JPH0466084A - 酸性アミラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、低いｐＨで澱粉物質を加水分解するのに用い
る有用な新規な酸性アミラーゼ、およびバチルス属に属
する菌株を用いた該アミラーゼの製造法に関する。

［従来の技術］ アミラーゼは澱粉を加水分解し、澱粉を液化させる酵素
として知られ、澱粉工業、アルコール製造工業、繊維工
業さらには食品加工など、産業上広範に用いられる重要
な酵素である。

例えば、澱粉糖製造工程においてグルコース含有シロッ
プは一般に２段階で生産されている。第一に澱粉はｐＨ
６〜７の範囲でアミラーゼ処理により液化される。この
液化された澱粉は次にｐＨ４〜４．５でグルコアミラー
ゼにより糖化される。

現在、澱粉の加水分解の最初のステップに用いられてい
る主要なアミラーゼは、バチルス・ズブチリス、バチル
ス・リケニフォルミス由来のものが知られている（食品
工業と酵素　編−島英治　朝食書店　１９８３）。

ところで、澱粉を液化する際、原料澱粉中に含まれる不
純物のため原料の懸濁液はｐＨ５以下、時には４以下を
呈す。このため、消石灰もしくは炭酸カルシウムでｐＨ
６〜７に上げ、しかる後にアミラーゼを作用させている
。このように、ｐＨを高くするとアミラーゼは安定に使
用できるが。

液化分解物の還元性末端の異性化が起こり易くマルチュ
ロースが副生じ、目的とする澱粉加水分解物質の回収を
低減させる。

しかるに、酸性領域に於て効率的に作用するアミラーゼ
が得られれば、ｐＨ調整の必要もなく。

また、異性化の防止さらには細菌汚集による腐敗やメイ
ラード反応等による着色の低減が図れるなどの利点があ
る。また、食品は一般に酸性のものが多いため、これら
への利用も期待できる。

現在、酸性領域において作用するアミラーゼとしては嫌
気性菌由来のものがよく知られている（特開昭６０−１
１８２、特開昭６０−４１４８２、特開昭６１−１１５
４８４．　　特開昭６１−１８５１８５、特開昭６２−
９１１８１、特開昭６３−１０２６７８、特開昭６３−
１９６２８８など）が、一般に低ｐＨ領域での活性が低
い。ただし、クロスツリジウム属細菌由来のアミラーゼ
には、ｐＨ２付近でも十分活性を保持しているものがあ
るが、該酵素はアルカリ領域でも活性を有し広ｐＨ領域
で働くことが特徴となっている（特開昭６ｌ−１１５４
８４）。しかし、嫌気性菌由来のいずれのアミラーゼに
おいてもその生産性は必ずしも十分満足いくものでなく
、また培養にも特別の配慮が必要など商業的には必ずし
も満足いくものでない。

一方、好気性菌由来のアミラーゼに関しては、低ｐＨ領
域まで作用するものが知られている（参考：　Ａｚｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４６，７−１３（１９８２
）、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、５０，２３−
３Ｎ１９８８）、　　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１２
８，５１５−５２１（１９７Ｂ）、５ｔａｒｃｈ／５ｔ
ａｅｒｋｅ、３１，１６６−１７１（１９７９））、し
かし、至適温度が８０℃付近と高く、かつ作用好適ｐＨ
が２．　０〜６．　０で、ｐＨ２でも最大活性の７０％
以上の活性を有し、低ｐＨ領域で有効に作用するアミラ
ーゼはいまだ知られていない。

［発明の目的コ 本発明の目的は、熱に安定でかつ酸性で安定に作用する
すぐれた新規アミラーゼとその製造法を提供することに
ある。

［発明の概要コ 本発明者等は、熱に安定でかつ酸性で安定に作用するア
ミラーゼを得ることを目的に、酵素および該酵素生産微
生物の探索を広く行った。

その結果、土壌中より分離したバチルス・アシドカルダ
リウスと同定した微生物（バチルスＳＤ８０１株）が、
酵素の特性、特に高温での作用性ならびに作用ｐＨ域が
従来のアミラーゼと異なる新規な酸性アミラーゼを生成
することを見いだし本発明に至った０本発明の酸性アミ
ラーゼを生成するバチルスＳＤ８０１菌株は工業技術院
微生物工業研究所に寄託している（微工研菌寄第１１５
３４号）。

本菌の菌学的性質は次表に示す通りである。

試験項目 試験結果 形態 桿菌 ダラム染色性 ＋ 芽胞 胞子嚢 形 位置 カタラーゼ 運動性 ｖ−Ｐ反応 ウレアーゼ 嫌気下での生育 デンプン分解 ゼラチン液化 卵黄反応 ｐＨ５，７での生育 ｐＨ６，８での生育 ４０℃での生育 膨出 楕円形 亜端立 ＋ ＋ ＋ ＋ ５０℃での生育 ５５℃での生育 ６５℃での生育 クエン酸塩の利用 ５％ＮａＣ１存在下での生育 ７％Ｎ　ａ　Ｃｌ存在下での生育 硝酸塩還元 ＋ ＋ ＋ トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット　　　　　　＋ イノジット グリセリン　　　　　　　＋ 澱粉　　　　　　　　　　　十 グルコース 糖からの酸およびガスの産生 糖 酸の産生 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−マンノース Ｄ−フルクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 ショ糖 乳糖 ガスの産生 これらの結果より、　「バージニーズ・マニュアル・オ
ブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー」第８版に
基づき本菌をバチルス・アシドカルダリウスと同定した
。そこでバチルス・アシドカルダリウスのタイプカルチ
ャー菌（ＡＴＣＣ２７００９）と比較したところ、カタ
ラーゼおよび糖からの酸の産生について異なった性質を
示した。

すなわち、ＳＤ８０１菌株はカタラーゼ陽性なのに対し
て、ＡＴＣＣ２７００９は陰性であった。

また、麦芽糖、ショ糖、乳糖、　トレハロース、Ｄ−ソ
ルビットからの酸の産生はＳＤ−８０１菌株は産生じな
いのに対し、ＡＴＣＣ２７００９は酸を産生していた。

これまで、バチルス・アシドカルダリウスの中で上記の
性質を示すものはいまだ知られていない。

従って、本発明に用いる酸性アミラーゼ生産菌株は新規
なものであると考えた。

次に本発明に用いられる培地について説明する。

本発明に用いられる培地には、安価に入手し得る公知の
各種材料を使用することが出来る。例えば、窒素源とし
ては、コーン・ステイープ・リカーポリペプトン、大豆
粉、フスマエキス、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸
、硫酸アンモニウムなどであり、炭素源としては、マル
トース、各種澱粉、可溶性澱粉、澱粉液化液、デキスト
リン等である。

これらの窒素源や炭素源の他に各種の塩１例えばマグネ
シウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩などの無機塩や
各種ビタミンを必要により添加する。

また、本発明で使用する微生物の生育ｐＨは弱酸性の範
囲であるので、適当なｐＨ調整剤を用いて培地のｐＨを
調整する必要がある。そのために種々の緩衝液を用いる
ことが便利である。

次に１本発明の酸性アミラーゼの精製法について説明す
る。バチルス・アシドカルダリウス例えばＳＤ８０１菌
株のような新規な酸性アミラーゼ生産菌を適当な培地に
摂取し、その生育温度の観点から約り０℃〜約７０℃ま
で、好ましくは５５℃付近、２０時間〜７２時間、好気
的に培養することにより培養液中に酸性アミラーゼが蓄
積される。培養後、培養上澄液に蓄積される菌体外に分
泌される酵素は、粗酵素液として遠心分離（６０００ｒ
ｐｍ）により菌体を除去することにより得られる。この
粗酵素液をそのまま用いることが経済的で有利であるが
、これを更に精製して使用することもできる。精製のた
めに、例えば硫酸アンモニウム等の塩析、エタノール、
アセトン、イソプロパツール等による溶媒沈澱法、限外
濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル減退クロ
マトグラフィー等による一般的な酵素精製法を用いるこ
とが出来る。なお、アミラーゼ活性の測定は以下のよう
にして行った。０．４％の可溶性澱粉（メルク社製　Ｎ
ｏ、１２５２）０．１５ｍ１と０．２Ｍ＃酸ナトナトリ
ウム−塩酸緩衝液定のｐＨに調整されたもの）０．１５
ｍ１を混合し、６０℃、５分間保温した。ついで、酵素
液０．１ｍｌを添加し、所定の温度で所定の時間反応さ
せ、直ちに０．５Ｎ塩酸１　ｍ　ｌと混合し反応を停止
させた。０．０１５％ヨウ素溶液３　ｍ　ｌを添加し攪
はんした後＋　　７００ｎｍでの吸光度を分光光度計を
用いて測定した。尚、アミラーゼ活性の１単位は上記条
件の基で、１分間につき青色の発色量が１０％減りする
量とした。

次に、本発明の酸性アミラーゼの酵素特性について説明
する。

１）作用および基質特異性 本酵素標品は、馬鈴薯、とうもろこし、甘藷など穀類及
び芋類の各種澱粉に作用し液化する。

２）作用ｐＨ 本酵素標品を０．　２％可溶性澱粉存在下、＃酸緩衝液
、リン酸緩衝液またはホウ酸緩衝液中で６０℃で測定し
たとき、ｐＨ２〜５．４に至るまで最大活性の７０％以
上を示す。ｐＨが６以上または、２以下では活性の急激
な低下が起こり、ｐＩ（７では最大活性の高々数％にな
り、ｐＨ７，５では実質的に活性は認められなかった。

また、ｐＨ１，５では活性はほとんどなかった。

３）ｐＨ安定性 本酵素標品の安定ｐＨ範囲をＩｎ緩衝液、リン酸緩衝液
または、ホウＳａＷ液を用いて測定した。

その結果、６０℃、６０分間の処理ではｐ　Ｈ２゜５〜
６．０付近に至るまで活性は９０％以上残存していた。

また、ｐＨ１，７または６．４で２時間処理をすると約
８０％の活性が失われ、ｐＨ７゜５の処理では実質的に
活性が失われていた。

４）作用温度 本酵素標品のｐＨ４，０における至適温度は８０℃付近
である。至適温度の活性の７０％を有する温度は、７１
’Ｃ〜８５℃である。

５）熱安定性 本酵素標品を６０℃、２時間加熱処理を行い残存活性を
測定したところ、はぼ１００％活性を保持していた（ｐ
Ｈ３，４，５）。さらに、７０℃。

１０分処理の場合、残存活性はほぼ１００％保持された
が、９０℃の場合、完全に失活した。

６）分子量 本酵素標品の分子量はゲル減退（トヨパールＨＷ５５ｓ
、　　東ソー社製）における挙動から、６００００〜８
５０００前後と推定される。

以上述べたことから明らかなように、本酵素標品は作用
ｐＨならびに作用温度に特徴を有する。

しかるに、ぶどう糖や異性化糖を製造するには、まず原
料の澱粉をα−アミラーゼで鐘化し、その後グルコアミ
ラーゼで液化している。液化の際、原料澱粉を数十％の
高濃度に仕込むため、液のｐＨは酸性を呈する。このた
め、従来のα−アミラーゼを使うには、澱粉液をアルカ
リで中和してから液化している。液化処理した後、従来
公知のグルコアミラーゼは作用ｐＨが酸性域にあるため
、酸を加えて再度ｐＨを酸性にしなければならない。

しかして、本酵素標品を用いれば、液化、糖化両工程の
ｐＨ調整が不要となり、反応後の脱塩工程への負荷を軽
減できる。また、酸性領域で澱粉物質の消化を必要とす
る例えば食品加工等への適用に関しても、ｐＨの調整な
くして用いることが出来るなど商業上のメリットが大き
いことが期待できる。

［発明の実施例コ 以下１本発明の実施例を示し、更に詳しく説明する。

実施例１ 澱粉２％、大豆粉４％、酵母エキス０．５％、リン酸２
カリウム０．　５％、硫酸マグネシウム０゜５％、硝酸
カルシウム５０ＰＰｍ、硫酸鉄ＩＰＰｍ、塩化ナトリウ
ム０．　５％を含む液体培地（ｐＨ４，０）を２０００
　ｍ　ｌを５０００　ｍ　ｌ容の培養槽に分注し、１２
０℃で２０分間殺菌する。これに同じ培地で培養した本
発明者等により分離せるバチルス属の菌体を添加し、１
１０００ｒｐで攪はんしながら５５℃で２０時間好気的
に培養を行った。培養液のｐＨはｐＨ４〜５となるよう
に自動調節し、温度も５５℃に自動調節する。培養後、
培養液を６０００ｒｐｍで遠心分離し、菌体を除去する
。この上澄液は１６．３単位／ｍｇの比活性を示した。

次に、上澄液に硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよ
うに添加し、沈澱中の酵素を２ｍＭの塩化カルシウム及
び０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む＃酸緩衝液に溶解し
透析した。これを陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｄ
ＥＡＥ−セファデックス　Ａｓ２．ファルマシア製）を
行い、素通り画分を陽イオン交換クロマトグラフィー（
ＣＭ−セファデックス　Ｃ−５０，ファルマシア製）を
実施した。溶出はｏ＝ｏ、６Ｍの塩化ナトリウム１００
０　ｍ　ｌで行い、７ｍｌずつ分画した。イオン交換ク
ロマトグラフィーでアミラーゼ活性が認められる部分を
限外濾過濃縮後、ゲル減退クロマトグラフィー（トヨパ
ール　ＨＷ５５ｓ、　　東ソー社製）を行った。ゲル濾
過におけるアミラーゼ活性を有するピークの比活性は１
１５０単位／　ｍ　ｇで上澄液の比活性に比べて約７０
倍に向上した。

実施例２ 可溶性澱粉（メルク社製　Ｎｏ、１２５２）溶液に澱粉
のｇ当り３５０単位の本酵素標品を添加した。この混合
液のｐＨを４．　０に調整し、次に％で、６０℃に保温
しＯ〜５時間反応の経時変化を追跡した。反応終了後、
酵素を反応液中からメンブランフィルタ−（セントリコ
ン１０．アミコン社製）で除去し、薄層クロマトグラフ
ィー及び高速液体クロマトグラフィーにより反応生成物
を分析した。

薄層クロマトグラフィーによる生成物の分析は次のよう
にして行った。反応生成物を、薄層（キーゼルグール　
６０　Ｆ　２５４．　　メルク社製）上で２−プロパツ
ール：　メチルエチルケトン＝０．５Ｍｚｔｔつｉｌ：
　　０．　２５Ｍイソプロピルアミン（酢酸に溶解）　
＝：３：　　２：　ｏ、　　８５：　ｏ、　　ｓｏで展
開した。発色液は、０．２％ジフェニルアミンおよび０
．２％アニリンの混合物と８５％リン酸を５：１に混合
して用いた。その結果、反応初期で番よマルトテトラオ
ース、マルトトリオース、マルトースがおもに生成し、
後期ではマルトース、マルトトリオースが顕著に増加し
、グルコースの生成も認められた。

一方、高速液体クロマトグラフィーによる反応生成物の
分析は次のようにして行った。反応成分をカルシウム型
のカチオン交換樹脂カラム（ｓｈｏｄｅｘ　　５ＵＧＡ
Ｒ５ＣＩＯＩＩ、昭和電工社製）を用い、水での溶出に
よりクロマトグラフィー処理を行った。溶出した成分は
、示差屈折率検出器で検出し、データ処理装置を用いて
分析した。反応５時間後の生成物の分析結果を次表に示
した。

％（Ｗ／Ｖ）の可溶性澱粉溶液０．３ｍｌに、適当に希
釈された本酵素含有溶液０．１ｍｌを混合し、６０℃１
０分反応させたのち、０．５Ｎ塩酸１　ｍ　ｌを加えて
反応を止めた。ついで３　ｍ　ｌの０゜０１５％ヨウ素
溶液を加えて充分攪はんし、発現する青色を７００ｎｍ
における吸光度により測定し、酵素活性を求めた。各ｐ
Ｈにおける酵素活性値をｐＨ４における酵素活性値を１
００とした相対活性で次表に示した。

Ｇ１：クールコース　　Ｇ２：マルトース　　Ｇ３：マ
ルトトリトスＧ４：マルトテトラオース 実施例　３ ０、　１Ｍ１７）各種ｐＨＩＩＩＩ液に溶解させた０、
２実施例４ ０．１Ｍ＃酸緩衝液（ｐＨ４，０）に溶解させた０、　
　２％（ｗ　／　ｖ　）の可溶性澱粉溶液０．３ｍｌに
、適当に希釈された本酵素含有溶液０．１ｍｌを混合し
、４０〜９０℃で１０分反応させたのち、０．５Ｎ塩［
１１ｍ　ｌを加えて反応を止めた。

ついで、３　ｍ　ｌの０．０１５％ヨウ素溶液を加えて
充分に攪はんし、発現する青色を７００ｎｍにおける吸
光度により測定し、酵素活性を求めた。

各温度における酵素活性値を８０℃における酵素活性値
を１００とした相対活性で吹製に示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質を有するアミラーゼ； ［１］澱粉を加水分解し、グルコース、マルトース、マ
   ルトトリオース、マルトテトラオースを生成する。 ［２］至適ｐＨが、３．５〜４．０で、ｐＨ２〜５．４
   の範囲で最大活性の７０％以上の活性を保持。 ［３］作用温度は６０℃〜８５℃で、至適温度は８０℃
   付近。 ［４］ｐＨ７．０で、最大活性の数％以下の活性を示し
   、ｐＨ７．５、６０℃、３０分処理で失活する。 ［５］カラムクロマトグラフィーにより測定した分子量
   は、６００００〜８５０００前後である。 ［６］等電点が、５〜６付近である。 ２、バチルスＳＤ８０１またはこの変異株からなる菌株
   を培養し、培養物からアミラーゼを回収することを特徴
   とする酸性アミラーゼの製造法。