JPS5953038B2 - サイクロデキストリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はサイクロテ゛キストリンの製造方法に関し、詳
しくはミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に
属する、サイクロデキストリン・グリコジルトランスフ
ェラーゼ（Ｅ、Ｃ０２，４、■、１９）（Ｃｙｃｌｏｄ
ｅｘｔｒｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ） （以下本酵素という）を生成する菌株を培養し
て生成する核サイクロデキストリン・グリコジルトラン
スフェラーゼないしはその含有物を殿粉または殿粉分解
物に作用させて、サイクロテ゛キストリンを生成し、必
要ならばこれを採取するサイクロテ゛キストリンの製造
法に関する。

ここにいうサイクロテ゛キストリンとは、シャルデイン
ガー・テ゛キストリン（Ｓｃｎａｒｄｉｎｇｅｒｄｅｘ
ｔｒｉｎ）とも呼ばれ、殿粉に本酵素を作用させて、生
成される結晶性のデキストリンで、グルコース残基６．
７．８個のα−１・４−結合による環状オリゴ糖である
。

グルコース残基６．７．８個よりなるデキストリンで、
それぞれα−サイクロデキストリン、β−サイクロデキ
ストリン、γ−サイクロデキストリンと呼ばれている環
状デキストリンである。

これらのデキストリンの製法については、古くは、Ｔｉ
１ｄｅｎ、 Ｈｕｄｓｏｎ （Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ
ｏｃ、６４−１１４３２ （１９４２））及びり、Ｆｒ
ｅｎｃｈＣＪ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、７１．
３５３ （１９４９））等が詳述されている。

これらの方法はバチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）の生産する、所謂マセランス・
アミラーゼを用いて、殿粉を分解し、サイクロデキスト
リンを製造する方法である。

その後、これに類似する酵素を生産する菌株として：バ
チルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） （特開昭
５０−６３１８９ ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ、
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） （特開昭４８−４０９９
６）、バチルス・オーベンシス・スピシーズ（Ｂ、 ｏ
ｈｂｅｎｓｉｓ）（特開昭４９−１２４２８５ ）、バ
チルス属Ｎ００３８−２、Ｎｏ、１３５、Ｎｏ、１６９
（特公昭５３−３１２２３）等が知られているが、バ
チルス属以外に本酵素を生産する報告は殆んど知られて
いない。

本発明等は広く土壌中からの微生物を検索しミクロコツ
カス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する２種の菌株
を分離し、これらの菌株がバチルス属の公知酵素に類似
する本酵素を生産することを見出し、しかも、ミクロコ
ツカス属の菌株の生産する本酵素は広いｐＨ領域にて高
い熱安定性を示し、サイクロデキストリン生成能も大で
ある事が確かめられ、この本酵素を用いることにより、
サイクロデキストリンの工業的生産を有利に行い得るこ
とを見出し、本発明を完成するにいたった。

すなわち、本発明の要旨は、ミクロコツカス（Ｍｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するサイクロデキストリン・グ
リコジルトランスフェラーゼ （Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａ
ｎｓｆｅｒａｓｅ ）生成菌を、栄養培地で培養して得
られる培養液、培養Ｐ液、またはその濃縮液あるいはそ
れらの各段階の酵素製品を、殿粉あるいは殿粉分解物に
作用させて、サイクロデキストリンを生成させることを
特徴とするサイクロデキストリンの製造法である。

先ず、本発明の方法に用いられる微生物は、次にも述べ
るように従来サイクロデキストリン・トランスフェラー
ゼ生産菌として知られているバチルス（Ｈａｃｉｌｌｕ
ｓ）属菌株ではなく、同定の結果、球状細菌のミクロコ
ツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ） 属に属する菌株で
あることが見出され、それらのうちの強力な２菌株を仮
にＭ８４９菌株及びＢ６４５菌株と命名して、その菌学
的性質を明らかにした。

なお、これらの菌株の工業技術院微生物工業技術研究所
の微生物受託番号は、それぞれ微工研菌寄４９１２号及
び微工研菌寄４９１３号である。

これらの微生物の菌学的性質の記載に於いて、試験及び
分類はギプス及びスキーナー （Ｂ、 Ｍ、 Ｇｉｂｂｓ ａｎｄ Ｆ、 Ａ、 ５ｋ
ｉｎｎｅｒ）編、アイテ゛ンテイフイケーション・メソ
ーズ・フォア・ミクロビオロジスト （Ｉｄｅｎｔｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｓｔｓ） −Ｉ−版（Ｐａｒｔ Ａ）
（１９６６年）の中にパイアト・パーカー（Ｂａ１ｒｄ
Ｐａｒｋｅｒ ）に依って記述されたメソード・フォア
・クラシファイイック・スタヒロコキイ・アンド・ミク
ロコツキイ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｌａｓｓｉ
ｆｙｉｎｇＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｉ）と題する論文、及び同氏のザ・ジャ
ーナル・オブ・ゼネラル・ミクロヒオロシー（Ｊ、Ｇｅ
ｎ０Ｍ１ＣｒＯｂｉＯ１，）の３０巻、４０９頁（１９
６３年）及び３８巻、３６３頁（１９６５年）等に発表
の雑文を、イバンズとクロース（Ｊ、 Ｂ、 Ｅｖａｎ
ｓ ａｎｄ Ｗ、 Ｅ、Ｋｌｏｏｓ） ｃ７）アプライ
ド・ミクロビオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ） ２３巻３２６頁（１９７２年）に発表
の雑文を、また、コクールとマルテイネク（Ｍ、Ｋｏｃ
ｕｒ ａｎｄＴ、 Ｍａｒｔｉｎｅｃ）等のインターナ
ショナル・ジャーナル・オブ・システィマチイック・バ
クテリオロジ−（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ、
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ）２２巻
、２１８頁及び２２８頁（１９７２年）のそれぞれの雑
文並びにパージニーズ・マニュアル・オブ・テ゛夕ミネ
イテイブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版（１９７４年）の菌学的記載
を参照して行った。

（１） Ｍ８４９菌株（微工研菌寄４９１２号）の菌
学的性質 （ａ）形態 ■ 栄養細胞は直径０．９〜１．５ミクロン球状■ 単
独或は２ケ〜４ケ連鎖し、時に不規則に集合する。

■ 運動性なく ■ 胞子を形成しない ■ ダラム染色は陽性 （ｂ） 各種培地に於ける生育状態（特に記入しない
限り培養温度は３０℃である） ■ 肉汁寒天平板培養 集落は円形、周縁は金縁、凸円状に隆起 し、表面は光沢あり平滑、白色、不透明である。

■ 肉汁寒天斜面培養 生育良好にして線状、表面光沢あり平 滑、周辺なめらかであ邑が長期間培養すると時々波状と
なる事がある。

苗台は白色、不透明で培地は不変。

■ 肉汁液体培養 混濁し、粘質の菌体が沈殿する。

管壁にリング及び菌膜を形成しない。

特別な臭気なく、培養液は着色しない。

■ 肉汁ゲラチン穿刺培養（２０℃培養）生育はおくれ
、初期は表面生育のみで、 中部及び深部は発育しない。

約１５日以上も経過するとかぶら状に極めて僅かに液化
する。

ゲラチンの液化力を別の方法によって試験すると微弱に
液化した。

■ リドマスミルク培養 培養初期は不変であるが、５〜１０日後僅かに酸性に傾
き、以後次第に酸性となる。

ミルクの凝固及び゛ペップトン化、リドマスの脱色等は
認められない。

（Ｃ） 生理的性質 ■ 硝酸塩の還元性：陽性 ■ 脱窒反応：陰性 ■ ＭＲテスｌ−：縦隔性 ■ アセトインの生成：陰性 ■ インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成：陰性 ■ 殿粉の加水分解： （０，２〜１．０％可溶性殿
粉添加肉汁寒天培養に於いて）ｐＨ７，０の場合陰性；
ｐＨ９，５ならば陽性 ■ クエン酸塩の利用性： （コーザー培地、クリステ
ンセン培地及びシモンズ培地を使用）いずれも陰性 ■ 色素の生成：なし ［相］ ウレアーゼ：陽性 ０ オキシダーゼ（Ｋｏｖａｃ法）：陰性＠ カタラー
ゼ：肉汁寒天及び１％グルコース添加寒天培養のいずれ
に於いても陽性 ０ 生育の範囲：生育最適ｐＨは６．０〜８．５の範囲
であるが、ｐＨ９，５に於いてもよく発育する。

ｐＨ５，Ｏ以下では殆んど発育しない。生育最適温度は
２７〜３７℃である。

４０℃或は２０℃で生育するが、１０℃では僅かに生育
し、４５℃以上では生育しない。

０ 酸素に対する態度：好気性 ［相］ ＯＦテスト：酸化的、グルコース及びマンニト
ールから酸化的に酸を生成するが、ガスは生成しない。

嫌気的には酸もガスも生成しない。

〔インターナショナル・サブコミツテイ ー・オン・スタヒロコキイ・アンド・ミクロコキイ （
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅ
ｅｏｎ ５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ Ｍｉｃ
ｒｏｃｏｃｃｉ）の委員会推奨の方法に従う （Ｉｎｔｅｒｎ、Ｂｕｌｌ、Ｂａｃｔ、Ｎｏｍｅｎｃｌ
、Ｔａｘｏｎ、１５巻１０９頁１９６５年）〕 ［相］ 好気的培養条件下に於ける各種糖類から酸の生
成 酸生成 （１）Ｌ−アラビノース： − （２）Ｄ−キシロース： − （３）Ｄ−グルコース： 十 （４）Ｄ−マンノース： 十 （５）Ｄ−フラクトース： 十 （６）Ｄ−ガラクトース： ＋ （７）麦芽糖： ＋ （８）シヨ糖： ＋ （９）乳糖： ＋ （１０） ）レバロース： ＋（１１）
Ｄ−ツルピッ１〜： −（１２１Ｄ−マ
ンニット： ＋ （１３）イノジット： − （１４）グリセリン： ＋ （１５）デンプン： −以上のすべ
ての炭水化物からガスは生成 しない。

■ エスクリンの分解：陰性（長期間培養で時に微弱に
分解あり） ［相］ 馬尿酸の分解：陽性 ■ アルギニンの分解：陰性 ［相］ フェニルアラニンの脱アミン反応：陰性Ｏコア
ギュラーゼ：陰性 ［相］ 溶血性：陰性 ［相］ 塩化ナトリウム耐性：１５％以下の食塩含有肉
汁培地にはよく発育する。

１８％及び２０％食塩含有培地にも遅れて僅かに生育す る。

［株］ フォスファターゼ：陰性 ［相］ ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） ８０の分解：陰性［
相］ 無機窒素源寒天培地における生育：殆んど生育し
ない。

〔クロース（Ｋｌｏｏｓ）等の方
法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
、Ｊ、Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、２４巻７９
頁１９７４年）に従う。

〕Ｏゲラチン液化カニ微弱〔フラジラー・ゲラチン寒天
（Ｆｒａｚｉｅｒ ｇｅｌａｔｉｎ ａｇａｒ）法に従
う〕 ［相］ カゼイン分解カニ陰性〔スキムミルク寒天培地
における溶解にて判定〕 ［相］ ディ・エヌ・アーゼ（ＤＮａｓｅ） ：陰性以
上の性質から本酵素生産能を有する細菌Ｍ８４９菌株は
、ミクロコツカス属に属する細菌で゛あることは明白で
゛ある。

パージニーズ・マニュアル・オブ・テ゛タミネテイブ・
バクテリオロシー第７版（１９５７年）にはミクロコツ
カス属細菌として１６種が記載され、また、サルシナ（
Ｓａｒｃｉｎａ）属も別の独立の属として記載されてい
たが、その後の研究の進歩によって、現在の同分類書第
８版（１９７４年）には、サルシナ属は削除され、ミク
ロコツカス属に属するとされた多くの種も整理統合され
て、ミクロコツカス・ルテウム（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ １ｕｔｅｕｓ）、ミクロコツカス・パリアンス（Ｍ
、 ｖａｒｉａｎｓ）及びミクロコツカス・ロゼウス（
Ｍ、 ｒｏｓｅｕｓ）の唯３種のみとなった。

Ｍ８４９菌株の菌学的性質と、これ等３種の菌学的性状
記載を比較して、最も近似する菌種を選べば、ミクロコ
ツカス・パリアンスが挙げら、ｆ’Ｌル。

ミクロンコツカス・パリアンスの苗字記載によれば、肉
汁寒天培地をはじめとする通常の栄養培地上に発育する
苗台或は集落 （ｃｏｌｏｎｙ）の色が黄色である。

この性質はミクロコツカス・ロゼウスと区別する性質と
して重要な性質の一つであるとされている。

しかし前記引用したパイアト・パーカー等の参考文献を
詳細に検討すると、彼等の分類したミクロコツカス属の
サフ゛グループ５ （ｓｕｂｇｒｏｕｐ５）の中には
白色集落の菌株が多類含まれて居り、このサフ゛グルー
プ 相当するとされている。

またＭ８４９菌株はエスクリン分解力が通常は陰性であ
るが、長期間の培養に於いてエスクリンを微弱ながら分
解する事もあった。

これ等の性質に於いて、コクールそして？／ｌｚテイネ
ク（ Ｍ．Ｋｏｃｕｒ ａｎｄＴ， Ｍａｒｔｉｎｅｃ
）のミクロコツカス・パリアンスのネオタイプ菌株（Ｎ
ｅｏｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）の記載と比較すると少し
相違する点が見られる。

しかし菌膜或は集落の色がＭ８４９菌株は白色で、エス
クリン分解力に於いて、多少の相違があったとしても、
その他の形態的、培養的、生理的性質がミクロコツカス
・パリアンスの性質と一致する故、Ｍ８４９菌株はミク
ロコツカス・パリアンスと同一種と同定すべきを至当と
する。

本ミクロコツカス・パリアンスＭ８４９菌は微生物工業
技術研究所へ寄託され、微工研菌寄第４９１２号を得て
いる。

（２） Ｂ６４５菌株（微工研菌寄４９１３号）の菌
学的性質 （ａ）形態 ■ 栄養綱紀は大きさ直径１．０〜１．８ミクロンの球
状 ■ パケット状（Ｐａｃｋｅｔｓ）の集団を呈す。

■ 運動性なく ■ 胞子を形成しない。

■ ダラム染色陽性 （ｂ） 各種培地に於ける生育状態（特に記入のない
限り培養温度は３０℃である） ■ 肉汁寒天平板培養 点状〜小円形、全縁曲円形、光沢あり、 平滑、暗い黄色〜オレンジ色、不透明 ■ 肉汁寒天斜面培養 生育はやや遅れ中等度或はやや不良、線 状に発育、僅かに隆起、オレンジ黄色〜オレンジ色、表
面平滑、やわらかい、培地は不変である。

■ 肉汁液体培養 生育は遅れ均一に混濁する。

沈渣小量生成、管壁にリング及び菌膜は形成しない。

臭気なく培養液は着色しない。

■ 肉汁ゲラチン穿刺培養（２０℃） 生育は不良。

３０℃で５日間培養後冷却しても固まらない故液化力あ
り。

■ リドマスミルク培養 初めは殆んど変化しない。

リドマスの変色はないまま１０日目頃凝固を始め、ゆっ
くりとペプトン化する。

（Ｃ）生理的性質 ■ 硝酸塩の還元性：陰性 ■ 脱窒反応：陰性 ■ ＭＲテスト：陰性 ■ アセトインの生成：陰性 ■ インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成−：陰性 ■ テ゛ンプンの加水分解： （前記Ｍ８４９菌の場合
と同様の方法）ｐＨ７．０の場合陰性；ｐＨ９． ５の
場合陽性 ■ クエン酸塩の利用性：コーザー培地、シモンズ培地
には陰性、クリステンセン培地で陽性 ■ 色素の生成：菌膜は黄色〜オレンジ色を呈するも培
地中に水溶性色素は生成せず。

［相］ ウレアーゼ：陰性 ■ オキシダーゼ：〔コバツク（Ｋｏｖａｃ）法〕陰性 ０ カタラーゼ：陽性（１％グルコース含有培地に培養
の時も同じく陽性） ［相］ 生育の範囲：生育最適ｐＨは６．０〜８．５の
範囲であるが、ｐＨ９． ５でもよく生育し、ｐＨ１０
．５でも生育可能である。

ｐＨ５．０以下では殆んど生育しない。

生育最適温度は２５℃〜３５℃である。

４０℃以上又１７℃以下で生育しない。

０ 酸素に対する態度：好気性 ［相］ ＯＦテスト：前記Ｍ８４９菌株で試験した時と
同様の方法に従う。

グルコース及びマンニトールを炭素源とした条件に於い
て、好気的に生育するが嫌気的には生育しない。

そして酸化的に、また嫌気的に酸及びガスを生成しない
。

好気的生育と嫌気条件で生育しない事は前記したイバン
スとクロース（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋｌｏｏｓ）の方
法によっても認めた。

［相］ 好気的培養条件下に於ける各種糖類から酸の生
成 酸生成 （１）Ｌ−アラビノース： − （２）Ｄ−キシロース： − （３）Ｄ−グルコース： − （４）Ｄ−マンノース： − （５）Ｄ−フラクトース： − （６）Ｄ−ガラクトース： − （７）麦芽糖： − （８）シヨ糖： − （９）乳糖： − （１０） ）レバロース： −Ｑｌｌ
Ｄ−ソルビット： −ｆ１２） Ｄ−マンニ
ット： −（１３）イノジット： − （１４）グリセリン： − （１５）デンプン： − これ等の炭水化物からすべてガスは生成 しない。

（１り エスクリンの分解：陰性 （１８）馬尿酸の分解：陰性 （１匂 アルギニンの分解：陰性 （２０）フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性（２１
）コアギュラーゼ：陰性 （２２）溶血性：陰性 （２３）塩化ナトリウム耐性：５％以下の食塩含有肉汁
培地に生育する。

８％以上に生育しない。

例 フォスファターゼ：陰性 （２５）ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） ８０の分解：陰性２
６）・無機窒素源寒天培地に於ける生育：殆んど生育し
ない。

（前記Ｍ８４９菌株と同一方法で試験） □□□ゲラチン液化カニ陽性〔フラジラー・ゲラチン寒
天（Ｆｒａｚｉｅｒ ｇｅｌａｔｉｎ ａｇａｒ）法に
よる〕 （２８）カゼインの分解：陽性（スキムミルク寒天培地
法による） （２９）ディ・エヌ・アーゼ（ＤＮａｓｅ） ：陰性以
上の結果からＢ６４５菌株もまたミクロコツカス属に属
する細菌であり、この菌株の菌学的諸性質ハバージエー
ズ・マニュアル・オブ・デタミネテイブ・バタテリオロ
ジー第８版（１９７４年）及び前記引用したコクール、
バコーバ及びマルテイネク（Ｍ、Ｋｏｃｕｒ、 Ｚ、Ｐ
ａｃｏｖａ ａｎｄ Ｔ、Ｍａｒｔｉｎｅｃ）等のイン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システイマテイク
・バクテリオロジー （Ｉｎｔｅｒｎ、 Ｊ、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔ、 ）
２２巻２１８頁（１９７２年）の雑文に記載されたミ
クロコツカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １
ｕｔｅｕｓ）のネオタイプ菌株の菌学的性質と比較する
と、よく一致する。

従ってＢ６４５菌株はミクロコツカス・ルテウスと同定
される。

本ミクロコツカス・ルテウスＢ６４５菌は微生物工業技
術研究所へ寄託され、微工研菌寄第４９１３号を得てい
る。

（培養法） 次に、本酵素を発酵生産せしめるには、上記の本菌等を
通常の培養法で好気的振盪培養又は通気攪拌培養するこ
とで行われる。

使用する培地は常法のもの、すなわち炭素源として例え
ばコーン、馬鈴薯、甘しょ等の殿粉、可溶性殿粉、テキ
ストリン！酸処理殿粉、アミロース、アミロペクチン等
の炭水化物を４〜１０％用い、窒素源としては例えば大
豆粉、乾燥酵母、ミルクカゼイン、ペプトン、肉エキス
、コーンステイープリカー、ペプチド含有物、アミノ酸
類を単独ないし適量混合添加する。

その他少量の無機塩例えばに２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２０等を適当に添加した培地に上記菌株を接種し、
ｐＨ７〜１０．５にて２５〜４０℃好ましくは３０〜３
７℃で２４〜９６時間好気的に培養することによって、
本酵素を生成蓄積せしめることが出来る。

（酵素の採取法） 培養液から本酵素を採取、精製するには、従来各種の培
養物からその含有酵素を採取、精製するために知られた
常法を適宜に使用することができる。

例えば培養Ｐ液を減圧又は限外濾過にて濃縮する方法、
硫安、硫酸ソーダ、食塩等での塩析法、メタノール、エ
タノール、アセトンのような溶媒による分画沈殿法、適
宜のＤＥＡＥセルロース、交叉結合デキストラン等の吸
着剤による吸着、溶出法、また蛋白沈殿剤による沈殿法
、等電点沈殿法、電気透析法などの精製法を組み合せる
かまたは単独で応用することができる。

（酵素的性質） 本酵素の活性は次のようにして測定される。

１．０％可溶性殿粉のＣａＣｌ２１ ｍ Ｍを含有する
０、１Ｍベロナール緩衝液ｐＨ８，０１，Ｏｍｌを基質
とし、これに適当な濃度に希釈した酵素液０．１ｍｌを
加え、５０℃で２時間反応せしめた後、酢酸でｐＨ６，
Ｏに調整し、全量を水で２０ｍ１にし、１００℃で１０
分間加熱する。

次にこれに１００μｇのグルコアミラーゼを加えて、４
０℃で１時間作用させ、殿粉又はオリゴ糖を分解した後
、生じたグルコースの量をソモジー・ネルラン法で測定
する。

また、対照として酵素液の代りに水を加えたものを上記
と全く同様に処理する。

この両者の差をもってサイクロデキストリンの生成量と
する。

以下、本酵素の理化学的性質は次の通りである。

使用した酵素は培養炉液を限外濾過で脱塩濃縮し、アセ
トン沈殿にて回収したものである。

（１）作用及び基質特異性 本酵素は各種殿粉、例えば馬鈴薯殿粉、コーンスターチ
、可溶性殿粉あるいはデキストリンなどに作用してヨー
ド反応を消失せしめるが、還元力の増加は殆んどなく、
多量のサイクロテ゛キストリンを生成し、最終生産物と
して、サイクロデキストリンの他、マルトテトラオース
、マルトトリオース、マルトース、グルコース等を生じ
る。

又、α−１・４−グリコシド結合したオリゴ糖に本酵素
を作用させても同じ最終生産物が得られる。

従って、本酵素はサイクロデキストリン・グリコジルト
ランスフェラーゼ（ＥＣ，２，４，１，１９）というこ
とができる。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲の測定には酢酸緩衝液（ｐＨ
４，０〜６．０）、ベロナール緩衝液（ｐＨ６〜８．５
）、及びグリシン−カセイソーダ緩衝液（ｐＨ８，５〜
１２．０）を用いた（温度３７℃）。

本酵素のサイクロデキストリン生成の最適作用ｐＨは第
１図から明らかな如く、ｐＨ７にあり、ｐＨ５〜１１の
範囲でも充分に作用する。

但し、図中白丸はミクロコツカス間８４９菌、及び黒丸
はミクロコツカスＢ６４５菌の酵素活性をサイクロデキ
ストリンの生成活性で示したものである。

また、本酵素を各種ｐＨにて３７℃、２４時間放置後、
夫々の残存活性を測定したところ、第２図に示すように
、ｐＨ５〜９の範囲にて殆んど失活しない。

（３）作用適温の範囲 可溶性殿粉を基質としてｐＨ８，Ｏにおいて、２時間反
応させた時の作用適温は第３図に示すように、４０〜５
５℃までは温度と共に活性を増し至適温度は５５〜６５
℃である。

（４） ｐＨ１温度などによる失活の条件ｐＨ５，０
，７，０，９，０及び１１．０ノ酵素液（Ｃａは５ｍＭ
添加）を各温度にて１５分放置後、残存活性を測定した
ところ、第４図に示すようにｐＨ５〜９の範囲では５０
℃までは活性を失わず、６０℃において、約２０〜３０
％が失活する程度である。

（５）共存イオンの影響 Ｃａ廿１ｍＭ以上の添加によって本酵素活性の熱安定性
を増す。

（サイクロデキストリンの製造法） 基質、例えば馬鈴薯殿粉、コーンスターチ等の殿粉類ま
たは可溶性殿粉、デキストリン等の殿粉分解物を加熱溶
解した後、ｐＨ５〜１１、好ましくは６〜９になるよう
にｐＨ調整して、これに本酵素を生成する上記の菌株の
培養液、培養炉液、あるいはその濃縮液又は精製酵素末
等の本酵素の各段階の酵素製品を加える。

温度４０〜６５℃で所要時間反応させた後、常法により
生成物を沈殿せしめ、その沈殿物を集めて水洗し、これ
を常法に従って再結晶すれば、サイクロテ゛キストリン
が結晶状に得られる。

得られたサイクロテ゛キストリンをり、 Ｆｒｅｎｃｈ
等の方法（Ｊ、 Ａｍ、Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、第旦巻３
５３頁１９４９年）に従い、α・β及びγ−サイクロデ
キストリンを分別し、夫々白色結晶として精製標品を得
ることができる。

これらの理化学的性質の中、結晶形、融点、比旋光度、
ヨード呈色反応、還元糖量、赤外線吸収スペクトルを調
べた結果、公知のα−１β−およびγ−サイクロデキス
トリンの性質と一致することが確認された。

以下、本発明方法の実施例を示す。

実施例 １ 可溶性殿粉４．０％、大豆粉３．０％、グルタミン酸ソ
− タ゛ ０．３ ％ 、 Ｋ２ＨＰＯ４
０，２％ 、ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００，０５％、Ｃａ
Ｃｌ２・２Ｈ２００，０３％、Ｎａ２ＣＯ３０，４％、
ＮａＨＣＯ３０，６％からなる液体培地（ｐＨ９，０）
を５００ｍ１容坂ロフラスコに６０ｍ１宛分注し、殺菌
する。

これに本発明者等により分離せるミクロコツカス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ） Ｍ８４９株をスラントより１白
金耳接種し、３５℃にて３日間振盪培養した。

本培養液１．０１を遠心分離して菌体を除去した上清を
膜（東洋ＵＫ−１０）を使用し、限外濾過して０．２１
まで濃縮した後冷却し、２倍容の冷アセトンを添加する
と、酵素が沈殿する。

沈殿物を遠心分離によって採取し、減圧乾燥して８．２
ｇの粗酵素末が得られた。

可溶性殿粉３００ｇを水３１（ＣａＣ１２・２２Ｈ２Ｏ
６を含む）加熱溶解し、Ｎａ２ＣＯ３にてｐＨ８，Ｏに
調節後、上記粗酵素末１ｇを加え、５０℃にて４８時間
反応せしめる。

次いで、反応液を水冷後、トルエン２００ｍ１を加えて
、充分に攪拌混合し、生成物を沈殿させる。

生じた沈殿物を戸数し、水洗後、水１１に懸濁させ、加
熱してトルエンを除去する。

この溶解液に活性炭４ｇを加え、温度６０℃以上にて濾
過し、Ｐ液を冷却すると、サイクロテ゛キストリン１８
０ｇ （収率６０％）か１色の結晶として得られる。

実施例 ２ 前記ミクロコツカスＭ８４９株に代えて、本発明者等に
より分離せるミクロコツカス８６４５株を用いた他は、
すべて実施例１に記載の方法と同一の方法によって、粗
酵素末により可溶性殿粉を分解したところ、サイクロデ
キストリン１６０ｇ （収率５３％）が白色の結晶と
して得られる。

実施例 ３ 実施例１の粗酵素末１ｇに代えて、実施例１と同様の方
法で培養したプロスの遠沈上清１００ｍ１を用いた他は
、すべて実施例１に記載の方法と同一の方法によって、
可溶性殿粉を分解したところ、サイクロテ゛キストリン
１５０ｇ （収率５０％）が白色結晶として得られる
。

実施例 ４ 可溶性殿粉３００ｇを水３１ （ＣａＣ１□＊ ２２
Ｈ２Ｏ６を含む）に加熱溶解し、Ｎａ２ＣＯ３にてｐＨ
８，０に調節後、実施例１で得た粗酵素末１．５ｇを加
え、５０℃にて７２時間反応せしめる。

次いで反応液を減圧濃縮してＩＩまでとし、冷室に１晩
放置し、結晶を析出せしめる。

生じた結晶を戸数し、水０．７１に加熱溶解後、活性炭
３ｇを加え、温度６０℃以上にて濾過し、涙液を冷却す
るとサイクロデキストリン１００ｇ （収率３３％）
が白色の結晶として得られる。

実施例 ５ 可溶性殿粉３００ｇを水３１ （ＣａＣ１２＠ ２Ｈ
ｚ０６ｇを含む）に加熱溶解し、Ｎａ２ＣＯ３にてｐＨ
８，０に調節後、実施例１で得た粗酵素末１ｇを加え、
さらにトリクロルエチレン２００ｍ１を加えて５０℃に
て４８時間反応せしめる。

次いで、反応液を冷却しながら混合攪拌し、生成物を沈
殿せしめる。

生じた沈殿物を集めて水洗後、水１１に懸濁させ、加熱
してトリクロルエチレンを除去する。

この溶解液に活性炭４ｇを加え、温度６０℃以上にて濾
過し、Ｐ液を冷却後、同量のイソプロパツールを添加し
、一晩放置すると、サイクロデキストリン２００ｇ（収
率６７％）が白色の結晶として得られる。

この取得結晶のα・β及びγ−サイクロテ゛キストリン
の混合比率を分析するとα：β：γ＝５：８５：１０で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られるミクロコツカス属Ｍ８４
９株（白丸）および８６４５株（黒丸）の産生する本酵
素のサイクロデキストリン生成活性に及ぼすｐＨの影響
を示すグラフ、第２図は本酵素の３７℃における安定に
及ぼすｐＨの影響を示すグラフ、第３図はＭ８４９菌株
の産生ずる本酵素の作用温度を示すグラフ、第４図は本
酵素の活性の失活に及ぼす温度とｐＨの関係を示すグラ
フ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属
   するサイクロデキストリン・グリコジルトランスフェラ
   ーゼ（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔ
   ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）生成菌を、栄養培地で培養し
   て得られる培養液、培養瀘液、またはその濃縮液あるい
   はそれらの各段階の酵素製品を、殿粉あるいは殿粉分解
   物に作用させて、サイクロデキストリンを生成させるこ
   とを特徴とするサイクロデキストリンの製造法。