JPH06113846A - キチナーゼ - Google Patents
キチナーゼInfo
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- JPH06113846A JPH06113846A JP3055416A JP5541691A JPH06113846A JP H06113846 A JPH06113846 A JP H06113846A JP 3055416 A JP3055416 A JP 3055416A JP 5541691 A JP5541691 A JP 5541691A JP H06113846 A JPH06113846 A JP H06113846A
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- Japan
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- chitinase
- colloidal chitin
- chitin
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記の理化学的性質を有する新規キチナーゼ
Ａ：作用コロイダルキチンに作用し、Ｎ−アセチルグル
コサミン及び重合度２，３及び５のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を生成する：至適pH：３０℃でpH5.０と9.０に至
適pHを有する：至適温度：pH9.０で４５℃付近に至適温
度を有する：pH安定性：３０℃、pH5.０〜１0.０、１２
０分間の処理に安定：熱安定性：pH9.０、４０℃、１時
間の処理に安定：分子量：約６６０００：等電点：4.
３、例えばビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４を
用いる該キチナーゼの製造方法、及び該キチナーゼＡを
pH7.５〜１0.０の条件下でコロダルキチンに作用させる
ことを特徴とするペンタＮ−アセチルキトペンタオース
の製造方法。 【効果】 該キチナーゼＡを使用することによりコロイ
ダルキチンからペンタＮ−アセチルキトペンタオースを
選択的に製造することができる。
Ａ：作用コロイダルキチンに作用し、Ｎ−アセチルグル
コサミン及び重合度２，３及び５のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を生成する：至適pH：３０℃でpH5.０と9.０に至
適pHを有する：至適温度：pH9.０で４５℃付近に至適温
度を有する：pH安定性：３０℃、pH5.０〜１0.０、１２
０分間の処理に安定：熱安定性：pH9.０、４０℃、１時
間の処理に安定：分子量：約６６０００：等電点：4.
３、例えばビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４を
用いる該キチナーゼの製造方法、及び該キチナーゼＡを
pH7.５〜１0.０の条件下でコロダルキチンに作用させる
ことを特徴とするペンタＮ−アセチルキトペンタオース
の製造方法。 【効果】 該キチナーゼＡを使用することによりコロイ
ダルキチンからペンタＮ−アセチルキトペンタオースを
選択的に製造することができる。
Description
【０００１】本発明は、ペンタＮ−アセチルキトペンタ
オースを選択的に製造することができる新規キチナーゼ
に関する。本発明はさらに、該キチナーゼの製造方法、
及び該キチナーゼを用いてペンタＮ−アセチルキトペタ
オースを製造する方法に関する。
オースを選択的に製造することができる新規キチナーゼ
に関する。本発明はさらに、該キチナーゼの製造方法、
及び該キチナーゼを用いてペンタＮ−アセチルキトペタ
オースを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、比較的高重合度のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖に、植物の生長、分化作用や防御作用、また
動物細胞に対する免疫賦活作用や抗腫瘍活性等が見出さ
れ、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造が精力的に試みら
れている。従来、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法
としては、酸によりキチンを限定加水分解する方法（Bi
ochem. Biophs. Acta ８３，２４５−２５５、１９６４
年、及び特開昭６１−２７１２９６号公報等）、キチナ
ーゼによりキチンを加水分解する方法（Nature, ２０
０，１１２８、１９６３年）や、キチナーゼやリゾチー
ムなどの糖転移反応を利用した製造方法（T. Usui et a
l ： Biochem. Biophys. Acta,８４０，２５５、１９８
５年：碓氷ら：第３回キチン・キトサン・シンポジウム
講演要旨集、Ｐ．３０、１９８８年；特開平１−２２８
４９１号公報；同１−１７４３８３号公報；及び同１−
１１２９９５号公報等）が知られている。
トオリゴ糖に、植物の生長、分化作用や防御作用、また
動物細胞に対する免疫賦活作用や抗腫瘍活性等が見出さ
れ、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造が精力的に試みら
れている。従来、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法
としては、酸によりキチンを限定加水分解する方法（Bi
ochem. Biophs. Acta ８３，２４５−２５５、１９６４
年、及び特開昭６１−２７１２９６号公報等）、キチナ
ーゼによりキチンを加水分解する方法（Nature, ２０
０，１１２８、１９６３年）や、キチナーゼやリゾチー
ムなどの糖転移反応を利用した製造方法（T. Usui et a
l ： Biochem. Biophys. Acta,８４０，２５５、１９８
５年：碓氷ら：第３回キチン・キトサン・シンポジウム
講演要旨集、Ｐ．３０、１９８８年；特開平１−２２８
４９１号公報；同１−１７４３８３号公報；及び同１−
１１２９９５号公報等）が知られている。
【０００３】しかし、上記の方法はいずれも、５量体オ
リゴマーであるペンタＮ−アセチルキトペンタオースを
効率的に合成するものではなかった。
リゴマーであるペンタＮ−アセチルキトペンタオースを
効率的に合成するものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、キチ
ナーゼを用いて、コロイダルキチンから５量体であるペ
ンタＮ−アセチルキトペンタオースを選択的かつ効率的
に製造する方法を提供することを目的とする。
ナーゼを用いて、コロイダルキチンから５量体であるペ
ンタＮ−アセチルキトペンタオースを選択的かつ効率的
に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ビブリオ
属に属する微生物であるビブリオ アルギノリティカス
（Vibrio alginolyticus）ＴＫ−２４株の培養物に、強
いキチナーゼ活性を見出し、この培養物から精製された
キチナーゼが、コロイダルキチンからペンタＮ−アセチ
ルキトペンタオースを効率良く生産することを見出し、
本発明を完成させるに至った。
属に属する微生物であるビブリオ アルギノリティカス
（Vibrio alginolyticus）ＴＫ−２４株の培養物に、強
いキチナーゼ活性を見出し、この培養物から精製された
キチナーゼが、コロイダルキチンからペンタＮ−アセチ
ルキトペンタオースを効率良く生産することを見出し、
本発明を完成させるに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、新規キチナーゼ、該
キチナーゼの製造方法、及び該キチナーゼを用いたペン
タＮ−アセチルキトペンタオースの選択的製造方法を提
供するものである。ビブリオ アルギノリティカスＴＫ
−２４は、熊本県熊本市より採取された土壌から分離さ
れた。該ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４は、
平成３年２月１５日付で工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託され、その寄託番号は微工研菌寄第１２０１１
号である。
キチナーゼの製造方法、及び該キチナーゼを用いたペン
タＮ−アセチルキトペンタオースの選択的製造方法を提
供するものである。ビブリオ アルギノリティカスＴＫ
−２４は、熊本県熊本市より採取された土壌から分離さ
れた。該ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４は、
平成３年２月１５日付で工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託され、その寄託番号は微工研菌寄第１２０１１
号である。
【０００７】ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４
の菌学的性質は以下の通りである。尚、本明細書中、百
分率、比及び部は、特に断らない限り、重量で表示する
ものとする。ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４
の菌学的性質は以下の通りである。 1.形態的性質 (1) 培養コロニー形態（好気的条件下） ３０℃で良く生育し、肉汁寒天平板上のコロニーは半レ
ンズ状に生育し、半透明であり、表面は平滑である。 (2) 細胞の形態 細胞は曲りのない桿菌であり、0.５μm ×0.７〜1.０μ
m の大きさである。 (3) 運動性 運動性はあり、極毛性で、１本の鞭毛を着生する。 (4) スオーミング スオーミング（Swarming) ：疑陽性（±） 2.生理学的性質 (1) 炭素源の資化性 下記ＴＢＭ培地に各種炭素源を加えて、２８℃１週間の
培養をし、増殖のみられるものを陽性とした。
の菌学的性質は以下の通りである。尚、本明細書中、百
分率、比及び部は、特に断らない限り、重量で表示する
ものとする。ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４
の菌学的性質は以下の通りである。 1.形態的性質 (1) 培養コロニー形態（好気的条件下） ３０℃で良く生育し、肉汁寒天平板上のコロニーは半レ
ンズ状に生育し、半透明であり、表面は平滑である。 (2) 細胞の形態 細胞は曲りのない桿菌であり、0.５μm ×0.７〜1.０μ
m の大きさである。 (3) 運動性 運動性はあり、極毛性で、１本の鞭毛を着生する。 (4) スオーミング スオーミング（Swarming) ：疑陽性（±） 2.生理学的性質 (1) 炭素源の資化性 下記ＴＢＭ培地に各種炭素源を加えて、２８℃１週間の
培養をし、増殖のみられるものを陽性とした。
【０００８】 〔ＴＢＭ培地組成〕 トリスアミノメタン（pH7.５） 0.６１％ NaCl 0.１８％ NH4Cl 0.１ ％ KCl 0.０７５％ MgSO4 ・7H2O 0.０５％ K2HPO4 0.０２３％ CaCl2 ・2H2O ８１ ppm FeSO4 ・7H2O ２7.８ ppm 〔結果〕 ＋：陽性， −：陰性 ショ糖 ＋ セロビオース − Ｄ−グルコン酸 ＋ γ−アミノ酪酸 − プトレッシン ＋ Ｄ−グルクロン酸 − Ｄ−ガラクツロン酸 − プロピオン酸 ＋ グルタール酸 − α−ケトグルタール酸 ＋ エタノール ＋ Ｌ−アラニン ＋ Ｌ−グルタミン酸 ＋ 吉草酸 ＋ Ｌ−アラビノース − Ｌ−ラムノース − (2) 色素の産生能 ＴＢＭ培地＋グリセロール0.２％＋寒天２％の平板培地
で、３０℃４日間培養した。
で、３０℃４日間培養した。
【０００９】色素産生能 ： 陰性 (3) グルコースからの嫌気条件下でのガスの発生 ２％グルコースを含むＴＢＭ培地（ダーラム管入り）で
嫌気条件下で、３０℃１週間の培養をした。 グルコースからのガスの発生（嫌気） ： 陰性 (4) NaCl の要求性及び耐性 ＴＢＭ培地より NaCl を除いたもの、及び NaCl を１０
％加えたもので生育を調べた。
嫌気条件下で、３０℃１週間の培養をした。 グルコースからのガスの発生（嫌気） ： 陰性 (4) NaCl の要求性及び耐性 ＴＢＭ培地より NaCl を除いたもの、及び NaCl を１０
％加えたもので生育を調べた。
【００１０】 ０％ NaCl での生育 ： 陰性 １０％ NaCl での生育 ： 陽性 (5) アルギニンジヒドロラーゼ活性 １％Ｌ−アルギニンを含む培地で３０℃１週間培養をし
て、アルギニンジヒドロラーゼ活性を調べた。
て、アルギニンジヒドロラーゼ活性を調べた。
【００１１】アルギニンジヒドロラーゼ活性 ： 陰性 (6) アセトイン，ダイアセチルの生成（Ｖ−Ｐ反応） アセトイン，ダイアセチルの生成 ： 陰性 (7) 硝酸塩の還元性 0.１％ NaNO3を含む培地で硝酸塩の還元能を調べた。
【００１２】硝酸塩の還元性 ： 陽性 (8) オキシダーゼ活性 オキシダーゼ活性 ： 陽性 (9) ４０℃での生育 ４０℃生育性 ： 陽性 (10) 嫌気的条件下での生育 ガスパック嫌気システムでの生育 ： 陽性 以上の菌学的性質からバージェーズ マニュアル オブ
システマティックバクテリオロジー，vol １、（１９
８４）(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,
vol １．１９８４）を参考に、検討したところ、ビブ
リオ属（Vibrio) の一種である、ビブリオ・アルギノリ
ティカス（Vibrio alginolyticus) ＴＫ−２４と同定さ
れた。
システマティックバクテリオロジー，vol １、（１９
８４）(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,
vol １．１９８４）を参考に、検討したところ、ビブ
リオ属（Vibrio) の一種である、ビブリオ・アルギノリ
ティカス（Vibrio alginolyticus) ＴＫ−２４と同定さ
れた。
【００１３】本発明のキチナーゼＡは、ビブリオ属に属
し、キチナーゼＡの生産能を有する微生物を栄養源含有
培地に接種し、好気的に又は嫌気的培養することにより
製造される。この様な微生物の１例として上記のビブリ
オ アルギノリティカスＴＫ−２４を挙げることができ
る。上記微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の
培養法に準ずるが、通常は液体培養による振盪培養法、
通気撹拌培養法などの好気的条件下で行なうのが好適で
ある。
し、キチナーゼＡの生産能を有する微生物を栄養源含有
培地に接種し、好気的に又は嫌気的培養することにより
製造される。この様な微生物の１例として上記のビブリ
オ アルギノリティカスＴＫ−２４を挙げることができ
る。上記微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の
培養法に準ずるが、通常は液体培養による振盪培養法、
通気撹拌培養法などの好気的条件下で行なうのが好適で
ある。
【００１４】培養に用いられる培地としては、ビブリオ
属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地で
あればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地な
どいずれも用いることができる。培地組成としては炭素
源としてのキチンの他、グルコース、シュークロース、
フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖
蜜、コーン・スティーブ・リカー、有機酸、油脂などを
単独または組み合せて使用してもよい。窒素源としては
ファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、
硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を
単独または組み合せて用い得る。また、ナトリウム塩、
カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その他の重金
属塩なども必要に応じて添加使用され得る。なお、培養
中発泡の著しいときは、アデカノール（登録商標）、シ
リコーンオイル等の公知の各種消泡剤を適宜培地中に添
加することもできるが、その添加は目的物質の生産に悪
影響を与えないものとする必要がある。例えば0.５％以
下で使用することが好ましい。
属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地で
あればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地な
どいずれも用いることができる。培地組成としては炭素
源としてのキチンの他、グルコース、シュークロース、
フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖
蜜、コーン・スティーブ・リカー、有機酸、油脂などを
単独または組み合せて使用してもよい。窒素源としては
ファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、
硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を
単独または組み合せて用い得る。また、ナトリウム塩、
カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その他の重金
属塩なども必要に応じて添加使用され得る。なお、培養
中発泡の著しいときは、アデカノール（登録商標）、シ
リコーンオイル等の公知の各種消泡剤を適宜培地中に添
加することもできるが、その添加は目的物質の生産に悪
影響を与えないものとする必要がある。例えば0.５％以
下で使用することが好ましい。
【００１５】培地のpHは微生物の至適pH範囲、通常中性
付近とするのが望ましい。培地温度は、微生物が良好に
生育する温度、通常2.０〜４０℃、とくに好ましくは３
０℃付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場合、
一般に１〜５日間程度、好ましくは約１０８時間であ
る。上記培養によって目的とするキチナーゼが生成蓄積
される。もちろん上述した各種の培養条件は、本発明の
目的が達成される限り適宜変更でき、上記範囲から最適
条件を選択、調節される。
付近とするのが望ましい。培地温度は、微生物が良好に
生育する温度、通常2.０〜４０℃、とくに好ましくは３
０℃付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場合、
一般に１〜５日間程度、好ましくは約１０８時間であ
る。上記培養によって目的とするキチナーゼが生成蓄積
される。もちろん上述した各種の培養条件は、本発明の
目的が達成される限り適宜変更でき、上記範囲から最適
条件を選択、調節される。
【００１６】上記培養により生産されるキチナーゼの単
離精製は、該キチナーゼの蓄積が最大になる時に、酵素
を単離精製する一般的方法に準じて、行なうことができ
る。例えば、菌体を除去した培養液から塩析により取得
した沈殿物を、さらに溶解、透析、ゲル濾過等の手順に
従って精製することができる。本発明の方法において用
いられるビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４の生
産するキチナーゼには、少なくとも２種類の酵素が存在
することがわかっている。そのうちの１種である本発明
のキチナーゼＡは、以下の理化学的性質を有するもので
ある。
離精製は、該キチナーゼの蓄積が最大になる時に、酵素
を単離精製する一般的方法に準じて、行なうことができ
る。例えば、菌体を除去した培養液から塩析により取得
した沈殿物を、さらに溶解、透析、ゲル濾過等の手順に
従って精製することができる。本発明の方法において用
いられるビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４の生
産するキチナーゼには、少なくとも２種類の酵素が存在
することがわかっている。そのうちの１種である本発明
のキチナーゼＡは、以下の理化学的性質を有するもので
ある。
【００１７】（１）作用：コロイダルキチンに作用し、
Ｎ−アセチルグルコサミン及び重合度２，３及び５のＮ
−アセチルキトオリゴ糖を生成する。 （２）至適pH：pH5.０及び9.０（基質：コロイダルキチ
ン） （３）pH安定性：pH4.０〜8.０、３０℃、１２時間の処
理に安定 （４）至適温度：４５℃（基質：コロイダルキチン） （５）熱安定性：pH9.０、４０℃以下、１時間の処理に
安定 （６）分子量：約６６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：4.３ 上記のキチナーゼＡを、pH7.５〜１0.０の条件下で、コ
ロイダルキチンに作用させることにより、ペンタＮ−ア
セチルキトペンタオースを製造することができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン及び重合度２，３及び５のＮ
−アセチルキトオリゴ糖を生成する。 （２）至適pH：pH5.０及び9.０（基質：コロイダルキチ
ン） （３）pH安定性：pH4.０〜8.０、３０℃、１２時間の処
理に安定 （４）至適温度：４５℃（基質：コロイダルキチン） （５）熱安定性：pH9.０、４０℃以下、１時間の処理に
安定 （６）分子量：約６６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：4.３ 上記のキチナーゼＡを、pH7.５〜１0.０の条件下で、コ
ロイダルキチンに作用させることにより、ペンタＮ−ア
セチルキトペンタオースを製造することができる。
【００１８】本発明の製造方法に使用するコロイダルキ
チンの調製方法の１例としては、フレーク状キチン（半
井製）を５℃以下に冷却した濃塩酸で３５〜３７℃で液
の透明度が増すまで加水分解し、その後加水分解された
キチンを蒸留水：エタノール＝１：１混液から再結晶
し、さらに再結晶したキチンを脱イオン水に分散して分
散液が中性になるまで洗浄する方法を挙げることができ
る。
チンの調製方法の１例としては、フレーク状キチン（半
井製）を５℃以下に冷却した濃塩酸で３５〜３７℃で液
の透明度が増すまで加水分解し、その後加水分解された
キチンを蒸留水：エタノール＝１：１混液から再結晶
し、さらに再結晶したキチンを脱イオン水に分散して分
散液が中性になるまで洗浄する方法を挙げることができ
る。
【００１９】本発明の方法により、上記のコロイダルキ
チンと上記のキチナーゼＡを作用させるには、酵素の基
質であるコロイダルキチンの濃度範囲を、反応溶液の全
重量に対して0.２５〜1.０重量％（乾燥重量）、好まし
くは0.５重量％とし、pHを7.５〜１0.０、好ましくは9.
０とし、温度を３０〜５５℃、好ましくは４５℃として
反応させればよい。キチナーゼＡの使用量はコロイダル
キチン１ｇ（乾燥重量）当り１〜３万ユニット（１ユニ
ット：１分間に１μmol のＮ−アセチルグルコサミンを
遊離する活性を有する量）とすればよく、反応は上記の
条件で１２時間〜４０時間継続すればよい。反応溶媒と
しては濃度２５〜１００mMのトリスバッファー又はホウ
砂−塩酸バッファーを挙げることができる。
チンと上記のキチナーゼＡを作用させるには、酵素の基
質であるコロイダルキチンの濃度範囲を、反応溶液の全
重量に対して0.２５〜1.０重量％（乾燥重量）、好まし
くは0.５重量％とし、pHを7.５〜１0.０、好ましくは9.
０とし、温度を３０〜５５℃、好ましくは４５℃として
反応させればよい。キチナーゼＡの使用量はコロイダル
キチン１ｇ（乾燥重量）当り１〜３万ユニット（１ユニ
ット：１分間に１μmol のＮ−アセチルグルコサミンを
遊離する活性を有する量）とすればよく、反応は上記の
条件で１２時間〜４０時間継続すればよい。反応溶媒と
しては濃度２５〜１００mMのトリスバッファー又はホウ
砂−塩酸バッファーを挙げることができる。
【００２０】本発明の方法には精製したキチナーゼＡを
使用することが好ましいが、キチナーゼＡの生産能を有
する微生物の培養液、若しくは該培養液から硫安分画し
た粗精製キチナーゼＡを使用してもよい。例えば、培養
上清に硫安で８０％飽和し、沈殿したタンパクを濾別
し、２０mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.０に懸濁し、
上述バッファーで透析した粗精製キチナーゼＡを使用す
ることができる。
使用することが好ましいが、キチナーゼＡの生産能を有
する微生物の培養液、若しくは該培養液から硫安分画し
た粗精製キチナーゼＡを使用してもよい。例えば、培養
上清に硫安で８０％飽和し、沈殿したタンパクを濾別
し、２０mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.０に懸濁し、
上述バッファーで透析した粗精製キチナーゼＡを使用す
ることができる。
【００２１】反応終了後、例えば反応液を遠心分離して
上清を採取し、ペンタＮ−アセチルキトペンタオースを
分離精製すればよい。本発明の方法によれば、重合度５
のＮ−アセチルキトオリゴ糖が主成分として得られる。
反応混合物からのペンタＮ−アセチルキトペンタオース
の分離精製は、反応生成物を酵素反応液から分離採取す
る一般的方法に準じて行なうことができる。例えば、上
記の反応液を遠心液液分配クロマトグラフィー、各種の
ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、分取薄層クロマトグラフィー等、及びこれらの方法
の組み合わせによりペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオ
ースを分離、精製することができる。
上清を採取し、ペンタＮ−アセチルキトペンタオースを
分離精製すればよい。本発明の方法によれば、重合度５
のＮ−アセチルキトオリゴ糖が主成分として得られる。
反応混合物からのペンタＮ−アセチルキトペンタオース
の分離精製は、反応生成物を酵素反応液から分離採取す
る一般的方法に準じて行なうことができる。例えば、上
記の反応液を遠心液液分配クロマトグラフィー、各種の
ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、分取薄層クロマトグラフィー等、及びこれらの方法
の組み合わせによりペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオ
ースを分離、精製することができる。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、植物の生理活性物質及び
臨床検査におけるリゾチーム活性測定の基質として有用
なペンタＮ−アセチルキトペンタオースを、キチンから
選択的かつ高収率で得ることができる。
臨床検査におけるリゾチーム活性測定の基質として有用
なペンタＮ−アセチルキトペンタオースを、キチンから
選択的かつ高収率で得ることができる。
【００２３】
ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４の培養 ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−２４を５００ml容
振とうフラスコ中、下記培地Ａ１００mlを用いて、３０
℃で１２時間、１２０rpm で振とうさせながら前培養し
た。
振とうフラスコ中、下記培地Ａ１００mlを用いて、３０
℃で１２時間、１２０rpm で振とうさせながら前培養し
た。
【００２４】上記のように前培養した種菌をさらに１５
リットル容ジャーファーメンター中（ニューブランスウ
イック製）、下記培地Ｂ１０リットルを用い、培養温度
３０℃、振とう速度３００rpm 、通気量１０リットル／
分の条件で、約１０８時間本培養した。 培地Ａ 肉エキス（かつお肉製） 0.７％（和光純薬） ポリペプトン 1.０％（五大栄養化学） NaCl 2.０％ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ pH 7.０ 培地Ｂ 肉エキス（かつお肉製） 0.７％（和光純薬） ポリペプトン 1.０％（五大栄養化学） NaCl 2.０％ フレーク状キチン 0.３％（ナカライテスク） アデカノール（消泡剤） 0.０２％ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ pH 7.０ 〔実施例２〕 キチナーゼＡの精製 実施例１で得た培養液を、７０００rpm で２５分間遠心
分離し、培養上清を得た。この培養上清を硫酸アンモニ
ウム4.５kgを用いて塩析し（８０％飽和）、沈殿したタ
ンパクをハイフロスーパーセル（Johns-Manville Sales
Corp.製（８リットル））を用いてセライト濾過した。
セル上に残ったタンパクを２０mM酢酸ナトリウム緩衝液
５００ml（pH5.０）に懸濁し、再びセライト濾過し、濾
液を粗酵素液とした。
リットル容ジャーファーメンター中（ニューブランスウ
イック製）、下記培地Ｂ１０リットルを用い、培養温度
３０℃、振とう速度３００rpm 、通気量１０リットル／
分の条件で、約１０８時間本培養した。 培地Ａ 肉エキス（かつお肉製） 0.７％（和光純薬） ポリペプトン 1.０％（五大栄養化学） NaCl 2.０％ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ pH 7.０ 培地Ｂ 肉エキス（かつお肉製） 0.７％（和光純薬） ポリペプトン 1.０％（五大栄養化学） NaCl 2.０％ フレーク状キチン 0.３％（ナカライテスク） アデカノール（消泡剤） 0.０２％ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ pH 7.０ 〔実施例２〕 キチナーゼＡの精製 実施例１で得た培養液を、７０００rpm で２５分間遠心
分離し、培養上清を得た。この培養上清を硫酸アンモニ
ウム4.５kgを用いて塩析し（８０％飽和）、沈殿したタ
ンパクをハイフロスーパーセル（Johns-Manville Sales
Corp.製（８リットル））を用いてセライト濾過した。
セル上に残ったタンパクを２０mM酢酸ナトリウム緩衝液
５００ml（pH5.０）に懸濁し、再びセライト濾過し、濾
液を粗酵素液とした。
【００２５】次に５０ＦＴ−Ｃ−１１０透析チューブ
（三光純薬製）に上記粗酵素液を入れ、２０mM酢酸ナト
リウム緩衝液１５リットル（pH5.０）を透析液として２
回透析した。透析後の酵素懸濁液を、２０mM酢酸緩衝液
pH5.０で平衡化したＤＥＡＥトヨパール−６５０Ｍ（東
ソー社製）にかけ、0.１５Ｍ NaCl の入った２０mM酢酸
ナトリウム緩衝液２リットル（pH5.０）を用いて酵素を
溶出させた。上記の様にして得られた酵素分画４００ml
を再び硫酸アンモニウム２２５ｇを用いて塩析し（８０
％飽和）、生じたタンパクの沈殿を１００００rpm で１
０分間遠心分離して回収した。得られたタンパクの沈殿
を２０mM酢酸ナトリウム緩衝液５０ml（pH5.０）に懸濁
し、この懸濁液を３６／３２インチ透析チューブに入
れ、２０mM酢酸ナトリウム緩衝液１リットル（pH5.０）
を透析液として透析３回を行なった。透析後の酵素懸濁
液を２０mM酢酸ナトリウム緩衝液７０ml（pH5.０）で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール−６５０Ｍ（東ソー社
製）にかけ、２０mM酢酸ナトリウム緩衝液１０リットル
（pH5.０）の０〜0.２Ｍ NaCl リニアグラジエントを用
いて酵素を溶出させた。その後、上記の酵素分画に、硫
酸アンモニウムを３０％飽和になる様に加えた。２０mM
硫酸ナトリウム緩衝液pH5.０、硫酸アンモニウム３０％
飽和で平衡化したブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社
製）に上記の硫安分画を供じた後、２０mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液２リットル（pH5.０）の３０％〜０％硫酸アン
モニウムのリニアグラジエントを用い、疎水クロマトグ
ラフィーを行って酵素を溶出させた。
（三光純薬製）に上記粗酵素液を入れ、２０mM酢酸ナト
リウム緩衝液１５リットル（pH5.０）を透析液として２
回透析した。透析後の酵素懸濁液を、２０mM酢酸緩衝液
pH5.０で平衡化したＤＥＡＥトヨパール−６５０Ｍ（東
ソー社製）にかけ、0.１５Ｍ NaCl の入った２０mM酢酸
ナトリウム緩衝液２リットル（pH5.０）を用いて酵素を
溶出させた。上記の様にして得られた酵素分画４００ml
を再び硫酸アンモニウム２２５ｇを用いて塩析し（８０
％飽和）、生じたタンパクの沈殿を１００００rpm で１
０分間遠心分離して回収した。得られたタンパクの沈殿
を２０mM酢酸ナトリウム緩衝液５０ml（pH5.０）に懸濁
し、この懸濁液を３６／３２インチ透析チューブに入
れ、２０mM酢酸ナトリウム緩衝液１リットル（pH5.０）
を透析液として透析３回を行なった。透析後の酵素懸濁
液を２０mM酢酸ナトリウム緩衝液７０ml（pH5.０）で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール−６５０Ｍ（東ソー社
製）にかけ、２０mM酢酸ナトリウム緩衝液１０リットル
（pH5.０）の０〜0.２Ｍ NaCl リニアグラジエントを用
いて酵素を溶出させた。その後、上記の酵素分画に、硫
酸アンモニウムを３０％飽和になる様に加えた。２０mM
硫酸ナトリウム緩衝液pH5.０、硫酸アンモニウム３０％
飽和で平衡化したブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社
製）に上記の硫安分画を供じた後、２０mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液２リットル（pH5.０）の３０％〜０％硫酸アン
モニウムのリニアグラジエントを用い、疎水クロマトグ
ラフィーを行って酵素を溶出させた。
【００２６】溶出した酵素分画を回収して３６／３２イ
ンチ透析チューブ（和光純薬社製）に入れ、２０mM酢酸
ナトリウム緩衝液２リットル（pH5.０）を透析液として
透析２回を行った。透析後の酵素液を高速液体クロマト
グラフィー（東ソーＵＶ−８０００、ＣＣＰＭ、ＦＣ−
８０００）にかけた。カラムは２０mM酢酸ナトリウム緩
衝液pH5.０で平衡化した TSK gelＤＥＡＥ５−ＰＷ（東
ソー社製）を用い、溶離液は２０mM酢酸ナトリウム緩衝
液、１リットル（pH5.０）、０〜0.３Ｍ NaClのリニア
グラジエントを用いて、酵素を溶出させた。
ンチ透析チューブ（和光純薬社製）に入れ、２０mM酢酸
ナトリウム緩衝液２リットル（pH5.０）を透析液として
透析２回を行った。透析後の酵素液を高速液体クロマト
グラフィー（東ソーＵＶ−８０００、ＣＣＰＭ、ＦＣ−
８０００）にかけた。カラムは２０mM酢酸ナトリウム緩
衝液pH5.０で平衡化した TSK gelＤＥＡＥ５−ＰＷ（東
ソー社製）を用い、溶離液は２０mM酢酸ナトリウム緩衝
液、１リットル（pH5.０）、０〜0.３Ｍ NaClのリニア
グラジエントを用いて、酵素を溶出させた。
【００２７】次に得られた酵素分画を３６／３２インチ
透析チューブ（和光純薬社製）に入れ、蒸留水２リット
ルを透析液として透析を行った後、得られた酵素懸濁液
を凍結乾燥し、精製キチナーゼＡ5.５mgを得た。 〔実施例３〕 至適pH，至適温度の測定 キチナーゼＡの活性測定は、リゾチームの簡単な活性測
定で知られているシャーレの変法（Agr. Biol. Chem, V
ol ３５、 NO.７、１１５４〜１１５６、１９７１）に
準じて行った。
透析チューブ（和光純薬社製）に入れ、蒸留水２リット
ルを透析液として透析を行った後、得られた酵素懸濁液
を凍結乾燥し、精製キチナーゼＡ5.５mgを得た。 〔実施例３〕 至適pH，至適温度の測定 キチナーゼＡの活性測定は、リゾチームの簡単な活性測
定で知られているシャーレの変法（Agr. Biol. Chem, V
ol ３５、 NO.７、１１５４〜１１５６、１９７１）に
準じて行った。
【００２８】反応生成物のＮ−アセチルグルコサミンに
より、フェリシアン化カリウム中の鉄イオンが還元さ
れ、酵素反応溶液の４２０nmにおける吸光度が減少す
る。前述の1.０％コロイダルキチン1.０mlと１００mMト
リス− HCl緩衝液1.０mlを加えて全量を２mlとし、３０
℃で１０分間、プレインキューベーションした。上記の
溶液に、上記のキチナーゼＡ約0.０１ユニットを添加
し、３０分間４５℃で反応させた。反応液を２〜４℃、
３０００rpm で１０分間遠心分離した後、上清７５０μ
l を採取し、１mlのシャーレの試薬（0.５Ｍ炭酸ナトリ
ウムと0.００５％フェリシアン化カリウムから成る水溶
液）を加え、１００℃で１５分間加熱した。次いで流水
で急速冷却した後、４２０nmにおける吸光度の減少（Δ
Ａ42 0 を測定した。還元糖の生成は、Ｎ−アセチルグル
コサミンを用いた標準曲線から求めた。
より、フェリシアン化カリウム中の鉄イオンが還元さ
れ、酵素反応溶液の４２０nmにおける吸光度が減少す
る。前述の1.０％コロイダルキチン1.０mlと１００mMト
リス− HCl緩衝液1.０mlを加えて全量を２mlとし、３０
℃で１０分間、プレインキューベーションした。上記の
溶液に、上記のキチナーゼＡ約0.０１ユニットを添加
し、３０分間４５℃で反応させた。反応液を２〜４℃、
３０００rpm で１０分間遠心分離した後、上清７５０μ
l を採取し、１mlのシャーレの試薬（0.５Ｍ炭酸ナトリ
ウムと0.００５％フェリシアン化カリウムから成る水溶
液）を加え、１００℃で１５分間加熱した。次いで流水
で急速冷却した後、４２０nmにおける吸光度の減少（Δ
Ａ42 0 を測定した。還元糖の生成は、Ｎ−アセチルグル
コサミンを用いた標準曲線から求めた。
【００２９】キチナーゼＡの活性を次式により計算し
た。 Ｕ／ml＝ΔＡ420 ×1.２０×１／キチナーゼ量（ml）×
１／時間（分） ΔＡ420 ＝４２０nmにおける吸光度の変化 1.２０＝標準物質Ｎ−アセチルグルコサミンに対する標
準線の傾き 但し、キチナーゼ１ユニット（Ｕ）は１分間に１μmol
のＮ−アセチルグルコサミンを遊離する活性を有する量
とする。
た。 Ｕ／ml＝ΔＡ420 ×1.２０×１／キチナーゼ量（ml）×
１／時間（分） ΔＡ420 ＝４２０nmにおける吸光度の変化 1.２０＝標準物質Ｎ−アセチルグルコサミンに対する標
準線の傾き 但し、キチナーゼ１ユニット（Ｕ）は１分間に１μmol
のＮ−アセチルグルコサミンを遊離する活性を有する量
とする。
【００３０】上記の活性測定法により、キチナーゼＡに
対するpH及び温度の影響を調べた。0.０１ユニットのキ
チナーゼＡを１００mMクエン酸−HCl 緩衝液１ml（pH3.
０）中、３０℃で３０分間にわたり1.０％コロイダルキ
チン１mlと反応させて、その後ΔＡ420 を測定した。さ
らに、緩衝液を１００mMクエン酸−HCl 緩衝液（pH4.
０、5.０、6.０及び7.０）、１００mMトリス−HCl 緩衝
液（pH7.０、8.０及び9.０）、次いで１００mM炭酸ナト
リウム緩衝液（pH9.０、１0.０及び１1.０）に変えて上
記の測定を繰り返した。その結果を図１に示す。この結
果から、実施例２で得られたキチナーゼＡの至適pHは5.
０と9.０であることがわかった。
対するpH及び温度の影響を調べた。0.０１ユニットのキ
チナーゼＡを１００mMクエン酸−HCl 緩衝液１ml（pH3.
０）中、３０℃で３０分間にわたり1.０％コロイダルキ
チン１mlと反応させて、その後ΔＡ420 を測定した。さ
らに、緩衝液を１００mMクエン酸−HCl 緩衝液（pH4.
０、5.０、6.０及び7.０）、１００mMトリス−HCl 緩衝
液（pH7.０、8.０及び9.０）、次いで１００mM炭酸ナト
リウム緩衝液（pH9.０、１0.０及び１1.０）に変えて上
記の測定を繰り返した。その結果を図１に示す。この結
果から、実施例２で得られたキチナーゼＡの至適pHは5.
０と9.０であることがわかった。
【００３１】また、0.０１ユニットのキチナーゼＡを３
０℃、２４時間、pH3.０、5.０、7.０、9.０及び１1.０
の条件下にそれぞれ放置した後に、1.０％コロイダルキ
チン１mlを添加し３０℃で３０分間反応させ、その後Δ
Ａ420 を測定することにより、キチナーゼＡのpH安定性
を測定した。その結果を図２に示す。この結果から実施
例２で得られたキチナーゼＡはpH5.０〜１0.０の範囲で
安定であることがわかった。
０℃、２４時間、pH3.０、5.０、7.０、9.０及び１1.０
の条件下にそれぞれ放置した後に、1.０％コロイダルキ
チン１mlを添加し３０℃で３０分間反応させ、その後Δ
Ａ420 を測定することにより、キチナーゼＡのpH安定性
を測定した。その結果を図２に示す。この結果から実施
例２で得られたキチナーゼＡはpH5.０〜１0.０の範囲で
安定であることがわかった。
【００３２】0.０１ユニットのキチナーゼＡを0.４Ｍト
リス−HCl 緩衝液１ml（pH9.０）と１％コロイダルキチ
ン溶液１mlの混液中で３０℃で３０分間反応させて、そ
の後ΔＡ420 を測定した。さらに、反応温度を３５、４
０、４５、５０、及び５５℃に変えて上記の方法を繰り
返した。その結果を図３に示す。この結果から実施例２
で得られたキチナーゼＡの至適温度は４５℃であること
がわかった。
リス−HCl 緩衝液１ml（pH9.０）と１％コロイダルキチ
ン溶液１mlの混液中で３０℃で３０分間反応させて、そ
の後ΔＡ420 を測定した。さらに、反応温度を３５、４
０、４５、５０、及び５５℃に変えて上記の方法を繰り
返した。その結果を図３に示す。この結果から実施例２
で得られたキチナーゼＡの至適温度は４５℃であること
がわかった。
【００３３】また、0.０１ユニットのキチナーゼＡをpH
9.０で３０分間、３０、４０、５０、６０及び７０℃に
それぞれ保持して前処理した後に、１％コロイダルキチ
ン溶液１mlを添加し、前処理温度と同じ温度で３０分間
反応させて、その後ΔＡ420を測定することにより、キ
チナーゼＡの温度安定性を測定した。その結果を図４に
示す。この結果は、実施例２で得たキチナーゼＡが４０
℃以下の温度で安定であることがわかった。 〔実施例４〕 キチナーゼＡによるペンタＮ−アセチルキトペンタオー
スの製造 コロイダルキチンを以下のように製造した。
9.０で３０分間、３０、４０、５０、６０及び７０℃に
それぞれ保持して前処理した後に、１％コロイダルキチ
ン溶液１mlを添加し、前処理温度と同じ温度で３０分間
反応させて、その後ΔＡ420を測定することにより、キ
チナーゼＡの温度安定性を測定した。その結果を図４に
示す。この結果は、実施例２で得たキチナーゼＡが４０
℃以下の温度で安定であることがわかった。 〔実施例４〕 キチナーゼＡによるペンタＮ−アセチルキトペンタオー
スの製造 コロイダルキチンを以下のように製造した。
【００３４】フレーク状キチン（半井製）２０ｇを５℃
以下に冷却した濃塩酸８００mlに撹拌しながら加え、キ
チン粉末が均一に分散した後、分散液を撹拌しながら、
３７℃まで加熱した。分散液の透明度が増したところ
で、その分散液をグラスウールで濾過し、濾液を５℃以
下に保ったまま、蒸留水とエタノールの混合溶液（１：
１）を添加しつつ、キチンを再結晶した。次に遠心分離
によってコロイド状になったキチンを回収し、その後脱
イオン水８００mlに懸濁した。上記の遠心分離と洗浄の
工程を、キチンの分散液が中性になるまで繰り返して、
コロイダルキチンを得た。
以下に冷却した濃塩酸８００mlに撹拌しながら加え、キ
チン粉末が均一に分散した後、分散液を撹拌しながら、
３７℃まで加熱した。分散液の透明度が増したところ
で、その分散液をグラスウールで濾過し、濾液を５℃以
下に保ったまま、蒸留水とエタノールの混合溶液（１：
１）を添加しつつ、キチンを再結晶した。次に遠心分離
によってコロイド状になったキチンを回収し、その後脱
イオン水８００mlに懸濁した。上記の遠心分離と洗浄の
工程を、キチンの分散液が中性になるまで繰り返して、
コロイダルキチンを得た。
【００３５】尚、上記の手順により得られたコロイダル
キチンの濃度は、一定量のコロイダルキチンの分散液を
採取し、これを１０５℃で３時間乾燥し、残留物の重量
を測定することにより得ることができる。上記の１％コ
ロイダルキチン１mlを１００mMホウ砂−HCl 緩衝液（pH
9.０）１mlに加え、さらに0.１ユニットの実施例２で得
たキチナーゼＡを添加した。上記混合物を３０℃で１２
時間反応させた。反応液を１２０００rpm で３分間遠心
分離し、上清を採取し、これを１００℃で１０分間加熱
処理して酵素反応を止め、酵素反応サンプルを得た。
キチンの濃度は、一定量のコロイダルキチンの分散液を
採取し、これを１０５℃で３時間乾燥し、残留物の重量
を測定することにより得ることができる。上記の１％コ
ロイダルキチン１mlを１００mMホウ砂−HCl 緩衝液（pH
9.０）１mlに加え、さらに0.１ユニットの実施例２で得
たキチナーゼＡを添加した。上記混合物を３０℃で１２
時間反応させた。反応液を１２０００rpm で３分間遠心
分離し、上清を採取し、これを１００℃で１０分間加熱
処理して酵素反応を止め、酵素反応サンプルを得た。
【００３６】次いで、高速液体クロマトグラフィー（東
ソーＵＶ−８０１１、ＣＣＰＥ）で３０μl の上記の酵
素反応サンプルを分析した。分析は、ＴＳＫゲル アミ
ド−８０カラム８（東ソー）を用い、７０％アセトニト
リル（ＭＥＲＣＫ社）を溶出液として用いて、流速１ml
／分で酵素反応生成物を溶出させた。検出器（東ソー、
ＵＶ−８０１１）は２１０nmの吸収で検出した。
ソーＵＶ−８０１１、ＣＣＰＥ）で３０μl の上記の酵
素反応サンプルを分析した。分析は、ＴＳＫゲル アミ
ド−８０カラム８（東ソー）を用い、７０％アセトニト
リル（ＭＥＲＣＫ社）を溶出液として用いて、流速１ml
／分で酵素反応生成物を溶出させた。検出器（東ソー、
ＵＶ−８０１１）は２１０nmの吸収で検出した。
【００３７】その結果を図５に示す。この結果、上記の
酵素反応サンプル中に、ペンタ−Ｎ−アセチルキトペン
タオース0.03mg／mlが存在することがわかった。また、
重合度６以上のＮ−アセチルオリゴ糖は検出されなかっ
た。 〔実施例５〕コロイダルキチンとキチナーゼＡの反応時
間を１、６、２４及び３６時間にした他は実施例４の手
順を繰り返して、酵素反応サンプルを得た。
酵素反応サンプル中に、ペンタ−Ｎ−アセチルキトペン
タオース0.03mg／mlが存在することがわかった。また、
重合度６以上のＮ−アセチルオリゴ糖は検出されなかっ
た。 〔実施例５〕コロイダルキチンとキチナーゼＡの反応時
間を１、６、２４及び３６時間にした他は実施例４の手
順を繰り返して、酵素反応サンプルを得た。
【００３８】また、上記の各サンプルにつき、実施例４
と同様に高速液体クロマトグラフィーにより分析を行な
った。上記分析により得られた各Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖の生成量を反応時間に対してプロットし、これを図
６に示した。図６により、実施例２で得たキチナーゼＡ
は、２４時間以上の反応時間で効率よくペンタ−Ｎ−ア
セチルキトペンタオースを合成することがわかった。
と同様に高速液体クロマトグラフィーにより分析を行な
った。上記分析により得られた各Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖の生成量を反応時間に対してプロットし、これを図
６に示した。図６により、実施例２で得たキチナーゼＡ
は、２４時間以上の反応時間で効率よくペンタ−Ｎ−ア
セチルキトペンタオースを合成することがわかった。
【図１】図１は、ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−
２４が生産するキチナーゼＡに対するpHの影響を示す図
である。横軸はpH、縦軸は至適pHでの反応を１００とし
たときの相対活性を表わす。
２４が生産するキチナーゼＡに対するpHの影響を示す図
である。横軸はpH、縦軸は至適pHでの反応を１００とし
たときの相対活性を表わす。
【図２】図２は、ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−
２４が生産するキチナーゼＡのpH安定性を示す図であ
る。横軸はpH、縦軸は至適pHでの反応を１００としたと
きの相対活性を表わす。
２４が生産するキチナーゼＡのpH安定性を示す図であ
る。横軸はpH、縦軸は至適pHでの反応を１００としたと
きの相対活性を表わす。
【図３】図３は、ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−
２４が生産するキチナーゼＡの温度の影響を示す図であ
る。横軸は温度、至適温度での反応を１００としたとき
の相対活性を表す。
２４が生産するキチナーゼＡの温度の影響を示す図であ
る。横軸は温度、至適温度での反応を１００としたとき
の相対活性を表す。
【図４】図４は、ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−
２４が生産するキチナーゼＡの温度安定性を示す図であ
る。横軸は温度、縦軸はキチナーゼＡの残存活性率を表
す。
２４が生産するキチナーゼＡの温度安定性を示す図であ
る。横軸は温度、縦軸はキチナーゼＡの残存活性率を表
す。
【図５】図５は、ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−
２４が生産するキチナーゼＡの酵素反応サンプルの高性
能液体クロマトグラムを示す図である。横軸は保持時
間、縦軸は２１０nmの吸光度を表す。
２４が生産するキチナーゼＡの酵素反応サンプルの高性
能液体クロマトグラムを示す図である。横軸は保持時
間、縦軸は２１０nmの吸光度を表す。
【図６】図６は、ビブリオ アルギノリティカスＴＫ−
２４が生産するキチナーゼＡの酵素反応生成物の経時変
化を示す図面である。横軸は反応時間、縦軸は各キトオ
リゴ糖生成量を表す。
２４が生産するキチナーゼＡの酵素反応生成物の経時変
化を示す図面である。横軸は反応時間、縦軸は各キトオ
リゴ糖生成量を表す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年４月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】培地のｐＨは微生物の至適ｐＨ範囲、通常
中性付近とするのが望ましい。培地温度は、微生物が良
好に生育する温度、通常２０〜４０℃、とくに好ましく
は３０℃付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場
合、一般に１〜５日間程度、好ましくは約１０８時間で
ある。上記培養によって目的とするキチナーゼが生成蓄
積される。もちろん上述した各種の培養条件は、本発明
の目的が達成される限り適宜変更でき、上記範囲から最
適条件を選択、調節される。
中性付近とするのが望ましい。培地温度は、微生物が良
好に生育する温度、通常２０〜４０℃、とくに好ましく
は３０℃付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場
合、一般に１〜５日間程度、好ましくは約１０８時間で
ある。上記培養によって目的とするキチナーゼが生成蓄
積される。もちろん上述した各種の培養条件は、本発明
の目的が達成される限り適宜変更でき、上記範囲から最
適条件を選択、調節される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】（２）至適ｐＨ：ｐＨ５．０及び９．０
（基質：コロイダルキチン） （３）ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜８．０、３０℃、１２
０分の処理に安定 （４）至適温度：４５℃（基質：コロイダルキチン） （５）熱安定性：ｐＨ９．０、４０℃以下、１時間の処
理に安定 （６）分子量：約６６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：４．３ 上記のキチナーゼＡを、ｐＨ７．５〜１０．０の条件下
で、コロイダルキチンに作用させることにより、ペンタ
Ｎ−アセチルキトペンタオースを製造することができ
る。
（基質：コロイダルキチン） （３）ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜８．０、３０℃、１２
０分の処理に安定 （４）至適温度：４５℃（基質：コロイダルキチン） （５）熱安定性：ｐＨ９．０、４０℃以下、１時間の処
理に安定 （６）分子量：約６６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：４．３ 上記のキチナーゼＡを、ｐＨ７．５〜１０．０の条件下
で、コロイダルキチンに作用させることにより、ペンタ
Ｎ−アセチルキトペンタオースを製造することができ
る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】また、０．０１ユニットのキチナーゼＡを
３０℃、１２０分、ｐＨ３．０、５．０、７．０、９．
０及び１１．０の条件下にそれぞれ放置した後に、１．
０％コロイダルキチン１ｍｌを添加し３０℃で３０分間
反応させ、その後ΔＡ４２０を測定することにより、キ
チナーゼＡのｐＨ安定性を測定した。その結果を図２に
示す。この結果から実施例２で得られたキチナーゼＡは
ｐＨ５．０〜１０．０の範囲で安定であることがわかっ
た。
３０℃、１２０分、ｐＨ３．０、５．０、７．０、９．
０及び１１．０の条件下にそれぞれ放置した後に、１．
０％コロイダルキチン１ｍｌを添加し３０℃で３０分間
反応させ、その後ΔＡ４２０を測定することにより、キ
チナーゼＡのｐＨ安定性を測定した。その結果を図２に
示す。この結果から実施例２で得られたキチナーゼＡは
ｐＨ５．０〜１０．０の範囲で安定であることがわかっ
た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年４月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】追加
【補正内容】
【００１７】（１）作用：コロイダルキチンに作用し、
Ｎ−アセチルグルコサミン及び重合度２，３及び５のＮ
−アセチルキトオリゴ糖を生成する。 （２）至適ｐＨ：ｐＨ５．０及び９．０（基質：コロイ
ダルキチン） （３）ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜８．０、３０℃、１２
０分の処理に安定 （４）至適温度：４５℃（基質：コロイダルキチン） （５）熱安定性：ｐＨ９．０、４０℃以下、１時間の処
理に安定 （６）分子量：約６６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：４．３ 上記のキチナーゼＡを、ｐＨ７．５〜１０．０の条件下
で、コロイダルキチンに作用させることにより、ペンタ
Ｎ−アセチルキトペンタオースを製造することができ
る。
Ｎ−アセチルグルコサミン及び重合度２，３及び５のＮ
−アセチルキトオリゴ糖を生成する。 （２）至適ｐＨ：ｐＨ５．０及び９．０（基質：コロイ
ダルキチン） （３）ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜８．０、３０℃、１２
０分の処理に安定 （４）至適温度：４５℃（基質：コロイダルキチン） （５）熱安定性：ｐＨ９．０、４０℃以下、１時間の処
理に安定 （６）分子量：約６６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：４．３ 上記のキチナーゼＡを、ｐＨ７．５〜１０．０の条件下
で、コロイダルキチンに作用させることにより、ペンタ
Ｎ−アセチルキトペンタオースを製造することができ
る。
Claims (3)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規キチナ
ーゼＡ （１）作用：コロイダルキチンに作用し、Ｎ−アセチル
グルコサミン及び重合度２，３及び５のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖を生成する。 （２）至適pH：３０℃でpH5.０と9.０に至適pHを有する
（基質：コロイダルキチン） （３）至適温度：pH9.０で４５℃付近に至適温度を有す
る（基質：コロイダルキチン） （４）pH安定性：３０℃、pH5.０〜１0.０、１２０分間
の処理に安定 （５）熱安定性：pH9.０、４０℃、１時間の処理に安定 （６）分子量：約６６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：4.３ - 【請求項２】 ビブリオ属に属する請求項１記載のキチ
ナーゼＡ生産菌を培養し、その培養物から該キチナーゼ
Ａを単離することを特徴とするキチナーゼＡの製造方
法。 - 【請求項３】 請求項１記載のキチナーゼＡを、pH7.５
〜１0.０の条件下でコロダルキチンに作用させることを
特徴とする、ペンタＮ−アセチルキトペンタオースの製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3055416A JPH06113846A (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | キチナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3055416A JPH06113846A (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | キチナーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113846A true JPH06113846A (ja) | 1994-04-26 |
Family
ID=12997970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3055416A Pending JPH06113846A (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | キチナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06113846A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1096007A1 (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-02 | Agency Of Industrial Science And Technology | Chitinase and method for preparing the same |
| JP2008079501A (ja) * | 2005-03-14 | 2008-04-10 | Yamaguchi Univ | カイコキチナーゼおよびそれを含有してなる昆虫防除剤。 |
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
| WO2019102838A1 (ja) * | 2017-11-22 | 2019-05-31 | 国立大学法人東京大学 | キチン分解酵素組成物、キチン分解反応液及び糖の製造方法 |
-
1991
- 1991-03-20 JP JP3055416A patent/JPH06113846A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1096007A1 (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-02 | Agency Of Industrial Science And Technology | Chitinase and method for preparing the same |
| JP2008079501A (ja) * | 2005-03-14 | 2008-04-10 | Yamaguchi Univ | カイコキチナーゼおよびそれを含有してなる昆虫防除剤。 |
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
| WO2019102838A1 (ja) * | 2017-11-22 | 2019-05-31 | 国立大学法人東京大学 | キチン分解酵素組成物、キチン分解反応液及び糖の製造方法 |
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