JPH0515369A - 新規プルラナーゼおよびその製造法 - Google Patents

新規プルラナーゼおよびその製造法

Info

Publication number
JPH0515369A
JPH0515369A JP3192491A JP19249191A JPH0515369A JP H0515369 A JPH0515369 A JP H0515369A JP 3192491 A JP3192491 A JP 3192491A JP 19249191 A JP19249191 A JP 19249191A JP H0515369 A JPH0515369 A JP H0515369A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
negative
pullulanase
optimum
bacillus
positive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP3192491A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3026857B2 (ja
Inventor
Yoshinaga Tachibana
佳永 橘
Iwao Kojima
岩夫 小島
Ritsuko Yoshida
律子 吉田
Tomoko Adachi
朋子 足立
Yoshiaki Takesada
好昭 武貞
Saburo Yamauchi
三郎 山内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NAGASE SEIKAGAKU KOGYO KK
Original Assignee
NAGASE SEIKAGAKU KOGYO KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NAGASE SEIKAGAKU KOGYO KK filed Critical NAGASE SEIKAGAKU KOGYO KK
Priority to JP3192491A priority Critical patent/JP3026857B2/ja
Priority to US07/902,739 priority patent/US5281527A/en
Publication of JPH0515369A publication Critical patent/JPH0515369A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3026857B2 publication Critical patent/JP3026857B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/24Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405Glucanases
    • C12N9/2451Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457Pullulanase (3.2.1.41)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y302/00Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041Pullulanase (3.2.1.41)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 酸性条件下でのpH安定性に優れた新規プル
ラナーゼを提供する。 【構成】 バチルス属に属する微生物、特にパチルス
サーキュランスSV−98株(FERM BP−389
6)を培養することにより酸性条件下でのpH安定性に
優れた新規プルラナーゼが製造される。この酵素は例え
ば澱粉からグルコースやマルトースを製造する際に有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は新規プルラナーゼおよび
その製造方法に関する。更に詳しくは、バチルス属に属
する微生物を培養することにより得られる新規プルラナ
ーゼおよびその製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα
−1,6−グルコシダーゼは、グルコアミラーゼとの併
用により澱粉からグルコースを製造したり、またβ−ア
ミラーゼとの併用により澱粉からマルトースを製造した
りする際に、これらの糖の増収に有効であることが認め
られている。現在までに報告されているα−1,6−グ
ルコシダーゼは、例えば、エシエリヒア インターメデ
ィア(Escherichia intermedia)のイソアミラーゼ〔ア
プライド マイクロバイオロジー(Applied Microbio
l.)15,492(1967)〕、ストレプトコッカス
ミテイス(Streptococcus mitis )のプルラナーゼ
〔バイオケミカル ジャーナル(Biochem.J.)、10
8,33(1968)〕、ストレプトマイセス属(Stre
ptomyces sp.)のイソアミラーゼ〔ジャーナルオブ ザ
ファーメンテイション テクノロジー(J.Ferment.Te
ch. )、49,552(1971)〕、バチルス属(Ba
cillussp.)のプルラナーゼ〔アグリカルチャラル ア
ンド バイオロジカル ケミストリー(Agric.Biol.Che
m )、40,1515(1976);スターチ(Starc
h)、34,340(1982)〕などがある。しか
し、これらのα−1,6−グルコシダーゼは、温度安定
性およびpH安定性に劣り、また多くはその最適温度が
40〜50℃程度である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】一般に澱粉糖の生産
は、60℃以上の高温で、かつpH4.5以下の酸性条
件下で行われている。この様な条件下で作用するα−
1,6−グルコシダーゼとしては、バチルス アシドプ
ルリチカス(Bacillus acidpullulyticus )[特公昭6
2−25037]やバチルス セクトラマス(Bacillus
sectorramus)[特開昭63−84485]由来のプル
ラナーゼが知られているにすぎない。しかし、両者の酵
素の安定pH範囲において、pH4.5以下は範囲限界
に近いため、より酸性条件下でのpH安定性に優れたα
−1,6−グルコシダーゼが求められる。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、酸性側に
最適pHおよび安定pH範囲を有し、耐熱性であるα−
1,6−グルコシダーゼを生産する菌株を求めるために
広く自然界より検索した結果、京都府福知山市の土壌中
から採取されたバチルス サーキュランス(Bacillus c
irculans)SV−98株が上記目的を達成するものであ
ると認め、本発明を完成するに至った。
【0005】すなわち、本発明の新規プルラナーゼは、
以下のような理化学的性質を有している。 (イ) 作用および基質特異性 プルランに作用し、主としてマルトトリオースを生成す
る。アミロペクチン、β−限界デキストリンおよび可溶
性澱粉のα−1,6−グルコシド結合を分解する。 (ロ) 最適pHおよびpH安定性 最適pHはpH5.0近傍であり、50℃、30分間の
加熱条件下ではpH3.0〜6.5の範囲内で安定であ
る。 (ハ) 温度安定性 pH5.0において30分間保持した場合、55℃まで
安定である。 (ニ) 最適温度 55℃〜60℃の範囲に最適温度を有する。 (ホ) 分子量 ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動による分子量は
98000である。 (ヘ) 等電点 等電点電気泳動による等電点は4.7である。
【0006】本発明の新規プルラナーゼは、バチルス
(Bacillus)属菌、特にバチルス サーキュランス(Ba
cillus circulans)SV−98株(微工研菌寄第121
61号)により生産される。この菌株は以下に示すよう
な菌学的性質を有する。菌学的性質の試験および分類法
は、「バージェーズ マニュアル オブ ディターミネ
イティブ バクテリオロジー 第8版(1974)」お
よび「バージェーズ マニュアル オブ システマテイ
ック バクテリオロジー(1986)」に従って行っ
た。 A.形態 (1)細胞の形 桿菌 (2)細胞の大きさ 0.4 〜0.5 ×3.0 〜8.0 μm (3)運動性の有無 有 (4)胞子の有無 有 (5)グラム染色 陽性 (6)抗酸性染色 陰性 B.各培地における生育状態 (1)標準寒天平板培養 コロニーは正円形、表面はやや ラフで白色。 (2)標準寒天斜面培養 表面はややラフで白色。 (3)標準液体培養 薄く濁り沈澱を有する。色素の 生成はない。 (4)標準ゼラチン穿刺培養 変化なし (5)リトマスミルク 変化なし C.生理学的性質 (1)硝酸塩の還元性 陽性 (2)脱窒反応 陰性 (3)メチルレッド試験 陰性 (4)VPテスト 陰性 (5)インドールの生成 陰性 (6)硫化水素の生成 陰性 (7)澱粉の加水分解 陽性 (8)クエン酸の利用 陰性 (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩 陽性 アンモニウム塩 陰性 (10) 色素の生成 糖加アンモニウム寒天培養で黄 色の不溶性色素を生成。 (11) ウレアーゼ活性 陰性 (12) オキシダーゼ活性 陽性 (13) カタラーゼ活性 陽性 (14) 生育温度の範囲 15〜45℃ (15) 酸素に対する態度 通性嫌気性 (16) ジオキシアセトンの生成 陰性 (17) 馬尿酸の分解 陰性 (18) アルギニンの分解 陰性 (19) フェニルアラニンの脱アミノ 陰性 (20) 温度抵抗性(85℃、10分の耐性) 陽性 (21) 塩化ナトリウムの耐性(2%) 陰性 (22) サブロウ寒天培地における生育 陽性 (23) 0.001 %リゾチーム培地における生育 陽性 (24) チロシンの分解 陽性 (25) クエン酸・アンモニウム寒天培地 でのアルカリ産生 陰性 (26) カゼインの分解 陰性 (27) ゼラチンの分解 陰性 (28) 嫌気性培地における生育 陽性 (29) マッコンキー培地における生育 陰性 (30) レシチナーゼ反応 陰性 (31) VP培地におけるアルカリ産生 陰性 (32) 糖類の利用と生酸性 (a)L−アラビノース 陽性 (b)D−キシロース 陽性 (c)D−グルコース 陽性 (d)D−マンノース 陽性 (e)D−フラクトース 陽性 (f)D−ガラクトース 陰性 (g)麦芽糖 陰性 (h)ショ糖 陽性 (i)乳糖 陰性 (j)トレハロース 陽性 (k)D−ソルビット 陽性 (l)D−マンニット 陰性 (m)イノシット 陰性 (n)グリセリン 陰性 (o)澱粉 陰性 (p)メリビオース 陽性 (q)サリシン 陰性 (r)エタノール 陰性
【0007】これまでに、バチルス サーキュランス
(Bacillus circulans)由来のプルラナーゼとしては、
バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)F−
2株[特開平01−60376]が報告されているが、
この酵素はソジウムドデシルサルフェイト電気泳動によ
る分子量が218000であり、さらにプルラナーゼ活
性の他のアミラーゼ活性も有している。また、プルラナ
ーゼ活性に対する理化学的性質も本発明のプルラナーゼ
と比較したものを表1に示す。
【0008】
【0009】この表からわかるように、本発明のプルラ
ナーゼは、バチルス サーキュランス F−2由来のプ
ルラナーゼ活性を有するアミラーゼとその理化学的性質
が明らかに異なるものであるので、本発明のプルラナー
ゼおよびその生産菌株であるバチルス サーキュランス
(Bacillus circulans)SV−98株は新規なものであ
ると判断される。
【0010】この微生物を培養して本発明のプルラナー
ゼを生産させるには、通常の静置培養、振盪培養、通気
攪拌培養、あるいは固体培養等により連続的あるいは間
欠的に行うことができる。用いる培地は、窒素源として
は例えば、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆
粉、コーンスチープリカ、コーンミール等の有機窒素源
の他、硫安、塩安、硝安、リン安等の無機窒素源が必要
に応じて適宜混合して、または単独で用いられる。炭素
源としては、例えば、水飴、マルトース、各種澱粉、可
溶性澱粉、澱粉液化液、デキストリン、プルラン等が必
要に応じて適宜混合して、または単独で用いられる。培
地には窒素源、炭素源の他に例えば、リン酸、Mg2+
Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、N
+ 、K+ の塩や各種ビタミン類が必要に応じて適宜混
合して、または単独で用いられる。培地のpHは通常p
H4.0〜8.0、好ましくはpH5.0〜6.0が適
当である。培養の温度は通常20〜45℃、好ましくは
37〜42℃で培養するのが適当である。また培養時間
は該菌の生育およびプルラナーゼの生産に十分な時間続
行されるが、通常6〜48時間を要する。
【0011】このようにして培養した後、培養物を遠心
分離または濾過することによって菌体を分離して上清を
得、この上清から通常の手段、例えば塩析法、溶媒沈澱
法(例えばエタノール、アセトン等)によって蛋白質を
沈澱させたり、または限外濾過により濃縮させて本発明
のプルラナーゼを得る。塩析法、溶媒沈澱法ではプルラ
ナーゼを沈澱させ、濾過あるいは遠心分離で沈澱物を集
めた後、これを脱塩処理した物を凍結乾燥粉末とするこ
ともできる。更に上記で得られたプルラナーゼを塩析
法、溶媒沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交
換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法、アフィニティー
クロマトグラフィー法、晶出法等の通常の酵素の精製手
段を適宜組み合わせることによって比活性の向上した粗
酵素乃至精製酵素とすることもできる。
【0012】プルラナーゼの活性測定法並びに活性表示
法は以下の通りである。即ち、0.2Mの酢酸緩衝液
(pH4.5)に溶解させた2%(w/v)のプルラン
溶液0.5mlに酵素液0.5mlを混合し、60℃で
30分間反応させた後、遊離した還元性基の濃度をDN
S法〔ラボラトリー イクスペリメント イン バイオ
ロジカル ケミストリー(Laboratory Experiments in
Biological Chemistry)、3435、(1944)〕に
より測定する。酵素活性の単位は、前述の条件下で1分
間に1μmolのグルコースと当量の還元性基を生成す
る酵素量を1単位とする。
【0013】
【実施例】以下に実施例をもって、本発明の内容をより
具体的に示す。これらはいずれも本発明の内容を例示す
るものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではな
い。
【0014】実施例 1 バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)SV
−98株(FERMP−12161)をプルラン1.0
%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.5%、NaCl
0.5%、MgSO4 ・7H2O 0.05%、MnCl2 0.0
01%、CaCl2 ・2H2O 0.05%、KH2PO4 0.2
%、(NH4)2SO4 0.2%を含む培地(pH6.0)10
mlに1白金耳植菌し、37℃で好気的に16時間振盪
培養を行った。培養終了後、得られた培養物を遠心分離
(10000rpm、10分間)により菌体および不溶
物を除去し、得られた培養上清を酵素液としてそのプル
ラナーゼ活性を測定した。この結果、本実施例で得られ
た酵素液のプルラナーゼ活性は5.3単位/mlであっ
た。
【0015】実施例 2 実施例1で述べた培地および培養方法を用いてバチルス
サーキュランス(Bacillus circulans)SV−98株
を37℃で16時間前培養して得られる種菌液10ml
を10リッター容のジャーファーメンター中のプルラン
2.0%、ポリペプトン1.0%、酵母エキス1.0
%、NaCl 0.5%、MgSO4 ・7H2O 0.05%、MnCl
2 0.001%、CaCl2 ・2H2O 0.05%、KH2PO4
0.2%、(NH4)2SO40.2%を含む培地(pH6.
0)5リッターに添加し、37℃、通気量1vvm、攪
拌回転数500rpmで20時間通気攪拌培養を行っ
た。培養終了後、得られた培養物を10000rpm、
4℃で連続遠心分離して菌体および不溶物を除去した
後、平均分画分子量10000の限外濾過膜を用いて約
10倍に濃縮した。この上清に固形硫酸アンモニウムを
30%飽和濃度となるように添加し夾雑物を析出させ、
遠心分離により除去した後、上清に固形硫酸アンモニウ
ムを65%飽和濃度となるように添加し、4℃で一夜放
置した。生じた沈澱を遠心分離により回収し、脱イオン
水200mlに溶解させた後、脱イオン水に対して一夜
4℃で透析した。透析後の粗酵素溶液を凍結乾燥するこ
とによって、7700単位/gのプルラナーゼ活性を持
つ粗酵素粉末3.8gを得た。
【0016】実施例 3 実施例2で得た粗酵素粉末1gを12.5mMリン酸緩
衝液(pH8.0)に溶解し、同緩衝液で平衡化したD
EAE−トヨパール650M(東洋曹達製)のアニオン
交換カラムに吸着させ、0〜0.5MのNaClを含む1
2.5mMリン酸緩衝液(pH8.0)の濃度勾配法に
よって酵素を溶出させた。溶出した活性画分は、25m
M酢酸緩衝液(pH5.0)に対して一夜4℃で透析し
た。次に25mM酢酸緩衝液(pH5.0)で平衡化し
たα−サイクロデキストリン−エポキシセファロース6
B(ファルマシア製)のアフィニティーカラムに吸着さ
せ、0〜0.3mg/mlのβ−サイクロデキストリン
を含む25mM酢酸緩衝液(pH5.0)の濃度勾配法
によって酵素を溶出させた。溶出した活性画分は、脱イ
オン水に対して一夜4℃で透析した後、平均分画分子量
10000の限外濾過膜を用いて5.5mlに濃縮し
た。この濃縮液は、150単位/mlのプルラナーゼ活
性を持ち、ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動によ
り1バンドであることが認められた。
【0017】実施例 4 実施例3で調製した酵素試料を市販のグルコアミラーゼ
と併用して澱粉の糖化反応を行った。基質としては、コ
ーンスターチを市販液化酵素スピターゼHS(ナガセ生
化学工業(株)製)でDE12に液化したものを使用し
た。糖濃度は糖化時33重量%になる様に調製した。市
販グルコアミラーゼXL−4(ナガセ生化学工業(株)
製)を液化澱粉固形分1gに対して3.3単位の酵素量
と本発明のプルラナーゼを液化澱粉固形分1gに対して
4.0単位の酵素量を加え、pH4.5、60℃で糖化
反応を行った。糖化反応試料のデキストロース含量は、
高速液体クロマトグラフィーにより種々の時間で分析し
た。結果は、次の表2に示す。
【0018】
【0019】実施例 5 実施例3で調製した酵素試料を市販のβ−アミラーゼと
併用して澱粉の糖化反応を行った。基質としては、コー
ンスターチを市販液化酵素スピターゼHS(ナガセ生化
学工業(株)製)でDE12に液化したものを使用し
た。糖濃度は糖化時33重量%になる様に調製した。市
販β−アミラーゼ1500(ナガセ生化学工業(株)
製)を液化澱粉固形分1gに対して15.0単位の酵素
量と本発明のプルラナーゼを液化澱粉固形分1gに対し
て4.0単位の酵素量を加え、pH4.5、60℃で糖
化反応を行った。糖化反応試料のマルトース含量は、高
速液体クロマトグラフィーにより種々の時間で分析し
た。結果は、次の表3に示す。
【0020】
【0021】
【発明の効果】本発明の酵素は、従来のα−1,6−グ
ルコシダーゼに較べて酸性側でのpH安定性に優れてお
り、グルコアミラーゼとの併用により澱粉からグルコー
スを製造したり、β−アミラーゼとの併用により澱粉か
らマルトースを製造する際に、その生産性を改善するも
のである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成4年8月25日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0006
【補正方法】変更
【補正内容】
【0006】本発明の新規プルラナーゼは、バチルス
(Bacillus)属菌、特にバチルス サーキュラ
ンス(Bacillus circulans)SV−
98株(微工研条寄第3896号)により生産される。
この菌株は以下に示すような菌学的性質を有する。菌学
的性質の試験および分類法は、「バージェーズ マニュ
アル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジー
第8版(1974)」および「バージェーズ マニュ
アル オブ システマテイック バクテリオロジー(1
986)」に従って行った。 A.形態 (1)細胞の形 桿菌 (2)細胞の大きさ 0.4〜0.5×3.0〜8.0μm (3)運動性の有無 有 (4)胞子の有無 有 (5)グラム染色 陽性 (6)抗酸性染色 陰性 B.各培地における生育状態 (1)標準寒天平板培養 コロニーは正円形、表面はやや ラフで白色。 (2)標準寒天斜面培養 表面はややラフで白色。 (3)標準液体培養 薄く濁り沈澱を有する。色素の 生成はない。 (4)標準ゼラチン穿刺培養 変化なし (5)リトマスミルク 変化なし C.生理学的性質 (1)硝酸塩の還元性 陽性 (2)脱窒反応 陰性 (3)メチルレッド試験 陰性 (4)VPテスト 陰性 (5)インドールの生成 陰性 (6)硫化水素の生成 陰性 (7)澱粉の加水分解 陽性 (8)クエン酸の利用 陰性 (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩 陽性 アンモニウム塩 陰性 (10)色素の生成 糖加アンモニウム寒天培養で黄 色の不溶性色素を生成。 (11)ウレアーゼ活性 陰性 (12)オキシダーゼ活性 陽性 (13)カタラーゼ活性 陽性 (14)生育温度の範囲 15〜45℃ (15)酸素に対する態度 通性嫌気性 (16)ジオキシアセトンの生成 陰性 (17)馬尿酸の分解 陰性 (18)アルギニンの分解 陰性 (19)フェニルアラニンの脱アミノ 陰性 (20)温度抵抗性(85℃、10分の耐性) 陽性 (21)塩化ナトリウムの耐性(2%) 陰性 (22)サブロウ寒天培地における生育 陽性 (23)0.001%リゾチーム培地における生育 陽性 (24)チロシンの分解 陽性 (25)クエン酸・アンモニウム寒天培地 でのアルカリ産生 陰性 (26)カゼインの分解 陰性 (27)ゼラチンの分解 陰性 (28)嫌気性培地における生育 陽性 (29)マッコンキー培地における生育 陰性 (30)レシチナーゼ反応 陰性 (31)VP培地におけるアルカリ産生 陰性 (32)糖類の利用と生酸性 (a)L−アラビノース 陽性 (b)D−キシロース 陽性 (c)D−グルコース 陽性 (d)D−マンノース 陽性 (e)D−フラクトース 陽性 (f)D−ガラクトース 陰註 (g)麦芽糖 陰性 (h)ショ糖 陽性 (i)乳糖 陰性 (j)トレハロース 陽性 (k)D−ソルビット 陽性 (l)D−マンニット 陰性 (m)イノシット 陰性 (n)グリセリン 陰性 (o)澱粉 陰性 (p)メリビオース 陽性 (q)サリシン 陰性 (r)エタノール 陰性
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0014
【補正方法】変更
【補正内容】
【0014】実施例 1 バチルス サーキュランス(Bacillus cir
culans)SV−98株(FERMBP−389
)をプルラン1.0%、ポリペプトン0.5%、酵母
エキス0.5%、NaCl 0.5%、MgSO・7
O0.05%、MnCl0.001%、CaCl
・2HO0.05%、KHPO0.2%、(N
SO 0.2%を含む培地(pH6.0)1
0mlに1白金耳植菌し、37℃で好気的に16時間振
盪培養を行った。培養終了後、得られた培養物を遠心分
離(10000rpm、10分間)により菌体および不
溶物を除去し、得られた培養上清を酵素液としてそのプ
ルラナーゼ活性を測定した。この結果、本実施例で得ら
れた酵素液のプルラナーゼ活性は5.3単位/mlであ
った。
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成4年8月25日
【旧受託番号】 微工研菌寄第12161号
【新受託番号】 微工研条寄第3896号 (FERM BP−389
6)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 足立 朋子 京都府福知山市長田野町1−52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内 (72)発明者 武貞 好昭 京都府福知山市長田野町1−52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内 (72)発明者 山内 三郎 京都府福知山市長田野町1−52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の理化学的性質を有する新規プルラ
    ナーゼ (イ) 作用および基質特異性 プルランに作用し、主としてマルトトリオースを生成す
    る。アミロペクチン、β−限界デキストリンおよび可溶
    性澱粉のα−1,6−グルコシド結合を分解する。 (ロ) 最適pHおよびpH安定性 最適pHはpH5.0近傍であり、50℃、30分間の
    加熱条件下ではpH3.0〜6.5の範囲内で安定であ
    る。 (ハ) 温度安定性 pH5.0において30分間保持した場合、55℃まで
    安定である。 (ニ) 最適温度 55℃〜60℃の範囲に最適温度を有する。 (ホ) 分子量 ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動による分子量は
    98000である。 (ヘ) 等電点 等電点電気泳動による等電点は4.7である。
  2. 【請求項2】 以下の理化学的性質を有する新規プルラ
    ナーゼ生産能を有するバチルス属に属する微生物を培地
    に培養し、培養物から該プルラナーゼを採取することを
    特徴とする新規プルラナーゼの製造方法。 (イ) 作用および基質特異性 プルランに作用し、主としてマルトトリオースを生成す
    る。アミロペクチン、β−限界デキストリンおよび可溶
    性澱粉のα−1,6−グルコシド結合を分解する。 (ロ) 最適pHおよびpH安定性 最適pHはpH5.0近傍であり、50℃、30分間の
    加熱条件下ではpH3.0〜6.5の範囲内で安定であ
    る。 (ハ) 温度安定性 pH5.0において30分間保持した場合、55℃まで
    安定である。 (ニ) 最適温度 55℃〜60℃の範囲に最適温度を有する。 (ホ) 分子量 ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動による分子量は
    98000である。 (ヘ) 等電点 等電点電気泳動による等電点は4.7である。
  3. 【請求項3】 バチルス属に属する微生物がバチルス
    サーキュランス(Bacillus circulans)である請求項2
    記載の新規プルラナーゼの製造方法。
  4. 【請求項4】 バチルス属に属する微生物がバチルス
    サーキュランス(Bacillus circulans)SV−98株で
    ある請求項3記載の新規プルラナーゼの製造方法。
JP3192491A 1991-07-05 1991-07-05 新規プルラナーゼおよびその製造法 Expired - Lifetime JP3026857B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3192491A JP3026857B2 (ja) 1991-07-05 1991-07-05 新規プルラナーゼおよびその製造法
US07/902,739 US5281527A (en) 1991-07-05 1992-06-23 Process for producing pullalanase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3192491A JP3026857B2 (ja) 1991-07-05 1991-07-05 新規プルラナーゼおよびその製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0515369A true JPH0515369A (ja) 1993-01-26
JP3026857B2 JP3026857B2 (ja) 2000-03-27

Family

ID=16292192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3192491A Expired - Lifetime JP3026857B2 (ja) 1991-07-05 1991-07-05 新規プルラナーゼおよびその製造法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US5281527A (ja)
JP (1) JP3026857B2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6908326B2 (en) 2003-08-08 2005-06-21 J. S. T. Mfg. Co., Ltd. Floating connector
JP2021115715A (ja) * 2020-01-23 2021-08-10 中田エンヂニアリング株式会社 スクリュー、押出機及び押出方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0605040B1 (fr) * 1992-12-28 1999-08-11 Genencor International, Inc. Pullulanase, microorganismes la produisant, procédés de préparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci
EP0769049A1 (en) * 1994-06-15 1997-04-23 Novo Nordisk A/S Pyrodictium xylanase, amylase and pullulanase
WO2012095746A2 (en) 2011-01-11 2012-07-19 Capsugel Belgium Nv New hard capsules
CN110678170A (zh) 2017-04-14 2020-01-10 比利时胶囊公司 普鲁兰多糖胶囊
BR112019021396A2 (pt) 2017-04-14 2020-04-28 Capsugel Belgium Nv processo para fabricação de pululano

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4628028A (en) * 1985-05-23 1986-12-09 Cpc International Inc. Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production
US5055403A (en) * 1989-06-26 1991-10-08 Enzyme Bio-Systems, Ltd. Thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6908326B2 (en) 2003-08-08 2005-06-21 J. S. T. Mfg. Co., Ltd. Floating connector
JP2021115715A (ja) * 2020-01-23 2021-08-10 中田エンヂニアリング株式会社 スクリュー、押出機及び押出方法

Also Published As

Publication number Publication date
US5281527A (en) 1994-01-25
JP3026857B2 (ja) 2000-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS5953038B2 (ja) サイクロデキストリンの製造法
JP3026857B2 (ja) 新規プルラナーゼおよびその製造法
JPH0330672A (ja) 新規耐熱性および耐酸性プルラナーゼ酵素およびその製造方法
US4315988A (en) Thermophilic collagenases, thermophilic bacteria capable of producing thermophilic collagenases, and process for producing said collagenases
EP0258050A2 (en) An amylase of a new type
Yoshida et al. Production and application of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase by a strain of Plesiomonas
JPH0515368A (ja) 新規プルラナーゼおよびその製造方法
US4855232A (en) Method for production of glucose by use of transglucosidase
CA1285896C (en) .alpha.-1, 6-GLUCOSIDASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
US5387516A (en) Heat stable debranching enzyme from a Bacillus microorganism
JP3003008B2 (ja) 耐酸、耐熱性グルコースイソメラーゼ、その製造法及びそれを用いるフラクトースの製造法
JP3557276B2 (ja) 酵素をコードするdnaとそれを含む組換えdna並びに形質転換体
JP3529173B2 (ja) 新規な寒天分解酵素及びそれを用いるネオアガロビオースの製造法
JPS6331194B2 (ja)
KR960007741B1 (ko) 신규 α-1, 6-글루코시다제 및 그의 제조방법
JPS6331195B2 (ja)
JPH062071B2 (ja) 糖類の製造法
JP2544480B2 (ja) プリンヌクレオシドホスホリラ―ゼおよびその製造方法
JPH10136979A (ja) 新規酸性α−アミラーゼ及びその製造法
JP2548356B2 (ja) ブリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびその製造法
JP2691354B2 (ja) 新規なα−アミラーゼ、その製造法及びそれを用いた糖類の製造法
JPH0616704B2 (ja) フッ化物イオンに耐性な細菌カタラーゼ及びそれを生産するミクロコッカスsp.kwi‐5菌株
JPH0358784A (ja) 新規なシクロマルトデキストリナーゼ及びその製造方法
JPH0632611B2 (ja) γ―サイクロデキストリン合成酵素及びその製造法
JPH099960A (ja) 新規ピルビン酸オキシダーゼ及びその製造法 とピルビン酸分析法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees