のシアル酸量
が少なく測定され、一方、ＥＤＴＡの無添加により二価
金属イオンの酵素に対する作用が働き、コロミン酸由来
のシアル酸量が多く測定されたことが分かる。
測定した値（ΔＯＤ５４９／１５ｍｉｎ）とＥＤＴＡを
含む緩衝液中で測定した値は、それぞれ０．１６３及び
０．００２であった。ＥＤＴＡは金属イオンが酵素活性
に与える影響を除去する作用を有するため、ＥＤＴＡの
添加により反応液中に存在する二価金属イオンの酵素に
対する作用が阻害されて、コロミン酸由来のシアル酸量
が少なく測定され、一方、ＥＤＴＡの無添加により二価
金属イオンの酵素に対する作用が働き、コロミン酸由来
のシアル酸量が多く測定されたことが分かる。
【００６３】
【発明の効果】本発明によれば、１種類のノイラミニダ
ーゼで、コロミン酸及びその他のシアル酸含有物質を含
む混合物中におけるコロミン酸以外のシアル酸含有物質
由来のシアル酸量及び全シアル酸量を測定することがで
きる。
ーゼで、コロミン酸及びその他のシアル酸含有物質を含
む混合物中におけるコロミン酸以外のシアル酸含有物質
由来のシアル酸量及び全シアル酸量を測定することがで
きる。
【図１】ノイラミニダーゼ２０５の各温度による作用性
を示す図。
を示す図。
【図２】ノイラミニダーゼ２２０の各ｐＨによる作用性
を示す図。
を示す図。
【図３】ノイラミニダーゼ２２０の各温度による作用性
を示す図。
を示す図。
【図４】ノイラミニダーゼ２０５活性への二価金属イオ
ンの影響を示す図。
ンの影響を示す図。
【図５】基質をコロミン酸とした場合における、ノイラ
ミニダーゼ２０５の各ｐＨ範囲での酵素活性（ＭｇＣｌ
2存在下、非存在下）を示す図。
ミニダーゼ２０５の各ｐＨ範囲での酵素活性（ＭｇＣｌ
2存在下、非存在下）を示す図。
Claims (5)
- 【請求項１】 ノイラミニダーゼを用いて、コロミン酸
及び他のシアル酸含有物質を含む混合物中のコロミン酸
由来のシアル酸量を測定する方法。 - 【請求項２】 ビブリオ属に属する微生物由来のノイラ
ミニダーゼを用いて、コロミン酸及び他のシアル酸含有
物質を含む混合物中のコロミン酸由来のシアル酸量を測
定する方法。 - 【請求項３】 ビブリオ属に属する微生物由来のノイラ
ミニダーゼが、下記の理化学的性質 （１）作用及び特異性：糖蛋白質、糖脂質、オリゴ糖及
び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基を
遊離させる反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：５〜７ （３）至適温度：５０℃ （４）分子量：約６５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る測定） を有するノイラミニダーゼ２０５であることを特徴とす
る、請求項２記載のシアル酸量の測定法。 - 【請求項４】 ビブリオ属に属する微生物が、ビブリオ
・スピーシーズＪＴ０２０５であることを特徴とする、
請求項２又は３記載のシアル酸量の測定法。 - 【請求項５】 コロミン酸及び他のシアル酸含有物質を
含む混合物中に、(a) 二価金属イオンを添加することな
く、ビブリオ属に属する微生物由来のノイラミニダーゼ
を添加し、混合物のｐＨを７．５以上に調整して反応さ
せることにより、コロミン酸以外のシアル酸含有物質由
来のシアル酸量を測定するとともに、(b) ビブリオ属に
属する微生物由来のノイラミニダーゼ及び二価金属イオ
ンを添加し、混合物のｐＨを７．５以上に調整して反応
させることにより、全シアル酸量を測定し、この全シア
ル酸量と、工程(a) で測定したコロミン酸以外のシアル
酸含有物質由来のシアル酸量との差から、コロミン酸由
来のシアル酸量を算出することを特徴とする、コロミン
酸由来のシアル酸量の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15815095A JPH09296A (ja) | 1995-06-23 | 1995-06-23 | シアル酸量の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15815095A JPH09296A (ja) | 1995-06-23 | 1995-06-23 | シアル酸量の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09296A true JPH09296A (ja) | 1997-01-07 |
Family
ID=15665360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15815095A Pending JPH09296A (ja) | 1995-06-23 | 1995-06-23 | シアル酸量の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09296A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6034130A (ja) * | 1983-08-06 | 1985-02-21 | Kanamasu Ikedaen:Kk | カルシウム付き緑茶の製造法 |
| US4954476A (en) * | 1987-01-23 | 1990-09-04 | Siemens Aktiengesellschaft | Method of making catalysts from titanium oxide |
| US10090021B2 (en) | 2016-03-31 | 2018-10-02 | Sony Interactive Entertainment Inc. | Electronic apparatus |
-
1995
- 1995-06-23 JP JP15815095A patent/JPH09296A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6034130A (ja) * | 1983-08-06 | 1985-02-21 | Kanamasu Ikedaen:Kk | カルシウム付き緑茶の製造法 |
| JPS6240977B2 (ja) * | 1983-08-06 | 1987-09-01 | Kanemasu Ikedaen Kk | |
| US4954476A (en) * | 1987-01-23 | 1990-09-04 | Siemens Aktiengesellschaft | Method of making catalysts from titanium oxide |
| US10090021B2 (en) | 2016-03-31 | 2018-10-02 | Sony Interactive Entertainment Inc. | Electronic apparatus |
| US10446192B2 (en) | 2016-03-31 | 2019-10-15 | Sony Interactive Entertainment Inc. | Electronic apparatus with air duct and fan |
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